Способ для прогноза метастазирования рака молочной железы на основе набора генов длинных некодирующих РНК Российский патент 2023 года по МПК C12Q1/68 

Настоящее изобретение относится к области фундаментальной медицины, и касается способа прогноза метастазирования рака молочной железы (РМЖ) с помощью оценки статуса метилирования набора генов длинных некодирующих РНК (днРНК), а именно: HAND2-AS1, KCNK15-AS1, MAGI2-AS3, SSTR5-AS1 и SNHG6. Заявленный способ основан на анализе метилирования набора из пяти генов днРНК и позволяет прогнозировать развитие метастазов РМЖ с 82%-ой специфичностью, 81%-ой чувствительностью и высокой достоверностью (AUC=0.9). Для оценки прогноза метастазирования у пациенток с РМЖ с указанной точностью необходимо выявление метилирования не менее двух любых генов данного набора в ДНК, выделенной из ткани молочной железы.

Несмотря на многочисленные успехи в диагностике и лечении РМЖ, данный вид опухоли по данным статистики остается наиболее распространенным в онкологии заболеванием среди женщин. Так, по последним оценкам экспертов в 2021 году в России зарегистрировано около 2,6 миллиона новых случаев РМЖ, что составляет 18,3% от общего числа случаев рака. Также, по данным статистики GLOBOCAN, РМЖ занимает лидирующие позиции по заболеваемости и смертности в большинстве других стран мира. Основная сложность терапии данного вида онкологии заключается в его гетерогенности, в том числе и на молекулярном уровне. Тем не менее, оценка процессов эпигенетической регуляции множества задействованных молекулярных путей может дать подход к открытию новых маркеров и терапевтических мишеней. Развитие методов и технологий геномного анализа позволило в значительной мере оценить перспективы некодирующих РНК, включая микроРНК и днРНК, в регуляции опухоль ассоциированных белок-кодирующих генов, включая роль метилирования данных генов в злокачественной трансформации, что определяет их клинический потенциал.

Нами ВПЕРВЫЕ в образцах ДНК опухолей больных РМЖ с метастазами обнаружен статистически значимо (р<0.001) повышенный уровень метилирования 5 генов днРНК (HAND2-AS1, KCNK15-AS1, MAGI2-AS3, SEMA3B-AS1, SSTR5-AS1) относительно ДНК опухолей больных РМЖ без метастазов. На основе этих 5 генов (HAND2-AS1, KCNK15-AS1, MAGI2-AS3, SEMA3B-AS1, SSTR5-AS1) составлен НОВЫЙ набор маркеров и разработан способ для прогноза метастазирования РМЖ с высокой специфичностью и чувствительностью на основе биопсии или резекционного материала пациенток.

По состоянию на данный момент имеется сообщение, касающееся метилирования в опухолях больных РМЖ хозяйского гена днРНК MAGI2-AS3 - MAGI2 среди этих 5 генов [1]. Имеется также Заявка на изобретение [Рег. №2022121163], в которой сообщено о повышенном статусе метилирования генов (HAND2-AS1, KCNK15-AS1 и PLUT) в опухолях больных РМЖ относительно тканей молочной железы от пост-мортальных лиц, умерших без онкопатологии, и возможности применения этих данных для диагностики РМЖ [2]. Данные о различии уровней метилирования 5 отобранных генов (HAND2-AS1, KCNK15-AS1, MAGI2-AS3, SEMA3B-AS1, SSTR5-AS1) в опухолях больных РМЖ с метастазами и без метастазов отсутствуют в каких-либо источниках информации.

Согласно данным мировых исследований ранее имелись публикации по разработке способов прогнозирования развития метастазов РМЖ. Так, в исследовании [3] проведен отбор ряда дифференциально экспрессируемых днРНК и отмечена их потенциальная возможность как маркеров метастазирования.

Есть работа, в которой описан потенциал эпигенетических маркеров на примере ряда микроРНК и днРНК для прогнозирования неблагоприятного развития и дальнейшей прогрессии РМЖ [4]. В работе приводится ряд маркеров, который, по мнению авторов потенциально может быть использован в составлении прогноза прогрессии РМЖ. В целом работа представляет собой результат биоинформатической оценки эпигенетических маркеров с неизвестным уровнем чувствительности и специфичности. В итоговую таблицу вошло более 30 различных маркеров, полученных в результате эпигеномного анализа.

Согласно более ранней патентной заявке европейских ученых WO 2016/135168 2016.09.01 (2016), исследователям удалось выделить две панели маркеров, основанных на определении статуса метилирования и/или уровня экспрессии ряда генов, кодирующих белки и определении группы маркеров микроРНК в РМЖ и других видах рака. Данные панели, согласно авторам, должны работать вместе, что потенциально снижает эффективность выявления точной комбинации маркеров, необходимой для оценки качественной тактики лечения. Кроме того, методология патента не позволяет оценить метастатический потенциал опухоли у пациента. Тем не менее, одна из панелей имеет высокие (0,89) показатели специфичности и чувствительности диагностики и/или возможной прогрессии любого рака, в частности РМЖ [5].

В более раннем патенте WO 2012/045905 A3 (2012) представлен способ комплексной оценки прогрессии опухоли молочной железы с образованием метастазов по уровню изменения экспрессии одного гена c-MAF. Согласно заключению авторов патента, данная модель наиболее применима для определения изменений в рецептор - зависимых типах РМЖ. Кроме того, система не содержит данных по чувствительности и специфичности, что не позволяет в полной мере оценить рабочий потенциал модели [6].

В патенте WO 2021/170777 А1 (2021) авторы изучили возможности применения межгенной днРНК LINC01087 не только для диагностики, но и для прогноза и лечения РМЖ. По мнению авторов работы, существенное снижение уровня экспрессии LINC01087 при трижды негативном подтипе РМЖ может рассматриваться как фактор неблагоприятного прогноза течения заболевания, позволяющий выявить более агрессивный фенотип на более ранних этапах. К сожалению, данный маркер не позволяет оценить потенциал метастазирования для любого типа РМЖ и не может дать точной картины прогноза течения заболевания для люминального фенотипа опухоли [7].

Наиболее похожими по специфике аналогами могут считаться два патента. Один из них [6] рассмотрен нами выше. Другой патент WO 2017/ 095213 А1 рассматривает в качестве метода оценки прогрессии опухоли профиль изменения экспрессии ряда микроРНК. Однако проект ограничивает прогноз течения РМЖ показателем выживаемости и не может использоваться в широком спектре случаев [8].

Задача заявляемого изобретения - расширить возможности методов прогноза метастазирования РМЖ с помощью применения новых маркеров на основе группы генов днРНК.

Задача решена путем:

- разработки заявляемого способа для прогноза метастазирования РМЖ на основе анализа уровня метилирования набора из пяти генов днРНК (HAND2-AS1, KCNK15-AS1, MAGI2-AS3, SSTR5-AS1 и SNHG6) в биопсийных или резекционных образцах опухолей больных РМЖ и позволяющего оценить прогноз развития метастазов с высокой точностью, с помощью выявления метилирования у двух или более генов из этого набора

Прогноз метастазирования РМЖ осуществляют по методу:

Собирают образцы ткани опухоли молочной железы и прилежащей, гистологически неизмененной ткани у лиц, с выявленным онкологическим заболеванием. Выделение и очистку ДНК из образцов ткани молочной железы проводят методом фенол-хлороформенной экстракции. Качество и точную концентрацию ДНК определяют спектрофотометрически по соотношению оптической плотности при длинах волн 260 и 280 нм. Анализ уровня метилирования генов днРНК проводят с применением бисульфитной конверсии ДНК и количественной метил-специфичной ПЦР (qMSP) с детекцией в реальном времени, как описано в работе [9].

Для оценки значимости различий применяют непараметрический критерий Манна-Уитни. Различия считают значимыми при р<0.05. Расчеты проводят в системе для статистического анализа данных IBM SPSS Statistics 22. При оценке значимости различий в уровне метилирования учитывают пороговый уровень, рассчитанный на основании данных по уровню метилирования каждого гена в образцах РМЖ без метастазов [10]. Затем по этим значениям отбирают образцы опухоли РМЖ с уровнем метилирования выше порога, рассчитанного для каждого гена. Далее сравнивают образцы опухолей от больных с метастазами и без метастазов. И методом ROC-анализа определяют набор маркеров, позволяющих наиболее значимо различить пациентов с метастазами и без метастазов. С помощью ROC-анализа рассчитывают также специфичность, чувствительность и значение AUC (Area Under Curve) для набора маркеров и для характеристики ЗАЯВЛЯЕМОГО способа прогноза метастазирования больных РМЖ.

На Фиг. 1 изображена система из пяти маркеров (HAND2-AS1, KCNK15-AS1, MAGI2-AS3, SSTR5-AS1, SNHG6) для прогноза образования метастазов у больных РМЖ с чувствительностью 80,5% и специфичностью 81,6% (AUC=0,896), составленная методом ROC-анализа. Примечание: уровень значимости р<0,0001.

Пример 1. Анализ уровня метилирования пяти генов днРНК HAND2-AS1, KCNK15-AS1, MAGI2-AS3, SSTR5-AS1 и SNHG6, используемых в заявляемом способе для прогноза метастазирования РМЖ.

Статус метилирования каждого гена оценивают с использованием двух пар праймеров, специфичных как к метилированному, так и к неметилированному аллелю (Таблица 1). Используют набор реактивов «qPCRmix-HS SYBR» по протоколу фирмы Евроген. Амплификацию проводят в системе Bio-Rad CFX96 Real-Time PCR Detection System (США) в соответствии с прилагаемым к прибору протоколом. Полноту конверсии ДНК определяют с помощью контрольного локуса АСТВ с использованием олигонуклеотидов специфичных к неконвертированной матрице [9]. Для сравнительного анализа эффективности амплификации также применяют локус АСТВ с использованием олигонуклеотидов, специфичных к конвертированной матрице. В качестве контролей для неметилированных аллелей используют коммерческий препарат ДНК #G1471 (Promega, США). В качестве позитивного контроля 100%-ого метилирования используют коммерческий препарат ДНК #SD1131 (Thermo Scientific, США). Соотношение уровней метилирования и их значимость оценивают с применением непараметрического критерия Манна-Уитни. Различия считают значимыми при р<0.001. Уровень метилирования пяти генов днРНК HAND2-AS1, KCNK15-AS1, MAGI2-AS3, SSTR5-AS1 и SNHG6 определен в 41 образце РМЖ с метастазами и в 39 образцах РМЖ без метастазов (Таблица 2).

Пример 2. Оценка различий статуса метилирования пяти генов днРНК HAND2-AS1, KCNK15-AS1, MAGI2-AS3, SSTR5-AS1 и SNHG6 с учетом порогового уровня в образцах опухоли с метастазами и без.

Для выявления различий гиперметилирования исследуемых генов днРНК HAND2-AS1, KCNK15-AS1, MAGI2-AS3, SSTR5-AS1 и SNHG6 в опухоли с метастазами и без них был выбран пороговый уровень, который рассчитывался для каждого гена на основании данных, полученных для образцов без метастазов (табл. 2). Пороговый уровень равен N(mean) + 2SD, где N(mean) - средний уровень метилирования в выборке (образцы без метастазов), SD - стандартное отклонение [10]. Оценка статуса метилирования генов в клинических образцах РМЖ с метастазами и без них с учетом порогового уровня дана в Таблице 3.

Пример 3. Оценка чувствительности и специфичности заявляемого способа для прогноза образования метастазов РМЖ на основе набора маркеров (HAND2-AS1, KCNK15-AS1, MAGI2-AS3, SSTR5-AS1 и SNHG6) с применением ROC-анализа.

Важным свойством заявляемого способа для прогноза образования метастазов при РМЖ является высокая специфичность относительно ложноположительных случаев и высокая чувствительность. С учетом данных по статусу метилирования пяти генов (HAND2-AS1, KCNK15-AS1, MAGI2-AS3, SSTR5-AS1 и SNHG6) в образцах пациенток с РМЖ, из которых 41 образец имеет метастазы, а 38 не имеет (табл. 2), проведен анализ характеристик набора маркеров методом ROC-анализа, как показано на Рисунке. Согласно результатам ROC-анализа, чувствительность и специфичность заявляемого способа для прогноза образования метастазов при РМЖ, составили 80.5% и 81,6%, соответственно, а величина AUC (Area Under the ROC Curve) составила 0,896 (~0,9), что считается показателем высокой точности для набора маркеров. Таким образом, заявляемый способ позволяет осуществить прогноз образования метастазов у пациенток с РМЖ с 81%-ой чувствительностью и 82%-ой специфичностью. Согласно параметрам, оценивающим набор маркеров (в частности, критерий >0,2), необходимо и достаточно выявления метилирования двух любых маркерных генов из пяти маркеров данного набора для прогноза возникновения метастазов у больной РМЖ с указанной точностью.

Заявляемый способ для прогноза образования метастазов у больных РМЖ характеризуются тем, что

- Позволяет прогнозировать развитие метастазов у больных РМЖ с высокой чувствительностью (81%) и специфичностью (82%) при величине AUC=0.9. Рассмотренные ближайшие аналоги (WO 2012/045905 A3 (2012), WO 2017/095213 А1) не позволяют в полной мере оценить метастатический потенциал РМЖ, в особенности учитывая гетерогенный характер этого вида рака. Эти работы рассматривают очень узкий диапазон применимости выбранных авторами маркеров. Кроме того, информация о чувствительности и специфичности методов отсутствует [6, 8].

Цитированные источники научно-технической информации:

1. Xu X, Yuan X, Ni J, Guo J, Gao Y, Yin W, Li F, Wei L, Zhang J. MAGI2-AS3 inhibits breast cancer by downregulating DNA methylation of MAGE. J Cell Physiol. 2021;236(2):1116-1130. doi: 10.1002/jcp.29922. PMID: 32730644.

2. Заявка на патент на изобретение, регистрационный №2022121163 от 03.08.2022. Филиппова Е.А. и др. «Способ для диагностирования рака молочной железы на основе набора генов длинных некодирующих РНК».

3. Zhang K, Luo Z, Zhang Y, Song X, Zhang L, Wu L, Liu J. Long non-coding RNAs as novel biomarkers for breast cancer invasion and metastasis. Oncol Lett. 2017;14(2):1895-1904. doi: 10.3892/ol.2017.6462. PMID: 28789424;

4. Sobhani, N.; Chahwan, R.; Roudi, R.; Morris, R.; Volinia, S.; Chai, D.; D'Angelo, A.; Generali, D. Predictive and Prognostic Value of Non-Coding RNA in Breast Cancer. Cancers 2022, 14, 2952. https://doi.org/10.3390/cancers14122952. PMID: 35740618

5. WO 2016/135168 2016.09.01 (2016). Burwinkel Barbara et. al. Biomarker panel for the detection of cancer.

6. WO 2012/045905 A3 (2012) Gomis Cabre Roger et al. Methods for the diagnosis, prognosis and treatment of breast cancer metastasis.

7. WO 2021/170777 A1 (2021). Maiuri Chiara et al. Methods for diagnosing, prognosing and managing treatment of breast cancer.

8. WO 2017/ 095213 A1 Melendez Zajgla J. et. al. Method for prognosis in breast cancer.

9. Hattermann K., Mehdorn H.M., Mentlein R., Schultka S., Held-Feindt J. A methylation-specific and SYBR-green-based quantitative polymerase chain reaction technique for 06-methylguanine DNA methyltransferase promoter methylation analysis. Analytical Biochemistry. 2008. Vol.377, N 1, 62-71. doi 10.1016/j.ab.2008.03.014. PMID: 18384736

10. Lehmann U, Berg-Ribbe I, Wingen LU, Brakensiek K, Becker T, Klempnauer J, Schlegelberger B, Kreipe H, Flemming P. Distinct methylation patterns of benign and malignant liver tumors revealed by quantitative methylation profiling. Clin Cancer Res. 2005;11(10):3654-60. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-04-2462. PMID: 1589756

Изобретение относится к молекулярной биологии. Описан способ для прогноза метастазирования рака молочной железы на основе группы генов длинных некодирующих РНК путем выявления метилирования любых двух маркеров из пяти, согласно изобретению маркерами являются гены: HAND2-AS1, KCNK15-AS1, MAGI2-AS3, SSTR5-AS1 и SNHG6. Заявляемый способ позволяет осуществить прогноз образования метастазов при раке молочной железы с высокой специфичностью и чувствительностью. 1 ил., 3 табл., 3 пр.

Способ составления прогноза метастазирования рака молочной железы на основе группы генов длинных некодирующих РНК путем выявления метилирования любых двух маркеров из пяти, отличающийся тем, что маркерами являются гены HAND2-AS1, KCNK15-AS1, MAGI2-AS3, SSTR5-AS1 и SNHG6.