СПОСОБ ПРОГНОЗА МЕТАСТАЗИРОВАНИЯ ОПУХОЛЕЙ РАКА ЖЕЛУДКА Российский патент 2023 года по МПК C12N15/00 C12Q1/686 G01N33/574 G01N33/53 

Изобретение относится к измерениям для диагностических и прогностических целей в частности, в онкологии, иммунологии, лабораторной диагностике и предназначено и может быть использовано для прогнозирования метастазирования у больных раком желудка с разной морфологической структурой для прогнозирования метастазирования опухолевого процесса у больных раком желудка. Рак желудка (РЖ) занимает четвертое место по заболеваемости и второе место по смертности среди всех онкологических заболеваний в мире. Пятилетняя выживаемость среди пациентов с РЖ составляет только 20-30%.

Метастазирование - один из основных показателей злокачественности опухолевого процесса и основная причина смертности большинства больных злокачественными опухолями. При развитии метастазов продолжительность жизни больных раком желудка (РЖ) в среднем составляет 9-10 месяцев. Это указывает на важность выявления и изучения биомаркеров, которые позволили бы предсказать риск метастазирования РЖ. В последние десять лет широко исследуют микроРНК регуляторные молекулы, которые относятся к классу малых некодирующих РНК. Вследствие их размеров, тканевой специфичности и относительной стабильности в биологических жидкостях эти молекулы могут служить доступными биомаркерами для выявления и прогнозирования развития рака, в том числе и РЖ. Накапливается информация об участии микроРНК в биохимических путях развития опухоли, активно исследуют их функцию в процессах метастазирования злокачественных новообразований.

Весьма актуальным является выявление генов, ассоциированных с метастазированием опухоли. Знание таких генов и особенностей их функционирования при переходе к диссеминированному состоянию может привести к персонификации терапии и, следовательно, повышению ее эффективности. При этом могут открываться перспективы терапии не только метастатического РЖ, но и более ранних его стадий для предотвращения образования метастазов. Кроме того, такие гены могут являться источником биомаркеров, сигнализирующих о повышенном риске метастазирования опухоли.

В терапии разных типов рака в настоящее время активно используются таргетные препараты, воздействующие на конкретные гены мишени. При РЖ используемыми таргетными препаратами являются трастузумаб - моноклональное антитело против HER2 и рамуцирумаб, ингибирующий тирозин-киназный рецептор VEGFR2. Кроме того, разрабатываются средства терапии, направленные на другие гены-мишени, относящиеся к основным путям развития РЖ - PI3K-AKT-mTOR и RAS-RAF-MEK. В качестве мишеней при этом чаще всего рассматриваются ростовые факторы и их рецепторы. К таковым относятся эпидермальный фактор роста (EGF), фактор роста фибробластов (FGF), трансформирующий фактор роста (TGF-β), нейропилин1 (NRP1). Последний из указанных способен связываться с разными лигандами (TGF-β, FGF) и рецепторами VEGF (VEGFR1 и VEGFR2), модулируя их активность.

Известен способ прогнозирования развития метастазов и тест-система для прогнозирования развития метастазов у больных раком желудка на основании определения числа копий HV2 мтДНК, содержащая реагенты для амплификации ДНК в режиме реального времени (ПЦР-РВ) и контрольные смеси, смесь для ПЦР-РВ реакции, содержащую 0,57 мМ dNTPs, 7,1 мМ MgCl₂, 2,7-кратный ПЦР-буфер с 2,9-кратной концентрацией красителя EvaGreen Dye и 7,1% ДМСО, ДНК-полимер азу Thermus aquaticus 5 ед./мкл и высокоспецифичные праймеры для генов HV2 и В2М с концентрацией 1,8 мкМ каждого в водном растворе, праймеры для гена HV2: прямой GGGAGCTCTCCATGCATTTGGTA, обратный AAATAATAGGATGAGGCAGGAATC; для гена В2М: прямой TGCTGTCTCCATGTTTGATGTATCT, обратный TCTCTGCTCCCCACCTCTAAGT. (RU 2683571).

Известен способ прогнозирования метастазов у больных раком желудка, включающий определение маркера пролиферативной активности Ki-67 и маркера апоптоза р53, отличающийся тем, что у больных раком желудка различного морфологического строения проводят иммуногистохимическое исследование, дополнительно определяют маркер апоптоза bcl-2 и устанавливают, что при абсолютных значениях при перстневидно-клеточном раке: р53 - 10%, bcl-2 - 10%, Ki-67 - 12%; при недифференцированном раке: р53 - 13%, bcl-2 - 11%, Ki-67 - 9%; при аденокарциноме: р53 - 10%, bcl-2 - 9%, Ki-67 - 12% прогнозируют возникновение метастазов в лимфоузлах, а при р53 - 6%, bcl-2 - 5%, Ki-67 - 10% прогнозируют отсутствие метастатического поражения лимфоузлов (RU 2445632).

Известен способ прогнозирования развития метастазов в регионарные лимфоузлы у пациентов с аденокарциномой желудка, включающий получение ДНК из операционного материала опухолевой и условно здоровой ткани пациента и иммуногистохимическое исследование на срезах парафиновых блоков, отличающийся тем, что осуществляют амплификацию фрагментов генетических локусов В2М, NFKB1 и HER2 NFKB1 и HER2 методом ПЦР в реальном времени с помощью высокоспецифичных праймеров на матрице выделенной ДНК, проводят количественную интерпретацию результатов амплификации и расчет относительной копийности генов по формуле rC=rС_{опухоль}/rС_норма=2^-ΔCt_{(опухоль}/2^-ΔCt_(норма), где rC - относительная копийность гена, ΔCt - разность среднего значения сигналов флюоресценции (C_t) по трем повторам для гена мишени и среднего C_t по трем повторам для референсного гена: Δ_ct=_ct(ген мишень)-^Ct(В2М), параллельно осуществляют иммуногистохимическое исследование на срезах парафиновых блоков с помощью моноклональных антител к Ki67 и HER2, сравнивают полученные значения rC с прогностическими значениями копийности, и при значениях rC_NFKB1<0,8±0,02 и rC_HER2<1,1±0,08 в комбинации с уровнем экспрессии в ядрах опухолевых клеток белка Ki67_игx<35,6±6,1 и негативной экспрессией HER2_игx(-) прогнозируют отсутствие метастазов, а при значениях rC_NFKB1>0,9±0,01 и rC_HER2>2,0±0,1 в комбинации с уровнем экспрессии в ядрах опухолевых клеток белка Ki67_игx>54,2±4,9 и позитивной экспрессией HER2_игx (+++) прогнозируют развитие метастазов, прогноз делается на основании копийности ДНК генов. (RU 2661600, прототип)

Во всех известных способах прогнозирование метастазирования реализуется только в лимфоузлы желудка, чем обусловлена ограниченность их использования.

Технической проблемой, разрешаемой настоящим изобретением, является определение показателей, обеспечивающих прогнозирование отдаленных метастазов рака желудка. В плане разработки биомаркеров для выявления и мониторирования РЖ большое значение имеет создание панели микроРНК и генов, а также способа прогнозирования метастазирования рака желудка.

Технический результат, обеспечивающий разрешение указанной проблемы заключается в расширении возможностей прогнозирования отдаленных метастазов рака желудка и повышении достоверности этого прогнозирования за счет исследования экспрессии микроРНК и генов.

Сущность изобретения заключается в том, что способ прогноза метастазирования опухолей рака желудка (РЖ), заключается в том, что:

- получают образцы ткани опухоли РЖ и нормальной слизистой ткани желудка пациента, проводят выделение РНК из образцов для чего выполняют лизирование ткани, фенольную экстракцию, доочистку на колонке, проверку концентрации суммарной РНК и определяют отношение поглощения на длинах волн 260 нм и 280 нм,

- отделяют образцы для определения экспрессии микроРНК и генов, выбранные из условия, что отношение поглощения на длинах волн 260 нм и 280 нм составляет (А_260/280)>1,9, отношение поглощения на длинах волн 260 нм и 230 нм (А_260/230)>1,8, выравнивают концентрацию суммарной РНК до 50 нг/мкл;

- затем выполняют обратную транскрипцию мРНК и микроРНК и количественное определение экспрессии мРНК и микроРНК с использованием полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ), получают значения уровней экспрессии микроРНК и мРНК в опухолевой ткани относительно нормальной слизистой желудка методом количественной ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) в парных образцах опухоль - нормальная ткань,

- определяют уровни экспрессии микроРНК miR-34a, miR-146a, miR-335 и miR-590 и генов VEGF, VEGFR1, VEGFR2, NRP1, в опухолевой ткани относительно нормальной слизистой ткани желудка используя полученные обратной транскрипцией ДНК для микроРНК и мРНК,

- сравнение уровней экспрессии указанных микроРНК разных стадий РЖ выполняют ROC-анализом и получают пороговые значения 0,4; 0,8; 0,3 и 0,4 для miR-34а, miR-146a, miR-335 и miR-590, соответственно,

- пороговые значения, оптимально дифференцирующее уровни экспрессии указанных микроРНК и генов между метастазирующими и не метастазирующими опухолями рака желудка, полученные ROC-анализом используют для дальнейшего анализа полученных уровней экспрессии и дают прогноз риска метастазирования РЖ, исходя из следующего:

- неблагоприятный прогноз риска метастазирования опухоли рака желудка в лимфоузлы в случаях, когда экспрессия любых трех из этих четырех микроРНК miR-34а, miR-146a, miR-335 и miR-590 ниже порогового значения;

- неблагоприятный прогноз риска отдаленного метастазирования (диссеминации опухоли) рака желудка в том случае, когда значения уровня экспрессии двух маркеров из группы трех маркеров: miR335 и FGFR2 ниже, а VEGFR1 - выше пороговых значений в образцах опухолевой ткани относительно нормальной ткани,

- неблагоприятный прогноз риска отдаленного метастазирования (диссеминации опухоли) рака желудка в том случае, когда для гена VEGFR1 экспрессия в образцах опухолевой ткани превышает пороговое значение 0,5 относительно нормальной ткани, значение уровня экспрессии мРНК гена FGFR2 ниже 0,05, а уровень экспрессии miR335 ниже 0,3,

- или благоприятный прогноз риска отдаленного метастазирования при отсутствии указанных выше значений уровней экспрессии микроРНК и генов в опухолевой ткани относительно нормальной.

Предпочтительно, исследуют образцы больных РЖ без метастазов в лимфатические узлы (Т3-4, N0), больных РЖ с наличием метастазов в лимфатических узлах (Т3-4, N3) и больных РЖ с отдаленными метастазами (диссеминированный рак желудка).

Предпочтительно, определенный с помощью ROC-анализа пороговый уровень экспрессии гена, оптимально дифференцирующий уровни экспрессии указанных генов между метастазирующими и не метастазирующими опухолями рака желудка, для гена VEGFR1 составляет 0.5, а для генов FGFR2 и NRP1 он составляет 0,05 и 0.97, соответственно.

Предпочтительно, образцы опухолей РЖ и нормальной ткани желудка подучают во время хирургических операций или путем биопсии, а после забора образцы сразу замораживают и хранят при температуре минус 70°С. Берут для исследования не менее 10 мкл выделенной ДНК с концентрацией не менее 5 нг/мкл.

Предпочтительно, количественную ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) в парных образцах опухоль норма производят троекратно с использованием наборов TaqMan®Gene Expression Assays:

HER 2 - TaqMan Gene Expression Assay Hs 01001580_m1

VEGFA - TaqMan Gene Expression Assay Hs 00900055_m1

NRP1 - TaqMan Gene Expression Assay Hs00826128_m1

bFGF / FGF2 - TaqMan Gene Expression Assay Hs00266645_m1

TGF b - TaqMan Gene Expression Assay Hs00998133_m1

FGFR2 - TaqMan Gene Expression Assay Hs01552918_m1

VEGFR1 / FLT1 - TaqMan Gene Expression Assay Hs01052961_m1

VEGFR2 / KDR - TaqMan Gene Expression Assay Hs00911700_m1

GAPDH - TaqMan Gene Expression Assay Hs02786624_g1

Предпочтительно, количественную ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) в парных образцах опухоль - норма производят троекратно с использованием наборов TaqMan® miRNA Assays:

Предпочтительно, наличие и качество РНК в образцах проверяют, используя электрофорез в 1,8% агарозном геле, качественными считают образцы РНК, демонстрирующие четкие полосы 18S и 28S РНК, без детектируемой электрофоретически примеси ДНК.

Предпочтительно, порог, оптимально дифференцирующий уровни экспрессии микроРНК miR-34a, miR-146a, miR-335 и miR-590 между метастазирующими и не метастазирующими опухолями рака желудка, определенные ROC-анализом составляют 0,4; 0,8; 0,3 и 0,4, соответственно).

Предпочтительно, концентрацию водного раствора РНК определяют троекратно на спектрофотометре, а количественное определение экспрессии микроРНК осуществляют троекратно с использованием полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ).

Предпочтительно, статистическую обработку результатов проводят с помощью пакета стандартных программ Statistica 10, при этом уровень значимости для выявленных различий принимают равным менее 0,05, указанные пороги используют при статистической обработке результатов с помощью точного критерия Фишера, а для анализа полученных результатов используют встроенную программу Applied Biosystems Step One Plus, при этом в качестве контрольного гена используют ген GAPDH.

На чертежах фиг. 1, фиг. 2 приведены результаты ROC анализа при определении экспрессии микроРНК в панели miR-34a/miR-146a/miR-335/miR-590 и анализе уровня экспрессии трех из четырех указанных микроРНК, а также исключения серой зоны. Результаты А) анализируются средние значения экспрессии трех микроРНК, результаты Б) средние значения для учета нахождения трех микроРНК ниже порогового значения нормированы путем умножения на

Как следует из приведенных чертежей Фиг. 1, 2, результаты анализа при обоих подходах весьма схожи. При варианте А плошадь под кривой AUC=0,932, р=0,0001, чувствительность составляет 87,5%, специфичность - 90,91%. При варианте Б, который в большей степени отражает риск метастазирования, результаты несколько лучше: плошадь под кривой AUC=0,977, р=0,0001, чувствительность составляет 100%, специфичность - 90,91%. Поскольку пороговые значения для разных микроРНК отличаются, простое усреднение уровней экспрессии может ухудшать результат вследствие этого. Нормирование на вероятность случайных колебаний экспрессии относительно порогового значения призвано сгладить недостаток простого усреднения уровней экспрессии. Полученные данные демонстрируют устойчивость результатов и их слабую зависимость от способа обработки, что дополнительно свидетельствует о сильной ассоциации экспрессии найденных микроРНК при разработанном способе их использования с метастазированием. Материалы и методы реализации способа.

Способ прогноза метастазирования опухолей рака желудка (РЖ), реализуется следующим образом:

- получают образцы ткани опухоли РЖ и нормальной слизистой ткани желудка пациента, проводят выделение РНК из образцов для чего выполняют лизирование ткани, фенольную экстракцию, доочистку на колонке, проверку концентрации суммарной РНК и определяют отношение поглощения на длинах волн 260 нм и 280 нм,

- отделяют образцы для определения экспрессии микроРНК, выбранные из условия: концентрация суммарной РНК составляет 50 нг/мкл, отношение поглощения на длинах волн 260 нм и 280 нм составляет (А_260/280)>1,9, отношение поглощения на длинах волн 260 нм и 230 нм (А_260/230)>1,8, выравнивают концентрацию суммарной РНК до 50 нг/мкл;

- затем выполняют обратную транскрипцию отобранных образцов и количественное определение экспрессии мРНК и микроРНК с использованием полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ), получают значения уровней экспрессии микроРНК в опухолевой ткани относительно нормальной слизистой желудка методом количественной ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) в парных образцах опухоль нормальная ткань,

- определяют уровни экспрессии микроРНК miR-34a, miR-146a, miR-335 и miR-590 и генов VEGF, VEGFR1, VEGFR2, NRP1, bFGF, FGFR2, TGF-β, HER2/neu, в опухолевой ткани относительно нормальной слизистой ткани желудка для чего используют полученные обратной транскрпцией ДНК для микроРНК и мРНК,

- причем сравнение уровней экспрессии указанных микроРНК разных стадий РЖ выполняют ROC-анализом и получают пороговые значения 0,4; 0,8; 0,3 и 0,4 для указанных микроРНК соответственно,

- пороговые значения,, оптимально дифференцирующее уровни экспрессии указанных микроРНК и генов между метастазирующими и не метастазируюшими опухолями рака жедудка, полученные ROC-анализом, используют для дальнейшнго анализа полученных уровней экспрессии и дают прогноз риска метастазирования РЖ, исходя из следующего:

- неблагоприятный прогноз риска метастазирования опухоли рака желудка в лимфоузлы в случаях, когда экспрессия любых трех из этих четырех микроРНК miR-34а, miR-146a, miR-335 и miR-590 ниже порогового значения;

- неблагоприятный прогноз риска отдаленного метастазирования (диссеминации опухоли) рака желудка в том случае, когда значения уровня экспрессии двух маркеров из группы трех маркеров: miR335 и FGFR2 ниже, а VEGFR1 - выше пороговых значений в образцах опухолевой ткани относительно нормальной ткани,

- неблагоприятный прогноз риска отдаленного метастазирования (диссеминации опухоли) рака желудка в том случае, когда для гена VEGFR1 экспрессия в образцах опухолевой ткани превышает пороговое значение 0,5 относительно нормальной ткани, значение уровня экспрессии мРНК гена FGFR2 ниже 0,05, а уровень экспрессии miR335 ниже 0,3,

- или благоприятный прогноз риска отдаленного метастазирования при отсутствии указанных выше значений уровней экспрессии микроРНК и генов в опухолевой ткани относительно нормальной.

Как правило, исследуют образцы больных РЖ без метастазов в лимфатические узлы (Т3-4, N0), больных РЖ с наличием метастазов в лимфатических узлах (Т3-4, N3) и больных РЖ с отдаленными метастазами (диссеминированный рак желудка).

Предпочтительно, определенный с помощью ROC-анализа пороговый уровень экспрессии гена, оптимально дифференцирующий уровни экспрессии указанных генов между метастазирующими и не метастазирующими опухолями рака жедудка, для гена VEGFR1 составляет 0.,5, а для генов FGFR2 и NRP1 он составляет 0,05 и 0.97, соответственно.

Предпочтительно, образцы опухолей РЖ и нормальной ткани желудка подучают во время хирургических операций или путем биопсии, а после забора образцы сразу замораживают и хранят при температуре минус 70°С. Берут для для исследования не менее 10 мкл выделенной ДНК с концентрацией не менее 5 нг/мкл..

Предпочтительно, количественную ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) в парных образцах опухоль - норма производят троекратно на приборе Step One Plus фирмы Applied Biosystems (США) с использованием наборов TaqMan®Gene

Expression Assays:

HER 2 - TaqMan Gene Expression Assay Hs 01001580_m1

VEGFA - TaqMan Gene Expression Assay Hs 00900055_m1

NRP1 - TaqMan Gene Expression Assay Hs00826128_m1

bFGF / FGF2 - TaqMan Gene Expression Assay Hs00266645_m1

TGF b - TaqMan Gene Expression Assay Hs00998133_m1

FGFR2 - TaqMan Gene Expression Assay Hs01552918_m1

VEGFR1 / FLT1 - TaqMan Gene Expression Assay Hs01052961_m1

VEGFR2 / KDR - TaqMan Gene Expression Assay Hs00911700_m1

GAPDH - TaqMan Gene Expression Assay Hs02786624_g1

Предпочтительно, количественную ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) в парных образцах опухоль норма производят троекратно на приборе Step One Plus фирмы Applied Biosystems (США) с использованием наборов реагентов для оценки уровня экспрессии TaqMan® miRNA Assays:

Предпочтительно, дополнительную очистку РНК проводят с помощью набора RNA Clean-Up and Concentration Kit (NORGEN).

Предпочтительно, наличие и качество РНК в образцах проверяют, используя электрофорез в 1,8% агарозном геле, качественными считают образцы РНК, демонстрирующие четкие полосы 18S и 28S РНК, без детектируемой электрофоретически примеси ДНК.

Предпочтительно, порог, оптимально дифференцирующий уровни экспрессии микроРНК miR-34a, miR-146a, miR-335 и miR-590-5p между метастазирующими и не метастазируюшими опухолями рака жедудка, определенные ROC-анализом составляют 0,4; 0,8; 0,3 и 0,4, соответственно).

Предпочтительно, для выделения РНК в парных образцах опухоль - нормальная слизистая ткань желудка используют набор RNeasy Mini Kit (QIAGEN, США).

В частных случаях реализации, обратную транскрипцию проводят с использованием набора, ImProm-II™ Reverse Transcriptase (Promega, США).

В иных частных случаях обратную транскрипцию проводят с использованием набора TaqMan™ MicroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems™, США).

Предпочтительно, концентрацию водного раствора РНК определяют троекратно на спектрофотометре Nanodrop 1000 (Thermo Scientific, США), а количественное определение экспрессии микроРНК осуществляют троекратно с использованием полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) на приборе Step One Plus фирмы Applied Biosystems (США)..

Предпочтительно, статистическую обработку результатов проводят с помощью пакета стандартных программ Statistica 10, при этом уровень значимости для выявленных различий принимают равным менее 0,05, а указанные пороги использовуют при статистической обработке результатов с помощью точного критерия Фишера, а для анализа полученных результатов используют встроенную программу Applied Biosystems Step One Plus, при этом в качестве контрольного гена использовуют ген GAPDH.

При реализации способа образцы опухолей РЖ и нормальной ткани того же органа получены во время хирургических операций или путем биопсии. После забора ткань сразу замораживалась и хранилась при температуре -70 С.

Исследовали образцы больных РЖ без метастазов в лимфатические узлы (Т3-4, N0), с наличием метастазов в лимфатических узлах (Т3-4, N3) и с отдаленными метастазами (диссеминированный рак желудка).

Для выделения РНК использовали набор miRNeasy MiniKit (QIAGEN, США). Выделение производили согласно инструкции к набору. Этапы выделения РНК включают лизирование ткани, фенольную экстракцию, доочистку на колонке. Дополнительную очистку РНК проводили с помощью набора RNA Clean-Up and Concentration Kit (NORGEN). Наличие и качество РНК проверяли, используя электрофорез в 1,8% агарозном геле. Качественными считали образцы РНК, демонстрирующие четкие полосы 18S и 28S РНК, без детектируемой электрофоретически примеси ДНК. Концентрацию водного раствора РНК определяли на спектрофотометре Nanodrop 1000 (Thermo Scientific, США).

В исследование брали образцы, отвечающие требованиям: концентрация суммарной РНК 50 нг/мкл, отношение поглощения на длинах волн 260 и 280 нм (А_260/280)>1,9, отношение поглощения на длинах волн 260 и 230 нм (А_260/230)>1,8.

Обратную транскрипцию проводили, используя набор TaqMan™ MicroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems™, США). Количественное определение экспрессии микроРНК осуществляли с использованием полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) на приборе Step One Plus фирмы Applied Biosystems (США). Каждое измерение проводили трехкратно. ПЦР-РВ проводили с использованием наборов Applied Biosystems (США) TaqMan® miR-NA Expression Assays в соответствии с инструкцией производителя. В качестве эндогенного контроля использовали РНК U 48. В результате измерений получены значения уровней экспрессии микроРНК в опухолевой ткани относительно нормальной слизистой желудка. Порог, оптимально дифференцирующий уровни экспрессии микроРНК miR-34a, miR-146a, и miR-335 при сравнении разных стадий РЖ определяли ROC-анализом (0,4; 0,8; 0,3 и 0,4, соответственно). Указанные пороги использованы при статистической обработке результатов с помощью точного критерия Фишера. Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета стандартных программ Statistica 10. Уровень значимости для выявленных различий принимали равным менее 0,05.

Методом количественной ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) в парных образцах опухоль - норма изучали уровни экспрессии мРНК генов VEGF, VEGFR1, VEGFR2, NRP1, bFGF, FGFR2, TGF-β, HER2/neu.

Из каждой пары образцов выделяли суммарную фракцию РНК. Для выделения РНК использовали набор RNeasy Mini Kit (QIAGEN, США). Обратную транскрипцию проводили, используя набор ImProm-II™ Reverse Transcriptase (Promega, США). ПЦР-РВ осуществляли на приборе Step One Plus фирмы Applied Biosystems (США). Каждое измерение проводили трехкратно. ПЦР-РВ проводили с использованием наборов TaqMan®Gene Expression Assays в соответствии с инструкцией изготовителя.

Использованные наборы:

HER 2 - TagMan Gene Expression Assay Hs 01001580_m1

VEGFA - TagMan Gene Expression Assay Hs 00900055_m1

NRP1 - TagMan Gene Expression Assay Hs00826128_m1

bFGF / FGF2 - TagMan Gene Expression Assay Hs00266645_m1

TGF b - TagMan Gene Expression Assay Hs00998133_m1

FGFR2 - TagMan Gene Expression Assay Hs01552918_m1

VEGFR1 / FLT1 - TagMan Gene Expression Assay Hs01052961_m1

VEGFR2 / KDR - TagMan Gene Expression Assay Hs00911700_m1

GAPDH - TagMan Gene Expression Assay Hs02786624_g1

Для анализа полученных результатов использовали встроенную программу Applied Biosystems Step One Plus. В качестве контрольного использовали ген GAPDH. В результате обработки измерений получены значения уровней экспрессии генов в опухолевой ткани относительно нормальной. Пороговый уровень экспрессии гена в опухоли определяли с помощью ROC-анализа. Для гена VEGFR1 он составил > 0.5, для генов FGFR2 и NRP1: < = 0,05 и > 0.97, соответственно.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета стандартных программ Statistica 10 и программы MedCalc. Были применены методы: точный критерий Фишера и ROC анализ. Уровень значимости для выявленных различий принимали равным менее 0,05.

Рнзультаты.

Изучили экспрессию выбранных микроРНК и генов на всех этапах развития опухолевого процесса: от неметастатического РЖ (N0), с поражением метастазами лимфоузлов и с развитием метастазов в отдаленных органах.

При исследовании экспрессии miR-34a, miR-146a, miR-335 и miR-590 в образцах РЖ без метастазов и в образцах РЖ с распространением метастатического процесса в лимфоузлы были получены результаты, приведенные в таблице 1.

Все четыре микроРНК ассоциированы с метастазированием в лимфоузлы. Уровни экспрессии всех четырех микроРНК понижаются по мере вовлечения в метастатический процесс регионарных лимфоузлов. С наибольшим относительным риском метастазирования ОР связана экспрессия микроРНК miR-34a и miR-590.

Однако применение экспрессии одиночных микроРНК в качестве маркеров затруднительно вследствие экспериментальных ошибок. Исключить их позволяет одновременное использование нескольких микроРНК (панели). Характеристики различных комбинаций микроРНК в качестве маркеров представлены в таблице 2.

Указанные панели используются по принципу: экспрессия определенного количества микроРНК в панели ниже порогового значения. Как следует из представленных характеристик, наилучшими свойствами обладает панель, включающая все четыре микроРНК miR-34a, miR-146a, miR-335 и miR-590, применяемая по формуле: экспрессия любых трех из этих четырех микроРНК ниже порогового значения. При этом все параметры, характеризующие рассматриваемую панель как определяющую риск метастазирования в лимфоузлы, существенно лучше, чем показатели отдельных маркеров. Риск метастазирования ОР составляет 22, отношение шансов ОШ = 75.

Связь экспрессии изученных генов с метастазированием в лимфоузлы не выявлена. В то же время, экспрессия генов FGFR2, VEGFR1 и NRP1 была ассоциирована с метастазированием в отдаленные от желудка органы и ткани (диссеминация опухоли), как следует из результатов ROC анализа. Результаты определения связи уровней экспрессии изучаемых генов с диссеминацией опухоли РЖ даны в таблице 3.

Наилучшими значениями отношения шансов ОШ, характеризующее перевес доли маркера в метастазирующих опухолях по отношению к неметастазирующим, имеют микроРНК miR-335 и гены VEGFR1 и NRP1.

Для выявления наилучшей панели были изучены различные комбинации микроРНК и генов. Результаты суммированы в таблице 4.

Две из них показали высокую чувствительность и специфичность. Для панели miR335/VR1/FGFR2 (два из трех) чувствительность составила 96%, специфичность 87%; для панели miR34a/miR335/FGFR2 (два из трех) чувствительность составила 82%, специфичность - 92%. Две другие панели также продемонстрировали приемлемые показатели: для miR34a/miR335/NRP1 (два из трех) чувствительность 82% и специфичность 84%. Для miR34a/miR335/VR1 (два из трех) чувствительность 83% и специфичность 75%.

Однако наилучшие показатели, особенно значение отношения шансов ОШ = 143 и ОР = 7,1, имеет панель, включающая miR335/VR1/FGFR2.

Таким образом, сформированные и охарактеризованные панели позволили сформулировать способ прогнозирования метастазирования рака желудка в лимфоузлы и отдаленного метастазирования.

Для метастазирования рака желудка в лимфоузлы он заключается в определении экспрессии микроРНК в панели miR-34a/miR-146a/miR-335/miR-590; при уровне экспрессии трех из четырех указанных микроРНК ниже порогового значения риск метастазирования рака желудка в лимфоузлы высокий. В то же время, как следует из данных в таблице 2, две микроРНК также связаны с риском метастазирования в лимфоузлы, но с меньшей специфичностью. Учитывая это, а также не стопроцентную чувствительность, такие случаи следует выделить в так называемую серую зону, то есть в группу, в которой для окончательного заключения необходимы дополнительные исследования.

Получаемые при таком подходе (то есть, при оценке риска метастазирования по трем из четырех указанных микроРНК и исключения серой зоны) результаты можно оценить с помощью ROC анализа. Его результаты приведены на чертеже 1.

Чертеж 1 - Результаты ROC анализа при определении экспрессии микроРНК в панели miR-34a/miR-146a/miR-335/miR-590 и анализе уровня экспрессии трех из четырех указанных микроРНК, а также исключения серой зоны. А) анализируются средние значения экспрессии трех микроРНК, Б) средние значения для учета нахождения трех микроРНК ниже порогового значения нормированы путем умножения на

Как следует из чертежей 1, А и Б, результаты при обоих подходах весьма схожи. При варианте А плошадь под кривой AUC=0,932, р=0,0001, чувствительность составляет 87,5%, специфичность - 90,91%. При варианте Б, который в большей степени отражает риск метастазирования, результаты несколько лучше: плошадь под кривой AUC=0,977, р=0,0001, чувствительность составляет 100%, специфичность - 90,91%.

Ключевое значение в качестве характеристики способа имеет величина AUC. Полученные и приведенные выше величины характеризуют способ как отличный классификатор групп больных на имеющих высокий риск метастазирования опухоли в лимфоузлы и низкий риск (средне популяционный).

Для определения риска отдаленного метастазирования используется панель miR335/VR1/FGFR2. При уровне экспрессии двух из трех указанных маркеров - miR335 и FGFR2 ниже или VR1 выше порогового значения - риск метастазирования рака желудка в лимфоузлы высокий.

При этом: для метастазирования рака желудка в лимфоузлы благоприятным является развитие опухоли в том случае, если значения уровня экспрессии микроРНК образцов опухолевой ткани miR-34a, miR-146a, и miR-335 и miR-590 превышают пороговые значения: 0,4; 0,8; 0,3 и 0,4 соответственно, относительно нормальной ткани; для отдаленного метастазирования неблагоприятным является развитие опухоли в том случае, если значения уровня экспрессии генов VEGFR1 и NRP1 в образцах опухолевой ткани превышают пороговые значения 0,5 и 2, соответственно, относительно нормальной ткани, а значение уровня экспрессии мРНК гена FGFR2 значительно снижено (меньше 0,05), а уровень экспрессии miR335 менее 0,3.

Эффективность разработанного способа определяется создаваемой возможностью прогнозировать метастазирование опухолей больных раком желудка с высокой надежностью. Прогнозирование может быть проведена быстро при малом количестве анализируемого материала.

Более детальное описание операций способа.

I) Выделение РНК.

Для определения уровня экспрессии геновРНК выделяют с помощью набора для выделения тотальной РНК из тканей RNeasy Mini Kit (QIAGEN, США). Все процедуры проводят согласно инструкции к набору. Метод основан на лизисе образцов в растворе гуанидинтиоционата, сорбции РНК на колонках, отмывках РНК в спиртовых растворах и элюции РНК (ПРИЛОЖЕНИЕ 1). В результате с каждой лунки получают 30 мкл водного раствора РНК.

МикроРНК выделяют с помощью набора для выделения микроРНК из тканей miR-NeasyMiniKit(QIAGEN, США). Все процедуры проводят согласно инструкции к набору. Метод основан на лизисе образцов в растворе гуанидинтиоционата, сорбции РНК на колонках, отмывках РНК в спиртовых растворах и элюции РНК (ПРИЛОЖЕНИЕ 1). В результате с каждой лунки получают 30 мкл водного раствора РНК.

II) Проверка качества и измерение концентрации РНК.

Наличие и качество РНК проверяют, используя электрофорез в 1,8% агарозном геле. Электрофорез проводят в горизонтальном аппарате для электрофореза SUBCELL 96 BIO-RAD производства США при постоянной силе тока 130 мА в течение 30 мин. Оценку полученных фрагментов проводят на трансиллюминаторе Whatman-BiometraTL-3 в ультрафиолетовом свете.

Концентрацию водного раствора РНК определяют на спектрофотометре Nanodrop 1000 (Thermo Scientific, США) согласно инструкции к прибору.

II) Проведение реакции обратной транскрипции.

Для генов: для проведения реакции обратной транскрипции используют набор ImProm-II™ Reverse Transcription System (США). Перед проведением реакции обратной транскрипции концентрации РНК выравниваются в контрольных и экспериментальных образцах. Далее водный раствор РНК смешивают с гексапраймером Random 6 и реакционной смесью (буфер 5х, MgCl2 - 25mM, dNTP -10 mM, обратная транскриптаза) вышеупомянутого набора и проводят реакцию в термоциклере (ЗАО НПФ ДНК- Технология, Россия; ПРИЛОЖЕНИЕ 1).

Для микроРНК: для проведения реакции обратной транскрипции используют набор TaqMan™ MicroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems™, США). Перед проведением реакции обратной транскрипции концентрации РНК выравнивают в контрольных и экспериментальных образцах. ОТ-ПЦР проводят с использованием праймеров от Applied Biosystems (США) TaqMan® miR-NA Expression Assays в соответствии с инструкцией производителя. В качестве эндогенного контроля используют U 48. Реакцию проводят в термоциклере (Applied Biosystems™, США).

IV) Полимеразная цепная реакция в реальном времени (ПЦР РВ).

Для генов: для проведения реакции используют наборы фирмы Applied Biosystems: TaqMan® Gene Expression Master Mix (2-х кратная универсальная реакционная смесь для исследования уровня экспрессии генов методом ПЦР-РВ) и TaqMan® Gene Expression Assay (реакционная смесь праймеров и флюоресцентно-меченного олигонуклеотида) для каждого определяемого гена - FGFR2, VEGFR1 и NRP1 и гена контроля GAPDH.

Для каждого образца, составляют смесь общим объемом 20 мкл, содержащую: 1 мкл. TaqMan® Gene Expression Assay, 10 мкл. TaqMan ® Gene Expression Master Mix, 1,6 мкл. комплементарной ДНК, 7,4 мкл деионизированной воды. Полученную смесь встряхивают на вортексе и центрифугируют в течение 5 сек.

Для микроРНК: для проведения реакции использут наборы фирмы AppliedBiosystems: TaqMan® universalMasterMix (2-х кратная универсальная реакционная смесь для исследования уровня экспрессии генови микроРНК методом ПЦР-РВ) и TaqMan® miR-NAExpressionAssays (реакционная смесь праймеров и флюоресцентно-меченного олигонуклеотида) для каждой определяемой микроРНК-miR-34a, miR-146a,H miR-335 HmiR-590n эндогенного контроля U 48.

Для каждого образца, составляют смесь общим объемом 20 мкл, содержащую: 1 мкл. TaqMan® miR-NAExpression Assays, 10 мкл. TaqMan ® TaqMan® universalMasterMix, 4 мкл. соответствующей к ДНК, 5 мкл деионизированной воды. Полученную смесь встряхивают на вортексе и центрифугируют в течение 5 сек.

Амплификацию для генов и для микроРНК проводят в термоциклере StepOnePlus (AppliedBiosystems, США) в режиме:

50,0°С - 2 мин. - 1 цикл

95,0°С - 10 мин. - 1 цикл

Оптимальные критерии интерпретации результатов.

Все эксперименты по ПЦР в реальном времени проводят в трех независимых повторах. В качестве эндогенного контроля использоуют U48 (для микроРНК) и GAPDH (для генов). Расчет относительной экспрессии проводят с помощью программного обеспечения StepOneSoftware.

Четыре микроРНК (miR-34a, miR-146a, miR-335, miR-590 имеют статистически значимые отличия по уровню экспрессии между группами больных раком желудка с метастазами в лимфоузлы и без метастазов в лимфоузлы. Значения уровня экспрессии этих микроРНК ниже определенного критерия отсечения, свидетельствуют о развитии метастазов в лимфоузлах.

В случае, если значения уровня экспрессии не менее трех из этих микроРНК в образцах опухолевой ткани относительно нормальной ткани ниже пороговых значений, результаты проведенных измерений свидетельствуют в каждом из этих случаев, о развитии метастазов у больных с РЖ.

В соответствии с изложенным порядком реализации способа получены следующие результаты (примеры).

Частные примеры реализации операций вышеизложенного способа.

Парные образцы ткани слизистой желудка (опухоль и норма) были получены от больных раком желудка. После операции или биопсии образцы замораживались и хранились при температуре -70°С.

В исследование были включены образцы 28 больных с отдаленными метастазами (20 мужчин и 8 женщин), в возрасте от 29 до 87 лет. Рак желудка без отдаленных метастазов был у 25 пациентов (14 мужчин и 11 женщин), в возрасте от 39 до 80 лет. Поражение лимфоузлов имели 17 человек (без отдаленных метастазов). Основное число образцов опухоли было представлено аденокарциномой.

При определении экспрессии микроРНК в панели miR-34a/miR-146a/miR-335/miR-590 и при уровне экспрессии трех из четырех указанных микроРНК ниже порогового значения относительный риск (ОР) метастазирования рака желудка в лимфоузлы составил ОР = 22. Правильный результат получен в 91% случаев.

При определении риска отдаленного метастазирования использовали панель miR335/VR1/FGFR2. При уровне экспрессии двух из трех указанных маркеров - miR335 и FGFR2 ниже или VR1 выше порогового значения - относительный риск отдаленного метастазирования рака желудка составил RR = 7,1. Разработанная формула дает правильный результат в 94% случаев.

Примененный подход обеспечивает оптимальное сочетание надежности результата, чувствительности и специфичности метода. Вероятность ошибочного суждения о результате мала.

Пример 1

Во время хирургического вмешательства были получены образцы опухолевой и нормальной ткани желудка от 17 (включая 7 женщин и 10 мужчин в возрасте от 40 до 78 лет) с РЖ, метастазирующим в регионарные лимфоузлы. В этих образцах исследованы уровни экспрессии указанных выше микроРНК.

У восьми больных значения уровней экспрессии miR-34a, miR-146a и miR-335 понижены в опухолевой ткани относительно нормы более чем в 2,5; 1,25 и 3,3 раза соответственно. У двоих пациентов значения уровней экспрессии miR-34a, miR-146a, miR-335 и miR-590 понижены в опухолевой ткани относительно нормы более чем в 2,5; 1,25; 3,3 и 2,5 раза соответственно. Еще у одного больного miR-34a, miR-335 и miR-590 понижены в опухолевой ткани относительно нормы более чем в 2,5; 3,3 и 2,5 раза соответственно. У двоих пациентов значения уровней экспрессии miR-146a, miR-335 и miR-590 понижены в опухолевой ткани относительно нормы более чем в 1,25; 3,3 и 2,5 раза соответственно.

У двоих пациентов значения уровней экспрессии miR-146a и miR-335 понижены в опухолевой ткани относительно нормы более чем в 1,25 и 3,3 раза соответственно. Еще у двоих пациентов значения уровней экспрессии miR-34a и miR-146a понижены в опухолевой ткани относительно нормы более чем в 2,5 и 1,25; раза соответственно.

Для определения риска отдаленного метастазирования используется панель miR335/,VEGFR1/FGFR2. При уровне экспрессии двух из трех указанных маркеров - miR335 и FGFR2 ниже или VEGFR1 выше порогового значения - риск развития отдаленных метастазов при РЖ высокий.

Для отдаленного метастазирования неблагоприятным является развитие опухоли в том случае, если значения уровня экспрессии генов VEGFR1 в образцах опухолевой ткани превышают пороговые значения 0,5 относительно нормальной ткани, а уровни экспрессии гена FGFR2 и miR335 снижены: меньше 0,05 и 0,3, соответственно.

Таким образом, у 13 больных выборки понижены значения уровней экспрессии трех или всех четырех исследуемых микроРНК. Имеет место неблагоприятный прогноз риска метастазирования опухоли рака желудка в лимфоузлы.

Четыре пациента оказались в серой зоне (у них были понижены уровни экспрессии 2 из 4 микроРНК). Для этих пациентов требуется привлечение дополнительной информации при решении вопроса о прогнозе риска метастазирования опухоли рака желудка в лимфоузлы.

Пример 2.

Во время хирургического вмешательства были получены образцы опухолевой и нормальной ткани желудка от 12 (включая 6 женщин и 6 мужчин в возрасте от 52 до 80 лет) с РЖ, метастазирующим в регионарные лимфоузлы. В этих образцах исследованы уровни экспрессии указанных выше микроРНК.

У семерых пациентов значения уровней экспрессии miR-34a, miR-146a и miR-335 понижены в опухолевой ткани относительно нормы более чем в 2,5; 1,25 и 3,3 раза соответственно. У одного больного miR-34a, miR-146a и miR-590 понижены в опухолевой ткани относительно нормы в 3; 9 и 8 раз соответственно. У двоих пациентов значения уровней экспрессии miR-146a, miR-335 и miR-590 понижены в опухолевой ткани относительно нормы более чем в 1,25; 3,3 и 2,5 раза соответственно.

У одного пациента уровень экспрессии miR-590 понижен в опухолевой ткани относительно нормы в 3,5 раза. Еще у одного пациента значения уровней экспрессии miR-34a и miR-146a понижены в опухолевой ткани относительно нормы в 5 и 7 раза соответственно.

Для определения риска отдаленного метастазирования используется панель miR335/,VEGFR1/FGFR2. При уровне экспрессии двух из трех указанных маркеров - miR335 и FGFR2 ниже или VEGFR1 выше порогового значения - риск развития отдаленных метастазов при РЖ высокий.

Для отдаленного метастазирования неблагоприятным является развитие опухоли в том случае, если значения уровня экспрессии генов VEGFR1 в образцах опухолевой ткани превышают пороговые значения 0,5 относительно нормальной ткани, а уровни экспрессии гена FGFR2 и miR335 снижены: меньше 0,05 и 0,3, соответственно.

Таким образом, у 10 больных выборки понижены значения уровней экспрессии трех микроРНК. Имеет место неблагоприятный прогноз риска метастазирования опухоли рака желудка в лимфоузлы.

У двоих пациентов были снижены уровни экспрессии 2 и менее микроРНК. Для этих пациентов имеет место благоприятный прогноз риска метастазирования опухоли рака желудка в лимфоузлы.

Пример 3

Были исследованы образцы опухолевой и нормальной ткани желудка (биопсийный материал) от 20 больных (9 женщин и 11 мужчин в возрасте от 50 до 82 лет). В этих образцах определялись уровни экспрессии miR335 и генов VEGFR1, FGFR2.

У пятерых больных уровень экспрессии FGFR2 был значительно снижен (менее 0,05) или не определялся, VEGFR1 был повышен относительно нормы в 1,2 - 3,2 раза, miR335 понижен в 3 раза и более.

У троих пациентов VEGFR1 был повышен относительно нормы в 1,5 - 3,3 раза, miR-335 понижен в 3 раза и более. Уровень экспрессии гена FGFR2 составил 0,05 и менее.

У двоих больных уровень экспрессии VEGFRX был повышен в 1,9 и 3 раза, уровень экспрессии Уровень экспрессии FGFR2 был значительно снижен (менее 0,05) или не определялся. miR-335 был понижен более, чем в 3 раза и составил 0,25 и 0,18 соответственно.

Еще у двоих пациентов уровень экспрессии miR-335 был понижен в 5 и 9 раз, уровень экспрессии FGFR2 был значительно снижен (менее 0,05) или не определялся. VEGFR1 был повышен в 3 и 4 раза относительно нормы соответственно.

Все пациенты данной группы (12 человек) имели высокий риск развития отдаленных метастазов, согласно значениям данной панели.

По данным обследований этих 12 пациентов, у 11 больных были выявлены отдаленные метастазы, у одного больного отдаленных метастазов обнаружено не было.

У четверых пациентов уровень экспрессии FGFR2 составил 0,05 и более, уровень экспрессии VEGFR1 был понижен относительно нормы в 2 и более раза, miR335 был повышен относительно нормы в 2 и более раза.

У двоих пациентов уровень экспрессии miR-335 был понижен не более, чем в 2 раза и составил 0,8 и 0,6 соответственно. Уровень экспрессии FGFR2 составил 1,2 и 1,9 соответственно. Уровень экспрессии VEGFR1 был повышен в 1,5 и 1,8 раз соответственно,

Еще у двоих больных уровень экспрессии VEGFR1 был понижен в 5 и 7 раз соответственно, miR-335 был повышен в 4 и 4,5 раза соответственно, уровень экспрессии FGFR2 был значительно снижен (менее 0,05) или не определялся.

Для определения риска отдаленного метастазирования используется панель miR335/,VEGFR1/FGFR2. При уровне экспрессии двух из трех указанных маркеров -miR335 и FGFR2 ниже или VEGFR1 выше порогового значения - риск развития отдаленных метастазов при РЖ высокий.

Для отдаленного метастазирования неблагоприятным является развитие опухоли в том случае, если значения уровня экспрессии генов VEGFR1 в образцах опухолевой ткани превышают пороговые значения 0,5 относительно нормальной ткани, а уровни экспрессии гена FGFR2 и miR335 снижены: меньше 0,05 и 0,3, соответственно.

Для определения риска отдаленного метастазирования используется панель miR335/,VEGFR1/FGFR2. При уровне экспрессии двух из трех указанных маркеров - miR335 и FGFR2 ниже или VEGFR1 выше порогового значения - риск развития отдаленных метастазов при РЖ высокий.

Для отдаленного метастазирования неблагоприятным является развитие опухоли в том случае, если значения уровня экспрессии генов VEGFR1 в образцах опухолевой ткани превышают пороговые значения 0,5 относительно нормальной ткани, а уровни экспрессии гена FGFR2 и miR335 снижены: меньше 0,05 и 0,3, соответственно.

Таким образом, у всех восьми пациентов данной группы риск развития отдаленных метастазов невысокий, т.е. имеет место благоприятный прогноз риска метастазирования опухоли рака желудка в лимфоузлы.

По данным обследований 7 больных данной группы не имели отдаленных метастазов, у одного пациента были выявлены отдаленные метастазы.

Пример 4

Во время хирургического вмешательства были получены образцы опухолевой и нормальной ткани желудка от 19 (включая 8 женщин и 11 мужчин в возрасте от 48 до 76 лет) с РЖ, метастазирующим в регионарные лимфоузлы. В этих образцах исследованы уровни экспрессии указанных выше микроРНК.

У девяти больных значения уровней экспрессии miR-34a, miR-146a и miR-335 понижены в опухолевой ткани относительно нормы более чем в 2,55; 1,15 и 3,25 раза соответственно. У трех пациентов значения уровней экспрессии miR-34a, miR-146a, miR-335 и miR-590 понижены в опухолевой ткани относительно нормы более чем в 2,45; 1,35; 3,3 и 2,6 раза соответственно. Еще у одного больного miR-34a, miR-335 и miR-590 понижены в опухолевой ткани относительно нормы более чем в 2,25; 3,3 и 2,5 раза соответственно. У двоих пациентов значения уровней экспрессии miR-146a, miR-335 и miR-590 понижены в опухолевой ткани относительно нормы более чем в 1,45; 3,2 и 2,35 раза соответственно.

У двоих пациентов значения уровней экспрессии miR-146a и miR-335 понижены в опухолевой ткани относительно нормы более чем в 1,15 и 3,35 раза соответственно. Еще у двоих пациентов значения уровней экспрессии miR-34a и miR-146a понижены в опухолевой ткани относительно нормы более чем в 2,35 и 1,25; раза соответственно.

Для определения риска отдаленного метастазирования используется панель miR335/,VEGFR1/FGFR2. При уровне экспрессии двух из трех указанных маркеров - miR335 и FGFR2 ниже или VEGFR1 выше порогового значения - риск развития отдаленных метастазов при РЖ высокий.

Для отдаленного метастазирования неблагоприятным является развитие опухоли в том случае, если значения уровня экспрессии генов VEGFR1 в образцах опухолевой ткани превышают пороговые значения 0,5 относительно нормальной ткани, а уровни экспрессии гена FGFR2 и miR335 снижены: меньше 0,05 и 0,3, соответственно.

Таким образом, у 14 больных выборки понижены значения уровней экспрессии трех или всех четырех исследуемых микроРНК. Имеет место неблагоприятный прогноз риска метастазирования опухоли рака желудка в лимфоузлы.

Пять пациентов оказались в серой зоне (у них были понижены уровни экспрессии 2 из 4 микроРНК). В отношении этой группы пациентов имеет место благоприятный прогноз риска метастазирования опухоли рака желудка в лимфоузлы.

Пример 5.

Во время хирургического вмешательства были получены образцы опухолевой и нормальной ткани желудка от 16 (включая 8 женщин и 8 мужчин в возрасте от 44 до 77 лет) с РЖ, метастазирующим в регионарные лимфоузлы. В этих образцах исследованы уровни экспрессии указанных выше микроРНК.

У девяти пациентов значения уровней экспрессии miR-34a, miR-146a и miR-335 понижены в опухолевой ткани относительно нормы более чем в 2,5; 1,4 и 3,45 раза соответственно. У одного больного miR-34a, miR-146a и miR-590 понижены в опухолевой ткани относительно нормы в 4; 9 и 8 раз соответственно. У трех пациентов значения уровней экспрессии miR-146a, miR-335 и miR-590 понижены в опухолевой ткани относительно нормы более чем в 1,3; 3,4 и 2,5 раза соответственно.

У одного пациента уровень экспрессии miR-590 понижен в опухолевой ткани относительно нормы в 3,5 раза. Еще у одного пациента значения уровней экспрессии miR-34a и miR-146a понижены в опухолевой ткани относительно нормы в 6 и 7 раза соответственно.

Таким образом, у 14 больных выборки понижены значения уровней экспрессии трех микроРНК.

У двоих пациентов были снижены уровни экспрессии 2 микроРНК.

Таким образом, у 14 больных выборки понижены значения уровней экспрессии трех или всех четырех исследуемых микроРНК. Имеет место неблагоприятный прогноз риска метастазирования опухоли рака желудка в лимфоузлы.

Два пациента оказались в серой зоне (у них были понижены уровни экспрессии 2 из 4 микроРНК) Для этих пациентов требуется привлечение дополнительной информации при решении вопроса о прогнозе риска метастазирования опухоли рака желудка.

Пример 6

Были исследованы образцы опухолевой и нормальной ткани желудка (биопсийный материал) от 20 больных (9 женщин и 11 мужчин в возрасте от 50 до 82 лет). В этих образцах определялись уровни экспрессии miR335 и генов VEGFR1, FGFR2.

У пятерых больных уровень экспрессии FGFR2 был значительно снижен (менее 0,05) или не определялся, VEGFR1 был повышен относительно нормы в 1,2 - 3,2 раза, miR335 понижен в 3 раза и более.

У троих пациентов VEGFR1 был повышен относительно нормы в 1,5 - 3,3 раза, miR-335 понижен в 3 раза и более. Уровень экспрессии гена FGFR2 составил 0,05 и более.

У двоих больных уровень экспрессии VEGFR1 был повышен в 1,9 и 3 раза, уровень экспрессии Уровень экспрессии FGFR2 был значительно снижен (менее 0,05) или не определялся. miR-335 был понижен не более, чем в 2 раза и составил 0,7 и 0,9 соответственно.

Еще у двоих пациентов уровень экспрессии miR-335 был понижен в 5 и 9 раз, уровень экспрессии FGFR2 был значительно снижен (менее 0,05) или не определялся. VEGFR1 был понижен в 3 и 4 раза относительно нормы соответственно.

Все пациенты данной группы (12 человек) имели высокий риск развития отдаленных метастазов, согласно значениям данной панели.

По данным обследований этих 12 пациентов, у 11 больных были выявлены отдаленные метастазы, у одного больного отдаленных метастазов обнаружено не было.

У четверых пациентов уровень экспрессии FGFR2 составил 0,05 и более, уровень экспрессии VEGFR1 был понижен относительно нормы в 2 и более раза, miR335 был повышен относительно нормы в 2 и более раза.

У двоих пациентов уровень экспрессии miR-335 был понижен не более, чем в 2 раза и составил 0,8 и 0,6 соответственно. Уровень экспрессии FGFR2 составил 1,2 и 1,9 соответственно. Уровень экспрессии VEGFR1 был повышен в 1,5 и 1,8 раз соответственно.

Еще у двоих больных уровень экспрессии VEGFR1 был понижен в 6 и 7 раз соответственно, miR-335 был повышен в 3,9 и 4,5 раза соответственно, уровень экспрессии FGFR2 был значительно снижен (менее 0,05) или не определялся.

Для определения риска отдаленного метастазирования используется панель miR335/,VEGFR1/FGFR2. При уровне экспрессии двух из трех указанных маркеров - miR335 и FGFR2 ниже или VEGFR1 выше порогового значения - риск развития отдаленных метастазов при РЖ высокий.

Для отдаленного метастазирования неблагоприятным является развитие опухоли в том случае, если значения уровня экспрессии генов VEGFR1 в образцах опухолевой ткани превышают пороговые значения 0,5 относительно нормальной ткани, а уровни экспрессии гена FGFR2 и miR335 снижены: меньше 0,05 и 0,3, соответственно.

Таким образом, у всех восьми пациентов данной группы риск развития отдаленных метастазов невысокий.

По данным обследований 7 больных данной группы не имели отдаленных метастазов, у одного пациента были выявлены отдаленные метастазы.

Приведенными примерами 1-6 подтверждено, что примененный подход обеспечивает наиболее эффективное сочетание надежности результата, чувствительности и специфичности метода. Только единичные ответы были ложноположительными, или ложноотрицательными и три были определены, как относящиеся к серой зоне и нуждающиеся в дальнейших исследованиях.

Как показали исследования, если положительный сигнал дают хотя бы три гена, вероятность ошибочного суждения о результате мала и может быть оценена, на основании показателей чувствительности и специфичности для отдельных генов панели, как не превышающая 0,007. Чувствительность и специфичность способа составили 86,3%. Без учета серой зоны чувствительность и специфичность составляют 93,5%.

Использование предлагаемого способа на разных стадиях развития рака желудка позволяет оперативно и с минимальной трудоемкостью сделать достоверный прогноз выживаемости для большинства больных раком желудка. В результате обеспечено увеличение производительности и эффективности исследований для прогнозирования выживаемости и обоснованного выбора тактики лечения больных раком желудка.

Таким образом, приведенные примеры подтверждают, что с помощью заявленного способа реализуется надежное прогнозирование отдаленных метастазов рака желудка, благодаря созданию панели микроРНК и генов для прогнозирования метастазирования рака желудка.

Технический результат, обеспечивающий разрешение указанной проблемы заключается в расширении возможностей и достоверности прогнозирования за счет исследования экспрессии микроРНК и генов.

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ прогноза метастазирования опухолей рака желудка, включающий стадии получения образцов тканей опухоли рака желудка и нормальной слизистой ткани желудка, выполнение обратной транскрипции микроРНК из группы miR-34a, miR-146a, miR-335 и miR-590 и мРНК группы генов VEGFR1, VEGFR2, NRP1, определение уровней экспрессии вышеперечисленных микроНРК и мРНК, сравнение уровней экспрессии вышеперечисленных микроРНК и мРНК относительно нормальной слизистой ткани желудка и произведение определения прогноза риска метастазирования опухоли рака желудка. Технический результат изобретения заключается в расширении возможностей прогнозирования отдаленных метастазов рака желудка и повышении достоверности этого прогнозирования за счет исследования экспрессии микроРНК и генов. 7 з.п. ф-лы, 2 ил., 6 табл., 6 пр.

1. Способ прогноза метастазирования опухолей рака желудка, при котором:

- получают образцы ткани опухоли рака желудка и нормальной слизистой ткани желудка пациента, проводят выделение РНК из образцов для чего выполняют лизирование ткани, фенольную экстракцию, доочистку на колонке, проверку концентрации суммарной РНК и определяют отношение поглощения на длинах волн 260 нм и 280 нм,

- образцы для определения экспрессии группы микроРНК: miR-34a, miR-146a, miR-335 и miR-590 и мРНК группы генов: VEGFR1, VEGFR2, NRP1, выбирают из условия, что отношение поглощения на длинах волн 260 нм и 280 нм составляет >1,9, отношение поглощения на длинах волн 260 нм и 230 нм >1,8, выравнивают концентрацию суммарной РНК до 50 нг/мкл;

- выполняют обратную транскрипцию микроРНК из группы miR-34a, miR-146a, miR-335 и miR-590 и мРНК группы генов VEGFR1, VEGFR2, NRP1, полученную ДНК используют для определения уровней экспрессии микроРНК miR-34a, miR-146a, miR-335 и miR-590 и экспрессии мРНК генов VEGFR1, VEGFR2, NRP1, в опухолевой ткани относительно нормальной слизистой ткани желудка, методом ПЦР в реальном времени,

- выполняют сравнение уровней экспрессии микроРНК miR-34a, miR-146a, miR-335 и miR-590 в опухолевой ткани относительно нормальной слизистой ткани желудка, используя полученные ROC-анализом пороговые значения 0,4; 0,8; 0,3 и 0,4 для микроРНК miR-34a, miR-146a, miR-335 и miR-590, соответственно

- выполняют сравнение уровней экспрессии мРНК генов VEGFR1, VEGFR2, NRP1 в опухолевой ткани относительно нормальной слизистой ткани желудка используя полученные ROC-анализом пороговые значения экспрессии мРНК указанных генов, который для гена VEGFR1 составляет 0.5, а для генов FGFR2 и NRP1 составляют 0,05 и 0.97, соответственно,

- по результатам сравнения с пороговыми значениями выявленных уровней экспрессии микроРНК miR-34a, miR-146a, miR-335 и miR-590 и экспрессии мРНК генов VEGFR1, VEGFR2, NRP1 в опухолевой ткани относительно нормальной слизистой ткани желудка производят определения прогноза риска метастазирования опухоли рака желудка, исходя из следующих признаков:

- неблагоприятный прогноз риска метастазирования опухоли рака желудка в лимфатические узлы ассоциирован с экспрессией любых трех из микроРНК miR-34a, miR-146a, miR-335 и miR-590 в образцах опухолевой ткани относительно нормальной слизистой ткани желудка ниже порогового значения;

- неблагоприятный прогноз риска метастазирования рака желудка в том случае, когда значения уровня экспрессии miR335 и FGFR2 ниже, а VEGFR1 - выше пороговых значений в образцах опухолевой ткани относительно нормальной слизистой ткани желудка.

2. Способ прогноза метастазирования опухолей рака желудка по п.1, отличающийся тем, что исследуют образцы больных раком желудка без метастазов в лимфатические узлы.

3. Способ прогноза метастазирования опухолей рака желудка по п.1, отличающийся тем, что исследуют образцы больных раком желудка с наличием метастазов в лимфатических узлах и больных раком желудка с отдаленными метастазами.

4. Способ прогноза метастазирования опухолей рака желудка по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что образцы опухолей рака желудка и нормальной ткани желудка получают во время хирургических операций или путем биопсии, а после забора образцы сразу замораживают и хранят при температуре минус 70°С, при этом берут для исследования не менее 30 нг выделенной ДНК.

5. Способ прогноза метастазирования опухолей рака желудка по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что количественную ПЦР в реальном времени в парных образцах опухоль – норма производят троекратно.

6. Способ прогноза метастазирования опухолей рака желудка по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что наличие и качество РНК в образцах проверяют, используя электрофорез в 1,8% агарозном геле, качественными считают образцы РНК, демонстрирующие четкие полосы 18S и 28S РНК, без детектируемой электрофоретически примеси ДНК.

7. Способ прогноза метастазирования опухолей рака желудка по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что концентрацию раствора РНК определяют троекратно на спектрофотометре, а количественное определение экспрессии микроРНК осуществляют троекратно с использованием полимеразной цепной реакции в реальном времени.

8. Способ прогноза метастазирования опухолей рака желудка по п.1, отличающийся тем, что при статистической обработке результатов уровень значимости для выявленных различий принимают равным менее 0,05.