СИСТЕМА И СПОСОБ СТРУКТУРИРОВАНИЯ ПОДЛОЖЕК ПРОТОЧНЫХ КЮВЕТ Российский патент 2024 года по МПК B01J19/00 

ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА СМЕЖНЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] Данная заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке на патент США № 62/884 753, поданной 9 августа 2019 г., и заявке на патент Нидерландов № 2023679, поданной 21 августа 2019 г. каждая из которых полностью включена в настоящий документ путем ссылки.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0002] Изготовление подложек для нанолунок, используемых в промышленных процессах, таких как секвенирование путем синтеза, может включать в себя сложный процесс, включающий функционализацию поверхности микроструйного устройства, такого как, например, проточная кювета, в которой находятся подложки для нанолунок или которая иным образом содержит их. В некоторых примерах особенно сложный аспект изготовления подложки для нанолунок включает в себя удаление существующих поверхностных химических веществ, обнаруженных в промежуточных областях между нанолунками, путем полировки этих промежуточных пространств. К проблемам, связанным с подготовкой поверхности этого типа, относятся избыточная полировка, недостаточная полировка и царапанье или повреждение структурированных поверхностей. Соответственно, существует потребность в способе изготовления подложек нанолунок, которые не имеют вышеуказанных сложностей и трудностей.

ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0003] Ниже представлено изложение сущности некоторых примеров. Данное изложение сущности изобретения не является широким обзором и не предназначено для определения ключевых или критически важных аспектов или элементов настоящего изобретения или для определения объема его патентной охраны.

[0004] Преимущества вариантов реализации описанной системы и способов заключаются в возможности пространственного разделения химического структурирования наноразмерных элементов внутри микроструйных устройств, таких как проточные кюветы, и улучшении изготовления подложки нанолунок за счет полного устранения этапа полирования. В описанных способах используются плоские волноводы или аналогичные устройства для пространственного контроля химической функционализации конкретных предварительно заданных областей для каждой подложки нанолунки, изготовленной в проточной кювете. Подложки нанолунок структурируют в микроструйные проточные кюветы с использованием известных процессов изготовления проточной кюветы. Плоский волновод направляет возбуждающий свет только в нижнюю часть каждой подложки нанолунки, где он фотоинициирует химическую реакцию, которая ковалентно связывает реагент-мишень с нижней частью нанолуночной подложки. Непрореагировавшие молекулы удаляются на стадии промывки, которая следует за фотоинициацией, без какого-либо неблагоприятного воздействия на структурированные поверхности проточной кюветы. В некоторых вариантах реализации в описанной системе и способах применяют те же источники света, которые используются в процессе секвенирования методом синтеза, и определенные системы фотоинициирования, чувствительные к синему свету (например, с длиной волны 470 нм).

[0005] В соответствии с одним вариантом реализации предлагается первый способ структурирования подложки проточной кюветы. Этот способ включает подготовку проточной кюветы к фотоинициированной химической реакции, причем проточная кювета включает в себя подложку, на которой находятся решетки для ввода излучения; первый слой материала, расположенный над подложкой; второй слой материала, расположенный над первым слоем материала; и нанолунки, образованные во втором слое материала, причем каждая нанолунка включает верхнюю часть и нижнюю часть; при этом подготовка проточной кюветы включает силанизацию второго слоя материала; и покрытие первой группой реагентов силанизированного второго слоя материала и нанолунок; введение второй группы реагентов в нанолунки, причем вторая группа реагентов включает по меньшей мере один реагент-мишень, хелатированный медью лиганд и систему светочувствительного фотоинициатора; и направление света внутрь проточной кюветы через решетки для ввода излучения только на нижнюю часть каждой нанолунки для фотоинициирования химической реакции между первой и второй группами реагентов, причем инициированная светом химическая реакция ковалентно связывает реагент-мишень только с нижней частью каждой нанолунки. В некоторых примерах способ дополнительно включает вымывание непрореагировавших реагентов из нанолунок; использование полимерных и азидных компонентов, которые связываются с полимером как первая группа реагентов; использование поли(N-(5-азидоацетамидилпентил)акриламида в качестве полимера; использование камфорхинон-аминной фотосенсибилизирующей системы в качестве светочувствительного фотоинициатора с применением излучения с длиной волны около 470 нм; использование праймера, связанного с алкином, в качестве реагента-мишени; использование флуорофора, связанного с алкином, в качестве реагента-мишени; использование лазера в качестве источника света; и использование материала с показателем преломления от 1,0 до 1,3 для подложки и материала с показателем преломления от 2,0 до 2,15 для первого слоя, хотя возможны и другие значения.

[0006] В соответствии с другим вариантом реализации предлагается второй способ структурирования подложек проточных кювет. Этот способ включает в себя изготовление проточной кюветы с плоским волноводом путем формирования слоя решеток для ввода излучения на стеклянной подложке; нанесение среднего слоя на слой решеток для ввода излучения; нанесение покровного слоя на средний слой; и формирование подложек нанолунок в покровном слое, причем каждая подложка нанолунки включает в себя верхнюю часть и нижнюю часть, а подложки нанолунки образуют между собой промежуточные области; силанизацию покровного слоя; покрытие первой группой реагентов силанизированного покровного слоя и подложек нанолунок; введение второй группы реагентов в подложки нанолунок, причем вторая группа реагентов включает по меньшей мере один реагент-мишень, хелатированный медью лиганд и систему светочувствительного фотоинициатора; направление света внутрь проточной кюветы с плоским волноводом через решетки для ввода излучения только к нижней части каждой подложки нанолунки для фотоинициирования химической реакции между первой и второй группами реагентов, причем фотоинициированная химическая реакция ковалентно связывает реагент-мишень только с нижней частью каждой подложки нанолунки. В некоторых примерах способ дополнительно включает вымывание непрореагировавших реагентов из нанолунок; использование полимерных и азидных компонентов, которые связываются с полимером как первая группа реагентов; использование поли(N-(5-азидоацетамидилпентил)акриламида в качестве полимера; использование камфорхинон-аминной фотосенсибилизирующей системы в качестве светочувствительного фотоинициатора с применением излучения с длиной волны около 470 нм; использование праймера, связанного с алкином, в качестве реагента-мишени; использование флуорофора, связанного с алкином, в качестве реагента-мишени; использование лазера в качестве источника света; и использование материала с показателем преломления от 1,0 до 1,3 для слоя решеток, вводящих излучение, и материала с показателем преломления от 2,0 до 2,15 для среднего слоя, хотя возможны и другие значения.

[0007] В еще одном варианте осуществления предлагается третий способ структурирования подложки проточной кюветы. Этот способ включает в себя изготовление проточной кюветы с плоским волноводом путем формирования слоя решеток для ввода излучения на стеклянной подложке; нанесение среднего слоя на слой решеток для ввода излучения; нанесение покровного слоя на средний слой; и формирование подложек нанолунок в покровном слое, причем каждая подложка нанолунки включает в себя верхнюю часть и нижнюю часть, а подложки нанолунки образуют между собой промежуточные области; и силанизацию покровного слоя; покрытие покровного слоя и подложек нанолунок первой группой реагентов, причем первая группа реагентов дополнительно включает в себя полимер, азидные фрагменты, связанные с полимером, медь-содержащий лиганд и систему светочувствительного фотоинициатора; направление света с заданной длиной волны внутрь проточной кюветы с плоским волноводом только на нижнюю часть каждой подложки нанолунки для фотоинициирования химической реакции между реагентами в первой группе реагентов, причем фотоинициированная химическая реакция ковалентно связывает полимер только с нижней частью каждой подложки нанолунки; введение второй группы реагентов в подложки нанолунок, причем вторая группа реагентов включает по меньшей мере один реагент-мишень, медь-содержащий лиганд и систему светочувствительного фотоинициатора; и направление света с заданной длиной волны внутрь проточной кюветы с плоским волноводом только на нижнюю часть каждой подложки нанолунки для фотоинициирования химической реакции между ковалентно связанным полимером и второй группой реагентов, причем фотоинициированная химическая реакция ковалентно связывает реагент-мишень только с нижней частью подложки каждой нанолунки. В некоторых примерах способ дополнительно включает вымывание непрореагировавших реагентов из подложек нанолунок после каждой фотоинициированной химической реакции; использование 3-азидпропилтриметоксисилана для силанизации покровного слоя; использование поли(N-(5-азидоацетамидилпентил)акриламида в качестве полимера; использование камфорхинон-аминной фотосенсибилизирующей системы в качестве светочувствительного фотоинициатора с применением излучения с длиной волны около 470 нм; использование праймера, связанного с алкином, в качестве реагента-мишени; использование флуорофора, связанного с алкином, в качестве реагента-мишени; использование лазера в качестве источника света; и использование материала с показателем преломления от 1,0 до 1,3 для слоя решеток, вводящих излучение, и материала с показателем преломления от 2,0 до 2,15 для среднего слоя, хотя возможны и другие значения.

[0008] В другом варианте реализации способы, описанные в данном документе, включают силанизацию, проводимую путем осаждения норборненсилана из паровой фазы. В одном примере поли(N-(5-азидоацетамидилпентил)акриламид наносят методом центрифугирования на силанизированный слой при помощи следующей процедуры: Стадия 1-600 об/мин, 5 секунд, ускорение 1500 об/мин/с; Стадия 2-1500 об/мин, 30 секунд, ускорение 5000 об/мин/с; Стадия 3-4000 об/мин, 5 секунд, ускорение 5000 об/мин/с; Стадия 4-600 об/мин, 5 секунд, ускорение 5000 об/мин/с с последующим предпочтительным нагреванием при температуре 65-75 °C в течение 1 часа. В другом примере силанизацию проводят путем осаждения из паровой фазы 3-азидпропилтриметоксисилана, после чего поли(N-(5-азидоацетамидилпентил)акриламид предпочтительно поперечно сшивают с азидными группами, используя фотоинициированную реакцию, в которой применяют бифункциональный сшивающий агент, такой как NH-бис(ПЭГ-2 пропаргил), фотоинициатор (например, камфорхинон при длине волны 470 нм) и сульфат меди с лигандом, например PMDTA. В еще одном примере поли(N-(5-азидоацетамидилпентил)акриламид ковалентно связывают с поверхностями в нижней части нанолунок, используя свет, предпочтительно лазерное излучение.

[0009] В соответствии с другим вариантом реализации способы, описанные в настоящем документе, включают в себя свет, направленный через решетки для ввода излучения только в нижнюю часть каждой нанолунки для фотоинициирования химической реакции между первой и второй группами реагентов. В одном примере медь затем удаляют с помощью разбавленного раствора ЭДТА (0,1 M). В другом примере в способе отсутствует этап полировки для удаления любых существующих поверхностных химических веществ, обнаруженных в промежуточных областях между нанолунками.

[0010] В еще одном варианте реализации предложена проточная кювета. В одном примере проточная кювета содержит: подложку, слой решеток для ввода излучения со своим показателем преломления, расположенный на подложке, средний слой со своим показателем преломления, расположенный на слое проводящих свет решеток, причем показатель преломления среднего слоя превышает показатель преломления слоя решеток для ввода излучения, силанизированный слой на среднем слое, в котором множество нанолунок разделены промежуточными областями. В одном примере подложка представляет собой стекло. В другом примере слой решеток для ввода излучения и средний слой образованы из смолы. В еще одном примере слой решеток для ввода излучения и/или средний слой образованы из пентоксида тантала. В еще одном примере проточная кювета содержит поли(N-(5-азидоацетамидилпентил)акриламид, ковалентно связанный с поверхностями в нижней части нанолунок. В другом примере проточная кювета содержит вторую группу реагентов, расположенных на первой группе реагентов, и включает в себя по меньшей мере один реагент-мишень, хелатированный медью лиганд и систему светочувствительного фотоинициатора. В еще одном примере проточная кювета представляет собой проточную кювету с плоским волноводом. Эту проточную кювету можно использовать для секвенирования нуклеиновых кислот, включая крупносерийное секвенирование методом синтеза. Такую кювету можно изготовить в соответствии с любым способом, описанным в настоящем документе, для производства проточных кювет и пространственного структурирования их подложек.

[0011] Следует понимать, что любые соответствующие признаки/примеры каждого из аспектов описания, приведенные в настоящем документе, могут быть реализованы совместно в любом сочетании для достижения преимуществ и результатов, описанных здесь. При этом любые признаки/примеры по любому одному или нескольким этим аспектам могут быть реализованы совместно с любыми признаками другого(-их) аспекта(-ов), как описано в настоящем документе, в любом сочетании для достижения преимуществ, описанных в настоящем документе.

[0012] Описание также включает следующие пункты формулы изобретения:

1. Способ структурирования подложек проточных кювет, включающий в себя следующие этапы:

подготовку проточной кюветы для фотоинициированной химической реакции, причем проточная кювета включает в себя подложку, содержащую решетки для ввода излучения;

первый слой материала, расположенный над подложкой;

второй слой материала, расположенный над первым слоем материала; и нанолунки, образованные во втором слое материала, причем каждая нанолунка включает верхнюю часть и нижнюю часть, и при этом подготовка проточной кюветы включает:

силанизацию второго слоя материала;

покрытие силанизированного второго слоя материала и нанолунок первой группой реагентов;

введение второй группы реагентов в нанолунки, причем вторая группа реагентов включает по меньшей мере один реагент-мишень, хелатированный медью лиганд и систему светочувствительного фотоинициатора; и

направление света внутрь проточной кюветы через решетки для ввода излучения только в нижнюю часть каждой нанолунки для фотоинициирования химической реакции между первой и второй группами реагентов,

причем фотоинициированная химическая реакция ковалентно связывает реагент-мишень только с нижней частью каждой нанолунки.

2. Способ по п. 1, дополнительно включающий вымывание непрореагировавших реагентов из нанолунок.

3. Способ по любому из пп. 1-2, дополнительно включающий использование полимера и азидных фрагментов, которые связываются с полимером в качестве первой группы реагентов.

4. Способ по п. 3, дополнительно включающий применение поли(N-(5-азидоацетамидилпентил)акриламида в качестве полимера.

5. Способ по любому из пп. 1-4, дополнительно включающий в себя использование камфорхинон-аминной фотосенсибилизирующей системы в качестве светочувствительного фотоинициатора с применением излучения с длиной волны 470 нм.

6. Способ по любому из пп. 1-5, дополнительно включающий в себя использование праймера, связанного с алкином, в качестве реагента-мишени.

7. Способ по любому из пп. 1-6, дополнительно включающий в себя использование флуорофора, связанного с алкином, в качестве реагента-мишени.

8. Способ по любому из пп. 1-7, дополнительно включающий в себя использование лазера в качестве источника света.

9. Способ по любому из пп. 1-8, дополнительно включающий в себя использование материала с показателем преломления от 1,0 до 1,3 для подложки и материала с показателем преломления от 2,0 до 2,15 для первого слоя.

10. Способ структурирования подложек проточных кювет, включающий в себя следующие этапы:

изготовление проточной кюветы с плоским волноводом, причем изготовление проточной кюветы с плоским волноводом включает в себя:

формирование слоя решеток для ввода излучения на слое стеклянной подложки;

нанесение среднего слоя на слой решеток для ввода излучения;

нанесение покровного слоя на средний слой; и

формирование подложек нанолунок в покровном слое, причем каждая подложка нанолунки включает в себя верхнюю часть и нижнюю часть, и подложки нанолунки образуют между собой промежуточные области;

силанизацию покровного слоя;

покрытие первой группой реагентов силанизированного покровного слоя и подложек нанолунок;

введение второй группы реагентов в подложки нанолунок, причем вторая группа реагентов включает по меньшей мере один реагент-мишень, хелатированный медью лиганд и систему светочувствительного фотоинициатора; и

направление света внутрь проточной кюветы с плоским волноводом через решетки для ввода излучения только в нижнюю часть каждой нанолунки для фотоинициирования химической реакции между первой и второй группами реагентов,

причем фотоинициированная химическая реакция ковалентно связывает реагент-мишень только с нижней частью каждой нанолунки.

11. Способ по п. 10, дополнительно включающий вымывание непрореагировавших реагентов из нанолунок.

12. Способ по любому из пп. 10-11, дополнительно включающий использование полимера и азидных фрагментов, которые связываются с полимером в качестве первой группы реагентов.

13. Способ по п. 12, дополнительно включающий применение поли(N-(5-азидоацетамидилпентил)акриламида в качестве полимера.

14. Способ по любому из пп. 10-13, дополнительно включающий в себя использование камфорхинон-аминной фотосенсибилизирующей системы в качестве светочувствительного фотоинициатора с применением излучения с длиной волны 470 нм.

15. Способ по любому из пп. 10-14, дополнительно включающий в себя использование праймера, связанного с алкином, в качестве реагента-мишени.

16. Способ по любому из пп. 10-15, дополнительно включающий в себя использование флуорофора, связанного с алкином, в качестве реагента-мишени.

17. Способ по любому из пп. 10-16, дополнительно включающий в себя использование лазера в качестве источника света.

18. Способ по любому из пп. 10-17, дополнительно включающий в себя использование материала с показателем преломления от 1,0 до 1,3 для слоя решеток, вводящих излучение, и материала с показателем преломления от 2,0 до 2,15 для среднего слоя.

19. Способ структурирования подложек проточных кювет, включающий в себя следующие этапы:

изготовление проточной кюветы с плоским волноводом, причем изготовление проточной кюветы с плоским волноводом включает в себя:

формирование слоя решеток для ввода излучения на слое стеклянной подложки;

нанесение среднего слоя на слой решеток для ввода излучения;

нанесение покровного слоя на средний слой; и

формирование подложек нанолунок в покровном слое, причем каждая подложка нанолунки включает в себя верхнюю часть и нижнюю часть, и подложки нанолунки образуют между собой промежуточные области; и

силанизацию покровного слоя;

покрытие покровного слоя и подложек нанолунок первой группой реагентов, причем первая группа реагентов дополнительно включает в себя полимер, азидные фрагменты, связанные с полимером, медь-содержащий лиганд и систему светочувствительного фотоинициатора;

направление света с заданной длиной волны внутрь проточной кюветы с плоским волноводом только на нижнюю часть каждой подложки нанолунки для фотоинициирования химической реакции между реагентами в первой группе реагентов, причем фотоинициированная химическая реакция ковалентно связывает полимер только с нижней частью каждой подложки нанолунки;

введение второй группы реагентов в подложки нанолунок, причем вторая группа реагентов включает по меньшей мере один реагент-мишень, медь-содержащий лиганд и систему светочувствительного фотоинициатора; и

направление света с заданной длиной волны внутрь проточной кюветы с плоским волноводом только на нижнюю часть каждой подложки нанолунки для фотоинициирования химической реакции между ковалентно связанным полимером и второй группой реагентов, причем фотоинициированная химическая реакция ковалентно связывает реагент-мишень только с нижней частью подложки каждой нанолунки.

20. Способ по п. 19, дополнительно включающий вымывание непрореагировавших реагентов из нанолунок после каждой фотоинициированной химической реакции.

21. Способ по любому из пп. 19-20, дополнительно включающий применение 3-азидпропилтриметоксисилана для силанизации покровного слоя.

22. Способ по любому из пп. 19-21, дополнительно включающий применение поли(N-(5-азидоацетамидилпентил) акриламида в качестве полимера.

23. Способ по любому из пп. 19-22, дополнительно включающий в себя использование камфорхинон-аминной фотосенсибилизирующей системы в качестве светочувствительного фотоинициатора с применением излучения с длиной волны 470 нм.

24. Способ по любому из пп. 19-23, дополнительно включающий в себя использование праймера, связанного с алкином, в качестве реагента-мишени.

25. Способ по любому из пп. 19-23, дополнительно включающий в себя использование флуорофора, связанного с алкином, в качестве реагента-мишени.

26. Способ по любому из пп. 19-25, дополнительно включающий в себя использование лазера в качестве источника света.

27. Способ по любому из пп. 19-26, дополнительно включающий в себя использование материала с показателем преломления от 1,0 до 1,3 для слоя решеток, вводящих излучение, и материала с показателем преломления от 2,0 до 2,15 для среднего слоя.

28. Способ по любому из предшествующих пп. 1-18, в котором силанизацию проводят путем химического осаждения норборненсилана из паровой фазы.

29. Способ по любому из предшествующих пп. 4-9, 13-18, в котором поли(N-(5-азидоацетамидилпентил)акриламид нанесен методом центрифугирования на силанизированный слой с помощью следующей процедуры: стадия 1-600 об/мин, 5 секунд, ускорение 1500 об/мин/с; Стадия 2-1500 об/мин, 30 секунд, ускорение 5000 об/мин/с; стадия 3-4000 об/мин, 5 секунд, ускорение 5000 об/мин/с; стадия 4-600 об/мин, 5 секунд, ускорение 5000 об/мин/с с последующим предпочтительным нагреванием при температуре 65-75 °C в течение 1 часа.

30. Способ по любому из предшествующих пп. 21-27, в котором силанизацию проводят путем осаждения из паровой фазы 3-азидпропилтриметоксисилана, после чего поли(N-(5-азидоацетамидилпентил)акриламид предпочтительно поперечно сшивают с азидными группами, используя фотоинициированную реакцию, в которой применяют бифункциональный сшивающий агент, такой как NH-бис(ПЭГ-2 пропаргил), фотоинициатор (например, камфорхинон при длине волны 470 нм), сульфат меди+лиганд, например, PMDTA.

31. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором поли(N-(5-азидоацетамидилпентил)акриламид ковалентно связывается с поверхностями на дне, используя свет, предпочтительно лазерное излучение.

32. Способ по п. 30 или 31, в котором медь впоследствии удаляют с использованием разбавленного раствора ЭДТА (0,1 M).

33. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором отсутствует этап полировки для удаления любых химических веществ, присутствующих на поверхности и обнаруженных в промежуточных областях между нанолунками.

34. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором свет направляют через решетки для ввода излучения только в нижнюю часть каждой нанолунки для фотоиницирования химической реакции между первой и второй группами реагентов.

35. Проточная кювета (10) для фотоинициированной химической реакции, содержащая:

подложку (100),

слой (200) решетки для ввода излучения, расположенный на подложке (100), причем светопроводящий слой (200) имеет свой показатель преломления,

средний слой (300), расположенный на слое решетки (200), причем средний слой (300) имеет свой показатель преломления, при этом показатель преломления среднего слоя (300) больше показателя преломления слоя (200) решетки для ввода излучения,

силанизированный слой (400), расположенный на среднем слое (300), в котором имеется силанизированный слой (400), множество нанолунок (500),

причем нанолунки (500) разделены промежуточными областями (600).

36. Проточная кювета (10) по заключению 35, в которой подложка (100) представляет собой стекло.

37. Проточная кювета по п. 35 или 36, в которой слой решетки (200) для ввода излучения и средний слой (300) выполнены из смолы.

38. Проточная кювета по п. 37, в которой слой решетки (200) для ввода излучения и/или средний слой (300) образованы из пентоксида тантала.

39. Проточная кювета по любому из пп. 35-38, в которой силанизированный слой (400) образован из водного буфера или полимерного покровного слоя.

40. Проточная кювета по любому из предшествующих пп. 35-39, в которой показатель преломления слоя решетки (200) для ввода излучения находится в диапазоне от 0,5 до 2,0. от 0,8 до 1,5; или от 1,0 до 1,3, а показатель преломления среднего слоя (300) находится в диапазоне от 1,5 до 2,5; от 1,8 до 2,3; или от 2,0 до 2,15.

41. Проточная кювета по любому из предшествующих пп. 35-40, в которой поли(N-(5-азидоацетамидилпентил)акриламид ковалентно связывается с поверхностями в нижней части нанолунок (500).

42. Проточная кювета по п. 41, дополнительно содержащая первую группу реагентов, расположенных на поли(N-(5-азидоацетамидилпентил)акриламиде, ковалентно связанных с поверхностями в нижней части нанолунок (500).

43. Проточная кювета по п. 42, в которой вторая группа реагентов расположена на первой группе реагентов, при этом вторая группа реагентов включает в себя по меньшей мере один реагент-мишень, хелатированный медью лиганд и систему светочувствительного фотоинициатора.

44. Способ секвенирования нуклеиновых кислот с использованием проточной кюветы, изготовленной по любому из предшествующих пп. 1-34, и/или проточной кюветы по любому из пп. 35-43.

45. Система фотоинициированных химических реакций, содержащая проточную кювету по любому из предшествующих пп. 35-43 и источник света, предпочтительно источник лазерного излучения.

[0013] Дополнительные признаки и аспекты настоящего изобретения будут очевидны обычным специалистам в данной области после прочтения и понимания представленного ниже подробного описания примеров. Как будет понятно специалисту в данной области, возможны дополнительные примеры изобретения без отступления от его объема и сущности. Соответственно, графические материалы и связанные с ними описания следует рассматривать как иллюстративные и не имеющие ограничительного характера.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0014] Подробное описание одного или более вариантов реализации представлено в приведенных ниже сопроводительных графических материалах и описании. Прочие признаки, аспекты и преимущества станут очевидными из описания, рисунков и формулы изобретения, в которых:

[0015] На ФИГ. 1A показана структура проточной кюветы с проточным волноводом в соответствии с одним из вариантов реализации раскрытой системы и способа;

[0016] На ФИГ. 1B показан один вариант реализации проточной кюветы, изображенной на ФИГ. 1A, причем верхняя поверхность проточной кюветы покрыта азидными фрагментами с использованием сополимера N-(5-азидоацетамидилпентил)акриламида и акриламида (PAZAM);

[0017] На ФИГ. 1C показан один вариант реализации проточной кюветы, показанной на ФИГ. 1B, в которую введены реагенты, причем реагенты включают в себя праймеры, связанные с алкином, хелатированный медью лиганд и систему светочувствительного фотоинициатора;

[0018] На ФИГ. 1D показан один вариант реализации проточной кюветы, показанной на ФИГ. 1C, в которой плоский волновод соединен с проточной кюветой и направляет свет в нее;

[0019] На ФИГ. 1E, в одном варианте реализации, показан вид крупным планом нанолунки внутри проточной кюветы с указанием областей нанолунки, с которыми ковалентно связываются праймеры;

[0020] На ФИГ. 2A показана химическая реакция, в которой полимер PAZAM-азид присоединен к поверхности проточной кюветы с плоским волноводом в одном варианте реализации описанного способа;

[0021] На ФИГ. 2B показана химическая реакция, в которой фотоинициированная клик-реакция алкин-азид используется для ковалентного связывания реагента-мишени с подложкой нанолунки в одном варианте реализации описанного способа;

[0022] На ФИГ. 3A показана химическая реакция, в которой полимер PAZAM-азид, нанесенный на поверхность проточной кюветы с плоским волноводом, структурируют с помощью первой фотоинициированной клик-реакции в другом варианте реализации описанного способа;

[0023] На ФИГ. 3B показана химическая реакция, в которой праймеры (флуорофоры) структурированы на слое PAZAM, изображенном на фиг. 3A, с помощью второй фотоинициированной клик-реакции.

[0024] На ФИГ. 4 показана блок-схема реализации, на которой показан вариант осуществления первого способа структурирования подложек проточных кювет.

[0025] На ФИГ. 5 показана блок-схема реализации второго способа структурирования подложек проточных кювет. и

[0026] На ФИГ. 6 показана блок-схема реализации третьего способа структурирования подложек проточных кювет.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

[0027] В вариантах реализации описанной системы и способа используются плоские волноводы для пространственного управления химической функционализацией нанолунок, используемых в микроструйных устройствах, таких как проточные кюветы, используемые для секвенирования путем синтеза. Плоский волновод (т. е. волновод, имеющий плоскую геометрическую форму, который направляет свет только в одном направлении) направляет возбуждающий свет только в нижний участок нанолунок, где он фотоинициирует химическую реакцию, которая ковалентно связывает реагенты-мишени с дном нанолунок. Непрореагировавшие молекулы удаляют в процессе промывки, таким образом, локализуя реагенты-мишени в нижней части нанолунок.

[0028] Варианты реализации описанной системы и способа могут включать в себя фотоинициированную клик-реакцию азида с алкином, такую как реакция, применяемая в технологиях секвенирования методом синтеза. При этом типе реакции функциональные группы азида связываются со слоем гидрогеля, образованным на поверхности микроструйного канала, и затем добавляют реагенты алкин-праймер. Клик-реакцию азид-алкин фотоинициируют с использованием, в некоторых примерах, соединения меди и системы фотоинициатора, такой как система фотоинициирования II типа, например, камфорхинон. Данная система фотоинициатора может использовать синий свет с длиной волны приблизительно 470 нм в качестве источника возбуждения. Смешанные химические соединения могут быть использованы путем добавления замещающих функциональных групп в слой гидрогеля путем их включения в PAZAM. Например, азиды и тетразолы могут быть включены в PAZAM. Клик-реакцию азид-алкин фотоинициирует свет, имеющий длину волны от 450 нм до 495 нм (например, синий), а реакцию тетразол-алкен - свет, имеющий другую длину волны от 520 нм до 560 нм (например, зеленый). В одном примере используемый синий свет имеет длину волны приблизительно 470 нм.

[0029] Как правило, клик-реакции (клик-химия) включают биосовместимые низкомолекулярные реакции, обычно используемые в биоконъюгации для соединения различных субстратов со специфическими биомолекулами. Термин «клик-химия» не относится к единственной конкретной реакции, а относится к химическим способам получения веществ путем соединения малых модульных единиц друг с другом. Во многих сферах применения клик-реакций используют для соединения биомолекулы и репортерной молекулы. Клик-химия не ограничивается биологическими задачами, и концепция клик-реакции используется в фармакологической отрасли. Клик-реакция азид-алкин включает катализируемую медью реакцию азида с алкином и с образованием 5-членного гетероатома: катализируемое Cu(I) азид-алкиновое циклоприсоединение (CuAAC). Фотоинициированные реакции такого типа описаны в Chen et al., Photoinitiator Alkyne-aside Click and Radical Cross-Linking Reactions for the Patterning of PEG Hydrogels, BioMacromolecules, 2012, 13: 889-895; Shete и Kloxin, One-pot blue light triggered tough interpenetrating polymeric network (IPN) using CuAAC and methacrylate reactions, Polym. Chem., 2017, 8(24): 3668-3673; и Shete et al., Blue-light activated rapid polymerization for defect-free bulk Cu(i)-catalyzed azide-alkene cycloaddition (CuAAC) crosslinked networks, Chem. Commun (Camb)., 2016, 52(69): 10574-10577.

[0030] На фиг. 1A - 1E показано изготовление проточной кюветы с плоским волноводом. Пример проточной кюветы с плоским волноводом 10 включает в себя подложку 100, которая может представлять собой стекло; слой для ввода излучения 200, который может представлять собой смолу; средний слой 300, который может представлять собой смолу с показателем преломления выше, чем у смолы, используемой для слоя решетки для ввода излучения 200 (например, пентоксид тантала); и водный буфер или структурированный полимерный покровный слой 400 (см. ФИГ. 1A), в котором образовано множество нанолунок 500. Затем верхняя поверхность покровного слоя 400 покрыта гидрогелем (например, PAZAM), с которым связаны азидные функциональные группы 700 (см. ФИГ. 1B). Затем в проточную кювету 10 вводят различные реагенты 800, причем реагенты включают в себя связанные с алкином праймеры, хелатированный медью лиганд, систему светочувствительного фотоинициатора (см. ФИГ. 1C). Затем свет направляют в проточную кювету с плоским волноводом 10, используя оптический элемент, фокусирующий свет, так что решетки для ввода излучения 200 и средний слой 300 отражают свет внутри проточной кюветы 10. Ослабевающие световые волны проникают в нижнюю часть каждой нанолунки 500, инициируя требуемую химическую реакцию. Праймеры для секвенирования или другие молекулы ковалентно связываются только с нижней частью каждой нанолунки 500 и пространственно исключаются из промежуточных областей 600. На последующем этапе промывки из нанолунок удаляют непрореагировавшие компоненты, такие как любой несвязанный гидрогель или несвязанные праймеры. Подходящие промывочные растворы включают в себя щелочные буферы, имеющие значение pH по меньшей мере 10, и гидроксид натрия. На ФИГ. 1E представлен крупный план нанолунки 500, а области 502 на ФИГ. 1E показывают расположение ковалентно связанных праймеров для секвенирования (или других молекул) после завершения фотоинициированной реакции.

[0031] В различных вариантах реализации изобретения показатель преломления материала слоя решетки для ввода излучения 200 находится в диапазоне от 0,5 до 2,0; от 0,8 до 1,5; или от 1,0 до 1,3, а показатель преломления материала среднего слоя 300 находится в диапазоне от 1,5 до 2,5; от 1,8 до 2,3; или от 2,0 до 2,15. Увеличение разности контрастности между значениями показателя преломления слоя решетки для ввода излучения 200 и среднего слоя 300 может повысить эффективность ввода света в проточную кювету с плоским волноводом 10 при условии, что показатель преломления верхнего слоя (т.е., среднего слоя 300) остается выше, чем показатель преломления нижнего слоя (т.е. слоя решетки для ввода излучения 200). В одном варианте реализации средний слой 300 включает в себя или изготовлен из оксида металла, такого как, например, пентоксид тантала (Ta₂O₅)_.

[0032] В вариантах реализации описанного способа можно использовать следующие доступные в продаже материалы. (i) норборенсилан: [(5-бицикло[2.2.1]ГЕПТ-2-ЕНИЛ)ЭТИЛ]ТРИМЕТОКСИСИЛАН, tech-95, эндо/экзо изомеры (Gelest Inc.); (ii) PAZAM: сополимер поли(N-(5-азидоацетамидилпентил)акриламида с акриламидом) любого соотношения акриламид:Azapa; (iii) Azapa: N-(5-азидоацетамидилпентил)акриламид; (iv) сульфат меди(II) пентагидрат (CuSO₄^.5H₂O) (Sigma-Aldrich); (v) N, N,N ',N ",N" - пентаметилдиэтилентриамин (PMDTA), (Sigma-Aldrich); (vi) Alexa Fluor^®488 алкин (алкин AF-488) (Invitrogen); (vii) фотоинициатор камфорхинона (CQ) (Sigma-Aldrich); (viii) этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) (Sigma-Aldrich); (ix) NH-бис(ПЭГ-2 пропаргил), (BroadPharm), BP-2313; (x) 3-азидпропилтриметоксисилан (Gelest Inc.).

Схема I: Одностадийная фотоинициированная клик-реакция

[0033] Как показано на ФИГ. 2A-2B, в одном варианте реализации описанного способа используется фотоинициирующий механизм для азид-алкиновой клик-реакции, который включает в себя камфорхинон-аминную систему фотосенсибилизации с использованием света, имеющего длину волны приблизительно 470 нм. Проточную кювету с плоским волноводом изготавливают, как описано выше, и покрывающий слой 400 затем обрабатывают с использованием полимера PAZAM, с которым связаны азидные фрагменты. Как показано на ФИГ. 2A, верхнюю поверхность покровного слоя 400 сначала подвергают силанизации производным норборненсилана с использованием процесса химического осаждения из паровой фазы; способ может быть стандартным в промышленности. Поверхность покрывают, а затем термически сшивают с помощью PAZAM. Это можно осуществить следующим способом (описанным в заявке на патент США № 2015/0005447 A1): На поверхность подложки из стекла, силанизируованной норборненом, наносят 500 мкл водного раствора PAZAM (0,25%+ 5% этанола) и распределяют по поверхности. Тонкую пленку PAZAM получают путем нанесения методом центрифугирования в соответствии со следующей процедурой: стадия 1-600 об/мин, 5 секунд, ускорение 1500 об/мин/с; стадия 2-1500 об/мин, 30 секунд, ускорение 5000 об/мин/с; стадия 3-4000 об/мин, 5 секунд, ускорение 5000 об/мин/с; стадия 4-600 об/мин, 5 секунд, ускорение 5000 об/мин/с. После нанесения покрытия методом центрифугирования подложки нагревают при температуре 65-75 °C в печи или на горячей пластине в течение 1 часа.

[0034] Как показано на ФИГ. 2B, готовят раствор полимера, содержащий Alexa Fluor^® 488 (AF-488 алкин) (30% масс.) с карбонатом калия (35 мМ) и равными концентрациями CuSO₄ · 5H₂O (PMDTA) и фотоинициатора камфорхинона (примечание: вариант данного раствора включает праймеры для секвенирования вместо алкина AF-488). Для облегчения растворения раствор можно обработать ультразвуком. Затем раствор вводят в каналы проточной кюветы и удерживают там в течение последующей фотоинициации клик-реакции при помощи возбуждающего лазерного излучения в плоском волноводе. После завершения фотоинициированной клик-реакции медь вымывают из каналов проточной кюветы раствором ЭДТА (0,1 М), которая образует комплексное соединение с медью. Флуоресцентные изображения можно получить с помощью конфокального флуоресцентного микроскопа для проверки наличия флуорофора в нанолунках проточной кюветы. Как было указано ранее, реакция протекает только в нижней части нанолунок, поскольку свет направляется только в нанолунки посредством решетки с плоским волноводом. Полировку не использовали, поскольку меченные красителем молекулы связаны только в нанолунках, а не в промежуточных областях или участках между нанолунками.

Схема II: Двухэтапная фотоинициированная клик-реакция

[0035] Как показано на ФИГ. 3A-3B, другой вариант реализации описанного способа обеспечивает двухэтапную фотоинициированную клик-реакцию, в которой также используется фотосенсибилизирующая система камфорхинон-амин, в которой используется свет с длиной волны приблизительно 470 нм. Этот двухэтапный процесс сводит к минимуму диффузию реагентов от желаемых целевых областей, что приводит к меньшей функциональности промежуточных зон или участков между нанолунками проточной кюветы. Плоский волновод изготавливают так, как описано выше, и на первом этапе этого варианта реализации (см. ФИГ. 3A) PAZAM является фотоструктурированным в нанолунках с применением первой фотоинициированной клик-реакции. Этот первый этап включает прикрепление азидных групп к поверхности проточной кюветы при помощи 3-азидопропилтриметоксисилана с процессом химического осаждения из паровой фазы; способ может быть стандартным в промышленности. PAZAM затем сшивают с азидными группами с помощью фотоинициированной реакции, в которой применяют бифункциональный сшивающий агент, такой как NH-бис (ПЭГ-2 пропаргил), фотоинициатор, (например, камфорхинон при длине волны 470 нм), сульфат меди с лигандом (например, PMDTA) и свет. PAZAM ковалентно связывается с поверхностями в нижней части нанолунок с использованием лазерного света, направленного в плоский волновод. После завершения реакции медь удаляют разбавленным раствором ЭДТА (0,1 M), который образует комплексное соединение с медью.

[0036] На второй стадии (см. ФИГ. 3B) флуоресцентная метка (или другая молекула) структурируется с помощью второй фотоинициированной клик-реакции. Получают полимерный раствор, содержащий Alexa Fluor^® 488 (алкин AF-488) (30% масс.) с карбонатом калия (35 мМ) и равными концентрациями CuSO₄ · 5H₂O, PMDTA, а также фотоинициатора камфорхинона. Для облегчения растворения раствор можно обработать ультразвуком. Затем раствор вводят в каналы проточной кюветы и удерживают там в течение последующего фотоинициирования при помощи возбуждающего лазерного излучения в плоском волноводе. После завершения фотоинициированной клик-реакции медь вымывают из каналов раствором ЭДТА (0,1 М), которая образует комплексное соединение с медью. Флуоресцентные изображения получают с помощью конфокального флуоресцентного микроскопа для проверки наличия флуорофора в нанолунках проточной кюветы. Как было указано ранее, реакция протекает только в нижней части нанолунок, поскольку свет направляется только в нанолунки посредством решетки с плоским волноводом. Полировка не требуется, поскольку меченные красителем Alexa молекулы красителя связаны только в нанолунках, а не в промежуточных областях или участках между нанолунками.

[0037] На ФИГ. 4 показана блок-схема реализации , на которой показан вариант осуществления первого способа структурирования подложек проточных кювет. Первый способ структурирования подложек проточных кювет 400 включает подготовку проточной кюветы к фотоинициированной химической реакции на этапе 402, причем проточная кювета включает в себя подложку с образованной на ней решеткой для ввода излучения; первый слой материала, расположенный над подложкой; второй слой материала, расположенный над первым слоем материала; и нанолунки, образованные во втором слое материала, причем каждая нанолунка включает верхнюю часть и нижнюю часть; при этом подготовка проточной кюветы включает силанизацию второго слоя материала на этапе 404; и покрытие первой группой реагентов силанизированного второго слоя материала нанолунок на этапе 406; введение второй группы реагентов в нанолунки на этапе 408, причем вторая группа реагентов включает по меньшей мере один реагент-мишень, хелатированный медью лиганд и систему светочувствительного фотоинициатора; и направление света внутрь проточной кюветы через решетки для ввода излучения только на нижнюю часть каждой нанолунки для фотоинициирования химической реакции между первой и второй группами реагентов на этапе 410, причем инициированная светом химическая реакция ковалентно связывает реагент-мишень только с нижней частью каждой нанолунки.

[0038] Что касается варианта реализации, показанного на ФИГ. 4, ниже приведены не имеющие ограничительного характера примеры различных аспектов описанного способа. Примеры фотоинициированных химических реакций включают в себя химические реакции азид-алкин с использованием синего света с заданной длиной волны от прибл. 450 нм до 495 нм; химические реакции тетразол-алкин с использованием зеленого света с заданной длиной волны от прибл. 520 нм до 560 нм; и реакции циклоприсоединения азид/ацетилен без присутствия металлов с использованием маскирования тройных связей с дибензоциклооктинами в качестве циклопропенона (см., например, JACS 2009, 131, 15769-15776). Примеры методик формирования решеток для ввода излучения на подложке (которая может быть стеклом) включают в себя фотолитографическое структурирование решетки из диоксида кремния (SiO₂), обратную литографию, лазерное травление и наноимпринтинг. К примерам материалов для первого слоя относятся наноимпринтные литографические (NIL) смолы с низким показателем преломления и полимеры с низким показателем преломления. Примеры способов осаждения первого слоя материала на подложку включают покрытие распылением и покрытие центрифугированием. К примерам материалов для второго слоя относятся смолы с высоким показателем преломления, полимеры с высоким показателем преломления и оксиды металлов, такие как, например, пентоксид тантала (Ta₂O₅)_. Примеры способов нанесения второго слоя материала на первый слой включают вакуумное тонкопленочное осаждение из паровой фазы, покрытие распылением и покрытие центрифугированием. Примеры методик формирования нанолунок во втором слое материала включают структурирование в виде наноимпринтинговой литографии. Примеры способов покрытия силанизированного второго слоя материала и нанолунок первой группой реагентов включают покрытие распылением и покрытие центрифугированием. Примеры методик введения второй группы реагентов в нанолунки включают использование микроструйной насосной системы, такой как, например, перистальтический насос. Примеры методик направления света внутрь проточной кюветы через решетки для ввода излучения включают использование фокусирующих оптических элементов для направления света от внешнего источника в проточную кювету.

[0039] На ФИГ. 5 показана блок-схема реализации второго способа структурирования подложек проточных кювет. Второй способ структурирования подложек проточных кювет 500 содержит изготовление проточной кюветы с плоским волноводом на этапе 502 путем формирования слоя решеток для ввода излучения на стеклянной подложке на этапе 504; нанесение среднего слоя на слой решеток для ввода излучения на этапе 506; нанесение покровного слоя на средний слой на этапе 508; и формирование подложек нанолунок в покровном слое на этапе 510, причем каждая подложка нанолунки включает в себя верхнюю часть и нижнюю часть, а подложки нанолунки образуют между собой промежуточные области; силанизацию покровного слоя на этапе 512; покрытие первой группой реагентов силанизированного покровного слоя и подложек нанолунок на этапе 514; введение второй группы реагентов в подложки нанолунок на этапе 516, причем вторая группа реагентов включает по меньшей мере один реагент-мишень, хелатированный медью лиганд и систему светочувствительного фотоинициатора; направление света внутрь проточной кюветы с плоским волноводом через решетки для ввода излучения только к нижней части каждой подложки нанолунки для фотоинициирования химической реакции между первой и второй группами реагентов на этапе 518, причем фотоинициированная химическая реакция ковалентно связывает реагент-мишень только с нижней частью каждой подложки нанолунки.

[0040] Что касается варианта реализации, показанного на ФИГ. 5, ниже приведены не имеющие ограничительного характера примеры различных аспектов описанного способа. Примеры методик формирования слоя решеток для ввода излучения на подложке (которая может быть стеклом) включают в себя фотолитографическое структурирование решетки из диоксида кремния (SiO₂), обратную литографию, лазерное травление и наноимпринтинг. К примерам материалов для среднего слоя относятся наноимпринтные литографические (NIL) смолы с низким показателем преломления и полимеры с низким показателем преломления. Примеры способов нанесения среднего слоя материала на подложку включают покрытие распылением и покрытие центрифугированием. К примерам материалов для покровного слоя относятся смолы с высоким показателем преломления, полимеры с высоким показателем преломления и оксиды металлов, такие как, например, пентоксид тантала (Ta₂O₅)_. Примеры способов нанесения покровного слоя на средний слой включают вакуумное тонкопленочное осаждение из паровой фазы, покрытие напылением и покрытие центрифугированием. Примеры методик формирования нанолунок во втором слое материала включают структурирование в виде наноимпринтинговой литографии. Примеры способов покрытия силанизированного покровного слоя и нанолунок первой группой реагентов включают покрытие распылением и покрытие центрифугированием. Примеры методик введения второй группы реагентов в нанолунки включают использование микроструйной насосной системы, такой как, например, перистальтический насос. Примеры методик направления света внутрь проточной кюветы через решетки для ввода излучения включают использование фокусирующих оптических элементов для направления света от внешнего источника в проточную кювету. Примеры фотоинициированных химических реакций включают в себя химические реакции азид-алкин с использованием синего света с заданной длиной волны от прибл. 450 нм до 495 нм; химические реакции тетразол-алкин с использованием зеленого света с заданной длиной волны от прибл. 520 нм до 560 нм; и реакции циклоприсоединения азид/ацетилен без присутствия металлов с использованием маскирования тройных связей с дибензоциклооктинами в качестве циклопропенона (см., например, JACS 2009, 131, 15769-15776).

[0041] На ФИГ. 6 показана блок-схема реализации третьего способа структурирования подложек проточных кювет. Третий способ структурирования подложек проточных кювет 600 включает изготовление проточной кюветы с плоским волноводом на этапе 602 путем формирования слоя решеток для ввода излучения на стеклянной подложке на этапе 604; нанесение среднего слоя на слой решеток для ввода излучения на этапе 606; нанесение покровного слоя на средний слой на этапе 608; и формирование подложек нанолунок в покровном слое на этапе 610, причем каждая подложка нанолунки включает в себя верхнюю часть и нижнюю часть, а подложки нанолунки образуют между собой промежуточные области; и силанизацию покровного слоя на этапе 612; покрытие покровного слоя и подложек нанолунок первой группой реагентов на этапе 614, причем первая группа реагентов дополнительно включает в себя полимер, азидные фрагменты, связанные с полимером, медь-содержащий лиганд и систему светочувствительного фотоинициатора; направление света с заданной длиной волны внутрь проточной кюветы с плоским волноводом только на нижнюю часть каждой подложки нанолунки для фотоинициирования химической реакции между реагентами в первой группе реагентов на этапе 616, причем фотоинициированная химическая реакция ковалентно связывает полимер только с нижней частью каждой подложки нанолунки; введение второй группы реагентов в подложки нанолунок на этапе 618, причем вторая группа реагентов включает по меньшей мере один реагент-мишень, медь-содержащий лиганд и систему светочувствительного фотоинициатора; и направление света с заданной длиной волны внутрь проточной кюветы с плоским волноводом только на нижнюю часть каждой подложки нанолунки для фотоинициирования химической реакции между ковалентно связанным полимером и второй группой реагентов на этапе 620, причем фотоинициированная химическая реакция ковалентно связывает реагент-мишень только с нижней частью подложки каждой нанолунки.

[0042] Что касается варианта реализации, показанного на ФИГ. 6, ниже приведены не имеющие ограничительного характера примеры различных аспектов описанного способа. Примеры методик формирования решеток для ввода излучения на подложке (которая может быть стеклом) включают в себя фотолитографическое структурирование решетки из диоксида кремния (SiO₂), обратную литографию, лазерное травление и наноимпринтинг. К примерам материалов для среднего слоя относятся наноимпринтные литографические (NIL) смолы с низким показателем преломления и полимеры с низким показателем преломления. Примеры способов нанесения среднего слоя материала на подложку включают покрытие распылением и покрытие центрифугированием. К примерам материалов для покровного слоя относятся смолы с высоким показателем преломления, полимеры с высоким показателем преломления и оксиды металлов, такие как, например, пентоксид тантала (Ta₂O₅)_. Примеры способов нанесения покровного слоя на средний слой включают вакуумное тонкопленочное осаждение из паровой фазы, покрытие напылением и покрытие центрифугированием. Примеры методик формирования нанолунок во втором слое материала включают структурирование в виде наноимпринтинговой литографии. Примеры способов покрытия силанизированного покровного слоя и нанолунок первой группой реагентов включают покрытие распылением и покрытие центрифугированием. Примеры методик введения второй группы реагентов в нанолунки включают использование микроструйной насосной системы, такой как, например, перистальтический насос. Примеры методик направления света внутрь проточной кюветы через решетки для ввода излучения включают использование фокусирующих оптических элементов для направления света от внешнего источника в проточную кювету. Примеры фотоинициированных химических реакций включают в себя химические реакции азид-алкин с использованием синего света с заданной длиной волны от прибл. 450 нм до 495 нм; химические реакции тетразол-алкин с использованием зеленого света с заданной длиной волны от прибл. 520 нм до 560 нм; и реакции циклоприсоединения азид/ацетилен без присутствия металлов с использованием маскирования тройных связей с дибензоциклооктинами в качестве циклопропенона (см., например, JACS 2009, 131, 15769-15776).

[0043] Вся литература и аналогичные материалы, цитируемые в настоящей заявке, включая, без ограничений, патенты, заявки на патенты, статьи, книги, научные трактаты и веб-страницы, независимо от формата такой литературы и аналогичных материалов, включены в настоящий документ посредством ссылки. В случае если один или более из включенной в настоящий документ литературы и аналогичных материалов отличаются от настоящей заявки или противоречит ей, включая, без ограничений, определенные термины, использование терминов, описанные методы и т. п., данная заявка имеет преобладающую силу.

[0044] Вышеприведенное описание предоставлено для того, чтобы специалист в данной области мог реализовать на практике различные конфигурации, описанные в настоящем документе. Хотя технология, являющаяся объектом изобретения, описана, в частности, со ссылкой на различные фигуры и конфигурации, следует понимать, что она приведена только в качестве иллюстрации и не должна рассматриваться как ограничивающая объем технологии, являющейся объектом изобретения.

[0045] В настоящем документе элемент или стадия, перечисленные в единственном числе и предшествующие слова в единственном числе, следует понимать как не исключающие множественное число указанных элементов или стадий, если такое исключение не указано явным образом. Более того, ссылки на «один вариант реализации» не следует интерпретировать как исключающие существование дополнительных вариантов реализации, которые также включают в себя указанные элементы. Более того, если явно не указано иное, варианты реализации «содержащие» или «имеющие» элемент или множество элементов, имеющих конкретное свойство, могут включать в себя дополнительные элементы, независимо от того, имеют ли они это свойство или нет.

[0046] Термины «по существу» и «около», используемые в данном описании, используются для описания и учета небольших колебаний, например, из-за вариаций при обработке. Например, они могут относиться к меньшим или равным ± 5%, например, меньшим или равным ± 2%, например, меньшим или равным ± 1%, например, меньшим или равным ± 0,5%, например, меньшим или равным ± 0,2%, например, меньшим или равным ± 0,1%, например, меньшим или равным ± 0,05%.

[0047] Существует множество других способов реализации технологии, являющейся объектом изобретения. Различные функции и элементы, описанные в настоящем документе, можно разделять отличным от показанных образом без отступления от объема технологии, являющейся объектом изобретения. Для специалистов в данной области могут быть очевидны различные модификации этих вариантов реализации, и общие принципы, определенные в настоящем документе, могут применяться к другим вариантам реализации. Таким образом, специалист в данной области может вносить множество изменений и модификаций в технологию, являющуюся объектом изобретения, без отступления от объема технологии, являющейся объектом изобретения. Например, может быть использовано разное количество данных модулей или блоков, может быть использован другой тип или типы данных модулей или блоков, может быть добавлен данный модуль или блок или может быть опущен данный модуль или блок.

[0048] Подчеркнутые и/или выделенные курсивом заголовки и подзаголовки используются только для удобства, не ограничивают технологию, являющуюся объектом изобретения, и не упоминаются в связи с интерпретацией описания технологии, являющейся объектом изобретения. Все структурные и функциональные эквиваленты элементов различных вариантов реализации, описанных в настоящем описании, которые известны или станут позднее известными специалистам в данной области, в явной форме включены в настоящий документ путем ссылки и считаются охваченными технологией, являющейся объектом изобретения. Более того, ничто из раскрытого в настоящем документе не предназначено для общественности, независимо от того, указано ли такое раскрытие в приведенном выше описании в явном виде.

[0049] Следует понимать, что все комбинации вышеуказанных концепций и дополнительных концепций, более подробно описанных ниже (при условии, что такие концепции не являются взаимно противоречащими), рассматриваются как часть объекта изобретения, описанного в данном документе. В частности, все комбинации заявленного объекта изобретения, появляющиеся в конце данного описания, считаются частью объекта изобретения, описанного в данном документе.

Группа изобретений относится к способам структурирования подложек проточных кювет (варианты), проточной кювете для фотоинициированной химической реакции, способу севентирования нуклеиновых кислот и системе фотоинициированных химических реакций. Способ структурирования подложек проточных кювет с использованием фотоинициированных химических реакций включает в себя изготовление планарной волноводной проточной кюветы путем формирования слоя решеток для ввода излучения на стеклянной подложке; нанесение среднего слоя на слой решеток для ввода излучения; нанесение покровного слоя на средний слой; и формирование нанолунок в покровном слое; силанизацию покровного слоя; покрытие первой группой реагентов силанизированного покровного слоя и нанолунок; введение второй группы реагентов в нанолунки. Вторая группа реагентов включает в себя реагент-мишень и систему светочувствительного фотоинициатора. Согласно способу осуществляют подключение источника света к решеткам для ввода излучения и направление света внутрь планарной волноводной проточной кюветы для фотоинициирования химической реакции между первой и второй группами реагентов. Фотоинициированная химическая реакция ковалентно связывает реагент-мишень только с нижней частью каждой нанолунки. Группа изобретений обеспечивает устранение избыточной полировки, недостаточной полировки и царапанья или повреждения структурированных поверхностей при подготовке промежуточных областей между нанолунками. 6 н. и 38 з.п. ф-лы, 6 ил.

1. Способ структурирования подложек проточных кювет, включающий в себя следующие этапы:

подготовку проточной кюветы для фотоинициированной химической реакции, причем проточная кювета включает в себя

подложку, содержащую решетки для ввода излучения;

первый слой материала, расположенный над подложкой;

второй слой материала, расположенный над первым слоем материала; и

нанолунки, образованные во втором слое материала, причем каждая нанолунка включает верхнюю часть и нижнюю часть, и при этом подготовка проточной кюветы включает:

силанизацию второго слоя материала;

покрытие силанизированного второго слоя материала и нанолунок первой группой реагентов;

введение второй группы реагентов в нанолунки, причем вторая группа реагентов включает по меньшей мере один реагент-мишень, хелатированный медью лиганд и систему светочувствительного фотоинициатора; и

направление света внутрь проточной кюветы через решетки для ввода излучения только в нижнюю часть каждой нанолунки для фотоинициирования химической реакции между первой и второй группами реагентов,

причем фотоинициированная химическая реакция ковалентно связывает реагент-мишень только с нижней частью каждой нанолунки,

где в способе отсутствует этап полировки для удаления любых существующих химических веществ на поверхности, обнаруженных в промежуточных областях между нанолунками.

2. Способ по п. 1, дополнительно включающий вымывание непрореагировавших реагентов из нанолунок.

3. Способ по любому из пп. 1, 2, дополнительно включающий использование полимера и азидных фрагментов, которые связываются с полимером в качестве первой группы реагентов.

4. Способ по п. 3, дополнительно включающий применение поли(N-(5-азидоацетамидилпентил))акриламида в качестве полимера.

5. Способ по любому из пп. 1-4, дополнительно включающий в себя использование камфорхинон-аминной фотосенсибилизирующей системы в качестве светочувствительного фотоинициатора с применением излучения с длиной волны около 470 нм.

6. Способ по любому из пп. 1-5, дополнительно включающий в себя использование праймера, связанного с алкином, в качестве реагента-мишени.

7. Способ по любому из пп. 1-6, дополнительно включающий в себя использование флуорофора, связанного с алкином, в качестве реагента-мишени.

8. Способ по любому из пп. 1-7, дополнительно включающий в себя использование лазера в качестве источника света.

9. Способ по любому из пп. 1-8, дополнительно включающий в себя использование материала с показателем преломления от 1,0 до 1,3 для подложки и материала с показателем преломления от 2,0 до 2,15 для первого слоя.

10. Способ структурирования подложек проточных кювет, включающий в себя следующие этапы:

изготовление проточной кюветы с плоским волноводом, причем изготовление проточной кюветы с плоским волноводом включает в себя:

формирование слоя решеток для ввода излучения на слое стеклянной подложки;

нанесение среднего слоя на слой решеток для ввода излучения;

нанесение покровного слоя на средний слой; и

формирование подложек нанолунок в покровном слое, причем каждая подложка нанолунки включает в себя верхнюю часть и нижнюю часть, и подложки нанолунки образуют между собой промежуточные области;

силанизацию покровного слоя;

покрытие первой группой реагентов силанизированного покровного слоя и подложек нанолунок;

введение второй группы реагентов в подложки нанолунок, причем вторая группа реагентов включает по меньшей мере один реагент-мишень, хелатированный медью лиганд и систему светочувствительного фотоинициатора; и

направление света внутрь проточной кюветы с плоским волноводом через решетки для ввода излучения только в нижнюю часть каждой нанолунки для фотоинициирования химической реакции между первой и второй группами реагентов,

причем фотоинициированная химическая реакция ковалентно связывает реагент-мишень только с нижней частью каждой нанолунки,

где в способе отсутствует этап полировки для удаления любых существующих химических веществ на поверхности, обнаруженных в промежуточных областях между нанолунками.

11. Способ по п. 10, дополнительно включающий вымывание непрореагировавших реагентов из нанолунок.

12. Способ по любому из пп. 10 и 11, дополнительно включающий использование полимера и азидных фрагментов, которые связываются с полимером в качестве первой группы реагентов.

13. Способ по п. 12, дополнительно включающий применение поли(N-(5-азидоацетамидилпентил))акриламида в качестве полимера.

14. Способ по любому из пп. 10-13, дополнительно включающий в себя использование камфорхинон-аминной фотосенсибилизирующей системы в качестве светочувствительного фотоинициатора с применением излучения с длиной волны около 470 нм.

15. Способ по любому из пп. 10-14, дополнительно включающий в себя использование праймера, связанного с алкином, в качестве реагента-мишени.

16. Способ по любому из пп. 10-15, дополнительно включающий в себя использование флуорофора, связанного с алкином, в качестве реагента-мишени.

17. Способ по любому из пп. 10-16, дополнительно включающий в себя использование лазера в качестве источника света.

18. Способ по любому из пп. 10-17, дополнительно включающий в себя использование материала с показателем преломления от 1,0 до 1,3 для слоя решеток для ввода излучения, и материала с показателем преломления от 2,0 до 2,15 для среднего слоя.

19. Способ структурирования подложек проточных кювет, включающий в себя следующие этапы:

изготовление проточной кюветы с плоским волноводом, причем изготовление проточной кюветы с плоским волноводом включает в себя:

формирование слоя решеток для ввода излучения на слое стеклянной подложки;

нанесение среднего слоя на слой решеток для ввода излучения;

нанесение покровного слоя на средний слой; и

формирование подложек нанолунок в покровном слое, причем каждая подложка нанолунки включает в себя верхнюю часть и нижнюю часть, и подложки нанолунки образуют между собой промежуточные области; и

силанизацию покровного слоя;

покрытие покровного слоя и подложек нанолунок первой группой реагентов, причем первая группа реагентов дополнительно включает в себя полимер, азидные фрагменты, связанные с полимером, медь-содержащий лиганд и систему светочувствительного фотоинициатора;

направление света с заданной длиной волны внутрь проточной кюветы с плоским волноводом только на нижнюю часть каждой подложки нанолунки для фотоинициирования химической реакции между реагентами в первой группе реагентов, причем фотоинициированная химическая реакция ковалентно связывает полимер только с нижней частью каждой подложки нанолунки;

введение второй группы реагентов в подложки нанолунок, причем вторая группа реагентов включает по меньшей мере один реагент-мишень, медь-содержащий лиганд и систему светочувствительного фотоинициатора; и

направление света с заданной длиной волны внутрь проточной кюветы с плоским волноводом только на нижнюю часть каждой подложки нанолунки для фотоинициирования химической реакции между ковалентно связанным полимером и второй группой реагентов, причем фотоинициированная химическая реакция ковалентно связывает реагент-мишень только с нижней частью подложки каждой нанолунки,

где в способе отсутствует этап полировки для удаления любых существующих химических веществ на поверхности, обнаруженных в промежуточных областях между нанолунками.

20. Способ по п. 19, дополнительно включающий вымывание непрореагировавших реагентов из нанолунок после каждой фотоинициированной химической реакции.

21. Способ по любому из пп. 19, 20, дополнительно включающий применение 3-азидпропилтриметоксисилана для силанизации покровного слоя.

22. Способ по любому из пп. 19-21, дополнительно включающий применение поли(N-(5-азидоацетамидилпентил))акриламида в качестве полимера.

23. Способ по любому из пп. 19-22, дополнительно включающий в себя использование камфорхинон-аминной фотосенсибилизирующей системы в качестве светочувствительного фотоинициатора с применением излучения с длиной волны около 470 нм.

24. Способ по любому из пп. 19-23, дополнительно включающий в себя использование праймера, связанного с алкином, в качестве реагента-мишени.

25. Способ по любому из пп. 19-23, дополнительно включающий в себя использование флуорофора, связанного с алкином, в качестве реагента-мишени.

26. Способ по любому из пп. 19-25, дополнительно включающий в себя использование лазера в качестве источника света.

27. Способ по любому из пп. 19-26, дополнительно включающий в себя использование материала с показателем преломления от 1,0 до 1,3 для слоя решеток для ввода излучения, и материала с показателем преломления от 2,0 до 2,15 для среднего слоя.

28. Способ по любому из предшествующих пп. 1-18, в котором силанизацию проводят путем химического осаждения норборненсилана из паровой фазы.

29. Способ по любому из предшествующих пп. 4-9, 13-18, в котором поли(N-(5-азидоацетамидилпентил))акриламид нанесен методом центрифугирования на силанизированный слой с помощью следующей процедуры: стадия 1-600 об/мин, 5 с, ускорение 1500 об/мин/с; стадия 2-1500 об/мин, 30 с, ускорение 5000 об/мин/с; стадия 3-4000 об/мин, 5 с, ускорение 5000 об/мин/с; стадия 4-600 об/мин, 5 с, ускорение 5000 об/мин/с с последующим предпочтительным нагреванием при температуре 65-75 °C в течение 1 ч.

30. Способ по любому из предшествующих пп. 21-27, в котором силанизацию проводят путем осаждения из паровой фазы 3-азидопропилтриметоксисилана, после чего поли(N-(5-азидоацетамидилпентил))акриламид предпочтительно поперечно сшивают с азидными группами, используя фотоинициированную реакцию, в которой применяется бифункциональный сшивающий агент.

31. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором поли(N-(5-азидоацетамидилпентил))акриламид ковалентно связан с поверхностями на дне нанолунок с использованием света, предпочтительно лазерного света.

32. Способ по п. 30 или 31, в котором медь затем удаляют с помощью разбавленного раствора ЭДТА (0,1 M).

33. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором свет направляют через решетки для ввода излучения только в нижнюю часть каждой нанолунки для фотоиницирования химической реакции между первой и второй группами реагентов.

34. Проточная кювета для фотоинициированной химической реакции, содержащая:

подложку,

слой решетки для ввода излучения, расположенный на подложке, причем слой решетки для ввода излучения имеет свой показатель преломления,

средний слой, расположенный на слое решетки, причем средний слой имеет свой показатель преломления, при этом показатель преломления среднего слоя больше показателя преломления слоя решетки для ввода излучения,

силанизированный слой, расположенный на среднем слое, в котором имеется силанизированный слой со множеством нанолунок, и

причем нанолунки разделены промежуточными областями,

где промежуточные области между нанолунками не подвергаются этапу полировки для удаления любых существующих химических веществ на поверхности.

35. Проточная кювета по п. 34, в которой подложка представляет собой стекло.

36. Проточная кювета по п. 34 или 35, в которой слой решетки для ввода излучения и средний слой выполнены из смолы.

37. Проточная кювета по п. 36, в которой слой решетки для ввода излучения и/или средний слой образованы из пентоксида тантала.

38. Проточная кювета по любому из пп. 34-37, в которой силанизированный слой образован из водного буфера или полимерного покровного слоя.

39. Проточная кювета по любому из предшествующих пп. 34-38, в которой показатель преломления слоя решетки для ввода излучения находится в диапазоне от 0,5 до 2,0, а показатель преломления среднего слоя находится в диапазоне от 1,5 до 2,5.

40. Проточная кювета по любому из предыдущих пп. 34-39, в которой поли(N-(5-азидоацетамидилпентил))акриламид ковалентно связан с поверхностями в нижней части нанолунок.

41. Проточная кювета по п. 40, дополнительно содержащая первую группу реагентов, расположенных на поли(N-(5-азидоацетамидилпентил)) акриламиде, ковалентно связанном с поверхностями в нижней части нанолунок.

42. Проточная кювета по п. 41, в которой вторая группа реагентов расположена на первой группе реагентов и включает в себя по меньшей мере один реагент-мишень, хелатный лиганд меди и систему светочувствительного фотоинициатора.

43. Способ секвенирования нуклеиновых кислот с использованием проточной кюветы, изготовленной по любому из предшествующих пп. 1-33, и/или проточной кюветы по любому из пп. 34-42.

44. Система фотоинициированных химических реакций, включающая в себя проточную кювету по любому из предшествующих пп. 34-42 и источник света, предпочтительно источник лазерного излучения.