ПРОТОЧНЫЕ КЮВЕТЫ Российский патент 2024 года по МПК B01L3/00 C12N15/10 C12Q1/6869 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ

[0001] Настоящая заявка испрашивает преимущество по предварительной заявке на патент США № 62/881,597, поданной 1 августа 2019 г., содержимое которой полностью включено в настоящий документ путем ссылки.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0002] Существует множество способов и сфер применения, для которых желательно создать библиотеку фрагментированных и меченных молекул дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) из молекул-мишеней двухцепочечной ДНК (дцДНК). Часто целью является получение меньших молекул ДНК (например, фрагментов ДНК) из более крупных молекул дцДНК для применения в качестве шаблонов в реакциях секвенирования ДНК. Шаблоны могут обеспечивать получение более коротких чтений. В процессе анализа данных перекрывающиеся короткие чтения последовательностей можно выравнивать для реконструкции более длинных нуклеотидных последовательностей. В некоторых случаях для упрощения анализа данных можно использовать стадии предварительного секвенирования (такие как штрихкодирование конкретных молекул нуклеиновой кислоты).

ВВЕДЕНИЕ

[0003] Первый аспект изобретения, описанный в данном документе, представляет собой проточную кювету, содержащую подложку; катионный полимерный гидрогель на подложке, причем катионный полимерный гидрогель включает катионную функциональную группу, i) интегрированную в мономерное звено исходного полимерного гидрогеля или ii) присоединенную к мономерному звену исходного полимерного гидрогеля посредством линкера; и праймер для амплификации, присоединенный к катионному полимерному гидрогелю.

[0004] В примере первого аспекта мономерное звено представляет собой N-(5-бромацетамидилпентил)акриламид; катионная функциональная группа представляет собой фосфониевый катион; и фосфониевый катион замещает бром в N-(5 бромацетамидилпентил)акриламиде. В одном примере фосфониевый катион выбран из группы, состоящей из катиона трис(гидроксиметил)фосфония, катиона трис(гидроксипропил)фосфония, катиона тетракис(гидроксиметил)фосфония и катиона трис(2-карбоксиэтил)фосфония.

[0005] В другом примере первого аспекта i) мономерное звено включает концевую азидную группу, а линкер включает алкиновую группу; или ii) мономерное звено включает концевую алкиновую группу, и линкер включает азидную группу. В одном примере катионная функциональная группа включает протонированную аминогруппу, ион сульфония, катион четвертичного аммония или их комбинации. В другом примере мономерное звено представляет собой N-(5-азидоацетамидилпентил)акриламид; и катионная функциональная группа представляет собой катион N, N,N-триметилэтаноламмония. В еще одном примере линкер дополнительно включает расщепляемую дисульфидную связь, фоторасщепляемую связь, расщепляемую фосфодиэфирную связь или их комбинации.

[0006] В еще одном примере первого аспекта мономерное звено представляет собой N-(5-азидоацетамидилпентил)акриламид; линкер включает концевую алкиновую группу и концевой бром; и катионная функциональная группа представляет собой фосфониевый катион который замещает концевой бром.

[0007] В примере первого аспекта подложка включает множество углублений, разделенных промежуточными областями, и при этом катионный полимерный гидрогель расположен внутри каждого из углублений. В одном примере подложка дополнительно содержит множество камер, и при этом подгруппа множества углублений расположена в пределах периметра каждой из множества камер.

[0008] Следует понимать, что любые особенности проточной кюветы, описанной в настоящем документе, можно комбинировать любым желаемым способом и/или в любой желаемой конфигурации для достижения преимуществ, описанных в настоящем изложении, включая, например, положительный заряд для привлечения и пространственного удержания фрагментов библиотеки.

[0009] Второй аспект, описанный в данном документе, представляет собой способ, включающий введение текучей среды, содержащей положительно заряжаемую функциональную группу, в проточную кювету, содержащую исходный полимерный гидрогель, имеющий поверхностную функциональную группу, выбранную из группы, состоящей из отрицательно заряжаемого атома, азидной группы и алкиновой группы; и праймер для амплификации, присоединенный к исходному полимерному гидрогелю; и инкубирование исходного полимерного гидрогеля в текучей среде при определенной температуре и в течение некоторого времени с формированием таким образом катионного полимерного гидрогеля, включающего катионную функциональную группу.

[0010] В примере второго аспекта положительно заряжаемая функциональная группа замещает отрицательно заряжаемый атом исходного полимерного гидрогеля. В одном примере поверхностная функциональная группа представляет собой отрицательно заряжаемый атом; отрицательно заряжаемый атом представляет собой бром; а положительно заряжаемая функциональная группа выбрана из группы, состоящей из трис(гидроксиметил)фосфина, трис(гидроксипропил)фосфина, тетракис(гидроксиметил)фосфина и трис(2-карбоксиэтил)фосфина. В одном примере текучая среда дополнительно включает буфер, имеющий pH в диапазоне от 6 до 12. В одном примере температура находится в диапазоне от около 18 °C до около 65 °C, а время находится в диапазоне от около 1,5 минуты до около 5 минут.

[0011] В другом примере второго аспекта поверхностная функциональная группа представляет собой азидную группу или алкиновую группу; а положительно заряжаемая функциональная группа ковалентно присоединяется к поверхностной функциональной группе посредством линкера. В одном примере поверхностная функциональная группа представляет собой азидную группу; линкер представляет собой алкиновую группу; а катионная функциональная группа включает протонированную аминогруппу, ион сульфония, катион четвертичного аммония или их комбинации. В одном примере поверхностная функциональная группа представляет собой алкиновую группу; линкер представляет собой азидную группу; а катионная функциональная группа включает протонированную аминогруппу, ион сульфония, катион четвертичного аммония или их комбинации. В одном примере соединение включает положительно заряжаемую функциональную группу, присоединенную к линкеру, и при этом соединение представляет собой бромид пропаргилхолина. В одном примере текучая среда содержит воду. В одном примере температура находится в диапазоне от около 18 °C до около 60 °C, а время находится в диапазоне от около 30 минут до около 12 часов. В одном примере способ дополнительно включает добавление катализатора, лиганда и восстанавливающего агента в проточную кювету с текучей средой.

[0012] Следует понимать, что любые элементы этого способа можно комбинировать любым желаемым образом. Более того, следует понимать, что для достижения преимуществ, представленных в данном описании, в том числе, например, положительных зарядов для привлечения и пространственного ограничения фрагментов библиотеки, можно использовать любую комбинацию особенностей данного способа и/или проточной кюветы.

[0013] Третий аспект изобретения, описанный в данном документе, представляет собой набор, который содержит проточную кювету, содержащую подложку; исходный полимерный гидрогель, расположенный на подложке и имеющий поверхностную функциональную группу, выбранную из группы, состоящей из отрицательно заряжаемого атома, азидной группы и алкиновой группы; и праймер для амплификации, присоединенный к исходному полимерному гидрогелю; и текучую среду, включающую положительно заряжаемую функциональную группу, который взаимодействует или реагирует с поверхностной функциональной группой с образованием катионного полимерного гидрогеля, включающего катионную функциональную группу.

[0014] Следует понимать, что любые элементы этого набора можно комбинировать любым желаемым образом. Более того, следует понимать, что для достижения преимуществ, описанных в данном изложении, в том числе, например, положительных зарядов для привлечения и пространственного ограничения фрагментов библиотеки, можно использовать любую комбинацию особенностей любого из набора и/или способа и/или проточной кюветы.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0015] Признаки согласно примерам настоящего изобретения станут очевидными после ознакомления с нижеследующим подробным описанием и графическими материалами, на которых одинаковые номера позиций соответствуют подобным, хотя, возможно, неидентичным компонентам. Для краткости изложения номера позиций или признаки, имеющие ранее описанную функцию, могут быть описаны или не описаны применительно к другим графическим материалам, на которых они встречаются.

[0016] На Фиг. 1 представлена блок-схема, иллюстрирующая пример способа, описанного в настоящем документе;

[0017] на Фиг. 2A и 2B представлены полусхематичные виды в перспективе, которые в совокупности иллюстрируют способ, изображенный на Фиг. 1, где на Фиг. 2A показана часть проточной кюветы, содержащая исходный полимерный гидрогель, а на Фиг. 2B показана часть проточной кюветы, содержащая положительно заряженный (катионный) полимерный гидрогель;

[0018] на Фиг. 3 представлена химическая формула, иллюстрирующая формирование одного примера катионного полимерного гидрогеля;

[0019] на Фиг. 4 представлена химическая формула, иллюстрирующая формирование другого примера катионного полимерного гидрогеля;

[0020] Фиг. 5A и 5B в совокупности демонстрируют химическую формулу, иллюстрирующую формирование еще одного примера катионного полимерного гидрогеля;

[0021] на Фиг. 6 показан полусхематический вид в перспективе части другого примера проточной кюветы, описанной в настоящем документе;

[0022] на Фиг. 7 показан полусхематический вид в перспективе части еще одного примера проточной кюветы, описанной в настоящем документе; и

[0023] на Фиг. 8A-8C представлены схематические иллюстрации различных примеров комплексов, описанных в настоящем документе;

[0024] на Фиг. 9A представлена инвертированная микрофотография (где исходные темные участки изображения инвертированы в белый цвет, а исходные светлые участки изображения инвертированы в черный) высвобожденных фрагментов библиотеки ДНК на сравнительной проточной кювете, включающей необработанный гидрогель на одной дорожке стеклянной подложки;

[0025] на Фиг. 9B схематически показано взаимодействие высвобожденных фрагментов библиотеки ДНК и необработанного гидрогеля сравнительной проточной кюветы, изображенной на Фиг. 9A;

[0026] на Фиг. 10A представлена инвертированная микрофотография (где исходные темные участки изображения инвертированы в белый цвет, а исходные светлые участки изображения инвертированы в черный) высвобожденных фрагментов библиотеки ДНК на примере проточной кюветы, включающей гидрогель, обработанный трис(гидроксипропил)фосфином, на одной дорожке стеклянной подложки; и

[0027] на Фиг. 10B схематически показано взаимодействие высвобожденных фрагментов библиотеки ДНК и обработанного гидрогеля примера проточной кюветы, изображенной на Фиг. 10A.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

[0028] Примеры проточной кюветы, описанные в настоящем документе, имеют положительные заряды и праймеры для амплификации на поверхности полимерного гидрогеля. Положительные заряды на поверхности полимерного гидрогеля способствуют притяжению и пространственному ограничению фрагментов библиотеки, освобождаемых от носителя, который затем вводят в проточную кювету.

[0029] Фрагменты библиотеки представляют собой фрагменты одноцепочечной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) сходных размеров (например, < 1000 п. н.), полученные из большего по размеру образца нуклеиновой кислоты, или фрагменты комплементарной дезоксирибонуклеиновой кислоты (кДНК), полученные из фрагментов рибонуклеиновой кислоты (РНК) большего по размеру образца нуклеиновой кислоты, и эти фрагменты имеют адаптеры, присоединенные к соответствующим концам. Положительно заряженная поверхность гидрогеля будет притягивать отрицательно заряженные фрагменты библиотеки, освобождающиеся от конкретного носителя. Это уменьшит вероятность случайного связывания фрагментов библиотеки на поверхности проточной кюветы и уменьшит или предотвратит засевание фрагментами библиотеки боковых стенок проточной кюветы. Таким образом, повышается эффективность посева библиотеки.

[0030] Повышенная эффективность посева может иметь множество благоприятных сторон и преимуществ. Например, при повышении эффективности посева можно снизить требования к вводу библиотеки. В другом примере повышение эффективности посева может привести к получению по меньшей мере по существу гомогенизированной плотности кластеров. Во время секвенирования индивидуальные кластеры генерируют «пространственные облака» сигналов флуоресценции по мере встраивания нуклеотидов в соответствующие цепи шаблонов в кластерах. Ограниченность кластеров может по меньшей мере уменьшить пространственные взаимодействия и/или перекрытия облаков, а также может улучшать идентификацию пространственных облаков. Кроме того, поскольку чтения, полученные из любого индивидуального кластера, могут генерироваться из одного и того же образца, их можно использовать для реконструкции образца путем сшивки коротких чтений друг с другом методами биоинформатики.

[0031] Примеры способа, описанного в настоящем документе, вводят положительные заряды на поверхность исходного полимерного гидрогеля и при этом сохраняют совместимость поверхности с секвенированием.

[0032] Определения

[0033] Если не указано иное, следует понимать, что термины, используемые в настоящем документе, имеют свое обычное значение в соответствующей области. Ниже приведен ряд терминов, используемых в настоящем документе, и их значения.

[0034] Используемые в настоящем документе формы единственного числа подразумевают как единственные, так и множественные формы, если из контекста явно не следует иное. Используемый в настоящем документе термин «содержащий» представляет собой синоним терминов «включая», «включающий» или «характеризуется» и является включающим или не имеющим ограничительного характера, и он не исключает дополнительных неуказанных элементов или стадий способа.

[0035] Указание в настоящем описании на «один пример», «другой пример», «пример» и т. п. означает, что конкретный элемент (например, признак, конструкция, композиция, конфигурация и/или характеристика), описанный в отношении примера, включен по меньшей мере в один пример, описанный в настоящем документе, и может присутствовать или отсутствовать в других примерах. Кроме того, следует понимать, что описанные элементы любого примера можно комбинировать любым подходящим способом с разными примерами, если из контекста явно не следует иное.

[0036] Термины «по существу» и «около», используемые по всему тексту данного описания, включая формулу изобретения, используются для описания и учета небольших колебаний, например из-за вариаций при обработке. Например, эти термины могут относиться к меньшим или равным ±5% от указанного значения, например меньшим или равным ±2% от указанного значения, например меньшим или равным ±1% от указанного значения, например меньшим или равным ±0,5% от указанного значения, например меньшим или равным ±0,2% от указанного значения, например меньшим или равным ±0,1%, например меньшим или равным ±0,05% от указанного значения.

[0037] Адаптер: линейная олигонуклеотидная последовательность, которая может быть слита с молекулой нуклеиновой кислоты, например, посредством лигирования или тагментации. В некоторых примерах адаптер по существу не комплементарен 3’-концу или 5’-концу любой целевой последовательности, введенной в проточную кювету. Длины адаптеров могут находиться в диапазоне от около 10 нуклеотидов до около 100 нуклеотидов, или от около 12 нуклеотидов до около 60 нуклеотидов, или от около 15 нуклеотидов до около 50 нуклеотидов. Адаптер может включать любую комбинацию нуклеотидов и/или нуклеиновых кислот. В некоторых примерах адаптер включает одну или более расщепляемых групп в одном или более положениях. В некоторых примерах адаптер может включать последовательность, комплементарную по меньшей мере части праймера, например праймера, включающего универсальную нуклеотидную последовательность (такую как последовательность P5 или P7). В некоторых примерах адаптер может включать последовательность индекса или штрихкода, которая помогает исправить нижележащую ошибку, выполнить идентификацию или секвенирование. Индекс может быть уникальным для образца или источника молекулы нуклеиновой кислоты (например, фрагмента). В некоторых примерах адаптер может включать последовательность праймера для секвенирования или сайт связывания для секвенирования. Комбинации различных адаптеров могут быть встроены в молекулу нуклеиновой кислоты, например, фрагмент ДНК.

[0038] Захватный сайт: часть поверхности проточной кюветы физически модифицируется и/или модифицируется химическим свойством, позволяющим локализовать комплекс или образец. В одном примере захватный сайт может включать захватный химический агент.

[0039] Носитель: гидрогелевая подложка, на которой может присутствовать библиотека секвенирования, или твердая подложка, на поверхности которой могут быть прикреплены готовые к секвенированию фрагменты нуклеиновых кислот.

[0040] Захватный химический агент: материал, молекула или функциональная группа, способная присоединяться, удерживаться или связываться с молекулой-мишенью (например, комплексом или образцом). Один пример захватного химического агента включает захватную нуклеиновую кислоту (например, захватный олигонуклеотид), которая комплементарна по меньшей мере участку целевой нуклеиновой кислоты или присоединена к молекуле-мишени. Другим примером захватного химического агента является связывающая молекула. Для образца нативной ДНК или РНК связывающая молекула может иметь на одном конце связывающую нуклеиновую кислоту функциональную группу, например интеркаляторы, которые связываются посредством заряда или гидрофобного взаимодействия. В случае клеточного образца связывающая молекула может включать связывающуюся с клеточной мембраной функциональную группу (например, антигены против поверхностных белков) или проникающую через мембрану функциональную группу (например, фосфолипиды на одном конце). Еще одним примером захватного химического агента является член связывающейся пары рецептор-лиганд (например, авидин, стрептавидин, биотин, лектин, углевод, белок, связывающийся с нуклеиновой кислотой, эпитоп, антитело и т. д.), способный связываться с молекулой-мишенью (или с линкерной функциональной группой, присоединенной к молекуле-мишени). Еще одним примером захватного химического агента является химический реагент, способный образовывать электростатическое взаимодействие, водородную связь или ковалентную связь (например, по механизму тиол-дисульфидного обмена, клик-химии, реакции Дильса-Альдера и т. д.) с молекулой-мишенью.

[0041] Комплекс: носитель, такой как гидрогелевая подложка или твердая подложка, а также готовые к секвенированию фрагменты нуклеиновых кислот, прикрепленные или содержащиеся внутри носителя. Носитель может также включать один элемент связывающейся пары, другой элемент которой является частью захватного сайта.

[0042] Внешний иммобилизующий агент: газообразная, жидкая или вязкая среда, которая не смешивается с комплексом или образцом, введенным в дорожку (-и) или камеры проточной кюветы. Газообразный внешний иммобилизующий агент можно использовать для создания капли вокруг комплекса или образца. Примером газообразного внешнего иммобилизующего агента является воздух, который направляется с приемлемой скоростью потока через проточную кювету. Например, воздух можно использовать для аспирации текучей среды, содержащей комплекс или образец, из проточной кюветы, с образованием капель жидкости, содержащих комплекс или образец. Сформированная капля действует как диффузионный барьер. Жидкую или вязкую среду используют для предотвращения диффузии библиотеки секвенирования, освобожденной из комплекса или образованной внутри камеры, на поверхность проточной кюветы. Внешний иммобилизующий агент может образовывать диффузионный барьер, поскольку библиотеки секвенирования или любые другие полинуклеотиды практически не сольватируются во внешнем иммобилизующем агенте. Примеры внешних иммобилизующих агентов в жидкой форме включают гидрофобные масла, такие как минеральное масло, силиконовое масло, перфторированное масло, фторуглеродное масло (например, FLUORINERT™ Electronic Liquid FC40 производства 3M), или их комбинацию. Примеры внешних иммобилизующих агентов в форме вязкой среды включают буферы, содержащие полимеры (например, полиэтиленгликоль, поливинилпирролидон и т. п.), декстран, сахарозу, глицерин и т. п. В некоторых примерах вязкая среда представляет собой термочувствительный гель. Термочувствительный гель является невязким при температурах, не используемых при посеве, и превращается в вязкую среду при температурах посева. Примеры термочувствительных гелей включают поли(N-изопропилакриламид) и композиты-наночастицы из полиэтиленоксид-полипропиленоксид-полиэтиленоксида (ПЭО-ППО-ПЭО)/лапонита.

[0043] Фрагмент: участок или часть генетического материала (например, ДНК, РНК и т. д.).

[0044] Гидрогель или гидрогелевая матрица: полужесткий полимерный материал, проницаемый для жидкостей и газов. Полимерный материал, образующий гидрогель, может быть линейным или слегка сшитым посредством ковалентных, ионных или водородных связей. В одном примере гидрогель содержит от около 60% до около 90% текучей среды, такой как вода, и от около 10% до около 30% полимера. Гидрогель может быть пористым, т. е. включать поровое/пустое пространство. Пористость представляет собой объемную долю (безразмерное значение) гидрогеля, т. е. измеряет объем пустот в материале и отражает долю объема пустот в общем объеме в процентах от 0 до 100% (или от 0 до 1). В одном примере пористость гидрогеля может находиться в диапазоне от около 50% (0,5) до около 99% (0,99). Пористость может быть достаточной для обеспечения диффузии реагентов (например, ферментов, химических веществ и олигонуклеотидов меньшего размера (менее 50 пар нуклеотидов, например, праймеров), но препятствует диффузии молекул нуклеиновых кислот большего размера (например, образцов, фрагментов и т. д.).

[0045] Используемый в настоящем документе термин «катионный полимерный гидрогель» относится к исходному полимеризованному гидрогелю, имеющему катионную функциональную группу, i) интегрированную в одно из мономерных звеньев или ii) присоединенную к одному из мономерных звеньев посредством линкера. Используемый в настоящем документе термин «исходный полимерный гидрогель» относится к полимеризованному гидрогелю до любой реакции/взаимодействия для введения катионной функциональной группы. Катионный полимерный гидрогель может также называться в настоящем документе положительно заряженным гидрогелем.

[0046] Гидрогелевая подложка: гидрогель, имеющий по меньшей мере по существу сферическую форму (например, гидрогелевые гранулы), который может содержать библиотеку секвенирования.

[0047] Молекула нуклеиновой кислоты: полимерная форма нуклеотидов любой длины, может включать рибонуклеотиды, дезоксирибонуклеотиды, их аналоги или их смеси. Термин может относиться к одноцепочечным или двухцепочечным полинуклеотидам.

[0048] Термин «целевая» или «шаблонная» молекула нуклеиновой кислоты может относиться к анализируемой последовательности.

[0049] Нуклеотиды в молекуле нуклеиновой кислоты могут включать нуклеиновые кислоты природного происхождения и их функциональные аналоги. Примеры функциональных аналогов способны гибридизоваться с нуклеиновой кислотой специфичным для последовательности образом или могут использоваться в качестве шаблона для репликации конкретной нуклеотидной последовательности. Нуклеотиды природного происхождения обычно имеют каркас, содержащий фосфодиэфирные связи. Структура аналога может иметь альтернативную каркасную связь, в том числе любую из множества известных в данной области. Нуклеотиды природного происхождения обычно содержат сахар дезоксирибозу (например, присутствующую в ДНК) или сахар рибозу (например, присутствующую в РНК). Структура аналога может иметь альтернативную сахарную функциональную группу, в том числе любую из множества известных в данной области. Нуклеотиды могут включать природные или неприродные основания. Природная ДНК может включать один или более из аденина, тимина, цитозина и/или гуанина, а природная РНК может включать один или более из аденина, урацила, цитозина и/или гуанина. Можно использовать любое неприродное основание, такое как запертая нуклеиновая кислота (ЗНК) и мостиковая нуклеиновая кислота (МНК).

[0050] Положительно заряжаемая функциональная группа: положительно заряжаемая функциональная группа может представлять собой любую функциональную группу, которая несет или может нести положительный заряд. В одном примере положительный заряд может быть введен в заряжаемую функциональную группу посредством реакции замещения. В других примерах положительно заряжаемая функциональная группа несет положительный заряд при определенном значении pH (например, физиологическом pH).

[0051] Праймер: молекула нуклеиновой кислоты, которая может гибридизироваться с исследуемой целевой последовательностью. В одном примере праймер функционирует в качестве субстрата, на котором можно полимеризовать нуклеотиды с помощью полимеразы. Например, праймер для амплификации или захватный праймер может служить отправной точкой для амплификации шаблона и генерации кластеров. В другом примере синтезированная цепь нуклеиновой кислоты может включать сайт, с которым может гибридизироваться праймер (например, праймер для секвенирования), чтобы праймировать синтез новой цепи, комплементарной цепи синтезированной нуклеиновой кислоты. Любой праймер может включать любую комбинацию нуклеотидов или их аналогов. В некоторых примерах праймер представляет собой одноцепочечный олигонуклеотид или полинуклеотид. Длина праймера может иметь любое число оснований и может включать различные неприродные нуклеотиды. В одном примере праймер для секвенирования представляет собой короткую цепь, имеющую длину в диапазоне от 10 до 60 оснований или от 20 до 40 оснований.

[0052] Образец: любой источник генетического материала, такой как клетки, микробиомы или нуклеиновые кислоты. В некоторых примерах клетка представляет собой одиночную клетку, в том числе прокариотическую или эукариотическую клетку. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой клетку млекопитающего, человеческую клетку или бактериальную клетку. В некоторых примерах нуклеиновая кислота представляет собой длинную молекулу ДНК, включающую вирусные нуклеиновые кислоты, бактериальные нуклеиновые кислоты или нуклеиновые кислоты млекопитающих. В некоторых примерах образец связывают (в виде фрагментов) посредством вставки транспозонов, соединенных с поверхностью твердой подложки (например, гранул).

[0053] Готовые к секвенированию фрагменты нуклеиновых кислот: участок (фрагмент) генетического материала, имеющий адаптеры на 3’- и 5’-концах. В готовом к секвенированию фрагменте нуклеиновой кислоты каждый адаптер включает известную универсальную последовательность (например, комплементарную по меньшей мере участку праймера на проточной кювете) и последовательность праймера для секвенирования. Оба адаптера могут также включать индексную последовательность (штрихкод или метку). В одном примере одна сторона (например, сторона Р5) может содержать индекс гранулы (или другой твердой подложки), а другая сторона (например, сторона Р7) может содержать индекс образца. Готовый к секвенированию фрагмент нуклеиновой кислоты можно связать посредством вставки транспозонов на поверхность твердой подложки (например, гранулы) или непосредственно иммобилизовать с помощью связывающейся пары или иным расщепляемым линкером. Готовый к секвенированию фрагмент нуклеиновой кислоты также может содержаться в гидрогелевой подложке.

[0054] Посев: иммобилизация адаптированных фрагментов (например, готовых к секвенированию фрагментов нуклеиновых кислот) на гидрогеле примера описанных в настоящем документе проточных кювет.

[0055] Библиотека секвенирования: набор фрагментов нуклеиновых кислот из одной или более целевых молекул нуклеиновых кислот или ампликонов фрагментов. В некоторых примерах фрагменты связаны с одним или более адаптерами на их 3‘-и 5’-концах. В некоторых примерах библиотеку секвенирования получают из одной или более целевых молекул нуклеиновой кислоты, и она является частью комплекса.

[0056] Твердая подложка: небольшой объект, имеющий форму, описываемую, например, как сфера, овал, микросфера, или иную принятую форму частиц с симметричными или несимметричными размерами. Твердая подложка может иметь присоединенную к ней библиотеку секвенирования. Примеры материалов, которые можно использовать для твердой подложки, включают, без ограничений, стекло; пластик, такой как акрил, полистирол или сополимер стирола и другого материала, полипропилен, полиэтилен, полибутилен, полиуретан или политетрафторэтилен (TEFLON® производства The Chemours Co); полисахариды или сшитые полисахариды, такие как агароза или сефароза; нейлон; нитроцеллюлозу; смолу; кремнезем или материалы на основе кремнезема, включая кремний и модифицированный кремний; углеродное волокно, металл; неорганическое стекло; пучок оптических волокон или различные другие полимеры. Примеры твердых подложек включают стеклянные гранулы с контролируемыми порами, парамагнитные гранулы, золь тория, гранулы сефарозы, нанокристаллы и другие примеры, известные специалистам в данной области и описанные, например, в публикации Microsphere Detection Guide, Bangs Laboratories, Fishers Ind.

[0057] Тагментация: модификация молекулы нуклеиновой кислоты (например, образца ДНК или РНК) с помощью транспосомы для фрагментации молекулы нуклеиновой кислоты и пришивания адаптеров к 5‘ и 3’-концам фрагмента за одну стадию. Реакции тагментации можно использовать для получения библиотек секвенирования, в частности комплексов, которые включают твердую подложку. В реакциях тагментации за одну стадию выполняют случайную фрагментацию образца и пришивание адаптера, что повышает эффективность процесса подготовки библиотеки секвенирования.

[0058] Транспосома: интегрирующий фермент (например, интеграза или транспозаза) и нуклеиновая кислота, включая сайт распознавания интеграции (например, сайт распознавания транспозазы).

[0059] Универсальная нуклеотидная последовательность: область последовательности, которая является общей для двух или более молекул нуклеиновых кислот, причем молекулы также имеют области, отличающиеся друг от друга. Универсальная последовательность, присутствующая в различных элементах набора молекул, может обеспечивать захват нескольких различных нуклеиновых кислот с использованием популяции универсальных захватных нуклеиновых кислот (т. е. адаптера, который имеет последовательность, комплементарную по меньшей мере части праймера). Аналогичным образом универсальная последовательность, присутствующая в разных элементах набора молекул, позволяет проводить амплификацию или репликацию нескольких различных нуклеиновых кислот с применением популяции универсальных сайтов связывания для секвенирования (последовательностей праймеров для секвенирования).

[0060] Способ получения положительно заряженной поверхности проточной кюветы

[0061] Пример способа 100 формирования примера проточной кюветы показан на Фиг. 1. Как видно на фигуре, один пример способа 100 включает введение текучей среды, содержащей положительно заряжаемую функциональную группу, в проточную кювету, содержащую исходный полимерный гидрогель, имеющий поверхностную функциональную группу, выбранную из группы, состоящей из отрицательно заряжаемого атома, азидной группы и алкиновой группы, и праймер для амплификации, присоединенный к исходному полимерному гидрогелю (номер позиции 102); и инкубирование исходного полимерного гидрогеля в текучей среде при определенной температуре и в течение некоторого времени с формированием таким образом катионного полимерного гидрогеля, включающего катионную функциональную группу (номер позиции 104).

[0062] Способ 100 также схематично показан на Фиг. 2A и Фиг. 2B.

[0063] Как показано на Фиг. 2A, в начале способа 100 проточная кювета 10 P (которая является предшественником проточной кюветы 10, показанной на Фиг. 2B) включает подложку 12, исходный полимерный гидрогель 14’ на подложке 12 и праймер 18 для амплификации, прикрепленный к исходному полимерному гидрогелю 14’.

[0064] Подложка 12, является по существу жесткой и нерастворимой в водной жидкости. Примеры подходящих подложек 12 включают эпоксисилоксан, полиэдрические олигомерные силсеквиоксаны (POSS) или их производные, стекло, модифицированное стекло, пластики, нейлон, керамику/керамические оксиды, кремнезем (оксид кремния (SiO2)), плавленый кварц, материалы на основе диоксида кремния, силикат алюминия, кремний, модифицированный кремний (например, легированный бором кремний p+), нитрид кремния (Si3N4), пентоксид тантала (TaO5) или другой (-ие) оксид (-ы) тантала (TaOx), оксид гафния (HfO2), неорганическое стекло или т. п. Примером POSS может служить описанный в публикации Kehagias et al., Microelectronics Engineering 86 (2009), pp. 776-778, которая полностью включена в настоящий документ путем ссылки. Некоторые примеры пластмасс, подходящих для подложки 12, включают акрилы, полистирол, сополимеры стирола и других материалов, полипропилен, полиэтилен, полибутилен, полиуретаны, политетрафторэтилен (например, TEFLON® производства The Chemours Co.), циклические олефины/циклоолефиновые полимеры (COP) (например, ZEONOR® производства Zeon), полиимиды и т. д. Подложка 12 также может представлять собой стекло, кремний или POSS со слоем покрытия из оксида тантала или другого керамического оксида на поверхности. Другим примером подходящей подложки 12 является подложка типа «кремний на изоляторе».

[0065] Подложка 12 может иметь форму полупроводниковой пластины, панели, прямоугольного листа, кристалла или любую другую подходящую конфигурацию. В одном примере подложка 12 может представлять собой круглую полупроводниковую пластину или панель с диаметром в диапазоне от около 2 мм до около 300 мм. В качестве более конкретного примера подложка 12 представляет собой полупроводниковую пластину с диаметром в диапазоне от около 200 мм до около 300 мм. В другом примере подложка 12 может представлять собой прямоугольный лист или панель с наибольшим размером до около 10 футов (~ 3 метра). В качестве конкретного примера подложка 12 представляет собой кристалл с шириной в диапазоне от около 0,1 мм до около 10 мм. Хотя приведены примеры размеров, следует понимать, что можно использовать подложку 12 любых приемлемых размеров.

[0066] Подложка 12, показанная на Фиг. 2A, имеет выполненную в ней дорожку 20. Дорожка 20 может быть образована в подложке 12 с использованием любого подходящего способа, который частично зависит от материала (-ов) подложки 12. В одном примере дорожка 20 вытравлена в стеклянной подложке 12. В другом примере дорожка 20 может быть сформирована в полимерной подложке 12 с помощью фотолитографии, наноимпринт-литографии и т. д. В еще одном примере на подложку 12 можно нанести отдельный материал (не показан) таким образом, что этот отдельный материал образует стенки дорожки 20, а подложка 12 образует нижнюю часть дорожки 20.

[0067] В одном примере дорожка 20 имеет прямолинейную конфигурацию. Длина и ширина дорожки 20 могут быть соответственно меньше длины и ширины подложки 12, так что часть поверхности 22 подложки, окружающая дорожку 20, доступна для прикрепления к крышке (не показана). В некоторых случаях ширина каждой дорожки 20 может составлять по меньшей мере около 1 мм, по меньшей мере около 2,5 мм, по меньшей мере около 5 мм, по меньшей мере около 7 мм, по меньшей мере около 10 мм или более. В некоторых случаях длина каждой дорожки 20 может составлять по меньшей мере около 10 мм, по меньшей мере около 25 мм, по меньшей мере около 50 мм, по меньшей мере около 100 мм или более. Ширина и/или длина каждой дорожки 20 может быть больше, меньше вышеуказанных значений или может иметь промежуточное значение. В одном примере дорожка 20 имеет квадратную форму (например, 10 мм x 10 мм).

[0068] Глубина каждой дорожки 20 может иметь глубину в один слой, при использовании микроконтактной, аэрозольной или струйной печати для нанесения отдельного материала, который образует стенки дорожки. В других примерах глубина каждой дорожки 20 может составлять около 1 мкм, около 10 мкм, около 50 мкм или более. В одном примере глубина может находиться в диапазоне от около 10 мкм до около 30 мкм. В дополнение к положительно заряженному полимерному гидрогелю, который притягивает освобожденные фрагменты библиотеки, эта глубина может способствовать блокировке боковой диффузии освобожденных фрагментов библиотеки между соседними дорожками 20, например, при использовании множества дорожек 20. В другом примере глубина составляет около 5 мкм или менее. Следует понимать, что глубина каждой дорожки 20 может быть больше, меньше вышеуказанных значений или может иметь промежуточное значение.

[0069] Хотя на Фиг. 2A показана одна дорожка 20, следует понимать, что подложка 12 может включать множество дорожек (например, 2, 3, 4, 8 и т. д.), отделенных друг от друга по текучей среде.

[0070] В примере, показанном на Фиг. 2A, дорожка 20 содержит исходный полимерный гидрогель 14'. Перед встраиванием или присоединением катионной функциональной группы 16 (Фиг. 2B) гидрогель может называться исходным полимерным гидрогелем 14' (см. Фиг. 2A). После встраивания или присоединения катионной функциональной группы 16 гидрогель может называться катионным полимерным гидрогелем 14 (см. Фиг. 2B).

[0071] Исходный полимерный гидрогель 14' может представлять собой сополимер из по меньшей мере двух различных мономерных звеньев. Исходный полимерный гидрогель 14' может быть представлен следующим образом: (M1)n(M2)m, где M1 - первое мономерное звено, M2 - второе мономерное звено, n - целое число в диапазоне от 1 до 50 000, а m - целое число в диапазоне от 1 до 100 000. В катионном полимерном гидрогеле 14 M1 можно заменить на M1' (описано со ссылкой на Фиг. 3) или M1" (описано со ссылкой на Фиг. 4), но M2, n и m будут такими же, как описано для исходного полимерного гидрогеля 14'. Далее более подробно описаны примеры каждого из мономерных звеньев M1, M2.

[0072] Одно из мономерных звеньев М1 включает поверхностную функциональную группу, выбранную из группы, состоящей из отрицательно заряжаемого атома, азидной группы и алкиновой группы. Отрицательно заряжаемый атом может представлять собой любую легко замещаемую группу, такую как относительно слабый нуклеофил. Некоторые конкретные примеры отрицательно заряжаемого атома включают галоген, такой как бром, иод и т. д.

[0073] Каждая из этих поверхностных функциональных групп мономерного звена М1 может быть замещена или ковалентно присоединена к праймеру 18 для амплификации. Например, бром может замещаться фосфотиоатной группой на 5'-конце праймера 18. В другом примере азидная группа способна ковалентно связываться с алкиновой группой на 5'-конце праймера 18. В еще одном примере алкиновая группа способна ковалентно связываться с азидной группой на 5'-конце праймера 18.

[0074] Каждая из этих поверхностных функциональных групп мономерного звена М1 также может обеспечивать присоединение катионной функциональной группы 16 к исходному полимерному гидрогелю 14' с получением катионного полимерного гидрогеля 14.

[0075] В некоторых примерах поверхностная функциональная группа мономерного звена М1 замещена катионной функциональной группой 16, и, таким образом, катионная функциональная группа 16 становится интегрированной в мономерное звено М1. Иными словами, катионная функциональная группа 16 присоединяется к мономерному звену M1 в том же положении, в котором присоединена поверхностная функциональная группа. Например, поверхностная функциональная группа может представлять собой более слабые окислительно-восстановительные соединения, чем катионная функциональная группа 16, и может происходить реакция замещения, когда поверхностная функциональная группа меняется на катионную функциональную группу 16. Примером заменяемой поверхностной функциональной группы является отрицательно заряжаемый атом, такой как бром.

[0076] В других примерах поверхностная функциональная группа взаимодействует с линкером для присоединения катионной функциональной группы 16 к мономерному звену M1. Например, азидная группа способна ковалентно связываться с концевой алкиновой группой линкера. В еще одном примере алкиновая группа способна ковалентно связываться с концевой азидной группой линкера.

[0077] С учетом мультифункциональности поверхностной функциональной группы мономерного звена M1 следует понимать, что некоторые из поверхностных функциональных групп мономерного звена M1 будут присоединять праймеры 18 для амплификации, а некоторые из поверхностных функциональных групп будут замещаться катионной функциональной группой 16 или присоединяться к ней. В некоторых случаях количество присоединенных праймеров 18 для амплификации от около 10 раз до около 50 раз больше количества присоединенных катионных функциональных групп 16.

[0078] Любое мономерное звено М1, которое включает поверхностную функциональную группу, описанную в настоящем документе, и которое может сополимеризоваться с другим (-ими) мономерным (-ыми) звеном (-ями) М2, можно использовать для образования исходного полимерного гидрогеля 14'. В одном примере мономерное звено М1 (включающее поверхностную функциональную группу) также включает акриламидное звено: . Можно также использовать вариации акриламидного звена, например, углерод в алкене может быть необязательно замещенным, или N может быть необязательно замещенным. Примеры других акриламидных звеньев включают метакриламид, N, N-диметилакриламид, этилакриламид и т. д.

[0079] Одним конкретным примером мономерного звена М1, которое включает как акриламидное звено, так и бром в качестве отрицательно заряжаемого атома, является N-(5-бромацетамидилпентил) акриламид (brapa):

Можно также использовать варианты N-(5-бромацетамидилпентил)акриламида, например, алкильная цепь -(CH2)- может иметь длину от 1 до 50, и/или каждый из -(CH2)- может быть необязательно замещенным.

[0080] Одним конкретным примером мономерного звена М1, которое включает как акриламидное звено, так и азидную группу, является N-(5-азидоацетамидилпентил)акриламид:

Схема 1В – Синтез линейного полиазидоакриламида (PAZAM)

MF – диметилформамид

Acrylamide – акриламид

KPS - персульфат калия

TEMED - N,N,N',N'-Тетраметилэтилендиамин

IPHA - изофталевая кислота.

Можно также использовать варианты N-(5-азидоацетамидилпентил)акриламида, например, алкильная цепь -(CH2)- может иметь длину от 1 до 50, и/или каждый из -(CH2)- может быть необязательно замещенным. Другой пример мономерного звена М1, включающего как акриламидное звено, так и азидную группу, представлен формулой:

,

где R1 представляет собой H или C1-C4 алкил; R2 представляет собой H или C1-C4 алкил; L представляет собой связывающую группу, включающую линейную цепь из 2-20 атомов, выбранных из группы, состоящей из углерода, кислорода и азота и необязательных заместителей у углерода и любых атомов азота в цепи; E представляет собой линейную цепь, содержащую от 1 до 4 атомов, выбранных из группы, состоящей из углерода, кислорода и азота и необязательных заместителей у углерода и любых атомов азота в цепи; A представляет собой N-замещенный амид с H или C1-C4 алкилом, присоединенным к N; и Z представляет собой азотсодержащий гетероцикл. Примеры Z включают 5-10 членов кольца, присутствующих в виде одной циклической структуры или слитой структуры. Еще один пример мономерного звена М1, включающего как акриламидное звено, так и азидную группу, представлен формулой:

где R3a выбран из водорода, необязательно замещенного алкила, необязательно замещенного фенила или необязательно замещенного C7-C14 аралкила; R3b выбран из водорода, необязательно замещенного алкила или необязательно замещенного фенила; и L1 выбран из необязательно замещенной алкиленовой связывающей группы или необязательно замещенной гетероалкиленовой связывающей группы.

[0081] Одним конкретным примером мономерного звена М1, которое включает как акриламидное звено, так и алкиновую группу, является N-пропаргилакриламид:

[0082] Следует понимать, что для образования исходного полимерного гидрогеля 14' могут использоваться другие мономерные звенья М1, при условии, что они функционализированы одной из поверхностных функциональных групп, описанных в настоящем документе.

[0083] Любое из мономерных звеньев М1 может быть сополимеризовано со вторым мономерным звеном М2 с образованием исходного полимерного гидрогеля 14'. Примеры второго мономерного звена M2 включают акриламидное звено, N, N-диметилакриламидное звено: , или , где R4a выбран из водорода, необязательно замещенного алкила, необязательно замещенного фенила или необязательно замещенного C7-C14 аралкила; R4b выбран из водорода, необязательно замещенного алкила или необязательно замещенного фенила; и L2 выбран из необязательно замещенной алкиленовой связывающей группы или необязательно замещенной гетероалкиленовой связывающей группы. Второе мономерное звено M2 не включает поверхностную функциональную группу (например, отрицательно заряжаемый атом, азидную группу или алкиновую группу) первого мономерного звена M1.

[0084] В других примерах мономерное звено M1 может быть сополимеризовано как с акриламидным звеном (например, мономерное звено M2), так и с N, N-диметилакриламидом (например, мономерное звено M3) с образованием исходного полимерного гидрогеля 14'. В этих примерах исходный полимерный гидрогель 14' может быть представлен как (M1)n(M2)m(M3)q, где n представляет собой целое число в диапазоне от 1 до 50 000, m представляет собой целое число в диапазоне от 1 до 100 000, а q представляет собой целое число в диапазоне от 1 до 100 000. В соответствующем катионном полимерном гидрогеле 14 M1 можно заменить на M1' (описано со ссылкой на Фиг. 3) или на M1" (описано со ссылкой на Фиг. 4), но M2, M3, n, m и q будут аналогичны описанным для исходного полимерного гидрогеля 14'.

[0085] В некоторых примерах исходный полимерный гидрогель 14' (либо (M1)n(M2)m, либо (M1)n(M2)m(M3)q) (и соответствующий катионный полимерный гидрогель 14) может представлять собой линейный сополимер или слабо поперечносшитый сополимер. Молекулярная масса исходного полимерного гидрогеля 14’ может находиться в диапазоне от около 10 кДа до около 1500 кДа или в конкретных примерах может составлять около 312 кДа или около 500 кДа. Молекулярная масса катионного полимерного гидрогеля 14 может быть выше, чем у соответствующего исходного полимерного гидрогеля 14', в зависимости от встроенной в него катионной функциональной группы 16 или катионной функциональной группы 16 и присоединенного к ней линкера.

[0086] Специалисту в данной области будет понятно, что конфигурация повторяющихся элементов n и m или n, m и q является типичной, а мономерные субъединицы могут присутствовать в любом порядке в структуре исходного полимерного гидрогеля 14’ / катионного полимерного гидрогеля 14 (например, случайная, блочная, структурированная форма или их комбинация).

[0087] Для введения исходного полимерного гидрогеля 14' в дорожку 20 можно получить смесь сополимера (либо (M1)n(M2)m, либо (M1)n(M2)m(M3)q), а затем нанести на подложку 12. В одном примере сополимер может присутствовать в смеси (например, с водой или с этанолом и водой). Затем смесь сополимера может быть нанесена на поверхность (-и) 22 подложки с помощью метода центрифугирования, или погружения, или потоком материала при положительном или отрицательном давлении, или с использованием другой подходящей методики.

[0088] В некоторых примерах поверхность 22 подложки (включая часть, которая является открытой на дорожке 20) можно активировать, а затем нанести на нее смесь сополимера. В одном примере силан или производное силана (например, норборненсилан) можно осадить на поверхность 22 подложки с помощью осаждения из паровой фазы, нанесения методом центрифугирования или других методов осаждения. В другом примере поверхность 22 подложки может подвергаться плазменному озолению с образованием активирующего (-их) поверхность агента (-ов) (например, групп -OH), который (-ые) может (могут) прилипать к сополимеру. В других примерах для активации поверхности 22 подложки можно использовать плазменное озоление с последующей силанизацией.

[0089] В зависимости от сополимера нанесенную смесь можно подвергать процессу отверждения с образованием исходного (ковалентно связанного) полимерного гидрогеля 14' на поверхности 22. В одном примере отверждение может происходить при температуре в диапазоне от комнатной температуры (например, около 25 °C) до около 95 °C в течение времени в диапазоне от около 1 миллисекунды до около нескольких дней. Затем можно выполнить полировку, чтобы удалить исходный полимерный гидрогель 14’ с поверхности 22 по периметру подложки 12, оставив при этом исходный полимерный гидрогель 14’ на поверхности 22 дорожки 20 по меньшей мере по существу нетронутым.

[0090] Проточная кювета 10P также включает праймер 18 для амплификации.

[0091] Для встраивания праймеров 18 для амплификации в исходный полимерный гидрогель 14' на дорожке 20 можно выполнить процесс прививания. В одном примере праймеры 18 для амплификации можно иммобилизовать на исходном полимерном гидрогеле 14' с помощью одноточечного ковалентного прикрепления за 5′-конец праймеров 18 или вблизи него. Данное прикрепление оставляет i) специфичный для адаптера участок праймеров 18 свободным для отжига с распознаваемым им готовым к секвенированию фрагментом нуклеиновой кислоты и ii) 3′-гидроксильную группу свободной для достройки праймера. Для этой цели можно использовать любое подходящее средство ковалентного связывания. Примеры праймеров с пригодными для использования концевыми группами включают праймеры с концевыми алкинами (например, которые могут присоединяться к азидной поверхностной функциональной группе исходного полимерного гидрогеля 14’), праймеры с концевыми фосфотиоатными группами (например, которые могут присоединяться к поверхностной функциональной группе брома исходного полимерного гидрогеля 14’) или праймеры с концевыми азидными группами (например, которые могут быть присоединены к алкиновой поверхностной функциональной группе исходного полимерного гидрогеля 14’). Конкретные примеры подходящих праймеров 18 включают праймеры P5 и P7, используемые на поверхности доступных в продаже проточных кювет, продаваемых компанией Illumina Inc., для секвенирования на приборах HISEQ™, HISEQX™, MISEQ™, MISEQDX™, MINISEQ™, NEXTSEQ™, NEXTSEQDX™, NOVASEQ™, GENOME ANALYZER™, ISEQ™ и других инструментальных платформах.

[0092] В одном примере прививание может включать проточное нанесение (например, с использованием временно связанной или постоянно связанной крышки), нанесение покрытия путем замачивания, нанесение напылением, нанесение трамбовкой или другим подходящим способом, при котором праймеры 18 будут присоединены к исходному полимерному гидрогелю 14' на дорожке 20. В каждом из данных примеров методик можно использовать раствор праймера или смесь праймера, которая может включать праймер (-ы), воду, буфер и катализатор. При использовании любого из способов прививания праймеры 18 взаимодействуют с реакционноспособными группами (например, с поверхностной функциональной группой мономерного звена M1) исходного полимерного гидрогеля 14' на дорожке 20 и не имеют аффинности к окружающей подложке 12. Таким образом, праймеры 20 избирательно прививаются на исходный полимерный гидрогель 14' в области дорожки 20.

[0093] Концентрация праймеров 18 в растворе или смеси праймеров может быть такой, чтобы некоторые из поверхностных функциональных групп мономерного звена M1 исходного полимерного гидрогеля 14' оставались доступными для взаимодействия или реакции для введения катионных функциональных групп 16 (Фиг. 2B).

[0094] Как показано на Фиг. 2A, текучую среду 24, включающую положительно заряжаемую функциональную группу 26, вводят в проточную кювету 10 P. Исходный полимерный гидрогель 14‘ можно инкубировать в текучей среде 24 при определенной температуре и в течение времени, достаточного для образования катионного полимерного гидрогеля 14, включающего катионную функциональную группу 16 (как показано на Фиг. 2B).

[0095] Используемая текучая среда 24 и положительно заряжаемая функциональная группа 26 могут зависеть от исходного полимерного гидрогеля 14' и, в частности, от поверхностной функциональной группы мономерного звена M1 в исходном полимерном гидрогеле 14'. Температура и время инкубации могут также зависеть от положительно заряжаемой функциональной группы 26 и исходного полимерного гидрогеля 14'.

[0096] Некоторые примеры положительно заряжаемой функциональной группы 26 сами встраиваются в мономерное звено M1 исходного полимерного гидрогеля 14' с образованием катионного полимерного гидрогеля 14, включающего катионную функциональную группу 16. Когда катионная функциональная группа 16 «встроена в мономерное звено исходного полимерного гидрогеля», это означает, что катионная функциональная группа 16 заместила поверхностную функциональную группу мономерного звена M1 исходного полимерного гидрогеля 14'. В данном примере поверхностная функциональная группа представляет собой отрицательно заряжаемый атом, а положительно заряжаемая функциональная группа 26 представляет собой окислительно-восстановительные соединения, более сильные, чем отрицательно заряжаемый атом. В качестве примеров отрицательно заряжаемый атом мономерного звена М1 представляет собой бром, а положительно заряжаемая функциональная группа выбрана из группы, состоящей из трис(гидроксиметил)фосфина, трис(гидроксипропил)фосфина, тетракис(гидроксиметил)фосфина и трис(2-карбоксиэтил)фосфина. Любая из этих фосфиновых положительно заряжаемых функциональных групп может замещать атом брома мономерного звена M1 исходного полимерного гидрогеля 14‘, так что соответствующий фосфониевый катион становится частью мономерного звена M1' (см. Фиг. 3) катионного полимерного гидрогеля 14. В таблице 1 показана положительно заряжаемая функциональная группа 26, используемая в реакции замещения брома, и соответствующий катион, который встраивается в мономерное звено M1‘ катионного полимерного гидрогеля 14. В каждом из этих примеров противоион представляет собой бромид (Br-).

[0097] Пример такой реакции замещения показан на Фиг. 3. В данном примере исходный полимерный гидрогель 14’ представляет собой не содержащий силанов акриламид, включающий N-(5-бромацетамидилпентил)акриламид в качестве первого мономерного звена M1 и акриламид в качестве второго мономерного звена M2. При воздействии текучей среды 24, содержащей положительно заряжаемую функциональную группу 26 (в данном примере трис(гидроксипропил)фосфин), положительно заряжаемая функциональная группа 26 замещает отрицательно заряжаемый атом исходного полимерного гидрогеля 14'. Результатом реакции замещения является катионный полимерный гидрогель 14, который содержит катионную функциональную группу 16 (в данном примере катион трис(гидроксипропил)фосфония), присоединенную к мономерному звену M1', где бром был присоединен к мономерному звену M1'.

[0098] В примере, показанном на Фиг. 3, текучая среда 24 может включать буфер, имеющий pH в диапазоне от 6 до 12. Например, буфер может представлять собой трис-буфер или этаноламиновый буфер. Концентрация положительно заряжаемой функциональной группы 26 в текучей среде 24 может находиться в диапазоне от около 1 мМ до около 500 мМ. В одном примере концентрация положительно заряжаемой функциональной группы 26 в текучей среде 24 может находиться в диапазоне от около 50 мМ до около 400 мМ. В другом примере концентрация любой из фосфиновых положительно заряжаемых функциональных групп 26 в текучей среде 24 может составлять около 100 мМ.

[0099] В этом примере температура инкубации находится в диапазоне от около 18 °C до около 65 °C, а время инкубации находится в диапазоне от около 1,5 минуты до около 5 минут.

[0100] Следует понимать, что пример реакции, показанный на Фиг. 3, является одним примером реакции замещения и что можно использовать другие мономерные звенья M1 (например, содержащие другую замещаемую поверхностную функциональную группу), M2 и/или другие положительно заряжаемые функциональные группы 26.

[0101] Другие примеры положительно заряжаемой функциональной группы 26 присоединяются к мономерному звену M1 исходного полимерного гидрогеля 14' посредством линкера 28 (Фиг. 4) с образованием катионного полимерного гидрогеля 14, включающего катионную функциональную группу 16. Когда катионная функциональная группа 16 «присоединена к мономерному звену полимерного гидрогеля посредством линкера», это означает, что поверхностная функциональная группа мономерного звена M1 исходного полимерного гидрогеля 14’ взаимодействует с линкером 28 для присоединения катионной функциональной группы 16.

[0102] В этом примере поверхностная функциональная группа представляет собой азидную группу или алкиновую группу, и положительно заряжаемая функциональная группа 26 ковалентно присоединяется к поверхностной функциональной группе посредством линкера 28. В одном примере поверхностная функциональная группа (мономерного звена M1) включает концевую азидную группу, а линкер 28 включает алкиновую группу. В другом примере поверхностная функциональная группа (мономерного звена M1) включает концевую алкиновую группу, а линкер 28 включает азидную группу.

[0103] В дополнение к азидной группе или алкиновой группе линкер 28 также может включать цепь, которая может представлять собой одно звено -CH2, может включать несколько звеньев -CH2, несколько звеньев -CH2CH2O, олигонуклеотидную цепь или другую полимерную цепь. В одном примере линкер 28 представляет собой бифункциональный ДНК-олигонуклеотид. Термин «бифункциональный» означает, что один конец ДНК-олигонуклеотидного линкера имеет одну концевую группу, которая может присоединяться к исходному полимерному гидрогелю 14', и другую концевую группу, которая может присоединяться к катионной функциональной группе 16.

[0104] Любой пример линкера 28 также может быть расщепляемым. Под «расщепляемым» подразумевается, что линкер 28 включает расщепляемую связь, и, таким образом, катионная функциональная группа 16 может быть удалена с поверхности проточной кюветы. В качестве примеров линкер 28 может включать расщепляемую дисульфидную связь, фоторасщепляемую связь, расщепляемую фосфодиэфирную связь или их комбинации. В качестве одного примера фосфодиэфирные связи ДНК-олигонуклеотида могут быть расщеплены посредством ферментативного расщепления. В качестве других примеров линкер 28 может включать расщепляемую дисульфидную связь (S-S) или фоторасщепляемую связь (например, линкеры, содержащие нитробензильную группу, например, фоторасщепляемый спейсер:

(поставляется компанией Integrated DNA Technologies). В одном примере расщепляемая связь расположена между концевой азидной или алкиновой группой и положительно заряжаемой функциональной группой 26. Расщепляемая связь в линкере 28 может быть желательной, чтобы катионную функциональную группу 16 можно было удалить из катионного полимерного гидрогеля 14, например, после посева фрагментов библиотеки, после экстракции ДНК из лизата и т. п. Расщепление катионной функциональной группы 16 приведет к удалению положительных зарядов, и поверхность проточной кюветы вернется в свое исходное состояние заряда (например, заряда до внедрения катионной функциональной группы 16).

[0105] В данном примере положительно заряжаемая функциональная группа 26 может представлять собой любую группу, которая несет или может нести положительный заряд и которая может присоединяться к линкеру 28. В качестве примеров положительно заряжаемая функциональная группа 26 может представлять собой аминогруппу, такую как полилизин, полиамидоамин и т. п., которая может нести положительный заряд при физиологическом pH (что приводит к образованию протонированной аминогруппы: R-NH3+ в качестве катионной функциональной группы 16), или четвертичную аммониевую соль, которая может нести положительный заряд при большинстве значений pH (что приводит к образованию катиона четвертичного аммония: в качестве катионной функциональной группы 16), или ион сульфония: . В некоторых примерах исходный полимерный гидрогель 14’ может включать комбинации различных положительно заряжаемых функциональных групп 26.

[0106] В некоторых примерах положительно заряжаемая функциональная группа 26 присоединяется к линкеру 28, и полученное соединение 30 (Фиг. 4) встроено в текучую среду 24, которую вводят в проточную кювету 10 P для получения катионного полимерного гидрогеля 14. Эти соединения 30 могут быть доступны в продаже или могут быть синтезированы. В качестве примеров подходящих соединений 30 азидсодержащий или алкинсодержащий линкер 28 может быть присоединен к любой из групп R аминогруппы, четвертичной аммониевой группы или иона сульфония. Один пример соединения 30 представляет собой бромид пропаргилхолина:

PAZAM - полиазидоакриламида

Triazoline – триазолин

Propargyl choline bromide - бромид пропаргилхолина

PMDTA - пентаметил-диэтилентриамин

Sodium Ascorbate - аскорбат натрия,

который включает алкиновый линкер 28, присоединенный к катиону N,N,N-триметилэтаноламмония (который относится к холиновому классу четвертичных аммонийных катионов). Другие примеры соединений 30 включают азидоэтил-SS-этиламин:

,

который включает азидсодержащий линкер 28, присоединенный к аминогруппе (которая может образовывать протонированный амин), или пропаргил-SS-этиламин:

,

который включает алкинсодержащий линкер 28, присоединенный к аминогруппе (которая может образовывать протонированный амин). Эти два конкретных линкера 28 включают азидную группу (N3) или алкиновую группу (C≡C), а также расщепляемую дисульфидную связь (S-S) в алкильной цепи.

[0107] Пример использования линкера 28 для присоединения положительно заряжаемой функциональной группы 26 к исходному полимерному гидрогелю 14’ показан на Фиг. 4. В данном примере исходный полимерный гидрогель 14' включает N-(5-азидоацетамидилпентил)акриламид в качестве первого мономерного звена M1 и акриламид в качестве второго мономерного звена M2. При воздействии текучей среды 24, содержащей положительно заряжаемую функциональную группу 26 (в данном примере представляет собой бромид пропаргилхолина), азидная группа первого мономерного звена М1 и алкиновая группа соединения 30 вступают в катализируемую медью реакцию азид-алкинового циклоприсоединения (CuAAC). В результате реакции CuAAC получают катионный полимерный гидрогель 14, который включает катионную функциональную группу 16 (в данном примере представляет собой катион N,N,N-триметилэтаноламмония), присоединенную к триазолу мономерного звена M1'.

[0108] В примере, показанном на Фиг. 4, текучая среда 24 может включать воду. Концентрация соединения 30 в текучей среде 24 может находиться в диапазоне от около 100 нМ до около 100 мкМ. Поскольку реакция связывания представляет собой реакцию CuAAC, текучая среда 24 может также включать катализатор и лиганд или катализатор, лиганд и восстановитель. Эти компоненты можно добавить в текучую среду 24, чтобы ввести их в проточную кювету 10 P. Можно использовать любой медный катализатор, образующий ионы меди (II), такой как CuSO4. Можно использовать любой лиганд, такой как N, N,N’,N’’,N’’-пентаметилдиэтилентриамин (PMDTA). Можно использовать любой восстанавливающий агент, такой как аскорбат натрия. В одном примере текучая среда 24 содержит от около 0,25 мол.% до около 2 мол.% медного катализатора и от около 5 мол.% до около 10 мол.% восстанавливающего агента.

[0109] В этом примере температура инкубации находится в диапазоне от около 18 °C до около 60 °C, а время инкубации находится в диапазоне от около 30 минут до около 12 часов. В другом примере температура инкубации для реакции CuAAC находится в диапазоне от около 18 °C до около 22 °C, а время инкубации находится в диапазоне от около 60 минут (1 час) до около 6 часов или от около 6 часов до около 12 часов.

[0110] Следует понимать, что пример реакции, показанный на Фиг. 4, является одним примером реакции присоединения и что можно использовать другие мономерные звенья M1, M2, другие линкеры 28 и/или другие положительно заряжаемые функциональные группы 26.

[0111] В других примерах для получения катионного полимерного гидрогеля 14, включающего катионную функциональную группу 16, можно использовать комбинацию способов, показанных на Фиг. 3 и Фиг. 4. Один пример показан на Фиг. 5A и Фиг. 5B.

[0112] В этом примере линкер 28’, содержащий концевой азид или алкин на одном конце и концевой отрицательно заряжаемый атом (например, бром, иод или другой слабый нуклеофил) на другом конце, присоединяется к поверхностной функциональной группе мономерного звена M1 исходного полимерного гидрогеля 14'. Когда линкер 28' содержит концевой азид, поверхностная функциональная группа мономерного звена M1 представляет собой алкин, а когда линкер 28' содержит концевой алкин, поверхностная функциональная группа мономерного звена M1 представляет собой азид. Реакция связывания может быть проведена способом, аналогичным описанному со ссылкой на Фиг. 4. Это приводит к получению модифицированного полимерного гидрогеля 14’’, как показано на Фиг. 5A.

[0113] Модифицированный полимерный гидрогель 14’’ затем может подвергаться реакции замещения, как описано со ссылкой на Фиг. 3. Текучую среду 24, содержащую положительно заряжаемую функциональную группу 26, которая сильнее, чем отрицательно заряжаемый атом (например, бром) модифицированного полимерного гидрогеля 14’’, можно вводить в проточную кювету 10 P. Как описано со ссылкой на Фиг. 3, положительно заряжаемая функциональная группа 26 вытесняет и замещает отрицательно заряжаемый атом с образованием другого примера катионного полимерного гидрогеля 14.

[0114] При проведении инкубации при определенной температуре и в течение подходящего периода времени образуется катионный полимерный гидрогель 14 (как показано на Фиг. 5B), который имеет на своей поверхности как катионную функциональную группу 16, так и праймер (-ы) 18 для амплификации.

[0115] Следует понимать, что примеры реакций, показанных на Фиг. 5A и Фиг. 5B, являются одним примером реакций замещения и присоединения и что могут применяться другие мономерные звенья M1 (например, имеющие другую замещаемую поверхностную функциональную группу), M2, другие линкеры 28 и/или другие положительно заряжаемые функциональные группы 26.

[0116] Проточная кювета 10 с положительно заряженным (катионным) полимерным гидрогелем 14 показана на Фиг. 2B. Проточная кювета 10, показанная на Фиг. 2B, включает подложку 12, катионный полимерный гидрогель 14 на подложке 12, катионную функциональную группу 16, i) интегрированную в мономерное звено M1’ катионного полимерного гидрогеля 14 или ii) присоединенную к мономерному звену M1’ полимерного гидрогеля 14 посредством линкера 28, 28’, и праймер 18 для амплификации, присоединенный к катионному полимерному гидрогелю 14.

[0117] Положительно заряженный полимерный гидрогель 14 может притягивать отрицательно заряженный комплекс или образец, введенный в проточную кювету 10, и, таким образом, дополнительный захватный сайт можно не использовать.

[0118] Дополнительные архитектуры проточных кювет

[0119] Хотя один из примеров архитектуры проточной кюветы показан на Фиг. 2B, следует понимать, что можно использовать и другие архитектуры проточных кювет.

[0120] Другой пример проточной кюветы 10’ показан на Фиг. 6. Данный пример аналогичен примеру, показанному на Фиг. 2B, за исключением того, что подложка 12 включает множество углублений 32, разделенных промежуточными областями 34, и катионный полимерный гидрогель 14 (включающий катионную функциональную группу 16) и праймер (-ы) 18 для амплификации расположены внутри каждого из углублений 32. В примере, показанном на Фиг. 6, углубления 32 образованы в дорожке 20.

[0121] В данном примере углубления 32 могут быть сформированы в подложке 12. Формирование может включать вытравливание углублений 32 в подложке 12 и/или использование импринт-литографии. Затем углубления 32 могут быть функционализированы катионным полимерным гидрогелем 14 (включающим катионную функциональную группу 16) и праймером (-ами) 18 для амплификации, как описано в настоящем документе. На промежуточных областях 34 между углублениями 32 отсутствует катионный полимерный гидрогель 14 (содержащий катионную функциональную группу 16) или праймер (-ы) 18 для амплификации. Это может быть обусловлено тем, что исходный полимерный гидрогель 14' прошел полировку промежуточных областей 34. После функционализации углублений 32 дополнительный материал 36 (например, гидрофобный материал) может быть прикреплен (например, связан, приклеен и т. д.) к подложке 12 (например, по периметру) с образованием стенок дорожки 20 вокруг углублений 32.

[0122] Углубления 32 могут быть распределены по проточной кювете 10' в соответствии с любым подходящим узором или схемой. Если проточная кювета 10' содержит множество дорожек 20, узор углублений 32 может быть одинаковым, или на разных дорожках 20 могут быть использованы разные узоры углублений 32. Может быть предусмотрено множество различных узоров/схем размещения углублений 32, включая правильные, повторяющиеся и неправильные узоры. В одном примере углубления 32 расположены шестиугольной сеткой для плотной упаковки и повышения плотности. Другие схемы размещения могут включать , например, размещение параллелограммом (т. е. прямоугольное, квадратное и т. д.), размещение треугольниками, по окружности и т. п.

[0123] Каждое углубление 32 может иметь любую подходящую форму (и соответствующую 3-мерную геометрию), такую как круг (как показано на Фиг. 6), овал, многоугольник (например, треугольник, четырехугольник, пятиугольник и т. д.) и т. п.

[0124] Размер каждого углубления 32 может характеризоваться площадью его отверстия, диаметром и/или длиной и шириной.

[0125] Площадь, занимаемая каждым отверстием углубления, может быть выбрана так, чтобы комплекс не мог попасть в углубление 32. В одном примере площадь каждого отверстия углубления может составлять по меньшей мере около 1 × 10-4 мкм2, по меньшей мере 1 × 10-3 мкм2, по меньшей мере около 1 × 10-2 мкм2, по меньшей мере около 0,1 мкм2, по меньшей мере около 0,5 мкм2, по меньшей мере около 1 мкм2 или по меньшей мере около 4 мкм2. Площадь, занимаемая каждым отверстием углубления, может быть меньше указанных значений или находиться в промежутке между указанными выше значениями.

[0126] В некоторых случаях диаметр или длина и ширина каждого углубления 32 могут составлять по меньшей мере около 1 нм, по меньшей мере около 50 нм, по меньшей мере около 100 нм, по меньшей мере около 500 нм или более, при условии, что размер меньше диаметра или длины и ширины дорожки. Пример диаметра углубления находится в диапазоне от около 1 нм до около 500 нм. Другой пример диаметра углубления находится в диапазоне от около 300 нм до около 2 мкм.

[0127] Углубления 32 также могут иметь глубину. Например, глубина каждого углубления 32 может составлять по меньшей мере около 10 нм, по меньшей мере около 50 нм, по меньшей мере около 1 мкм, до около 2 мкм. Следует понимать, что глубина каждого углубления 32 может быть больше, меньше указанного значения или находится между указанными значениями.

[0128] В одном примере соотношение сторон (диаметр : глубина) углублений 32 может находиться в диапазоне от около 1 : 1 до около 1 : 2 или от около 1 : 1,25 до около 1 : 1,75.

[0129] В этом примере соседние углубления 32 могут быть разделены промежуточными областями 34 в пределах данной дорожки 20. Средний шаг углублений представляет собой расстояние от центра одного углубления 32 до центра соседнего углубления 32 (межцентровое расстояние) или расстояние от правого края одного углубления 32 до левого края соседнего углубления 32 (межкраевое расстояние). Расположение или узор углублений 32 может быть регулярным, так что коэффициент вариации относительно среднего шага является небольшим, или расположение или узор могут быть нерегулярным, и в этом случае коэффициент вариации может быть относительно большим. В любом случае средний шаг может составлять, например, по меньшей мере около 10 нм, по меньшей мере около 0,1 мкм, по меньшей мере около 0,5 мкм или более, в зависимости от размеров дорожки 20. Альтернативно или дополнительно средний шаг может составлять, например, не более около 0,5 мкм, не более около 0,1 мкм или менее. Средний шаг для конкретного расположения углублений 32 может находиться в диапазоне от одного из нижних значений до одного из верхних значений, выбранных из приведенных выше диапазонов.

[0130] Другой пример проточной кюветы 10’’ показан на Фиг. 7. Этот пример аналогичен примеру, показанному на Фиг. 6, за исключением того, что подложка 12 дополнительно включает множество камер 38, 38’, и при этом подгруппа множества углублений 32 расположена внутри периметра каждой из множества камер 38, 38'. Аналогично Фиг. 6 катионный полимерный гидрогель 14 (включающий катионную функциональную группу 16) и праймер (-ы) 18 для амплификации расположены внутри каждого из углублений 32.

[0131] В данном примере углубления 32 могут быть сформированы в подложке 12. Формирование может включать вытравливание углублений 32 в подложке 12 и/или использование импринт-литографии. Затем углубления 32 могут быть функционализированы катионным полимерным гидрогелем 14 (включающим катионную функциональную группу 16) и праймером (-ами) 18 для амплификации, как описано в настоящем документе. На промежуточных областях 34 между углублениями 32 отсутствует катионный полимерный гидрогель 14 (содержащий катионную функциональную группу 16) или праймер (-ы) 18 для амплификации. После функционализации углублений 32 дополнительный материал 36 (например, гидрофобный материал) может быть прикреплен (например, связан, приклеен и т. д.) к подложке 12 (например, по периметру) с образованием стенок камер 38, 38’ вокруг подгрупп углублений 32.

[0132] Камеры 38, 38' могут быть распределены по подложке 12 с любым подходящим узором или схемой. Может быть предусмотрено множество различных схем расположения камер 38, 38', включая регулярные, повторяющиеся и нерегулярные узоры. В одном примере камеры 38, 38’ расположены шестиугольной сеткой для плотной упаковки и повышения плотности. Другие схемы размещения могут включать , например, размещение параллелограммом (т. е. прямоугольное, квадратное и т. д.), размещение треугольниками, по окружности и т. п. В некоторых примерах схема или узор может иметь координатный формат x-y из камер 38, 38’, расположенных в строках и столбцах.

[0133] Камеры 38, 38' могут иметь любую подходящую форму, такую как квадрат, круг, овал, многоугольник (например, треугольник, четырехугольник, пятиугольник и т. д.) и т. п.

[0134] Размер каждой камеры 38, 38’ может характеризоваться площадью ее отверстия, диаметром и/или длиной и шириной. Как показано на Фиг. 7, проточная кювета 10’’ имеет множество углублений 32, расположенных в каждой из камер 38, 38'. Таким образом, величина камеры 38, 38’ больше размера каждого углубления 32. Иными словами, размер (-ы) камеры 38, 38’ больше размера (-ов) каждого углубления 32. В данном примере термин «размер» относится к площади, занимаемой каждым отверстием камеры или отверстием углубления, и/или к диаметру камеры 38, 38' или углубления 32, и/или длине и ширине каждой камеры 38, 38' или углубления 32. В примере, показанном на Фиг. 7, площадь отверстия и диаметр каждой из камер 38, 38' больше площади отверстия и диаметра каждого из углублений 32. Площадь отверстия, а также диаметр или длина и ширина каждой камеры 38, 38' зависят от числа углублений 32, которые должны быть расположены в камере 38, 38'.

[0135] Площадь, занимаемая каждым отверстием камеры, может быть выбрана таким образом, чтобы комплекс (примеры которого показаны на Фиг. 8A-8C) мог войти в камеру 38, 38'. В одном примере площадь каждого отверстия камеры может составлять по меньшей мере около 1 мкм2, по меньшей мере около 10 мкм2, по меньшей мере около 100 мкм2 или более. Площадь, занимаемая каждым отверстием камеры, может быть больше указанных значений или находиться в промежутке между указанными выше значениями.

[0136] В некоторых случаях диаметр или длина и ширина каждой камеры 38, 38' могут составлять по меньшей мере около 1 мкм, по меньшей мере около 10 мкм, по меньшей мере около 20 мкм, по меньшей мере около 30 мкм, по меньшей мере около 40 мкм, по меньшей мере около 50 мкм, по меньшей мере около 100 мкм или более. Пример диаметра камеры находится в диапазоне от около 1 мкм до около 1000 мкм. В другом примере диаметр камеры находится в диапазоне от около 10 мкм до около 50 мкм. Когда камера 38, 38' имеет длину и ширину, следует понимать, что длина и ширина могут быть одинаковыми или разными.

[0137] Камера 38, 38' также может иметь глубину, которая зависит от методики, используемой для формирования камеры 38, 38'. Например, каждая камера 38, 38’ может иметь глубину в один слой при использовании микроконтактной, аэрозольной или струйной печати для нанесения дополнительного материала 36, который образует камеры 38, 38’. В других примерах глубина каждой камеры 38, 38’ может составлять около 1 мкм, около 10 мкм, около 50 мкм или более. В другом примере глубина составляет по меньшей мере около 50% от среднего диаметра комплекса, который должен быть введен в камеру 38, 38'. В одном примере эта глубина может находиться в диапазоне от около 10 мкм до около 30 мкм. В дополнение к положительно заряженному полимерному гидрогелю 14, который притягивает освобожденные фрагменты библиотеки, глубина камер 38, 38’ может способствовать блокировке боковой диффузии освобожденных фрагментов библиотеки между соседними камерами 38, 38’. Таким образом, освобожденные фрагменты библиотеки могут удерживаться внутри камеры 38, 38' без какого-либо внешнего иммобилизирующего агента. В другом примере глубина составляет около 5 мкм или менее. Следует понимать, что глубина каждой камеры 38, 38’ может быть больше, меньше указанных выше значений или иметь промежуточные значения.

[0138] Соседние камеры 38, 38' могут быть разделены поверхностью из дополнительного материала 36. Средний шаг для камер представляет собой расстояние от центра одной камеры 38, 38’ до центра соседней камеры 38, 38’ (межцентровое расстояние) или расстояние от правого края одной камеры 38, 38’ до левого края соседней камеры 38, 38’ (межкраевое расстояние). Расположение или узор камер 38, 38’ может быть регулярным, так что коэффициент вариации относительно среднего шага является небольшим, или расположение или узор может быть нерегулярным, и в этом случае коэффициент вариации может быть относительно большим. В любом случае средний шаг может составлять, например, по меньшей мере около 1 мкм, по меньшей мере около 5 мкм, по меньшей мере около 10 мкм, по меньшей мере около 100 мкм или более. В одном примере средний шаг в 2 раза превышает диаметр камеры 14. Средний шаг для конкретного узора камер 38, 38’ может находиться в диапазоне от одного из нижних значений до одного из верхних значений, выбранных из приведенных выше диапазонов. Хотя предоставлены примеры средних значений шага для камер, следует понимать, что могут использоваться другие средние значения шага для камер.

[0139] Каждая подгруппа углублений 32 представляет собой место в пределах периметра каждой из множества камер 38, 38'.

[0140] Хотя это и не показано на Фиг. 6 или Фиг. 7, дорожка 20 проточной кюветы 10' или каждая камера 38, 38' проточной кюветы 10’’ может иметь захватный сайт, который может притягивать комплекс или образец, введенный в проточную кювету 10' или 10". Более конкретно, по меньшей мере участок промежуточной области 34 в пределах дорожки 20 или камеры 38, 38' может включать захватный сайт.

[0141] Захватный (-ые) сайт (-ы) может (могут) быть физически и/или химически способен (способны) иммобилизовать комплекс или образец на подложке 12 (например, на промежуточных областях 34) в пределах дорожки 20 или в камерах 38, 38'.

[0142] Захватный (-ые) сайт (-ы) может (могут) быть расположен (-ы) в любом подходящем месте. Положение захватного (-ых) сайта (-ов) в пределах подложки 12 может быть равномерным или неравномерным. Захватные сайты могут иметь любую подходящую форму, геометрию и размеры, которые могут по меньшей мере частично зависеть от конфигурации захватных сайтов (например, зоны, лунки, выступа и т. д.) и типа комплекса или образца, которые должны быть захвачены захватным (-ыми) сайтом (-ами).

[0143] В некоторых примерах захватный (-ые) сайт (-ы) представляет (-ют) собой захватный химический агент, который наносят на участок промежуточной области 34. Можно использовать любые примеры захватных химических агентов, описанных в настоящем документе. В одном примере соответствующие захватные химические агенты можно нанести в желательных местах с помощью микроконтактной печати или другой подходящей методики.

[0144] В других примерах захватный (-ые) сайт (-ы) включает (-ют) лунку, образованную на поверхности подложки 12. Лунка может быть сформирована с применением травления или импринтинга в зависимости от используемой подложки 12. Лунка может иметь любую подходящую форму и геометрию, например описанные в настоящем документе для углублений 32. В некоторых примерах лунка не содержит добавленного к ней дополнительного захватного химического агента. В этих примерах размеры отверстия позволяют комплексу или образцу самостоятельно собираться в соответствующей лунке (например, в зависимости от формы). В других примерах лунка содержит добавленный к ней захватный химический агент.

[0145] Другие примеры захватных сайтов включают лунку и захватную гранулу, имеющие на своей поверхности захватный химический агент. Захватная гранула может иметь размер, подходящий для ее расположения в лунках. В некоторых примерах захватные гранулы могут располагаться в одной плоскости с соседними промежуточными областями 34 или немного выступать над ними, так что комплекс или образец, которые в конечном итоге прикрепляются к ним, не заключены в лунку. В одном примере захватная гранула выбрана из группы, состоящей из диоксида кремния, суперпарамагнитного материала, полистирола и акрилата. Любые примеры захватного химического агента, описанного в настоящем документе, можно использовать на поверхности захватной гранулы и можно наносить на захватную гранулу перед ее введением в лунку.

[0146] Глубина лунки захватного сайта может варьироваться в зависимости от того, должны ли быть в нее введены захватный химический агент и захватная гранула. Глубину можно выбирать по меньшей мере для вмещения этих материалов (т. е. материал содержится внутри лунок). В одном примере глубина лунки находится в диапазоне от около 1 нм до около 5 мкм.

[0147] В качестве другого примера захватные сайты включают выступы, образованные в подложке 12. Выступы представляют собой трехмерные структуры, которые выступают наружу (вверх) от соседней поверхности. Выступы могут быть получены путем травления, фотолитографии, импринтинга и т. д. Хотя для выступающих захватных сайтов можно использовать любую подходящую трехмерную геометрию, желательной может быть геометрия с по меньшей мере по существу плоской верхней поверхностью. Примеры геометрических форм выступов включают сферу, цилиндр, куб, многоугольные призмы (например, прямоугольные призмы, шестиугольные призмы и т. п.) или т. д.

[0148] Различные захватные химические агенты можно наносить на верхнюю поверхность соответствующих выступающих захватных сайтов. Можно использовать любые примеры захватных химических агентов, описанные в настоящем документе, и можно применять любой способ осаждения для нанесения захватного химического агента на верхнюю поверхность выступов.

[0149] Следует понимать, что можно использовать любое сочетание типов захватных сайтов (например, захватный агент и лунка) на проточной кювете 10', 10’’.

[0150] Проточные кюветы 10, 10', 10’’ также показаны без прикрепленной к подложке 12 крышки. Следует понимать, что в некоторых примерах проточных кювет 10, 10’, 10’’ крышка может быть прикреплена по меньшей мере к участку подложки 12, например, на поверхности 22. Крышка может быть расположена на поверхности 22 таким образом, что она образует одну проточную дорожку 20, или множество разделенных по текучей среде проточных дорожек 20, или множество камер 38, 38', которые могут быть разделены или не разделены по текучей среде.

[0151] Крышка может быть выполнена из любого материала, прозрачного для возбуждающего света, направленного в сторону подложки 12. В качестве примеров крышка может представлять собой стекло (например, боросиликатное стекло, плавленый кварц и т. п.), пластик или т. п. Доступным в продаже примером подходящего боросиликатного стекла является D 263® от компании Schott North America, Inc. Доступные в продаже примеры подходящих пластиковых материалов, а именно циклоолефиновых полимеров, представляют собой продукты ZEONOR® производства Zeon Chemicals L.P.

[0152] Крышка может быть соединена с поверхностью 22 подложки с помощью любого подходящего способа, такого как лазерная пайка, диффузионная пайка, анодная пайка, пайка эвтектическим сплавом, пайка плазменным активированием, пайка стеклокристаллическим припоем, или другими способами, известными в данной области. В одном примере можно использовать слой разделителя при прикреплении крышки к поверхности 22 подложки. Слой разделителя может быть выполнен из любого материала, который будет герметично соединять по меньшей мере участок подложки 12 и крышку.

[0153] В других примерах проточные кюветы 10, 10’, 10’’ не включают крыши, а включают две соединенные друг с другом подложки 12. В этих примерах реакционные поверхности (например, полимерный гидрогель 14, праймеры 18) подложек 12 обращены друг к другу. Подложки 12 могут быть связаны друг с другом с помощью методов и материалов, аналогичных описанным для крышки и подложки 12.

[0154] Наборы

[0155] Проточная кювета 10 P может быть частью набора, который можно использовать для введения положительных зарядов в исходный полимерный гидрогель 14'. В одном примере набор включает i) проточную кювету 10P, которая содержит подложку 12, исходный полимерный гидрогель 14’, расположенный на подложке 12 и имеющий поверхностную функциональную группу, выбранную из группы, состоящей из отрицательно заряжаемого атома, азидной группы и алкиновой группы, и праймер 18 для амплификации, прикрепленный к исходному полимерному гидрогелю 14’; и ii) текучую среду 24, включающую положительно заряжаемую функциональную группу 26, который взаимодействует или реагирует с поверхностной функциональной группой с образованием катионного полимерного гидрогеля 14, включающего катионную функциональную группу 16.

[0156] Любые примеры описанных в настоящем документе архитектур проточной кюветы, включая кюветы 10, 10', 10’’, можно использовать в проточной кювете 10 P. Более того, можно использовать любой пример подложки 12, исходного полимерного гидрогеля 14' и праймера 18 для амплификации. Кроме того, в наборе можно использовать любой пример текучей среды 24, включающей положительно заряжаемую функциональную группу 26.

[0157] Набор можно использовать для осуществления способа 100, как описано в настоящем документе.

[0158] Комплексы для применения с проточными кюветами

[0159] Примеры проточной кюветы 10, 10', 10’’ могут быть особенно подходящими для использования с примерами комплексов, описанных в настоящем документе. Комплекс включает носитель (например, гидрогелевую подложку или твердую подложку) и готовые к секвенированию фрагменты нуклеиновых кислот, присоединенные к носителю или содержащиеся внутри него. Примеры подходящих комплексов показаны на Фиг. 8A-8C. Хотя описаны некоторые примеры способов получения комплексов, следует понимать, что могут применяться и другие способы, при условии, что готовые к секвенированию фрагменты нуклеиновых кислот присоединены к носителю или содержатся внутри носителя.

[0160] На Фиг. 8A проиллюстрирован комплекс 40A, который включает твердую подложку 42 и готовые к секвенированию фрагменты 44 нуклеиновых кислот, присоединенные к твердой подложке 42.

[0161] В одном примере для образования этого комплекса 40A адаптерная последовательность 52, 52' связывается с твердой подложкой 42 посредством одного элемента 46 связывающейся пары. В одном примере данная адаптерная последовательность 52, 52’ включает первую последовательность праймера для секвенирования (например, последовательность праймера для секвенирования 1 чтения) и первую последовательность (например, последовательность P5, модифицированную урацилом), которая комплементарна по меньшей мере части одного из праймеров 18 для амплификации (например, P5) на проточной кювете 10, 10', 10’’. Эта адаптерная последовательность 52, 52’ связана с одним из членов 46 связывающейся пары (например, биотином) таким образом, что она может связываться с поверхностью твердой подложки 42 (которая содержит другой член (например, авидин, стрептавидин и т. д.)) связывающейся пары. Эта адаптерная последовательность может также включать индексную последовательность.

[0162] Y-адаптер можно смешать с ферментом транспозазой (например, двумя молекулами Tn5) с образованием транспосомы. Y-адаптер может включать две мозаичные концевые последовательности, которые гибридизуются друг с другом. Одна из мозаичных концевых последовательностей может быть присоединена к другому адаптеру 48, 48’, который включает вторую последовательность праймера для секвенирования (например, последовательность праймера для секвенирования чтения 2), вторую последовательность (например, последовательность P7, модифицированную урацилом), которая комплементарна по меньшей мере части другого из праймеров 18 для амплификации (например, P7) на проточной кювете 10, 10’, 10’’, и необязательно последовательность индекса/штрихкода.

[0163] Затем может быть выполнен процесс тагментации. Текучую среду (например, буфер для тагментации), включающую образец (например, ДНК), можно добавить к транспосомам и твердой подложке 42, имеющей связанную с ней адаптерную последовательность 52, 52'. Когда образец контактирует с транспосомами, ДНК тагментируется (фрагментируется и помечается адаптером 52, 52’ на твердой подложке 42) и связывается с Y-адаптером (например, посредством лигирования свободной мозаичной концевой последовательности). Последовательная тагментация образца приводит к образованию множества мостиковых молекул между транспосомами. Мостиковые молекулы охватывают твердую подложку 42. Транспосомы сохраняют непрерывность мостиковых молекул. Для получения готовых к секвенированию фрагментов 44 выполняют дополнительное удлинение и сшивание, чтобы фрагменты 50, 50’ образца прикрепились к последовательностям 48 и 48'.

[0164] Затем фермент транспозазу можно удалить путем обработки додецилсульфатом натрия (SDS) или нагреванием или расщеплением протеиназой K. После удаления ферментов транспозазы остаются готовые к секвенированию фрагменты 44 нуклеиновых кислот, прикрепленные к твердой подложке 42.

[0165] Полученный комплекс 40A показан на Фиг. 8A. Мостиковые молекулы представляют собой готовые к секвенированию фрагменты 42 нуклеиновых кислот, каждый из которых включает фрагмент 50, 50' и адаптерные последовательности 48 и 52 или 48' и 50', присоединенные с обоих концов. Адаптерные последовательности 52, 52' являются последовательностями, изначально связанными с твердой подложкой 42, и включают первую последовательность праймера для секвенирования и первую последовательность, комплементарную праймеру проточной кюветы. Адаптерные последовательности 52, 52' присоединены к одному члену 46 связывающего комплекса/пары. Адаптерные последовательности 48, 48’ получены от Y-адаптера и включают вторую последовательность, комплементарную другому праймеру проточной кюветы и второй последовательности праймера для секвенирования. Поскольку каждый готовый к секвенированию фрагмент 44 нуклеиновой кислоты включает подходящие адаптеры для амплификации (например, мостиковой амплификации) и секвенирования, ПЦР-амплификация не выполняется. Таким образом, эти фрагменты 44 готовы к секвенированию. Более того, поскольку фрагменты 44 библиотеки получены из одного и того же образца, фрагменты 44 могут подходить для вариантов применения в связанных длинных чтениях.

[0166] На Фиг. 8B проиллюстрирован другой комплекс 40B, который включает твердую подложку 42 и готовые к секвенированию фрагменты 44 нуклеиновых кислот, присоединенные к твердой подложке 42. В одном примере в пробирке создают не-ПЦР нуклеотидную библиотеку, а затем библиотеку гибридизируют с твердой подложкой 42 в пробирке. В примере, показанном на Фиг. 8B, праймеры (например, адаптеры 52’’, 48’’), имеющие один член 46 связывающейся пары, добавляют к фрагментам 50’’ библиотеки в пробирке, а затем готовые к секвенированию фрагменты 44' нуклеиновых кислот связываются с твердой подложкой 42. В другом примере твердая подложка 42 может иметь праймеры, присоединенные к ней посредством связывающейся пары (например, авидин на подложке 42 и биотин, присоединенный к праймеру). Эти праймеры гибридизуют с адаптерами 52’’, присоединенными к фрагментам 50’’ библиотеки (и, таким образом, праймер и член связывающейся пары находятся на одном конце фрагментов, а не на другом). В другом примере удлинение может быть выполнено с использованием замещающего цепь фермента. Это приведет к получению полностью двухцепочечной библиотеки (например, без вилки или Y-адаптера, как показано на Фиг. 8B). Готовые к секвенированию фрагменты 44' нуклеиновых кислот можно высвободить на проточной кювете путем денатурации.

[0167] На Фиг. 8C проиллюстрирован пример комплекса 40C, который включает гидрогелевую подложку 54 и готовые к секвенированию фрагменты 44’’ нуклеиновых кислот, содержащиеся в гидрогелевой подложке 54.

[0168] Для образования этого комплекса 40С текучую среду, содержащую гидрогелевый (-ые) мономер (-ы) и/или полимер (-ы) и поперечносшивающий (-ие) агент (-ы), смешивают в присутствии образца (например, генетического материала). Эту текучую среду можно поместить в минеральное масло или другую подходящую гидрофобную жидкость и эмульгировать с получением капель. Для полимеризации и/или поперечного сшивания гидрогелевого (-ых) мономера (-ов) и/или полимера (-ов) и образования гидрогелевой подложки 54 можно добавить радикальный инициатор.

[0169] При образовании комплекса 40C текучая среда может представлять собой воду; мономер может быть выбран из группы, состоящей из акриламида, N,N'-бис(акрилоил)цистамина, бисакриламида, диакрилата, диаллиламина, триаллиламина, дивинилсульфона, простого диаллилового эфира этиленгликоля, диакрилата этиленгликоля, триметилолпропантриметакрилата, этоксилированного триметилолдиакрилата, этоксилированного пентаэритритолтетракрилата, мономера коллагена и их комбинаций; и/или полимер может быть выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоль-тиола, полиэтиленгликоль-акрилата, полиэтиленгликоль-диакрилата, полиэтиленгликоля (например, имеющего средневесовую молекулярную массу в диапазоне от около 100 до около 200 000), полипропиленоксида, полиакриловой кислоты, поли(гидроксиэтилметакрилата), поли(метилметакрилата), поли(N-изопропилакриламида), поли(молочной кислоты), сополимера молочной и гликолевой кислот, поликапролактона, поли(винилсульфоновой кислоты), поли(L-аспарагиновой кислоты), поли(L-глутаминовой кислоты), полилизина, агара, агарозы, альгината, гепарина, альгинатсульфата, декстрансульфата, гиалуронана, пектина, каррагинана, желатина, хитозана, целлюлозы, коллагенового полимера и их комбинаций. Поперечносшивающий агент образует связи, например дисульфидные связи, в полимере гидрогелевой подложки 54. Поперечносшивающий агент может быть обратимым в том смысле, что он может быть поперечно сшитым и непоперечно сшитым в зависимости от химического вещества, воздействию которого он подвергается. В одном примере обратимый поперечносшивающий агент представляет собой бисакриламидный поперечносшивающий агент, содержащий дисульфидные связи, которые могут быть расщеплены восстанавливающими агентами, такими как дитиотреитол (DTT), трис-(2-карбоксиэтил)фосфин (TCEP) или трис-(3-гидроксипропил)фосфин (THP). В одном примере поперечносшивающий агент выбран из группы, состоящей из акриламида, N,N’-бис(акрилоил)цистамина, бисакриламида, 1,4-диароилпиперазина, N-N’N-N’-диаллил-L-тартардиамида и N-N'-(1,2-дигидроксиэтилен)-бис-акриламида. В одном примере радикальный инициатор может представлять собой фотоинициатор. Примеры фотоинициаторов включают азобисизобутиронитрил, бензоилпероксид, эозин-5-изотиоцианат. Этот тип радикального инициатора можно использовать, поскольку он не будет инициировать поперечное сшивание до воздействия света соответствующей длины волны. В другом примере радикальный инициатор может инициировать поперечное сшивание при воздействии на него источника радикалов. Примером радикального инициатора этого типа является тетраметилэтилендиамин (TEMED).

[0170] Образец заключается внутрь гидрогелевой подложки 54, поскольку его размер является достаточным для того, чтобы он не мог пройти через поры гидрогелевой подложки 54. В некоторых примерах образец представляет собой ДНК или РНК и имеет длину по меньшей мере около 100 нуклеотидов (например, 1000 нуклеотидов или более, 10 000 нуклеотидов или более, 500 000 нуклеотидов или более и т. д.). В некоторых примерах «размер пор» гидрогелевой подложки 54 может относиться к среднему диаметру или среднему эффективному диаметру поперечного сечения пор по результатам измерений множества пор. Эффективный диаметр некруглого поперечного сечения равен диаметру круглого поперечного сечения с такой же площадью поперечного сечения, что и у некруглого поперечного сечения. В одном примере диапазон размеров пор составляет от около 10 нм до около 100 нм.

[0171] Затем подготовка библиотеки может происходить внутри гидрогелевой подложки 54. Через поры гидрогелевой подложки 54 может происходить многократная замена реагентов. Образец и любые созданные из него фрагменты библиотеки остаются в пределах матрицы гидрогеля. Подготовка библиотеки может включать фрагментирование образца и добавление адаптеров, что приведет к получению готовых к секвенированию фрагментов 44’’.

[0172] В одном примере подготовка библиотеки может быть выполнена посредством тагментации, происходящей в пределах гидрогелевой подложки 54. Полученный комплекс 40C показан на Фиг. 8C. Адаптерные последовательности включают подходящие адаптеры для амплификации и секвенирования, и, таким образом, полученные фрагменты 44’’ готовы к секвенированию. В другом примере подготовка библиотеки может быть выполнена с применением полимеразного удлинения, что приводит к образованию двухцепочечной библиотеки. Этот пример библиотеки необходимо денатурировать перед освобождением из гидрогелевой подложки 54 и посевом.

[0173] Способы с применением комплексов

[0174] В некоторых примерах способа, описанных в настоящем документе, используется проточная кювета 10, 10’, 10’’, описанная в настоящем документе, и любой из комплексов 40A, 40B или 40C. Как описано выше, каждый из комплексов 40A, 40B или 40C включает готовые к секвенированию фрагменты, полученные из одного и того же образца генетического материала. Когда один или несколько комплексов изолированы внутри дорожки 20 или камер 38, 38', достигается пространственная колокализация библиотек из одного и того же образца.

[0175] В одном примере способа комплексы 40A, 40B или 40C вводят в проточную кювету 10, 10’, 10’’, например, через один или более входных портов. Комплексы 40A, 40B или 40C могут быть введены в текучую среду, такую как буфер Трис-HCl или 0,5-кратный солевой буфер цитрата натрия (SSC). По меньшей мере некоторые комплексы 40A, 40B или 40C из текучей среды будут оседать по меньшей мере в некоторых дорожках 20 и/или камерах 38, 38'. При использовании проточной кюветы 10 отрицательно заряженные готовые к секвенированию фрагменты 44, 44', 44' комплексов 40A, 40B или 40C могут притягиваться к положительно заряженному полимерному гидрогелю 14 в дорожке 20. При использовании проточной кюветы 10' или 10’’ присутствие положительно заряженного полимерного гидрогеля 14 ограничивается углублениями 32. В некоторых из этих примеров комплексы 40A, 40B или 40C могут оседать и оставаться на дорожке 20 или в камерах 38, 38’ отчасти благодаря глубине дорожки 20 или камер 38, 38'. В некоторых других из этих примеров дорожка 20 или камеры 38, 38' могут содержать захватный сайт, к которому прикрепляются комплексы 40A, 40B или 40C.

[0176] Следует понимать, что некоторые комплексы 40A, 40B или 40C могут не оседать, и эти комплексы 40A, 40B или 40C будут удаляться из проточной кюветы 10, 10', 10’’ перед дальнейшими процессами. Следует также понимать, что некоторые дорожки 20 или камеры 38, 38’ могут принимать один или более комплексов 40A, 40B или 40C, тогда как другие дорожки 20 или камеры 38, 38’ могут не принимать комплексов 40A, 40B или 40C. Распределение комплексов 40A, 40B или 40C может быть случайным, если захватные сайты не включены, или более контролируемым, если захватные сайты включены.

[0177] Этот пример способа также включает отмывку незахваченных комплексов 40A, 40B или 40C из проточной кюветы 10, 10', 10’’. Отмывка может включать подачу текучей среды в проточную кювету 10, 10', 10’’. Поток может выталкивать все не осевшие комплексы 40A, 40B или 40C, через выходное отверстие проточной кюветы 10, 10', 10’’.

[0178] Этот пример способа также включает обеспечение освобождения носителем (например, твердой подложкой 42 или гидрогелевой подложкой 54) захваченных комплексов 40A, 40B или 40C с высвобождением готовых к секвенированию фрагментов 44, 44’ или 44’’ нуклеиновых кислот в соответствующую дорожку 20 или камеру 38, 38', в которой захвачен каждый комплекс 40A, 40B или 40C.

[0179] Воздействие на носитель (т. е. подложку 42 или 54) для освобождения готовых к секвенированию фрагментов 44, 44’ или 44’’ нуклеиновых кислот может быть разным, в зависимости от используемого комплекса 40A, 40B или 40C. В одном примере носитель представляет собой твердую подложку 42, и воздействие включает введение расщепляющего агента в проточную кювету 10, 10’, 10’’. Расщепляющий агент может инициировать химическое, ферментативное или фотохимическое освобождение готовых к секвенированию фрагментов 44, 44’ нуклеиновых кислот от твердой подложки 42. В этих примерах другой стимул, такой как нагрев или свет, может активировать расщепляющий агент для освобождения фрагментов 44 или 44’ библиотеки от твердой подложки 42. Например, в качестве расщепляющего агента можно ввести свободный биотин и можно использовать нагревание до около 92 °C для индуцирования освобождения биотинилированного олигонуклеотида от твердой подложки 42.

[0180] В других примерах используется комплекс 40С, поэтому носителем является гидрогелевая подложка 54. В этих других примерах инициирование высвобождения библиотеки может включать нагревание проточной кюветы 10, 10’, 10’’, введение расщепляющего агента в проточную кювету 10, 10', 10’’ или их комбинации. Нагревание для высвобождения фрагментов 44’’ библиотеки от гидрогелевой подложки 54 может включать нагревание до температуры около 90 °C. Проточная кювета 10, 10’, 10’’ может быть нагрета, и гидрогелевая подложка 54 может разложиться с высвобождением фрагментов 44’’, когда комплексы 40C нагреются. В некоторых примерах расщепляющий агент может включать один или более компонентов, которые могут деполимеризовать гидрогелевую подложку 54 и высвободить из нее готовые к секвенированию фрагменты 44’’. В качестве примера расщепляющий агент включает дитиотреитол (DTT), трис-(2-карбоксиэтил)фосфин (TCEP) или трис-(3-гидроксипропил)фосфин (THP). В других примерах расщепляющий агент представляет собой свет. В этих примерах поперечносшивающий агент, используемый для образования гидрогелевой подложки 54, может включать фоторасщепляемую функциональную группу, а воздействие на комплексы 40C света соответствующей длины волны может расщеплять данную функциональную группу и разрушать гидрогелевую подложку 54.

[0181] Транспортировка и посев готовых к секвенированию фрагментов 44, 44’ или 44’’ нуклеиновых кислот частично контролируется положительными зарядами катионного полимерного гидрогеля 14. Готовые к секвенированию фрагменты 44, 44’ или 44’’ нуклеиновых кислот имеют отрицательный заряд и, таким образом, притягиваются к положительно заряженному полимерному гидрогелю 14. По существу фрагменты 44, 44’ или 44’’ любого конкретного комплекса 40A, 40B или 40C будут ограничены дорожкой 20 или камерой 38, 38', которой ограничивается конкретный комплекс 40A, 40B или 40C.

[0182] Помимо силы притяжения катионного полимерного гидрогеля 14 глубина дорожки 20 или камер 38, 38' также может ограничивать транспортировку и посев готовых к секвенированию фрагментов 44, 44’ или 44’’ нуклеиновых кислот, и, таким образом, внешний иммобилизующий агент можно не вводить в проточную кювету 10, 10', 10".

[0183] В описанных в настоящем документе проточных кюветах 10, 10', 10’’ катионный полимерный гидрогель 14 может притягивать готовые к секвенированию фрагменты 44, 44’ или 44’’ нуклеиновых кислот сразу же после их высвобождения, что позволяет праймерам 18 для амплификации засеять высвобожденные готовые к секвенированию фрагменты 44, 44’ или 44’’ нуклеиновых кислот относительно ограниченным образом. В одном примере посев осуществляется путем гибридизации между первой или второй последовательностью фрагмента 44, 44’ или 44’’ и комплементарным ей одним из праймеров 18. Посев можно проводить при подходящей температуре гибридизации фрагмента 44, 44’ или 44’’ и праймера (-ов) 18.

[0184] Затем посеянные библиотеки секвенирования можно амплифицировать с использованием любого подходящего способа, такого как образование кластеров.

[0185] В одном примере образования кластеров готовые к секвенированию фрагменты 44, 44’ или 44’’ нуклеиновых кислот копируются из гибридизированных праймеров 18 путем удлинения с 3’-конца с использованием высокоточной ДНК-полимеразы. Первоначальные готовые к секвенированию фрагменты 44, 44’ или 44’’ нуклеиновых кислот денатурируют, в результате чего копии остаются иммобилизованными на дорожках 20 или углублениях 32. Для амплификации иммобилизованных копий можно использовать изотермическую мостиковую амплификацию. Например, скопированные шаблоны образуют петлю и гибридизуются с соседним комплементарным праймером 18, а полимераза копирует скопированные шаблоны с образованием двухцепочечных мостиков, которые денатурируют с образованием двух одноцепочечных цепей. Эти две цепи образуют петлю и гибридизуются с соседними комплементарными праймерами 18, а затем снова удлиняются с образованием двух новых двухцепочечных петель. Процесс повторяют на каждой копии шаблона в циклах изотермической денатурации и амплификации с получением плотных клональных кластеров. Каждый кластер двухцепочечных мостиков денатурируют. В одном примере обратную цепь удаляют путем специфического расщепления оснований, в результате чего остаются шаблонные полинуклеотидные цепи прямого направления. Следует понимать, что кластеризация приводит к образованию нескольких шаблонных готовых к секвенированию фрагментов нуклеиновых кислот в каждой дорожке 20 или углублении 32.

[0186] После образования кластеров катионную функциональную группу 16 можно отщепить от катионного полимерного гидрогеля 14. Таким образом, заряд поверхности проточной кюветы может считаться обратимым. Отщепление катионной функциональной группы 16 может быть выполнено, если катионная функциональная группа 16 является расщепляемой или присоединена посредством расщепляемого линкера 28, 28’ (например, включает расщепляемую дисульфидную связь, или фоторасщепляемую связь, или расщепляемую нуклеотидную связь). Отщепление катионной функциональной группы 16 может быть выполнено путем фоторасщепления, воздействия кислотных условий (например, если линкер является неустойчивым к кислоте) или путем ферментативного расщепления (например, если в качестве линкера 28, 28' для присоединения катионной функциональной группы 16 используется бифункциональный ДНК-олигонуклеотид). Отщепление катионной функциональной группы 16 может обратить заряд поверхности проточной кюветы, частично из-за того, что готовые секвенированию шаблонные фрагменты нуклеиновых кислот, присоединенные к полимерному гидрогелю 14, имеют отрицательный заряд.

[0187] После образования кластеров (а в некоторых случаях - после отщепления катионной функциональной группы 16) можно выполнить секвенирование. Любой пример проточной кюветы 10, 10’, 10’’, описанный в данном документе, можно использовать в различных подходах или технологиях секвенирования, включая методики, часто называемые секвенированием путем синтеза (SBS), секвенированием циклических матриц, секвенированием путем лигирования, пиросеквенированием и т. п.

[0188] В качестве одного примера секвенирование путем синтеза (SBS) можно выполнять на такой системе, как HISEQ™, HISEQX™, MISEQ™, MISEQDX™, MINISEQ™, NOVASEQ™, NEXTSEQDX™, ISEQ™, NEXTSEQ™, или на других системах секвенирования Illumina (г. Сан-Диего, штат Калифорния, США). При методике SBS выполняют мониторинг удлинения праймеров секвенирования вдоль готовых к секвенированию шаблонных фрагментов нуклеиновой кислоты для определения последовательности нуклеотидов в шаблоне. 3’-концы шаблонов и любые связанные с проточной кюветой праймеры 18 (не прикрепленные к копиям) можно заблокировать для предотвращения помех реакции секвенирования и, в частности, для предотвращения нежелательного праймирования. Основным химическим процессом может быть полимеризация (например, катализируемая ферментом полимеразой) или лигирование (например, катализируемое ферментом лигазой). В конкретном процессе SBS на основе полимеразы к праймеру для секвенирования добавляют флуоресцентно-меченые нуклеотиды зависимым от шаблона образом, чтобы для определения последовательности шаблона можно было использовать определение порядка и типа нуклеотидов, добавляемых к праймеру для секвенирования. Например, для запуска первого цикла SBS в/через проточную кювету 10 можно подать один или более меченых нуклеотидов, ДНК-полимеразу и т. п., причем удлинение праймера для секвенирования приводит к встраиванию меченого нуклеотида. Такое встраивание можно обнаружить с помощью события визуализации. Во время события визуализации система освещения (не показана) может подавать на проточную кювету 10, 10’, 10’’ возбуждающий свет.

[0189] В некоторых примерах флуоресцентно меченные нуклеотиды могут дополнительно обладать свойством обратимой терминации, которое прекращает дальнейшее удлинение праймера после добавления нуклеотида к шаблону. Например, в шаблон может быть добавлен нуклеотидный аналог, имеющий функциональную группу - обратимый терминатор, так что последующее удлинение не будет происходить до тех пор, пока не будет подан разблокирующий агент для удаления функциональной группы. Таким образом, для примеров с обратимой терминацией в проточную кювету можно подавать разблокирующий реагент и т. п. (после детектирования).

[0190] Промывка (-и) может (могут) происходить между различными стадиями подачи текучей среды. Затем цикл SBS можно повторять n раз для удлинения шаблона на n нуклеотидов, таким образом определяя последовательность длиной n.

[0191] Хотя подробно описан метод SBS, следует понимать, что проточные кюветы 10, 10', 10’’, описанные в настоящем документе, можно использовать с другим протоколом секвенирования, для генотипирования или в других химических и/или биологических сферах применения.

[0192] Другие варианты применения проточной кюветы

[0193] Хотя секвенирование было подробно описано, следует понимать, что проточные кюветы 10, 10', 10’’, описанные в настоящем документе, можно использовать и в других областях применения, где требуется положительно заряженная поверхность. Например, положительно заряженный полимерный гидрогель 14 может подходить для извлечения ДНК из лизатов, введенных в проточную кювету 10, 10', 10’’. Например, клетки можно ввести в дорожку (-и) 20 или в камеры 38, 38’, а затем добавить лизирующий буфер. ДНК, высвобождаемая из клеток, может притягиваться к положительно заряженной поверхности. Внешний иммобилизующий агент (например, масло, воздух) можно дополнительно использовать или не использовать для дополнительной помощи в удерживании экстрагированной ДНК.

[0194] В качестве другого примера положительно заряженный полимерный гидрогель 14 можно использовать для отталкивания белков при определенных условиях pH, таким образом предотвращая нежелательное связывание белков с поверхностью. В данных примерах положительно заряженный полимерный гидрогель 14 может иметь или не иметь присоединенные к нему праймеры 18 для амплификации.

[0195] Проточные кюветы 10, 10', 10’’, описанные в настоящем документе, могут использоваться в других областях применения, где желательно наличие обратимо заряженной поверхности. Обратимо заряженная поверхность может иметь положительный заряд, когда присоединена катионная функциональная группа 16, и может иметь отрицательный заряд, когда катионная функциональная группа 16 отщеплена от нее. Положительно заряженная поверхность может способствовать притяжению ДНК, а отрицательно заряженная поверхность может способствовать элюированию. Отрицательно заряженные поверхности также могут быть желательны для притягивания положительно заряженных клеток (например, бактерий) к поверхности проточной кюветы.

[0196] Для дополнительной иллюстрации настоящего описания в настоящем документе приведен пример. Следует понимать, что данный пример приведен в целях иллюстрации и его не следует рассматривать как ограничивающий объем настоящего изобретения.

НЕ ИМЕЮЩИЙ ОГРАНИЧИТЕЛЬНОГО ХАРАКТЕРА РАБОЧИЙ ПРИМЕР

[0197] Для изготовления дорожки проточной кюветы для примера и дорожки проточной кюветы для сравнительного примера использовали стеклянную подложку с двумя дорожками. Обе дорожки обрабатывали силанизацией, и на них наносили PAZAM. Затем на PAZAM дорожек прививали праймеры Р5 и Р7. К подложке прикрепили крышку с помощью УФ-отверждаемого адгезива, чтобы изолировать две дорожки по текучей среде.

[0198] Трис(гидроксипропил)фосфин (100 мМ THP в 50 мМ буферном растворе Трис-HCl (pH 9)) вводили в дорожку примера при 60 °C в течение около 2 минут. Другую дорожку (сравнительного примера) не обрабатывали этой смесью.

[0199] Комплексы, используемые в данном примере, включали твердую подложку и готовые к секвенированию фрагменты нуклеиновых кислот, присоединенные к твердой подложке посредством линкера авидин-биотин. Библиотечные фрагменты комплекса были аналогичны показанным на Фиг. 8B. Не-ПЦР библиотеки готовили в пробирке в соответствии с протоколом платформы TRUSEQ™ (Illumina, Inc.). Библиотеки связывали с гранулой посредством гибридизации с праймерами P7, которые были присоединены к грануле посредством биотина. Библиотеки были окрашены Sytox green.

[0200] Комплексы вводили в дорожку примера и дорожку сравнительного примера проточной кюветы, пропуская через каждую дорожку буфер для гибридизации, содержащий комплексы (200 мкл в буфере для гибридизации). Посев инициировали путем высвобождения фрагментов библиотеки из комплекса. Высвобождение библиотеки инициировали нагреванием проточной кюветы до температуры выше температуры плавления праймера P7. Фрагменты гибридизировали и выполняли первое удлинение цепи. Твердую подложку и негибридизированные фрагменты удаляли с помощью 0,2 M раствора NaOH. Затем выполняли кластеризацию с применением мостиковой амплификации.

[0201] Были сделаны микрофотографии дорожки примера и дорожки сравнительного примера после кластеризации, и для ясности было проведено инвертирование исходных цветов. Как показано на Фиг. 9A, дорожка сравнительного примера, не обработанная трис(гидроксипропил)фосфином, имела относительно равномерный посев библиотеки по всей поверхности. Об этом свидетельствует распространение более темных пятен на инвертированной микрофотографии. На Фиг. 9B представлена схематическая иллюстрация высвобождения библиотеки из комплексов на дорожке сравнительного примера проточной кюветы. На иллюстрации показана ширина дорожки, а масштабная полоска отражает реальный размер поля зрения двухмерной внутренней поверхности проточной кюветы. Как показано на иллюстрации Фиг. 9B, транспорт и посев фрагментов библиотеки были не ограничены.

[0202] Напротив, как показано на Фиг. 10A, дорожка примера (обработанная трис(гидроксипропил)фосфином) имела концентрированные области с библиотеками ДНК. Об этом свидетельствуют концентрированные более темные пятна на инвертированной микрофотографии. На Фиг. 10B представлена схематическая иллюстрация высвобождения библиотеки из комплексов на дорожке примера проточной кюветы. На иллюстрации показана ширина дорожки, а масштабная полоска отражает реальный размер поля зрения двухмерной внутренней поверхности проточной кюветы. Как показано на Фиг. 10B, транспорт и посев фрагментов библиотеки ограничены, поскольку отрицательно заряженные фрагменты библиотеки притягиваются к положительно заряженной поверхности проточной кюветы. Эти результаты показывают, что поверхность, обработанная трис(гидроксипропил)фосфином, была положительно заряжена и, таким образом, могла притягивать фрагменты библиотеки ДНК после их высвобождения из комплексов.

[0203] Дополнительные примечания

[0204] Кроме этого, следует понимать, что диапазоны, приведенные в настоящем документе, включают указанный диапазон и любое значение или поддиапазон в пределах указанного диапазона, как если бы эти диапазоны были указаны явным образом. Например, диапазон, представленный границами от около 2 мм до около 300 мм, следует интерпретировать как включающий не только явно перечисленные пределы от около 2 мм до около 300 мм, но также включающий индивидуальные значения, такие как около 15 мм, 22,5 мм, 245 мм и т. д., и поддиапазоны, такие как от около 20 мм до около 225 мм и т. д.

[0205] Следует понимать, что все комбинации вышеуказанных концепций и дополнительных концепций, более подробно описанных ниже (при условии, что такие концепции не являются взаимно противоречащими), рассматриваются как часть обладающего признаками изобретения объекта изобретения, описанного в данном документе. В частности, все комбинации заявленного объекта изобретения, появляющиеся в конце данного описания, считаются частью обладающего признаками изобретения объекта изобретения, описанного в данном документе. Следует также понимать, что терминология, явно используемая в настоящем документе, которая также может присутствовать в любом описании, включенном в настоящий документ путем ссылки, должна иметь значение, наиболее соответствующее конкретным концепциям, описанным в настоящем документе.

[0206] Хотя подробно описано несколько примеров, следует понимать, что описанные примеры могут быть изменены. Таким образом, представленное выше описание следует рассматривать как не имеющее ограничительного характера.

Группа изобретений относится к области секвенирования нуклеиновых кислот, а именно к проточной кювете, способу формирования катионного полимерного гидрогеля и набору для введения положительных зарядов в исходный полимерный гидрогель в проточной кювете для секвенирования. Проточная кювета содержит: подложку, катионный полимерный гидрогель на подложке и праймер для амплификации, присоединенный к катионному полимерному гидрогелю. Катионный полимерный гидрогель включает катионную функциональную группу, i) интегрированную в мономерное звено исходного полимерного гидрогеля или ii) присоединенную к мономерному звену исходного полимерного гидрогеля посредством линкера. Способ формирования катионного полимерного гидрогеля включает: введение текучей среды, включающей положительно заряжаемую функциональную группу, в проточную кювету и инкубирование исходного полимерного гидрогеля в текучей среде с формированием катионного полимерного гидрогеля, включающего катионную функциональную группу. Группа изобретений обеспечивает снижение вероятности случайного связывания фрагментов библиотеки на поверхности проточной кюветы и уменьшение или предотвращение засевания фрагментами библиотеки боковых стенок проточной кюветы, что повышает эффективность посева библиотеки. 3 н. и 20 з.п. ф-лы, 16 ил., 1 табл.

1. Проточная кювета для секвенирования, содержащая:

подложку;

катионный полимерный гидрогель на подложке, причем катионный полимерный гидрогель включает катионную функциональную группу, i) интегрированную в мономерное звено исходного полимерного гидрогеля или ii) присоединенную к мономерному звену исходного полимерного гидрогеля посредством линкера; и

праймер для амплификации, присоединенный к катионному полимерному гидрогелю.

2. Проточная кювета по п. 1, причем:

мономерное звено представляет собой N-(5-бромацетамидилпентил)акриламид;

катионная функциональная группа представляет собой фосфониевый катион; и

фосфониевый катион замещает бром в N-(5-бромацетамидилпентил)акриламиде.

3. Проточная кювета по п. 2, причем фосфониевый катион выбран из группы, состоящей из катиона трис(гидроксиметил)фосфония, катиона трис(гидроксипропил)фосфония, катиона тетракис(гидроксиметил)фосфония и катиона трис(2-карбоксиэтил)фосфония.

4. Проточная кювета по п. 1, причем:

i) мономерное звено включает концевую азидную группу, а линкер включает алкиновую группу; или

ii) мономерное звено включает концевую алкиновую группу, а линкер включает азидную группу.

5. Проточная кювета по п. 4, причем катионная функциональная группа включает протонированную аминогруппу, ион сульфония, катион четвертичного аммония или их комбинации.

6. Проточная кювета по п. 4, причем:

мономерное звено представляет собой N-(5-азидоацетамидилпентил)акриламид; и

катионная функциональная группа представляет собой катион N,N,N-триметилэтаноламмония.

7. Проточная кювета по п. 4, причем линкер дополнительно включает расщепляемую дисульфидную связь, фоторасщепляемую связь, расщепляемую фосфодиэфирную связь или их комбинации.

8. Проточная кювета по п. 1, причем:

мономерное звено представляет собой N-(5-азидоацетамидилпентил)акриламид;

линкер включает концевую алкиновую группу и концевой бром; и

катионная функциональная группа представляет собой фосфониевый катион, который замещает концевой бром.

9. Проточная кювета по п. 1, причем подложка включает множество углублений, разделенных промежуточными областями, и при этом катионный полимерный гидрогель расположен внутри каждого из углублений.

10. Проточная кювета по п. 9, причем подложка дополнительно содержит множество камер, и при этом подгруппа множества углублений расположена в пределах периметра каждой из множества камер.

11. Способ формирования катионного полимерного гидрогеля, включающий:

введение текучей среды, включающей положительно заряжаемую функциональную группу, в проточную кювету, включающую:

исходный полимерный гидрогель, имеющий поверхностную функциональную группу, выбранную из группы, состоящей из отрицательно заряжаемого атома, азидной группы и алкиновой группы; и

праймер для амплификации, присоединенный к исходному полимерному гидрогелю; и

инкубирование исходного полимерного гидрогеля в текучей среде с формированием таким образом катионного полимерного гидрогеля, включающего катионную функциональную группу.

12. Способ по п. 11, причем положительно заряжаемая функциональная группа замещает отрицательно заряжаемый атом исходного полимерного гидрогеля.

13. Способ по п. 12, причем:

поверхностная функциональная группа представляет собой отрицательно заряжаемый атом;

отрицательно заряжаемый атом представляет собой бром; и

положительно заряжаемая функциональная группа выбрана из группы, состоящей из трис(гидроксиметил)фосфина, трис(гидроксипропил)фосфина, тетракис(гидроксиметил)фосфина и трис(2-карбоксиэтил)фосфина.

14. Способ по п. 12, причем текучая среда дополнительно включает буфер, имеющий pH в диапазоне от 6 до 12.

15. Способ по п. 12, включающий инкубирование исходного полимерного гидрогеля в текучей среде при температуре в диапазоне от 18 до 65°C, и времени в диапазоне от 1,5 до 5 мин.

16. Способ по п. 11, в котором:

поверхностная функциональная группа представляет собой азидную группу или алкиновую группу; и

положительно заряжаемая функциональная группа ковалентно присоединяется к поверхностной функциональной группе посредством линкера.

17. Способ по п. 16, в котором:

поверхностная функциональная группа представляет собой азидную группу;

линкер представляет собой алкиновую группу; и

катионная функциональная группа включает протонированную аминогруппу, ион сульфония, катион четвертичного аммония или их комбинации.

18. Способ по п. 16, в котором:

поверхностная функциональная группа представляет собой алкиновую группу;

линкер представляет собой азидную группу; и

катионная функциональная группа включает протонированную аминогруппу, ион сульфония, катион четвертичного аммония или их комбинации.

19. Способ по п. 16, причем соединение включает положительно заряжаемую функциональную группу, присоединенную к линкеру, и при этом соединение представляет собой бромид пропаргилхолина.

20. Способ по п. 16, причем текучая среда включает воду.

21. Способ по п. 16, включающий инкубирование исходного полимерного гидрогеля в текучей среде при температуре в диапазоне от 18 до 60°C, и времени в диапазоне от 30 мин до 12 ч.

22. Способ по п. 16, дополнительно включающий добавление катализатора, лиганда и восстанавливающего агента в проточную кювету с текучей средой.

23. Набор для введения положительных зарядов в исходный полимерный гидрогель в проточной кювете для секвенирования, содержащий:

проточную кювету, содержащую:

подложку;

исходный полимерный гидрогель, расположенный на подложке и имеющий поверхностную функциональную группу, выбранную из группы, состоящей из отрицательно заряжаемого атома, азидной группы и алкиновой группы; и

праймер для амплификации, присоединенный к исходному полимерному гидрогелю; и

текучую среду, включающую положительно заряжаемую функциональную группу, которая взаимодействует или реагирует с поверхностной функциональной группой с образованием катионного полимерного гидрогеля, включающего катионную функциональную группу.