СПОСОБ ДЕТЕКЦИИ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ В ОБРАЗЦАХ ОПУХОЛЕВОЙ ТКАНИ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ЕГО РЕАЛИЗАЦИИ Российский патент 2024 года по МПК G01N1/30 G01N21/01 G01N21/05 G01N21/64 

Изобретение относится к области изучения структуры тканей методами иммуногистохимического окрашивания, в частности для одновременной детекции онкологических маркеров в толстых срезах опухолевой ткани в проточном режиме с помощью конфокального микроскопа.

Иммуногистохимическое исследование биоптатов ткани является золотым стандартом в диагностике опухолевых заболеваний. Однако, традиционные методы, иммуногистохимического окрашивания обладают рядом недостатков, например, не подходят для исследования толстых срезов с толщиной порядка нескольких десятков или сотен микрометров, что не позволяет исследовать трехмерную структуру опухоли, а процедура одновременной окраски нескольких различных онкологических маркеров длительна по времени и трудно реализуема. Зонды для иммуногистохимического окрашивания на основе флуоресцентных нанокристаллов (НК) и однодоменных антител (одАТ) известны своим малым размером и гидрофильностью в связи с чем обладают высокой проникающей способностью внутрь ткани. НК обладают широким спектром поглощения и узким пиком флуоресцентного сигнала, максимум которого легко варьируется путем изменения состава или размера НК, что позволяет использовать их для одновременной визуализации нескольких различных онкологических маркеров. Микрофлюидные технологии широко применяются в биологических исследованиях, так как позволяют манипулировать с малыми по объему образцами и устройства ни их основе легко поддаются автоматизации и стандартизации, что позволяет повысить точность исследований и воспроизводимость результатов.

Известен аффинный зонд для детекции клеток колоректального рака, описанный в [1]. Известный зонд состоит из пептида, который специфически связывается с ядром клеток колоректального рака, и флуоресцентных НК, объединенных линкером, состоящим из 6-8 аминокислотных остатков гистидина и 9-11 аминокислотных остатков пролина. В составе известного зонда могут быть использованы НК состава CdSe/ZnS, CdTe/ZnS, CdSe/ZnSe и др., а последовательность линкера обеспечивает необходимую конформацию, подвижность и стабильность зонда. К недостаткам известного решения стоит отнести то, что для связывания НК и аминокислотной последовательности линкера и пептида используется координационное взаимодействие между атомами Zn на поверхности НК и аминокислотными остатками гистидина, которое не является сильным и эта связь может быть разрушена, что будет в результате приводить к мечению клеток колоректального рака только пептидной последовательностью без флуоресцентной метки, что приведет к ложноотрицательным результатам. Также стоит отметить, что подобные короткие аффинные пептидные последовательности не существуют к подавляющему большинству маркеров онкологических заболеваний и не могут применяться для мультиплексной диагностики различных видов рака.

Известно микрофлюидное устройство для проведения иммуногистохимического окрашивания, описанное в патенте [2]. К известному микрофлюидному устройству герметично подсоединяется стекло для микроскопа, на котором находится исследуемый образец. При этом стекло для микроскопа образует замкнутую камеру с микрофлюидным устройством, которое содержит массив каналов для подачи и отведения жидкостей. Массив микрофлюидных каналов позволяет заполнять камеру с образцом менее чем за 15 секунд, при том, что площадь камеры составляет 256 мм², а высота камеры не превышает 100 мкм. Однако, известное микрофлюидное устройство не позволяет проводить иммуногистохимическое окрашивание толстых срезов тканей, а подходит для окрашивания срезов тканей толщиной порядка 4-10 мкм, что ограничивается как скоростью и эффективностью диффузии относительно крупных полноразмерных IgG, применяемых для окраски, так и физическими размерами камеры, которая спроектирована для быстрой окраски срезов тканей.

Все известные решения не позволяют решить проблему, заключающуюся в окрашивании толстых срезов тканей, что не позволяет исследовать объемную структуру опухолевых тканей.

Техническим результатом заявляемого изобретения является повышение эффективности иммуногистохимических исследований за счет обеспечения возможности детекции онкологических маркеров в толстых срезах опухолевой ткани толщиной до 200 мкм и одновременного иммуногистохимического объемного окрашивания двух и более онкологических маркеров в режиме проточного окрашивания. Это позволяет получать данные о взаимном расположении в пространстве онкологических маркеров в полуавтоматическом режиме.

Технический результат достигается за счет того, что способ детекции онкологических маркеров в образцах опухолевой ткани включает предварительное размещение среза образца опухолевой ткани толщиною 20-200 мкм на стекле, фиксацию и пермеабилизацию среза образца опухолевой ткани, далее стекло с образцом опухолевой ткани промывают и размещают на проточной кювете, после чего проводят герметизацию, с возможностью образования поверхностями стекла и проточной кюветой замкнутого объема проточной камеры с заключенным в ней срезом образца опухолевой ткани, при этом высота проточной камеры, образованной поверхностями стекла и проточной кюветы, должна быть в 2-5 раз больше толщины анализируемого среза ткани, затем через отверстие для ввода подают буфер для блокирования неспецифического связывания, в объеме равном 3-5 объемам проточной камеры, после чего в отверстие для ввода подают промывочный буфер в объеме равном 5-10 объемам проточной камеры, далее в отверстие для ввода подают раствор содержащий смесь двух или более различных популяций пространственно ориентированных конъюгатов однодоменных антител и флуоресцентных нанокристаллов, в объеме равном 3-5 объемам проточной камеры, после чего в отверстие для ввода подают промывочный буфер в объеме равном 5-10 объемам проточной камеры, при этом подача жидкостей через вводной порт проточной кюветы осуществляют с помощью насоса, а давление жидкости в проточной камере регулируют с помощью изменения потока через выводной порт проточной кюветы, в завершении проводят детекцию флуоресценции нанокристаллов в заданных оптических диапазонах с помощью конфокального флуоресцентного микроскопа. При этом каждая отдельная популяция пространственно ориентированных конъюгатов содержит однодоменные антитела, связывающие заданный опухолевый биомаркер и флуоресцентные нанокристаллы с заданным спектром флуоресценции, причем различные популяции пространственно ориентированных конъюгатов отличаются между собой специфичность однодоменных антител и спектром флуоресценции нанокристаллов. А подачу жидкостей через вводное отверстие проточной кюветы осуществляют с одинаковой или переменной скоростью, или подачу жидкостей через вводное отверстие проточной кюветы осуществляют с паузами после прокачивания одного и/или двух, и/или трех объемов проточной камеры. При этом длительность паузы составляет от 1 до 180 минут, и скорость потока входящей жидкости составляет от 5 до 750 мкл/мин. Причем детекцию флуоресцентного сигнала от нанокристаллов проводят через 5-50 наносекунд после возбуждения их флуоресцентного сигнала.

Для реализации способа заявлено устройство, состоящее из проточной кюветы, входного порта, выходного порта, сливной трубки и модуля регулировки скорости выходного потока, причем проточная кювета представляет собой плоскую пластину, выполненную из оптически прозрачного полимера, содержащую сквозное входное отверстие, перпендикулярное плоскости пластины, соединенное с входным каналом вводного микрофлюидного модуля, выходные каналы которого соединены с торцом проточной камерой, противоположный торец проточной камеры соединен с входными каналами выводного микрофлюидного модуля, выходной канал которого соединен со сквозным выходным отверстием, расположенным перпендикулярно плоскости пластины, к входному отверстию проточной кюветы, подсоединен вводной порт для подключения насоса и подачи жидкости, а к выходному отверстию проточной кюветы, подсоединен выводной порт соединенный сливной трубкой с модулем регулировки скорости выходного потока жидкости, причем вводной и выводной порты присоединены к проточной кювете со стороны плоскости противоположной поверхности содержащей проточную камеру. При этом размер пластины проточной кюветы составляет 25 мм по ширине, 75 мм по длине и 2 мм по толщине, а размер проточной камеры составляет от 5 до 20 мм в ширину, от 20 до 60 мм в длину и от 50 до 600 мкм в высоту. Причем поперечный размер микрофлюидных каналов составляет от 50×50 мкм, до 150×150 мкм. Вводной микрофлюидный модуль имеет один входной канал и 2, 4, 8 или 16 выходных каналов, а выводной микрофлюидный модуль имеет один выходной канал и 2, 4, 8 или 16 входных каналов. Кроме того, водной и выводной порты подсоединен к входному и выходному отверстию путем склеивания с помощью полиэфирного клея. Пластина проточной кюветы изготовлена из полидиметилсилоксана. Модуль регулировки скорости выходного потока жидкости представляет собой зажим для сливной трубки, пропускная способность через который регулируется с помощью винта.

Иммуногистохимическое окрашивание опухолевой ткани является важным фактором в подборе правильного метода терапии. Современные подходы по изучению гистологического строения опухолевой ткани основаны на иммуноокрашивании тонких срезов толщиной порядка 2-20 мкм, с помощью первичных полноразмерных антител - иммуноглобулинов класса G (IgG), которые связывают исследуемые онкологические маркеры, а детекция первичных IgG может проводиться или по конъюгированным с ними флуоресцентным меткам или с помощью вторичных антител, которые связывают, первичное антитело и в свою очередь уже они конъюгированы с флуоресцентными метками для детекции. Этот подход имеет два недостатка, во-первых, он требует двух дополнительных этапов проведения анализа, а именно этапа нанесения вторичных антител и отмывки образца от не связавшихся вторичных антител. Во-вторых, при одновременной детекции нескольких биомаркеров необходимо чтобы использовались первичные антитела, полученные в разных животных, например, при детекции трех маркеров необходимо использовать первичные антитела, с видовой принадлежностью мышь, крыса и кролик, и соответствующие им конъюгаты вторичных антител против IgG мыши, крысы и кролика, чтобы обеспечить специфичность детекции. Таким образом мультиплексность детекции обусловлена не только доступными различными спектрами испускания флуоресцентных меток, но и количеством антител с различной видовой принадлежность. В этом случае максимальная простота и эффективность детекции достигаются путем использования зондов на основе первичных антител, конъюгированных с флуоресцентными метками. При этом также важны физико-химические показатели этих зондов, например, их физический размер и гидрофильность, которые обуславливают эффективность проникновения меток вглубь ткани. Так полноразмерные IgG обладают размером порядка 15 нм и молекулярной массой около 150 кДа, что затрудняет их проникновение внутрь тканей и клеток. Напротив, одАТ обладают размером порядка 2,5-4 нм и молекулярной массой около 13 кДа, а также более гидрофильные и конформационно устойчивы при повышенных температурах и нефизиологических условиях, чем полноразмерные IgG. Это делает их предпочтительными кандидатами на роль распознающих молекул в составе зондов для детекции онкологических маркеров в толстых срезах ткани при проведении иммуногистохимического окрашивания. Кроме того, ранее авторами настоящего изобретения запатентован [3] способ пространственно ориентированного конъюгирования одАТ и наночастиц, что позволяет создавать пространственно ориентированные конъюгаты одАТ и НК и не использовать вторичные флуоресцентно меченные антитела для детекции. Использование флуоресцентных НК позволяет проводить одновременную мультиплексную детекцию нескольких различных аналитов за счет того, что НК обладают узкими спектрами флуоресценции, которые зависят от их состава и размера, но при этом обладают широким спектром поглощения, что позволяет проводить одновременное возбуждение НК различных цветов одним широкополосным источником возбуждения. Таким образом используя две и более популяции пространственно ориентированных конъюгатов одАТ и НК различающиеся специфичностью одАТ и цветами, конъюгированных с ними НК, можно проводить одновременную окраску двух и более онкологических маркеров. Кроме того, НК обладают высокой фотостабильностью, что позволяет проводить процедуру иммуногистохимического окрашивания в условиях естественного или искусственного освещения, а также проводить длительное накопление сигнала для повышения чувствительности. Так как время жизни флуоресценции НК выше чем у большинства органических красителей и времени жизни аутофлуоресценции органических молекул, входящих в состав ткани, то можно проводить снятие флуоресцентного сигнала с временной задержкой после возбуждения, порядка 5-50 наносекунд, что позволит повысить соотношение полезного сигнала к фоновому шуму и тем самым повысить чувствительность детекции, как это описано авторами настоящего изобретения ранее в патенте [4]. При этом для лучшего окрашивания и промывки образца скорость потока может варьироваться в зависимости от толщины среза ткани. Также при более высокой скорости обеспечивается лучшая промывка проточной камеры, а при более низких скоростях жидкости лучше проникают внутрь ткани, что снижает их расход. Наличие пауз в процессе прокачивания позволяет жидкостям лучше проникнуть внутрь окрашиваемого среза и соответственно, чем толще срез, тем возможна более длительная пауза. Использование заявляемого способа и устройства для его осуществления в сочетании с зондами на основе конъюгатов одАТ и НК, позволяет проводить мультиплексное иммуногистохимическое окрашивание онкологических маркеров, находящихся в толстых срезах ткани благодаря высокой проникающей способности зондов, а также высокой фотостабильности и длительному времени жизни флуоресценции НК. Детекция флуоресцентного сигнала проводится с помощью конфокального флуоресцентного микроскопа, что позволяет проводить послойную детекцию флуоресцентного сигнала с разрешением порядка 200 нм в поперечной плоскости и 500 нм в осевом направлении.

Устройство для осуществления предложенного способа состоит из проточной кюветы, входного порта, выходного порта, сливной трубки и модуля регулировки скорости выходного потока. Присоединение к проточной кювете стекла, содержащего срез ткани для окрашивания, приводит к образованию замкнутого объема проточной камеры. Проточная кювета, выполнена из плоской пластины, размер которой может соответствовать размеру стандартного стекла для микроскопии - 25×75 мм и толщиной 2 мм, чтобы обеспечить жесткость конструкции, выполненной из оптически прозрачного полимера, такого как, например, полидиметилсилоксан. Поверхность проточной кюветы содержит два микрофлюидных модуля для подвода и отведения жидкости, а также проточную камеру для образца, размеры которой составляют от 5 до 20 мм в ширину и от 20 до 60 мм в длину, чтобы обеспечить достаточную для размещения и проведения анализа площадь образца ткани. Глубина проточной камеры может быть выбраны в диапазоне от 50 до 600 мкм, в зависимости от толщины исследуемого образца, чтобы обеспечить равномерное распределение жидкости в объеме проточной камеры. Микрофлюидный модуль для подачи жидкости имеет входной канал, соединенный с входным портом, расположенным на поверхности пластины проточной кюветы, от которого расходятся два и более канала, соединяющих входное отверстие с проточной камерой для образца. С другого конца проточной кюветы расположен микрофлюидный модуль для отведения жидкости, который также имеет отверстие, соединенное с выходным портом, расположенным на поверхности проточной кюветы, для отведения жидкости, от которого расходятся два и более канала, соединяющие выходное отверстие с противоположным от входа торцом проточной камеры. Каналы микрофлюидных модулей обеспечивают подачу, равномерное распределение и отведение жидкости внутри проточной камеры. Конструкция микрофлюидных модулей и проточной камеры может быть выполнена методом мягкой литографии, а отверстия для подачи и отвода жидкости могут быть выполнены методом сверления. Порты для подсоединения трубок к отверстиям для подачи и отвода жидкости выполнены из пластика и присоединены к поверхности пластины проточной кюветы путем склеивания, например, полиэфирным клеем. Диаметр и структура каналов микрофлюидных модулей должны обеспечивать протекание жидкости через проточную кювету со скорость от 5 до 750 микролитров в минуту, для чего их сечение должно составлять от 50×50 до 150×150 мкм. Количество каналов в микрофлюидных модулях от 2 до 16 зависит от ширины проточной камеры и необходимо для равномерной подачи жидкости в проточную камеру и ее отведения из проточной камеры. Для окрашивания к проточной кювете присоединяется стекло, содержащее срез ткани для анализа. Это приводит к замыканию каналов микрофлюидных модулей и проточной камеры, а также сквозных входного и выходного отверстий, вследствие чего жидкость при ее введении в проточную кювету через входное отверстие попадает в вводной микрофлюидный модуль, из него в проточную камеру, затем в выводной микрофлюидный модуль и через него в выходное отверстие. Герметизация кюветы и стекла осуществляется за счет плотного прилегания плоскости проточной кюветы и стекла, и может дополнительно фиксироваться, например, зажимами по периметру. При этом подача жидкости осуществляться с помощью насоса, например, перистальтического или шприцевого, присоединяемого к проточной кювете с помощью вводного порта. Кроме того, трубка, соединенная с выходным портом, содержит модуль регулировки скорости выходного потока, что может быть реализовано с помощью зажима, просвет которого регулируется с помощью винта. Возможность регулировки выходного потока необходима для регулировки давления внутри проточной камеры для увеличения или уменьшения эффективности проникновения жидкости внутрь исследуемого образца и его промывки.

Изобретение поясняется чертежом, где на фиг. 1 представлена принципиальная схема, иллюстрирующая конкретный пример реализации устройства для осуществления заявляемого способа. На фиг. 1 цифрами обозначены следующие элементы: пластина проточной кюветы - 1; входное отверстие - 2; входной канал вводного микрофлюидного модуля - 3; выходные каналы вводного микрофлюидного модуля - 4; проточная камера - 5; входные каналы выводного микрофлюидного модуля - 6; выходной канал выводного микрофлюидного модуля - 7; выходное отверстие - 8; входной порт - 9; выходной порт - 10; сливная трубка - 11; модуль регулировки скорости выходного потока - 12.

Реализация способа детекции онкологических маркеров в образцах опухолевой ткани при раке молочной железы и устройства для его осуществления раскрываются следующими примерами.

Пример 1.

Одновременная детекция биомаркеров на образце опухолевой ткани рака молочной железы. Для этого используется устройство, конструкция которого аналогична, изображенной на фиг. 1. Размер проточной кюветы составляет 25 мм по ширине, 75 мм по длине и 2 мм по толщине. Ширина проточной камеры составляет 5 мм, длина - 60 мм, глубина - 50 мкм. Ширина каналов микрофлюидных модулей составляет 50 мкм, а их глубина 50 мкм. Вводной микрофлюидный модуль имеет один входной канал и 2 выходных канала, а выводной микрофлюидный модуль имеет один выходной канал и 2 входных канала. Проточная кювета изготавливается методом мягкой литографии. Диаметры входного и выходного отверстий равны 1 мм, а порты для подсоединения трубок приклеены полиэфирным клеем со стороны пластины проточной кюветы противоположной стороне размещения микрофлюидных модулей и проточной камеры. Образец опухолевой ткани нарезается на микротоме на слои толщиной 20 мкм, один из которых размещается на положительно заряженном стекле для флуоресцентной микроскопии, так чтобы после совмещения стекла и проточной кюветы срез ткани оказался в области проточной камеры. Затем стекло со срезом ткани для фиксации и пермеабилизации погружается на 10 минут в 100% метанол, охлажденный до -20°C. Затем стекло со срезом ткани 5 минут инкубируется в 20 мл промывочного буфера, содержащего 140 мМ NaCl, 20 мМ Tris (pH 7,6). Затем промывочный буфер сменяется новым и стекло со срезом ткани инкубируется еще 5 минут. Спустя 5 минут стекло со срезом ткани вынимается из промывочного буфера и высушивается на открытом воздухе до полного высыхания поверхности стекла свободной от среза ткани. После этого стекло со срезом ткани накладывается на поверхность проточной кюветы так, чтобы образец оказался в области проточной камеры. Стекло и проточная кювета фиксируются с помощью зажимов по всему периметру. К входному порту проточной кюветы с помощью трубки подсоединяется перистальтический насос. Конец сливной трубки, через которую происходит вывод жидкости из проточной кюветы, помещается в емкость для сбора жидкости. Винтом на зажиме сливной трубки, с внутренним диаметром 1 мм, устанавливается такое усилие, чтобы площадь сечения отверстия для прохождения воды уменьшилась в 1,5 раза по сравнению с площадью сечения не деформированной трубки. Затем с помощью перистальтического насоса в проточную кювету подается буфер для блокирования неспецифического связывания (140 мМ NaCl, 20 мМ Tris (pH 7,6), 10% БСА) со скоростью 5 мкл/мин. После прокачивания 30 мкл (два объема проточной камеры) через проточную кювету поток останавливается и через 1 минуту прокачивается еще 15 мкл (один объем проточной камеры). Для промывки в кювету подается 75 мкл (5 объемов проточной камеры) промывочного буфера (140 мМ NaCl, 20 мМ Tris (pH 7,6), 10% БСА) со скоростью 5 мкл/мин. Затем с помощью перистальтического насоса в проточную кювету подается раствор, содержащий 140 мМ NaCl, 20 мМ Tris (pH 7,6), первую популяцию пространственно ориентированных конъюгатов НК (максимум флуоресценции на 680 нм) с одАТ к HER2 и вторую популяцию пространственно ориентированных конъюгатов НК (максимум флуоресценции 601 нм) с одАТ к EGFR, со скоростью 5 мкл/мин. После прокачивания 45 мкл (три объема проточной камеры) через проточную кювету поток останавливается на 180 минут. Для промывки в кювету подается 75 мкл (пять объемов проточной камеры) промывочного буфера (140 мМ NaCl, 20 мМ Tris (pH 7,6), 10% БСА) со скоростью 5 мкл/мин. После этого проточная кювета переносится в конфокальный микроскоп и производится послойное возбуждение и считывание флуоресцентного сигнала конъюгатов НК и одАТ на соответствующих длинах волн с временной задержкой между возбуждением и детекцией флуоресцентного сигнала 50 наносекунд.

Пример 2.

Одновременная детекция биомаркеров на образце опухолевой ткани рака молочной железы. Для этого используется устройство, конструкция которого аналогична, изображенной на фиг. 1. Размер проточной кюветы составляет 25 мм по ширине, 75 мм по длине и 2 мм по толщине. Ширина проточной камеры составляет 20 мм, длина - 20 мм, глубина - 600 мкм. Ширина каналов микрофлюидных модулей составляет 150 мкм, а их глубина 150 мкм. Вводной микрофлюидный модуль имеет один входной канал и 16 выходных каналов, а выводной микрофлюидный модуль имеет один выходной канал и 16 входных каналов. Проточная кювета изготавливается методом мягкой литографии. Диаметры входного и выходного отверстий равны 1 мм, а порты для подсоединения трубок приклеены полиэфирным клеем со стороны пластины проточной кюветы противоположной стороне размещения микрофлюидных модулей и проточной камеры. Образец опухолевой ткани нарезается на микротоме на слои толщиной 200 мкм, один из которых размещается на положительно заряженном стекле для флуоресцентной микроскопии, так чтобы после совмещения стекла и проточной кюветы срез ткани оказался в области проточной камеры. Затем стекло со срезом ткани для фиксации и пермеабилизации погружается на 10 минут в 100% метанол, охлажденный до -20°C. Затем стекло со срезом ткани 10 минут инкубируется в 20 мл промывочного буфера, содержащего 140 мМ NaCl, 20 мМ Tris (pH 7,6). Затем промывочный буфер сменяется новым и стекло со срезом ткани инкубируется еще 10 минут. Спустя 10 минут стекло со срезом ткани вынимается из промывочного буфера и высушивается на открытом воздухе до полного высыхания поверхности стекла свободной от среза ткани. После этого стекло со срезом ткани накладывается на поверхность проточной кюветы так, чтобы образец оказался в области проточной камеры. Стекло и проточная кювета фиксируются с помощью зажимов по всему периметру. К входному порту проточной кюветы с помощью трубки подсоединяется перистальтический насос. Конец сливной трубки, через которую происходит вывод жидкости из проточной кюветы, помещается в емкость для сбора жидкости. Винтом на зажиме сливной трубки, с внутренним диаметром 1 мм, устанавливается такое усилие, чтобы площадь сечения отверстия для прохождения воды уменьшилась в 1,5 раза по сравнению с площадью сечения не деформированной трубки. Затем с помощью перистальтического насоса в проточную кювету подается буфер для блокирования неспецифического связывания (140 мМ NaCl, 20 мМ Tris (pH 7,6), 10% БСА) со скоростью 250 мкл/мин. После прокачивания 720 мкл (три объема проточной камеры) через проточную кювету поток останавливается и через 60 минуту прокачивается еще 480 мкл (два объем проточной камеры). Для промывки в кювету подается 2,4 мл (десять объемов проточной камеры) промывочного буфера (140 мМ NaCl, 20 мМ Tris (pH 7,6), 10% БСА) со скоростью 750 мкл/мин. Затем с помощью перистальтического насоса в проточную кювету подается раствор, содержащий 140 мМ NaCl, 20 мМ Tris (pH 7,6), первую популяцию пространственно ориентированных конъюгатов НК (максимум флуоресценции на 680 нм) с одАТ к HER2 и вторую популяцию пространственно ориентированных конъюгатов НК (максимум флуоресценции 601 нм) с одАТ к EGFR, со скоростью 250 мкл/мин. После прокачивания 720 мкл (три объема проточной камеры) через проточную кювету поток останавливается и через 300 минут прокачивается еще 480 мкл (два объема проточной камеры) и поток останавливается еще на 300 минут. Для промывки в кювету подается промывочный буфер (140 мМ NaCl, 20 мМ Tris (pH 7,6), 10% БСА) со скоростью 150 мкл/мин. После прокачивания 1,2 мл (пять объемов проточной камеры) через проточную кювету поток останавливается и через 60 минут прокачивается еще 1,2 мл (пять объемов проточной камеры). После этого проточная кювета переносится в конфокальный микроскоп и производится послойное возбуждение и считывание флуоресцентного сигнала конъюгатов НК и одАТ на соответствующих длинах волн с временной задержкой между возбуждением и детекцией флуоресцентного сигнала 5 наносекунд.

Заявленный способ детекции онкологических маркеров в образцах опухолевой ткани позволяет проводить детекцию онкологических маркеров с помощью конфокального микроскопа в толстых срезах опухолевой ткани и обеспечивает одновременное иммуногистохимическое объемное окрашивание двух и более онкологических маркеров в режиме полуавтоматического проточного окрашивания с помощью заявленного устройства.

Источники информации

1. Заявка CN 102961761 А, опубл. 13 марта 2013 года. Quantum dot targeting probe for colorectal cancer tumor tissue identification and preparation method thereof.

2. Патент US 10436683 B2, опубл. 08 октября 2019 года. Sample processing device with detachable slide.

3. Патент RU 2560699 C2, опубл. 10 февраля 2015 года. Способ создания наноразмерной диагностической метки на основе конъюгатов наночастиц и однодоменных антител.

4. Патент RU 2639125 С1, опубл. 19 декабря 2017 года. Способ биологической визуализации.

Группа изобретений относится к способу детекции онкологических маркеров в образцах опухолевой ткани, включающему предварительное размещение среза образца опухолевой ткани толщиною 20-200 мкм на стекле, фиксацию и пермеабилизацию среза образца опухолевой ткани, далее стекло с образцом опухолевой ткани промывают и размещают на проточной кювете, после чего проводят герметизацию с возможностью образования поверхностями стекла и проточной кюветой замкнутого объема проточной камеры с заключенным в ней срезом образца опухолевой ткани, при этом высота проточной камеры, образованной поверхностями стекла и проточной кюветы, должна быть в 2-5 раз больше толщины анализируемого среза ткани, затем через отверстие для ввода подают буфер для блокирования неспецифического связывания, в объеме равном 3-5 объемам проточной камеры, после чего в отверстие для ввода подают промывочный буфер в объеме равном 5-10 объемам проточной камеры, далее в отверстие для ввода подают раствор содержащий смесь двух или более различных популяций пространственно ориентированных конъюгатов однодоменных антител и флуоресцентных нанокристаллов, в объеме равном 3-5 объемам проточной камеры, после чего в отверстие для ввода подают промывочный буфер в объеме равном 5-10 объемам проточной камеры, при этом подача жидкостей через вводной порт проточной кюветы осуществляют с помощью насоса, а давление жидкости в проточной камере регулируют с помощью изменения потока через выводной порт проточной кюветы, в завершении проводят детекцию флуоресценции нанокристаллов в заданных оптических диапазонах с помощью конфокального флуоресцентного микроскопа, и также относится к устройству для реализации способа, состоящему из проточной кюветы, входного порта, выходного порта, сливной трубки и модуля регулировки скорости выходного потока, причем проточная кювета представляет собой плоскую пластину, выполненную из оптически прозрачного полимера, содержащую сквозное входное отверстие, перпендикулярное плоскости пластины, соединенное с входным каналом вводного микрофлюидного модуля, выходные каналы которого соединены с торцом проточной камерой, противоположный торец проточной камеры соединен с входными каналами выводного микрофлюидного модуля, выходной канал которого соединен со сквозным выходным отверстием, расположенным перпендикулярно плоскости пластины, к входному отверстию проточной кюветы, подсоединен вводной порт для подключения насоса и подачи жидкости, а к выходному отверстию проточной кюветы, подсоединен выводной порт соединенный сливной трубкой с модулем регулировки скорости выходного потока жидкости, причем вводной и выводной порты присоединены к проточной кювете со стороны плоскости противоположной поверхности, содержащей проточную камеру. Группа изобретений обеспечивает повышение эффективности иммуногистохимических исследований за счет обеспечения возможности детекции онкологических маркеров в толстых срезах опухолевой ткани толщиной до 200 мкм и одновременного иммуногистохимического объемного окрашивания двух и более онкологических маркеров в режиме проточного окрашивания. 2 н. и 14 з.п. ф-лы, 1 ил., 2 пр.

1. Способ детекции онкологических маркеров в образцах опухолевой ткани, включающий предварительное размещение среза образца опухолевой ткани толщиною 20-200 мкм на стекле, фиксацию и пермеабилизацию среза образца опухолевой ткани, далее стекло с образцом опухолевой ткани промывают и размещают на проточной кювете, после чего проводят герметизацию, с возможностью образования поверхностями стекла и проточной кюветой замкнутого объема проточной камеры с заключенным в ней срезом образца опухолевой ткани, при этом высота проточной камеры, образованной поверхностями стекла и проточной кюветы, должна быть в 2-5 раз больше толщины анализируемого среза ткани, затем через отверстие для ввода подают буфер для блокирования неспецифического связывания, в объеме равном 3-5 объемам проточной камеры, после чего в отверстие для ввода подают промывочный буфер в объеме равном 5-10 объемам проточной камеры, далее в отверстие для ввода подают раствор содержащий смесь двух или более различных популяций пространственно ориентированных конъюгатов однодоменных антител и флуоресцентных нанокристаллов, в объеме равном 3-5 объемам проточной камеры, после чего в отверстие для ввода подают промывочный буфер в объеме равном 5-10 объемам проточной камеры, при этом подача жидкостей через вводной порт проточной кюветы осуществляют с помощью насоса, а давление жидкости в проточной камере регулируют с помощью изменения потока через выводной порт проточной кюветы, в завершении проводят детекцию флуоресценции нанокристаллов в заданных оптических диапазонах с помощью конфокального флуоресцентного микроскопа.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что каждая отдельная популяция пространственно ориентированных конъюгатов содержит однодоменные антитела, связывающие заданный опухолевый биомаркер и флуоресцентные нанокристаллы с заданным спектром флуоресценции, причем различные популяции пространственно ориентированных конъюгатов отличаются между собой специфичность однодоменных антител и спектром флуоресценции нанокристаллов.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что подачу жидкостей через вводное отверстие проточной кюветы осуществляют с одинаковой или переменной скоростью.

4. Способ по пп. 1-3, отличающийся тем, что подачу жидкостей через вводное отверстие проточной кюветы осуществляют с паузами после прокачивания одного и/или двух, и/или трех объемов проточной камеры.

5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что длительность паузы составляет от 1 до 180 минут.

6. Способ по пп. 1-3, отличающийся тем, что скорость потока входящей жидкости составляет от 5 до 750 мкл/мин.

7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что детекцию флуоресцентного сигнала от нанокристаллов проводят через 5-50 наносекунд после возбуждения их флуоресцентного сигнала.

8. Устройство для реализации способа по п. 1, состоящее из проточной кюветы, входного порта, выходного порта, сливной трубки и модуля регулировки скорости выходного потока, причем проточная кювета представляет собой плоскую пластину, выполненную из оптически прозрачного полимера, содержащую сквозное входное отверстие, перпендикулярное плоскости пластины, соединенное с входным каналом вводного микрофлюидного модуля, выходные каналы которого соединены с торцом проточной камерой, противоположный торец проточной камеры соединен с входными каналами выводного микрофлюидного модуля, выходной канал которого соединен со сквозным выходным отверстием, расположенным перпендикулярно плоскости пластины, к входному отверстию проточной кюветы, подсоединен вводной порт для подключения насоса и подачи жидкости, а к выходному отверстию проточной кюветы, подсоединен выводной порт соединенный сливной трубкой с модулем регулировки скорости выходного потока жидкости, причем вводной и выводной порты присоединены к проточной кювете со стороны плоскости противоположной поверхности, содержащей проточную камеру.

9. Устройство по п. 8, отличающееся тем, что размер пластины проточной кюветы составляет 25 мм по ширине, 75 мм по длине и 2 мм по толщине.

10. Устройство по п. 8, отличающееся тем, что размер проточной камеры составляет от 5 до 20 мм в ширину, от 20 до 60 мм в длину и от 50 до 600 мкм в высоту.

11. Устройство по п. 8, отличающееся тем, что поперечный размер микрофлюидных каналов составляет от 50×50 мкм, до 150×150 мкм.

12. Устройство по пп. 8, 11, отличающееся тем, что вводной микрофлюидный модуль имеет один входной канал и 2, 4, 8 или 16 выходных каналов.

13. Устройство по пп. 8, 11, отличающееся тем, что выводной микрофлюидный модуль имеет один выходной канал и 2, 4, 8 или 16 входных каналов.

14. Устройство по п. 8, отличающееся тем, что вводной и выводной порты подсоединен к входному и выходному отверстию путем склеивания с помощью полиэфирного клея.

15. Устройство по п. 8, отличающееся тем, что пластина проточной кюветы изготовлена из полидиметилсилоксана.

16. Устройство по п. 8, отличающееся тем, что модуль регулировки скорости выходного потока жидкости представляет собой зажим для сливной трубки, пропускная способность через который регулируется с помощью винта.