ЛИГАНДЫ TLR3, КОТОРЫЕ АКТИВИРУЮТ КАК ЭПИТЕЛИАЛЬНЫЕ, ТАК И МИЕЛОИДНЫЕ КЛЕТКИ Российский патент 2024 года по МПК C12N15/113 A61K31/713 A61P35/00 

Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей короткую и определенную двухцепочечную РНК (дцРНК), имеющую две комплементарные цепи, включающую одну цепь, содержащую по меньшей мере один блок поли(A), и комплементарную цепь, содержащую комплементарный блок поли(U), и по возможности, химерные формы с другими нуклеотидами из A, U, G, I или C. Изобретение также относится к такой композиции для использования при лечении TLR3-позитивного рака и к родственным способам лечения. В частности, оно относится к дцРНК, действующей в качестве лигандов TLR3 и активирующей как эпителиальные, так и миелоидные клетки.

Предшествующий уровень техники

TLR3 - это паттерн-распознающий рецептор, экспрессируемый в основном в эндолизосомах, который, по-видимому, предназначен для обнаружения вирусной инфекции посредством связывания дцРНК. Действительно, было показано, что дцРНК, продуцируемая вирусом либо в виде своего геномного материала (дцРНК-вирусы), либо в виде промежуточных продуктов их жизненного цикла (оцРНК-вирусы, ДНК-вирусы), активирует TLR3. Более того, было обнаружено, что некоторые эндогенные дцРНК позвоночных, высвобождающиеся во время разрушения ткани, активируют TLR3. Кроме того, были разработаны синтетические дцРНК, которые также активируют TLR3. Они включают поли(I:C), поли(A:U) и их варианты, такие как поли(I):поли(C)12U (Ampligen®).

Обширные эксперименты с дцРНК, включая анализы связывания TLR3 и анализы TLR3-зависимой передачи сигналов с TLR3 дикого типа и мутантным TLR3, кристаллографические исследования с дцРНК-связанным TLR3 и анализ in vivo ответа на дцРНК у мышей дикого типа и мышей TLR3-/- вносят вклад в определение структурных особенностей, необходимых для активации TLR3 (Botos, I. et al., Biochim. Biophys. Acta 1789, 667-674, 2009). Лиганды-агонисты TLR3 представляют собой дцРНК со следующими особенностями: (1) дцРНК должна состоять из немодифицированной рибозы, которая может включать инозины; (2) точная последовательность не имеет решающего значения; (3) минимальная длина приблизительно 50 п.о. (48 Å), по-видимому, обусловлена расстоянием между сайтами связывания РНК на внеклеточных доменах TLR3 в гомодимерах, которые представляют собой сигнальные единицы; (4) одноцепочечные РНК, которые складываются и образуют структуру стержень-петля, также могут активировать TLR3; (5) дцРНК должна сначала эффективно интернализоваться внутри клеток, то есть через связывание с рецепторами-скавенджерами, прежде чем запускать димеризацию TLR3, которая представляет собой первый этап передачи сигнала. В отличие от поли(A:U), которая, по-видимому, является высокоспецифичной для TLR3 у человека, поли(I:C) также связывает и активирует цитозольные рецепторы дцРНК RIG-I, MDA5 и PKR.

Преимущество таргетинга TLR3 при раке и других заболеваниях, скорее всего, будет связано с комбинированной активацией различных типов клеток, включая эпителиальные, миелоидные, мезенхимальные и эндотелиальные клетки. Хотя было показано, что иммунные и неиммунные клетки человека продуцируют или не продуцируют воспалительные цитокины в ответ на поли(I:C), предполагалось, что у человека это зависит от типа клеток, а не от самого лиганда TLR3.

Композиции, содержащие дцРНК, направленную на TLR3, являются коммерческими. Например, существуют коммерческие композиции поли(A:U), которые представляют собой смеси дцРНК разной длины, и длина обычно составляет порядка 200-8000 пар оснований.

Целью изобретения

является получение короткой дцРНК, которая эффективно активирует как миелоидные, так и эпителиальные клетки, и приводит к гибели раковых клеток. В частности, цель состоит в получении таких коротких дцРНК, способных как активировать миелоидные клетки, так и запускать гибель эпителиальных раковых клеток.

Другая цель состоит в обеспечении композиции дцРНК, в которой большинство, если не все молекулы дцРНК, имеют заданный состав и активны, так что необходимые условия регуляции функций достигаются легче, чем с неопределенными смесями, и дозы дцРНК могут быть улучшены.

Еще одна цель состоит в обеспечении дцРНК, которая не обязательно требует агента трансфекции для проникновения в клетки-мишени.

Пытаясь разработать новые клинические лиганды TLR3 для терапии, изобретатели провели скрининг определенных дцРНК на предмет их способности как активировать миелоидные клетки, так и запускать гибель эпителиальных раковых клеток, и смогли определить дцРНК, способную решить эти и другие задачи.

Краткое изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение относится к композиции, содержащей дцРНК, включающую по меньшей мере один блок или гомополимер поли(A) и комплементарный блок поли(U) короткой и определенной длины, в частности, дцРНК, в которой каждая цепь содержит от 50 до 200 нуклеотидов или оснований. Предпочтительно длина каждой цепи составляет примерно от 55 до 100, 150 или 200 оснований, особенно примерно от 60 до 70, 80, 90 или 100 оснований. Предпочтительно все цепи или практически все цепи в композиции имеют заданную длину. Предпочтительно цепи и дцРНК являются синтетическими.

Синтез - это приоритетный способ получения цепей дцРНК короткой и определенной длины. Цепи дцРНК по изобретению могут быть синтетическими цепями дцРНК, например, полученными путем синтеза. По соглашению, полученные таким образом цепи и дцРНК квалифицируются как синтетические. Различные способы синтеза описаны в других разделах заявки. Короткую и определенную длину цепей в соответствии с изобретением можно контролировать стандартными способами, такими как электрофорез, как проиллюстрировано здесь на примере акриламидного геля.

Способы синтеза позволяют предпочтительно получить короткие и определенные цепи дцРНК по изобретению. Эти способы позволяют предпочтительно получать цепи дцРНК, имеющие точную необходимую длину. Эти способы позволяют предпочтительно получать композицию, в которой все цепи имеют одинаковую длину и/или в которой все дцРНК состоят из цепей одинаковой длины. Однако определенное и ограниченное изменение длины некоторых цепей может быть приемлемым, и включено в композиции согласно изобретению, независимо от того, получены ли цепи путем синтеза или другим способом. В частности, такое изменение разрешено и охватывается, если это существенно не меняет функцию или эффективность композиции. В одном варианте осуществления вариантная композиция по-прежнему активирует миелоидные клетки и вызывает гибель эпителиальных раковых клеток. В другом варианте осуществления вариантная композиция все еще активирует миелоидные клетки и запускает гибель эпителиальных раковых клеток по существу на том же уровне, что и композиция, в которой все цепи имеют одинаковую длину и/или где все дцРНК состоят из цепей, имеющих одинаковую длину. Предпочтительно, композиции по изобретению содержат значительную и эффективную долю, особенно долю, равную или превышающую 95, 96, 97, 98, 99 или 99,5%, или примерно 100% цепей, имеющих определенную длину. Можно сказать, что композиция содержит активное начало дцРНК, состоящее по существу из такой значительной и эффективной доли цепей, имеющих определенную длину, включая эти проценты.

В дцРНК блоки поли(А) и поли(U) могут быть объединены с одним или несколькими основаниями из A, U, G, I, C, поли(А), поли(U), поли(G), поли(I) или поли(C) и комплементарными нуклеотидами или блоками. Примерные структуры для одной цепи (затем представлена комплементарная цепь): поли(А) - поли(I), поли(А) - поли(C), поли(I) - поли(А), поли(C) - поли(А), поли(I) - поли(А) - поли(I), поли(C) - поли(А) - поли(C), поли(А) - поли(I) - поли(А), поли(А) - поли(C) - поли(А).

«Гомополимер» означает последовательность по меньшей мере двух идентичных и смежных оснований.

Таким образом, охватываются поли(А/I) или (A/C) и комплементарная цепь, состоящая из блоков поли(U/C) или (U/I). Их также можно обозначить как поли(А/I): поли(U/C) или поли(А/C): поли(U/I). В соответствии с признаком, цепь поли(А/I) или поли(U/C) имеет заданную длину от более чем 50 до примерно 200 оснований. Предпочтительно длина указанной цепи составляет примерно от 55 до 200 оснований, особенно примерно от 60 до 100 оснований.

Цепи могут содержать, в частности, один или несколько блоков (предпочтительно один или два) из A или U, составляющих по меньшей мере примерно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 A, соответственно U; такой блок может дополнительно содержать менее 20, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% другого основания из A (когда Q = A) / U (когда Q = A), G, I и C.

В изобретении используется, в частности, дцРНК длиной от 50 до примерно 200 пар оснований (предпочтительно примерно от 55 до 100, 150 или 200, предпочтительно примерно от 60 до 120, предпочтительно примерно от 70 до 100, например, около 60, около 70, около 80, около 90), имеющая по меньшей мере одну цепь, содержащую по меньшей мере один блок A или U, и комплементарную цепь (таким образом, с комплементарным блоком U, соответственно A), в соответствии со следующей формулой (I) (представлена только одна цепь), где дцРНК составляет по меньшей мере 20%, предпочтительно по меньшей мере 25%, более предпочтительно по меньшей мере 50%, еще более предпочтительно по меньшей мере 70 или 75% (или даже по меньшей мере 80, 85, 90 или 95%) A и U:

(I) [P]_a [Q]_b [R]_c

- Q представляет собой гомополимер A или U, b представляет собой целое число, равное по меньшей мере 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 или более; такой блок может при необходимости содержать менее 20, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% другого основания из A (когда Q = A)/ U (когда Q = A), G, I и C;

- a, b и c представляют ряд оснований или нуклеотидов, так что a+b+c представляет длину цепи или дцРНК;

- a и c могут быть независимо 0 или целыми числами, так что a+b+c = от 50 до 200, предпочтительно от 60 до 120, более предпочтительно от 70 до 100; a, b и c могут быть одинаковыми или разными;

- если a = 1, в случае Q = A, P состоит из одного основания из U, G, I и C; в результате комплементарности, если Q = U, P состоит из одного основания из A, G, I и C;

- если a > 1, P состоит по меньшей мере из одного или двух оснований из A, U, G, I и C в одной из этих конфигураций: случайная комбинация по меньшей мере двух из этих оснований, один блок оснований из A, U, G, I и C, по меньшей мере два блока с разными основаниями из A, U, G, I и C, или смесь по меньшей мере одного блока оснований из A, U, G, I и C и по меньшей мере еще одного основания из A, U, G, I и C;

- если c = 1, в случае R = A, R состоит из одного основания из U, G, I и C; в результате комплементарности, если R = U, P состоит из одного основания из A, G, I и C;

- если c > 1, R состоит по меньшей мере из одного или двух оснований из A, U, G, I и C, в одной из этих конфигураций: случайная комбинация по меньшей мере двух из этих оснований, один блок из основания из A, U, G, I и C, по меньшей мере два блока с разными основаниями из A, U, G, I и C, или смесь по меньшей мере одного блока основания из A, U, G, I и C и по меньшей мере еще одного основания из A, U, G, I и C;

- P и R могут быть идентичными или разными в отношении оснований и/или длины последовательности.

В одном варианте в формуле (I) b представляет собой целое число не менее 10.

В формуле (I), где Q = A или U, b может составлять, в частности, примерно от 35 до 200, в частности, примерно от 50 до 200, предпочтительно примерно от 55 до 100, 150 или 200, предпочтительно примерно от 60 до 120, предпочтительно примерно от 70 до 100, например, около 60, около 70, около 80, около 90. Блок поли(А) может содержать менее 20, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% другого основания из U, G, I и C. Блок поли(U) будет комплементарен ему и будет включать соответствующие A, G, I и/или C.

В одном варианте осуществления этой формулы (I) выше и её вариантах осуществления ниже блок поли(A) или блоки поли(A) могут содержать менее 20, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% другого основания из U, G, I и C. Таким образом, соответствующий блок поли(U) или блоки поли(U) будут комплементарными и будут иметь парные основания из A, G, I и.

В одном варианте осуществления формула (I) образует поли(А):поли(U). В этом случае достаточно, например, чтобы a = c = 0, Q = A, и b составляло по меньшей мере 50 или по меньшей мере примерно 50, в частности, примерно от 50 до 200, предпочтительно примерно от 55 до 100, 150 или 200, предпочтительно примерно от 60 до 120, предпочтительно примерно от 70 до 100, например, около 60, около 70, около 80, около 90.

Изобретение также включает использование модифицированных нуклеотидов A, U, I, G, C, таких как O-метилированные нуклеотиды, фосфотиоатные нуклеотиды и т.д.

В другом варианте осуществления формула (I) образует поли(Р)-поли(А)-поли(R). Комплементарной цепью может быть поли(P’)-поли(U)-поли(R’), где P’ и R’ представляют собой комплементарное основание или основания из P, соответственно R, в этом положении.

В другом варианте осуществления формула (I) образует поли(А)-поли(Х)-поли(А), где Х может представлять собой U, G, I, С, поли(U), поли(G), поли(I), поли(С) или любую их комбинацию, и по возможности с вставками (А) или поли(А). Комплементарной цепью может быть поли(U)-поли(Y)-поли(U), где Y является комплементарным основанием или основаниями X в этом положении.

В другом варианте осуществления формула (I) образует поли(Р)-поли(А). Комплементарной цепью может быть поли(P’)-поли(U), где P’ является комплементарным основанием или основаниями P в этом положении.

В другом варианте осуществления формула (I) образует поли(А)-поли(R). Комплементарной цепью может быть поли(U)-поли(R’), где R’ представляет собой комплементарное основание или основания R в этом положении.

В следующих вариантах осуществления формулы a, b и c могут иметь то же значение, что и выше. A и U обозначают основания A и U.

В первом варианте осуществления дцРНК имеет формулу (II):

[A]_b

[U]_b

В частности, b = от 50 до 200, предпочтительно примерно от 55 до 100, 150 или 200, предпочтительно примерно от 60 до 120, предпочтительно примерно от 70 до 100, например, около 60, около 70, около 80, около 90.

Во втором варианте осуществления дцРНК имеет формулу (III):

[P]_a [A]_b [R]_c

[Y]_a [U]_b [Z]_c

P и R независимо выбраны из G, I и/или C, а Y и Z являются комплементарными основаниями.

В частности,

b представляет собой целое число от 20, 25 или 30 до 100, в частности примерно от 35 до 100, в частности примерно от 40 до 100, предпочтительно примерно от 50 до 100, например, приблизительно от 50 до 90, предпочтительно примерно от 50 до 80, например, около 40, около 50, около 60, около 70, около 80;

а и с независимо составляют примерно от 10 до 50, предпочтительно примерно от 15 до 40.

В частности,

b представляет собой целое число от 10, 15, 20, 25 или 30 до 100, в частности примерно от 35 до 100, в частности примерно от 40 до 100, предпочтительно примерно от 50 до 100, например, приблизительно от 50 до 90, предпочтительно примерно от 50 до 80, например, около 40, около 50, около 60, около 70, около 80;

а и с независимо составляют примерно от 5 до 50, в частности примерно от 10 до 50, предпочтительно примерно от 15 до 40.

В частности,

b представляет собой целое число от 10 до 100,

а и с независимо составляют примерно от 10 до 50, предпочтительно примерно от 15 до 40.

В частности,

b представляет собой целое число от 10, 15, 20, 25 или 30 до 100, в частности примерно от 35 до 100, в частности примерно от 40 до 100, предпочтительно примерно от 50 до 100, например, приблизительно от 50 до 90, предпочтительно примерно от 50 до 80, например, около 40, около 50, около 60, около 70, около 80,

а и с независимо составляют примерно от 10 до 50.

В третьем варианте осуществления дцРНК имеет формулу (IV):

[A]_b [R]_c

[U]_b [Z]_c

R выбран из G, I и/или C, Z представляет собой комплементарное основание.

В частности,

b представляет собой целое число от 20, 25 или 30 до 100, в частности примерно от 35 до 100, в частности примерно от 40 до 100, предпочтительно примерно от 50 до 100, например, приблизительно от 50 до 90, предпочтительно примерно от 50 до 80, например, около 40, около 50, около 60, около 70, около 80,

c составляет примерно от 10 до 50, предпочтительно примерно от 15 до 40, предпочтительно примерно от 30 до 40, например, около 35, около 40, около 45.

В частности,

b представляет собой целое число от 10, 15, 20, 25 или 30 до 100, в частности примерно от 35 до 100, в частности примерно от 40 до 100, предпочтительно примерно от 50 до 100, например, приблизительно от 50 до 90, предпочтительно примерно от 50 до 80, например, около 40, около 50, около 60, около 70, около 80,

c составляет примерно от 10 до 50, предпочтительно примерно от 15 до 40, предпочтительно примерно от 30 до 40, например, около 35, около 40, около 45.

В частности,

b представляет собой целое число от 10 до 100 или примерно от 35 до 100,

c составляет примерно от 30 до 50, предпочтительно примерно от 30 до 40, например, около 35, около 40, около 45.

В частности,

b представляет собой целое число от 10, 15, 20, 25 или 30 до 100, в частности примерно от 35 до 100, в частности примерно от 40 до 100, предпочтительно примерно от 50 до 100, например, приблизительно от 50 до 90, предпочтительно примерно от 50 до 80, например, около 40, около 50, около 60, около 70, около 80,

c составляет примерно от 10 до 50.

В четвертом варианте осуществления дцРНК имеет формулу (V):

[P]_a [A]_b

[Y]_a [U]_b

P выбран из G, I и/или C, Y представляет собой комплементарное основание.

В частности,

b представляет собой целое число от 20, 25 или 30 до 100, в частности примерно от 35 до 100, в частности примерно от 40 до 100, предпочтительно примерно от 50 до 100, например, приблизительно от 50 до 90, предпочтительно примерно от 50 до 80, например, около 40, около 50, около 60, около 70, около 80,

а составляет примерно от 10 до 50, предпочтительно примерно от 15 до 40, предпочтительно примерно от 30 до 40, например, около 35, около 40, около 45.

В частности,

b представляет собой целое число от 10 до 100, в частности примерно от 35 до 100, в частности примерно от 40 до 100, предпочтительно примерно от 50 до 100, например, приблизительно от 50 до 90, предпочтительно примерно от 50 до 80, например, около 40, около 50, около 60, около 70, около 80,

а составляет примерно от 10 до 50, предпочтительно примерно от 15 до 40, предпочтительно примерно от 30 до 40, например, около 35, около 40, около 45.

В частности,

b представляет собой целое число от 10 до 100, в частности примерно от 35 до 100,

а составляет примерно от 30 до 50, предпочтительно примерно от 30 до 40, например, около 35, около 40, около 45.

В частности,

b представляет собой целое число от 10 до 100, в частности примерно от 35 до 100, в частности примерно от 40 до 100, предпочтительно примерно от 50 до 100, например, приблизительно от 50 до 90, предпочтительно примерно от 50 до 80, например, около 40, около 50, около 60, около 70, около 80,

а составляет примерно от 10 до 50.

В одном из вариантов осуществления дцРНК имеет формулу (VI):

[P]_a [A]_b [R]_c

[Y]_a [U]_b [Z]_c

P и R независимо выбраны из I и C, а Y и Z являются комплементарными основаниями,

b представляет собой целое число примерно от 20, 25 или 30 примерно до 100,

один из a или c может быть 0, а a и c, не равные 0 одновременно, составляют примерно от 10 до 50.

В одном варианте осуществления этих формул (II), (III), (IV), (V), (VI) блок или гомополимер поли(А) или блоки или гомополимеры поли(А) могут содержать менее 20, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% другого основания из U, G, I и C. Комплементарный блок (блоки) U, конечно же, будет интегрировать комплементарные основания.

В предпочтительном варианте осуществления композиция содержит цепь поли(А/I) и цепь поли(U/C), где обе цепи имеют одинаковую заданную длину от более 0 до примерно 200 оснований. Предпочтительно длина обеих цепей составляет примерно от 55 до 200 оснований, предпочтительно примерно от 60 до 100 оснований. Например, обе цепи имеют примерно 60, 70, 80, 90 или 100 оснований каждая.

Термин «двухцепочечная» означает часть, где рибонуклеотиды связаны водородными связями (находятся в парных основаниях) с комплементарными рибонуклеотидами с образованием двухцепочечной структуры. Можно говорить о перекрывании, когда обе цепи соединены в пару. Предпочтительно все цепи являются парными (100% комплементарных цепей являются парными). Однако изобретение охватывает дцРНК, имеющую по меньшей мере примерно 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% или 99,5% длины из спаренных цепей (двухцепочечную конформацию). В одной и той же композиции можно иметь дцРНК с различным процентом спаривания. Определение того, какой процент дцРНК агониста TLR3 находится в двухцепочечной конформации, проводят путем деления количества нуклеотидов из парных оснований на общее количество нуклеотидов в молекуле. Таким образом, молекула с 21 парными основаниями, содержащая 2 «липких» конца как на 3', так и на 5'-конце, будет иметь 42 нуклеотида из парных оснований, и 4 нуклеотида не из парных оснований, что делает её на 42/46 или 91,3% двухцепочечной или спаренной.

Соответствие серии дцРНК можно контролировать известными способами. Примером является способ, описанный в Примерах 1 и 10, с акриламидными гелями.

Предпочтительно композиции по настоящему изобретению содержат набор таких дцРНК, имеющих более 95, 96, 97, 98, 99 или 99,5% парных оснований, или полностью (примерно на 100%) парных дцРНК, например, дцРНК включает цепь поли(А/I) и цепь поли(U/C), причем обе цепи имеют одинаковую заданную длину от более 50 до примерно 200 оснований, предпочтительно, длина обеих цепей составляет примерно от 55 до 200 оснований, предпочтительно примерно от 60 до 100 оснований. Например, обе цепи имеют примерно 60, 70, 80, 90 или 100 оснований каждая.

Композиция может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый растворитель, носитель или вспомогательное вещество. В одном варианте осуществления композиция является стерильной.

В изобретении термин «содержать» может быть заменен на «в основном состоит из» или «состоит из».

Еще одним объектом изобретения является такая композиция, как лекарственное средство.

Другим объектом изобретения является такая композиция для применения в способе лечения у человека или животного рака, экспрессирующего рецептор TLR3.

Другим объектом изобретения является такая композиция для использования в качестве лекарственного средства.

Другим объектом является использование этой композиции для производства лекарственного средства для лечения у человека или животного рака, экспрессирующего рецептор TLR3.

ДцРНК, содержащаяся в композиции, служит агонистом рецептора TLR3.

В одном из вариантов осуществления композиция индуцирует воспаление в миелоидных клетках человека или животного.

В одном из вариантов осуществления композиция индуцирует, например, продукцию фактора некроза опухоли-альфа и/или интерферона I типа миелоидными клетками человека или животного.

В одном из вариантов осуществления композиция индуцирует гибель эпителиальных раковых клеток.

В одном из вариантов осуществления композиция индуцирует как воспаление, так и гибель раковых клеток.

Другим объектом изобретения является такая композиция в качестве лекарственного средства, активирующего миелоидные клетки человека или животного, в частности, продукцию TNF-α и активацию ISRE-репортерного гена (интерферон-чувствительного отвечающего элемента, связанного с репортерным геном), и запускающего гибель эпителиальных раковых клеток.

Другим объектом изобретения является такая композиция в качестве лекарственного средства, специфически активирующего TLR3, экспрессируемый миелоидными клетками (макрофагами и дендритными клетками), индуцирующего секрецию воспалительного цитокина и запускающего TLR3-зависимую активацию воспаления и гибели в раковых клетках человека или млекопитающего.

Другим объектом является фармацевтическая композиция, содержащая дцРНК согласно изобретению и химиотерапевтическое лекарственное средство, для применения в способе лечения рака, экспрессирующего TLR3, с одновременным, раздельным или последовательным введением дцРНК согласно изобретению и химиотерапевтического лекарственного средства для млекопитающего или человека.

Другим объектом изобретения является способ лечения рака у пациента, который в этом нуждается. Способ включает введение достаточного количества композиции, как описано в настоящей заявке.

В одном из вариантов осуществления способ активирует миелоидные клетки.

В одном варианте осуществления способ индуцирует продукцию TNF-альфа миелоидными клетками.

В одном варианте осуществления способ запускает NF-Kb- и ISRE-зависимый сигнальный путь ниже TLR3.

В одном варианте осуществления способ запускает гибель эпителиальных раковых клеток.

В одном варианте осуществления способ активирует миелоидные клетки, в частности, с выработкой TNF-альфа, и запускает гибель эпителиальных раковых клеток.

В одном варианте осуществления способ специфически активирует TLR3, экспрессируемый миелоидными клетками (макрофагами и дендритными клетками), индуцируя секрецию воспалительного цитокина, и запускает TLR3-зависимое воспаление и гибель в раковых клетках человека или млекопитающего.

Подробное описание изобретения

Авторы изобретения провели скрининг серии синтетических дцРНК с различными составами оснований, распределением нуклеотидов на двух цепях и последовательностями на предмет их способности запускать продукцию TNF-альфа линией мышиных макрофагальных клеток RAW. Последовательности первых 47 протестированных дцРНК представлены в таблице 1. Анализ коммерческой поли(A:U) и 9 последовательностей 345, 397, 398, 415, 418, 405, 411, 412, 413 посредством нативного электрофореза на акриламидном геле показывает, что в отличие от коммерческой поли(A:U), которая представляет собой смесь дцРНК разной длины, для каждой синтетической дцРНК размером 50 п.о. обнаруживается одна основная полоса ожидаемого размера (Фигура 1). Когда 47 синтетических дцРНК были протестированы на их способность активировать продукцию TNF-альфа мышиными макрофагами линии Raw, ни одна из них не была эффективной, кроме последовательности поли(A:U) размером 50 п.о. (далее называемой последовательностью 412) (Фигура 2), которая была так же эффективна, как коммерческая высокомолекулярная поли(A:U). Таким образом, последовательность 412 эффективно интернализовалась макрофагами и была способна запускать сигнальный путь NF-Kb ниже TLR3. Примечательно, что когда A и U из поли(A:U) размером 50 п.о. были распределены по двум цепям (последовательность 413), секреция TNF-альфа не наблюдалась. Неожиданно, поли(I:C) размером 50 п.о. (последовательность 411) оказалась неспособной запустить продукцию TNF-альфа.

Затем авторы изобретения оценили способность последовательности 412 запускать гибель TLR3 WT и TLR3 KO эпителиальных клеток немелкоклеточного рака человека NCI-H292. В отсутствие реагента для трансфекции последовательность 412 не могла активировать ни воспалительную реакцию (Фигура 3), ни гибель клеток NCI-H292 (Фигура 4). Следовательно, в отличие от макрофагов, последовательность 412 либо не интернализовалась, либо не могла активировать ни сигнальный путь NF-kB TLR3, ни гибель в эпителиальных раковых клетках.

Затем использовали поли(A:U) длиной 70 п.о. (последовательность 432) и 90 п.о. (последовательность 452). Опять же, обе эти синтетические последовательности показали единственную основную полосу при анализе посредством нативного электрофореза на полиакриламидном геле (Фигура 5). Последовательности 432 и 452 были так же эффективны, как последовательность 412, для запуска воспалительного ответа Raw клеток, что проиллюстрировано продукцией TNF-альфа (Фигура 6) и активацией ISRE-репортерного гена люциферазы (Фигура 7). Более того, последовательности 432 и 452 неожиданно вызвали TLR3-зависимые воспалительные (Фигура 8) и апоптотические реакции (Фигура 9) человеческих раковых клеток NCI-H292 без реагента для трансфекции.

Авторы изобретения дополнительно протестировали поли(A:U) размером 60 п.о. (последовательность 422) и 80 п.о. (последовательность 442), 3 химерных последовательности поли(А) /I:U/C размером 70 п.о.: последовательность из 10 поли(I:C), затем 50 поли(A:U), затем 10 поли(I:C) (последовательность I10A50I10) (532); последовательность из 35 поли(A:U), затем 35 поли(I:C) (последовательность A35I35) (533); последовательность из 10 поли(A:U), затем 50 поли(I: C), затем 10 поли(A:U) (последовательность A10I50A10) (534), и последовательность из 70 п.о. поли(I:C) (535) (Таблица 2). Опять же, нативный электрофорез на полиакриламидном геле показал одну основную полосу ожидаемого размера для каждой синтетической дцРНК (Фигура 10).

Было отмечено, что: (1) химерные последовательности 532 и 533 размером 70 п.о. были наиболее эффективными для индукции секреции mTNF-α клетками Raw (Фигура 11); и (2) они обе были очень эффективны для запуска секреции IL-6 клетками NCI-H292 (Фигура 12); (3) кроме того, они были так же эффективны, как поли(A:U) размером 70 п.о. (432), в уничтожении клеток NCI-H292 (Фигура 13). Примечательно, что ни поли(I:C) (535) размером 70 п.о., ни богатая I:C химерная дцРНК размером 70 п.о. (534) не активировали в значительной степени секрецию TNF-альфа клетками Raw (Фигура 11).

Таким образом, хорошо определенная синтетическая последовательность поли(A:U) согласно изобретению, например, размером 70 п.о. и 80 п.о., и богатая A:U химерная последовательность размером 70 п.о., такая как 532 и 533, обладает уникальной способностью как к активации миелоидных клеток для индукции секреции воспалительных цитокинов, так и к запуску TLR3-зависимой активации воспаления и гибели в раковых клетках.

Предпочтительными примерами дцРНК согласно изобретению являются дцРНК 422, 432, 442, 452, 532 и 533. Другими примерами являются (с комплементарной цепью C или I, соответственно, U или A):

5’ (I)10 - (U)50 - (I)10 3’

5’ (A)60 - (I)10 3’

5’ (A)50 - (I)20 3’

5’ (A)20 - (I)50 3’

5’ (I)5 - (A)60 - (I)5 3’

5’ (I)15 - (A)40 - (I)15 3’

5’ (I)20 - (A)30 - (I)20 3’

5’ (I)25 - (A)20 - (I)25 3’

5’ (I)5 - (A)50 - (I)15 3’

5’ (I)13 - (A)64 - (I)13 3’

5’ (I)10 - (A)70 - (I)10 3’

Еще одни примеры (с комплементарной цепью C или I, соответственно, U или A):

5’ (A)10 - (I)60 3’

5’ (I)30 - (A)10 - (I)30 3’

Изобретение относится к композициям, содержащим одну из этих специфических дцРНК в качестве уникальной популяции дцРНК, содержащихся в указанной композиции, или в значительной и эффективной пропорции, особенно в пропорции, равной или превышающей 95, 96, 97, 98, 99 или 99,5 от общих дцРНК, содержащихся в композиции.

Определения

«TLR3», «белок TLR3» и «рецептор TLR3», используемые взаимозаменяемо, применяются в настоящей заявке для обозначения Toll-подобного рецептора 3, члена семейства Toll-подобных рецепторов (TLR). Его аминокислотная последовательность показана в NCBI, ID гена 7098. Toll-подобный рецептор 3 является членом семейства Toll-подобных рецепторов (TLR), которые играют фундаментальную роль в распознавании патогенов и активации врожденного иммунитета. Этот рецептор наиболее широко экспрессируется в плаценте и поджелудочной железе, и ограничен дендритной субпопуляцией лейкоцитов. Он распознает дцРНК, ассоциированную с вирусной инфекцией, и вызывает активацию NF-κB и продукцию интерферонов типа I.

Под «раком» подразумевается рост, деление или пролиферация аномальных клеток в организме. В частности, охватываются раковые образования, которые экспрессируют TLR3. Определение экспрессии TLR3 в раковых клетках находится в пределах компетенции специалиста в данной области техники и может быть измерено любым методом, доступным специалисту в данной области техники, таким как иммуногистохимия, вестерн-блоттинг или количественная ПЦР (например, с использованием системы LightCycler® от Roche Molecular Diagnostics) и т.д. Еще, в частности, виды рака, охватываемые настоящим изобретением, выбраны из эпителиальных видов рака, таких как мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, аденокарциномы легкого, гепатокарцинома, нейробластома, рак головы и шеи, рак яичника, рак почки, рак мочевого пузыря, рак простаты, рак молочной железы, рак шейки матки, рак поджелудочной железы, рак пищевода, рак желудка, рак тонкой кишки, рак толстой кишки или меланома; а также мезенхимальных онкологических заболеваний, таких как мезотелиома или саркома, и в частности, немелкоклеточного рака легкого.

В контексте настоящего описания термин «субъект» или «пациент» относится к теплокровному животному, такому как млекопитающее, животное или человек, в частности, к человеку, который поражен или потенциально может быть поражен одним или несколькими заболеваниями и состояниями, описанными в настоящей заявке.

Термины «лечить» или «лечение» в контексте настоящего описания относятся к терапевтическому лечению, цель которого состоит в устранении или уменьшении симптомов. Благоприятные или желаемые клинические результаты включают, помимо прочего, устранение симптомов, облегчение симптомов, уменьшение степени состояния, стабилизацию (т.е. отсутствие ухудшения) состояния, задержку или замедление прогрессирования состояния, а также профилактику начала, рецидива или распространения заболевания или расстройства, или одного или нескольких их симптомов. В некоторых вариантах осуществления термины относятся к лечению или применению соединения, представленного в настоящей заявке, до появления симптомов. Эти термины охватывают подавление или уменьшение симптома конкретного заболевания. В частности, в некоторых вариантах осуществления пациенты с семейным анамнезом заболевания являются кандидатами на схемы лечения. Кроме того, субъекты, у которых показана генетическая предрасположенность к конкретному заболеванию, являются кандидатами на схемы лечения в определенных вариантах осуществления. Кроме того, потенциальными кандидатами на лечение могут быть пациенты, у которых в анамнезе повторялись симптомы. В этом отношении термин «лечение» может использоваться как синоним термина «профилактическое лечение».

Идентификация субъектов, которые нуждаются в лечении описанных в настоящей заявке заболеваний и состояний, находится в пределах возможностей и знаний специалиста в данной области техники. Клиницист, квалифицированный в данной области техники, может легко идентифицировать с помощью клинических тестов, физического осмотра и медицинского/семейного анамнеза тех субъектов, которые нуждаются в таком лечении.

Используемый в настоящей заявке термин «фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество» относится к молекулярным объектам и композициям, которые не вызывают побочных, аллергических или других нежелательных реакций при введении млекопитающему, особенно человеку, в зависимости от ситуации. Фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество относится к нетоксичному твердому, полутвердому или жидкому наполнителю, разбавителю, инкапсулирующему материалу или вспомогательному компоненту любого типа.

Для целей настоящего изобретения применение в одно и то же время (например, одновременно) относится к введению лекарств вместе в одном и том же составе или в отдельных составах, причем введение может осуществляться с интервалом от нескольких минут до нескольких часов, но не более одного дня. В контексте настоящего описания введение в разное время (например, последовательно) относится к введению лекарственных средств комбинированной терапии с интервалом от нескольких часов до дней, недель и даже месяцев. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления субъект, проходящий комбинированную терапию, может получать оба препарата в одно и то же время (например, одновременно) или в разное время (например, последовательно, в любом порядке, в один и тот же день или в разные дни), при условии, что терапевтический эффект комбинации обоих лекарственных средств возникает у субъекта, проходящего терапию. В некоторых вариантах осуществления комбинация лекарств будет вводиться одновременно для одной дозы, но другая дозировка будет включать последовательное введение в любом порядке, в тот же день или в разные дни. Если два препарата вводят одновременно, их можно вводить в виде отдельных фармацевтических композиций, каждая из которых содержит любое лекарство из комбинации, или их можно вводить в виде единой фармацевтической композиции, содержащей оба этих препарата.

Составы и системы доставки агонистов TLR3

Под агонистом TLR3 в настоящей заявке подразумевается дцРНК согласно изобретению, если не указано иное.

Предпочтительно агонист TLR3 входит в состав фармацевтически приемлемой композиции. Описанные в настоящей заявке фармацевтически приемлемые композиции дополнительно содержат фармацевтически приемлемые носители, адъюванты и/или наполнители. Фармацевтически приемлемые носители, адъюванты и наполнители, которые можно использовать, включают ионообменники, оксид алюминия, стеарат алюминия, лецитин, белки сыворотки, такие как сывороточный альбумин человека, буферные вещества, такие как фосфаты, глицин, сорбиновую кислоту, сорбат калия, смеси неполных глицеридов насыщенных растительных жирных кислот, воду, соли или электролиты, такие как протамин сульфат, гидрофосфат динатрия, гидрофосфат калия, хлорид натрия, соли цинка, коллоидный диоксид кремния, трисиликат магния, поливинилпирролидон, вещества на основе целлюлозы, полиэтиленгликоль, карбоксиметилцеллюлозу натрия, полиакрилаты, воски, блок-полимеры полиэтилена-полиоксипропилена, полиэтиленгликоль и шерстяной жир, но не ограничиваются ими.

Фармацевтические композиции включают композиции, подходящие для перорального, ректального, назального, местного (включая буккальное и сублингвальное), вагинального или парентерального (включая подкожное, внутримышечное, внутривенное и внутрикожное) применения. В некоторых вариантах осуществления соединение описанных в настоящей заявке формул вводят трансдермально (например, с использованием трансдермального пластыря или ионтофоретических методов). Другие составы могут быть удобно представлены в виде стандартных дозированных форм, например, таблеток и капсул с замедленным высвобождением, а также в липосомах, и могут быть приготовлены любыми способами, хорошо известными в области фармацевтики. См., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA (17th ed. 1985). Такие способы приготовления включают стадию объединения вещества, которое должно быть введено, с такими ингредиентами, как носитель, который составляет один или несколько дополнительных ингредиентов. Как правило, композиции готовят путем однородного и тщательного объединения активных ингредиентов с жидкими носителями, липосомами или тонкоизмельченными твердыми носителями, включая наночастицы, или и с тем и другим, а затем, если необходимо, придания продукту формы.

В некоторых вариантах осущесвления композицию вводят в опухоль. Её можно наносить на поверхность, например, с использованием подходящего состава, такого как гель или пластырь, для длительного контакта с участком опухоли или в опухолевой массе, например, с помощью имплантата, или вводить в опухоль, например, с использованием композиций для инъекций, как описано в настоящей заявке.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления соединение применяют перорально. Композиции, подходящие для перорального введения, могут быть представлены в виде дискретных единиц, таких как капсулы, саше или таблетки, каждая из которых содержит заранее определенное количество активного ингредиента; в виде порошка или гранул; в виде раствора или суспензии в водной жидкости или неводной жидкости; или в виде жидкой эмульсии масло-в-воде или жидкой эмульсии вода-в-масле, или упакованных в липосомы и в виде болюса и т.д. Мягкие желатиновые капсулы могут быть полезны для включения таких суспензий, которые могут благоприятно увеличить скорость абсорбции соединения.

Таблетка может быть изготовлена прессованием или формованием, при необходимости с одним или несколькими вспомогательными ингредиентами. Прессованные таблетки могут быть приготовлены путем прессования в подходящем устройстве активного ингредиента в сыпучей форме, такой как порошок или гранулы, при необходимости смешанного со связующим агентом, любрикантом, инертным разбавителем, консервантом, поверхностно-активным или диспергирующим агентом. Формованные таблетки могут быть изготовлены путем формования в подходящей машине смеси порошкообразного соединения, смоченного инертным жидким разбавителем. Таблетки при необходимости могут быть покрыты оболочкой или снабжены насечками, и могут быть приготовлены таким образом, чтобы обеспечивать медленное или контролируемое высвобождение активного ингредиента из них. Способы изготовления таких композиций с медленным или контролируемым высвобождением фармацевтически активных ингредиентов, таких как указанные в настоящей заявке, и других соединений, известных в данной области техники, известны в данной области и описаны в нескольких выданных патентах США, некоторые из которых включают US 4369172 и US 4842866, но не ограничиваются ими. Покрытия можно использовать для доставки соединений в кишечник (см., например, патенты США №№ 6638534, 5217720 и 6569457, 6461631, 6528080, 6800663).

В случае таблеток для перорального применения обычно используемые носители включают лактозу и кукурузный крахмал. Также обычно добавляют любриканты, такие как стеарат магния. Для перорального введения в форме капсул подходящие разбавители включают лактозу и сухой кукурузный крахмал. Когда водные суспензии вводят перорально, активный ингредиент комбинируют с эмульгирующими и/или суспендирующими агентами. Если необходимо, могут быть добавлены некоторые подсластители, и/или ароматизаторы, и/или красители. Поверхностно-активные вещества, такие как лаурилсульфат натрия, могут быть полезны для улучшения растворения и абсорбции.

В некоторых вариантах осуществления композиция связана либо ковалентно, либо нековалентно с другой молекулой, такой как антитело, другой белок или пептид, липид или сахар, или другой лиганд рецептора.

Композиции, подходящие для перорального применения, включают леденцы, содержащие ингредиенты на ароматизированной основе, обычно сахарозу и аравийскую камедь или камедь трагаканта; и пастилки, содержащие активный ингредиент на инертной основе, такой как желатин и глицерин, или сахароза и аравийская камедь.

В некоторых вариантах осуществления композиция связана либо ковалентно, либо нековалентно с наночастицами.

Композиции, подходящие для парентерального применения, включают водные и неводные стерильные растворы для инъекций, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостатические вещества и растворенные вещества, которые делают композицию изотоничной с кровью предполагаемого реципиента; и водные и неводные стерильные суспензии, которые могут включать суспендирующие агенты и загустители. Составы могут быть представлены в однодозовых и многодозовых контейнерах, например, в запечатанных ампулах и флаконах, и могут храниться в лиофилизированных условиях, требующих только добавления стерильного жидкого носителя, например, воды для инъекций, непосредственно перед использованием. Экстемпоральные инъекционные растворы и суспензии могут быть приготовлены из стерильных порошков, гранул и таблеток. Такие растворы для инъекций могут быть в форме, например, стерильной водной или масляной суспензии для инъекций. Эта суспензия может быть приготовлена согласно методикам, известным в данной области техники, с использованием подходящих диспергирующих или смачивающих агентов (таких как, например, Tween 80) и суспендирующих агентов. Стерильный препарат для инъекций может также представлять собой стерильный раствор или суспензию для инъекций в нетоксичном парентерально приемлемом разбавителе или растворителе, например, в виде раствора в 1,3-бутандиоле. Среди приемлемых носителей и растворителей, которые можно использовать, можно назвать маннитол, воду, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. Кроме того, стерильные нелетучие масла обычно используются в качестве растворителя или суспендирующей среды. Для этой цели можно использовать любое не имеющее вкуса и запаха нелетучее масло, включая синтетические моно- или диглицериды. Жирные кислоты, такие как олеиновая кислота и ее глицеридные производные, полезны при приготовлении препаратов для инъекций, как и натуральные фармацевтически приемлемые масла, такие как оливковое масло или касторовое масло, особенно в их полиоксиэтилированных версиях. Эти масляные растворы или суспензии могут также содержать разбавитель или диспергатор на основе длинноцепочечного спирта.

Фармацевтические композиции можно применять в форме суппозиториев для ректального или вагинального введения. Эти композиции могут быть получены путем смешивания соединения с подходящим нераздражающим наполнителем, который является твердым при комнатной температуре, но жидким при ректальной температуре и, следовательно, будет плавиться в прямой кишке с высвобождением активных компонентов. Такие материалы включают масло какао, пчелиный воск и полиэтиленгликоли, но не ограничиваются этим.

Местное применение фармацевтических композиций особенно полезно, когда необходимое лечение затрагивает области (включая слизистую оболочку и мезотелиальные поверхности) или органы, легко доступные для местного применения. Для местного нанесения на кожу фармацевтическая композиция будет включать подходящую мазь, содержащую активные компоненты, суспендированные или растворенные в носителе. Носители для местного применения соединений по настоящему изобретению включают минеральное масло, жидкий вазелин, белый вазелин, пропиленгликоль, соединение полиоксиэтилена-полиоксипропилена, эмульгирующий воск и воду, но не ограничиваются ими. Альтернативно, фармацевтическая композиция может быть приготовлена в виде подходящего лосьона или крема, содержащего активное соединение, суспендированное или растворенное в носителе. Подходящие носители включают минеральное масло, сорбитан моностеарат, полисорбат 60, цетил-эфирный воск, цетеариловый спирт, 2-октилдодеканол, бензиловый спирт и воду, но не ограничиваются ими. В качестве альтернативы фармацевтическая композиция может быть приготовлена в виде подходящего геля. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению также можно наносить местно на нижнюю часть кишечного тракта с помощью композиции для ректального суппозитория или подходящего состава для клизмы. Также описаны трансдермальные пластыри для местного применения и ионтофоретическое введение.

Фармацевтические композиции можно вводить с помощью назального аэрозоля или ингаляции. Такие композиции готовят согласно методикам, хорошо известным в области фармацевтических препаратов, и они могут быть приготовлены в виде растворов в физиологическом растворе с использованием бензилового спирта или других подходящих консервантов, промоторов абсорбции для повышения биодоступности, фторуглеродов и/или других солюбилизирующих или диспергирующих агентов, известных в данной области техники. Составы аэрозолей, которые можно использовать в способах по настоящему изобретению, также включают составы, описанные в US 6811767.

Липосомы, чувствительные к pH или отрицательно заряженные, улавливают дцРНК, а не образуют с ней комплекс. Поскольку и дцРНК, и липид заряжены одинаково, происходит отталкивание, а не образование комплекса. Таким образом, дцРНК захватывается водной внутренней частью этих липосом. Один из основных типов липосомной композиции включает фосфолипиды, отличные от фосфатидилхолина природного происхождения. Нейтральные липосомные композиции, например, можно получить из димиристоилфосфатидилхолина (DMPC) или дипальмитоилфосфатидилхолина (DPPC). Анионные липосомные композиции обычно получают из димиристоилфосфатидилглицерина, тогда как анионные фузогенные липосомы получают в основном из диолеоилфосфатидилэтаноламина (DOPE). Другой тип липосомной композиции получают из фосфатидилхолина (PC), такого как, например, PC соевых бобов и PC яиц. Другой тип получают из смесей фосфолипидов, и/или фосфатидилхолина, и/или холестерина. Липосомы, содержащие нуклеиновые кислоты, описаны, например, в WO 96/40062, US 5264221, US 5665710.

В настоящей заявке также описывается имплантируемое устройство для высвобождения лекарственного средства, пропитанное агонистом TLR3 или содержащее его, или композицию, содержащую агонист TLR3, так что указанный агонист TLR3 высвобождается из указанного устройства и является терапевтически активным.

Комбинированные композиции с агонистами TLR3

Лечение агонистом TLR3, как описано в настоящей заявке, при необходимости может быть успешно объединено с одним или несколькими другими терапевтическими агентами, пригодными для лечения рака. Таким образом, агонисты TLR3, описанные в настоящей заявке, можно использовать вместе или в комбинации с другим терапевтическим агентом, применимым для лечения рака. Композиции агонистов TLR3, описанные выше, могут, таким образом, дополнительно включать другие терапевтические агенты, полезные при лечении рака. Другой терапевтический агент может находиться в том же или предпочтительно в отдельном контейнере. Такие агенты включают другие дцРНК - агонисты TLR3 с другой нуклеотидной последовательностью; цитотоксины, включая перечисленные выше для использования в комплексах цитотоксических и опухолевых лигандов TLR3, но не ограничиваясь ими; цитотоксические и противоопухолевые лигандные комплексы TLR3; агенты, которые нацелены на опухолевый антиген или пролиферативный белок опухоли; химиотерапевтические агенты, включая цисплатин (CDDP), карбоплатин, оксалиплатин, прокарбазин, мехлорэтамин, циклофосфамид, камптотецин, ифосфамид, мелфалан, хлорамбуцил, бусульфан, нитрозмочевину, дактиномицин, даунорубицин, доксорубицин, блеомицин, пликомицин, митомицин, этопозид (VP16), тамоксифен, ралоксифен, агенты, связывающие рецепторы эстрогена, таксол, гемцитабин, навельбин, ингибиторы фарнезил-протеинтансферазы, трансплатин, 5-фторурацил, винкристин, винбластин и метотрексат, или любой аналог или производный вариант вышеперечисленного; терапевтические агенты и комбинацию терапевтических агентов для лечения конкретных видов рака, таких как рак молочной железы: доксорубицин, эпирубицин, комбинацию доксорубицина и циклофосфамида (AC), комбинацию циклофосфамида, доксорубицина и 5-фторурацила (CAF), комбинацию циклофосфамида, эпирубицина и 5-фторурацила (CEF) (Герцептин™), тамоксифен, комбинацию тамоксифена и цитотоксина; таксаны, включая доцетаксел и паклитаксел; комбинацию таксана плюс доксорубицина и циклофофамида; для рака толстой кишки: комбинацию 5-ФУ и лейковорина, комбинацию 5-ФУ и левамизола, иринотекан (СРТ-11) или комбинацию иринотекана, 5-ФУ и лейковорина (IFL), или оксалиплатин; при раке простаты: радиоизотоп (например, палладий, стронций-89 и иридий), лейпролид или другие агонисты LHR, нестероидные антиандрогены (флутамид, нилутамид и бикалутамид), стероидные антиандрогены (ципротерона ацетат), комбинацию лейпролида и флутанида; эстрогены, такие как DES, хлортрианизен, этинилэстрадиол, конъюгированные эстрогены USP, DES-дифосфат, гормональные препараты второй линии, такие как аминоглютетимид, гидрокортизон, отмена флутамида, прогестерон и кетоконазол, низкие дозы преднизона, или другие химиотерапевтические агенты или комбинацию агентов для достижения субъективного улучшения симптомов и снижения уровня PSA, включая доцетаксел, паклитаксел, эстрамустин/доцетаксел, эстрамустин/этопозид, эстрамустин/винбластин и эстрамустин/паклитаксел; для меланомы: дакарбазин (DTIC), нитрозомочевины, такие как кармустин (BCNU) и ломустин (CCNU), агенты со средней активностью одного агента, включая алкалоиды барвинка, соединения платины и таксаны, схему Дартмута (цисплатин, BCNU и DTIC), интерферон альфа (IFN-A) и интерлейкин-2 (IL-2); при раке яичника: паклитаксел, доцетаксел, цисплатин, оксалиплатин, гексаметилмеламин, тамоксифен, ифосфамид, комбинацию паклитаксела (таксола) или доцетаксела (таксотера) и цисплатина или карбоплатина, комбинацию циклофосфамида и цисплатина, комбинацию циклофосфамида и карбоплатина, комбинацию 5-фторурацила (5FU) и лейковорина, этопозида, липосомального доксорубицина, геруцитабина или топотекана; при раке легкого: цисплатин, винкристин, винбластин, митомицин, доксорубицин и этопозид, по отдельности или в комбинации, комбинацию циклофосфамида, доксорубицина, винкристина/этопозида и цисплатина (CAV/EP), комбинацию цисплатина и винорелбина, паклитаксел, доцетаксел или гемцитабин, а также комбинацию карбоплатина и паклитаксела; но не ограничиваясь этим.

В одном аспекте другой терапевтический агент представляет собой ингибитор иммунной контрольной точки. Это может быть биологический терапевтический препарат или малая молекула. Предпочтительно ингибитор контрольной точки представляет собой моноклональное антитело, гуманизированное антитело, полностью человеческое антитело, гибридный белок или их комбинацию. Антитело может быть направлено против любого белка, который участвует в этом пути, и более конкретно против рецептора или лиганда. Как известно, ингибитор иммунной контрольной точки способен восстанавливать иммунный ответ на раковые клетки. В частности, ингибитор нарушает, препятствует или ингибирует взаимодействие между взаимодействующими белками и делает возможным иммунный ответ, в частности Т-клеток, убивающих опухолевые клетки. В дополнительном аспекте ингибитор контрольной точки ингибирует белок контрольной точки, которым может быть CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, CD160, CGEN-15049, CHK1, CHK2, A2aR, B-7 или их комбинация. В дополнительном аспекте ингибитор контрольной точки взаимодействует с лигандом белка контрольной точки, которым может быть CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, CD160, CGEN-15049, CHK1, CHK2, A2aR, B-7 или их комбинация.

Изобретение включает комбинированное применение антитела, которое блокирует, ингибирует или снижает пути PD1/PD-L1 и/или PD1/PD-L2. В настоящее время существует по крайней мере пять агентов, блокирующих этот путь, которые продаются или проходят клиническую оценку, любой из них может быть полезен в комбинации с изобретением. Этими агентами являются BMS-936558 (mAb против PD-L1, ниволумаб/ ONO-4538, Bristol-Myers Squibb, ранее MDX-1106 (антитело 5C4 в WO 2006/121168), MK-3475 (mAb против PD1, ламбролизумаб или пембролизумаб, Keytruda®, Merck), MPDL3280A/RG7446 (mAb против PD-L1, Roche/Genentech), AMP-224 (иммуноадгезин, содержащий анти-PD-L2, Amplimmune и GSK), пидилизумаб (mAb против PD1, CT-011, CureTech/TEVA - WO 2009/101611).

Для конструкций ДНК MK-3475, кодирующих вариабельные области тяжелой и легкой цепей гуманизированных антител, h409All была депонирована в Патентный депозитарий Американской коллекции типовых культур (10801 University Bld., Манассас, Вирджиния). Плазмида, содержащая ДНК, кодирующую тяжелую цепь h409A-I 1, была депонирована 9 июня 2008 и идентифицирована как 081469_SPD-H, а плазмида, содержащая ДНК, кодирующую легкую цепь h409AI 1, была депонирована 9 июня 2008 и идентифицирована как 0801470_SPD-LI 1.

Другие известные антитела к PD-1 и другие ингибиторы PD-1 включают AMP-224 (гибридный белок B7-DC/IgG1, лицензированный GSK), AMP-514, описанный в WO 2012/145493, антитело MEDI-4736 (анти-PD-L-1, разработанное AstraZeneca/Medimmune), описанное в WO2011/066389 и US2013/034559, антитело YW243.55.S70 (анти-PD-L1), описанное в WO2010/077634, MDX-1105, также известный как BMS-936559, представляющий собой антитело против PD-L1, разработанное Bristol-Myers Squibb, описанное в WO2007/005874, и антитела и ингибиторы, описанные в WO2006/121168, WO2009/014708, WO2009/114335 и WO2013/019906. Раскрытия любого документа, упомянутого в настоящей заявке, включены сюда посредством ссылки. Дополнительные примеры антител против PD1 описаны в WO2015/085847, например, антитела, имеющие вариабельный домен легкой цепи CDR1, 2 и 3 из SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8, соответственно, и вариабельный домен тяжелой цепи антитела CDR1, 2 и 3 из SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5, соответственно, где ссылки на SEQ ID NO имеют нумерацию согласно WO2015/085847.

Изобретение также включает комбинированное применение антитела против CTLA-4 (ассоциированного с цитотоксическими Т-лимфоцитами белка 4), также известного как CD152, который является другим ингибитором - членом семейства рецепторов CD28 и экспрессируется на Т-клетках. Антитела, которые связывают и ингибируют CTLA-4, известны в данной области техники. В одном примере антитело представляет собой ипилимумаб (торговое название Yervoy®, Bristol-Myers Squibb), человеческое антитело IgG.

В другой комбинации лиганд TLR3 является агонистом путей стимуляторных контрольных точек, таких как OX40, ICOS, GITR, 4-1BB или CD40.

В другой комбинации агент, связанный с лигандом TLR3, представляет собой молекулу, нацеленную на микроокружение опухоли, такую как ингибитор пути передачи сигнала трансформирующего фактора роста-бета (т.е. галунисертиб).

Способы использования композиции агониста TLR3, описанные в настоящей заявке, могут также включать комбинированное лечение антиангиогенным агентом. Таким образом, описанные выше композиции агонистов TLR3 могут также включать антиангиогенный агент. Формирование новых кровеносных сосудов (ангиогенез) является фундаментальным событием в процессе роста опухоли и метастатического распространения. Путь фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) хорошо зарекомендовал себя как один из ключевых регуляторов этого процесса. Ось VEGF/рецептора VEGF состоит из множества лигандов и рецепторов с перекрывающимися и различными специфичностями связывания лиганд-рецептор, экспрессией клеточного типа и функцией. Активация пути рецептора VEGF запускает сеть сигнальных процессов, которые способствуют росту, миграции и выживанию эндотелиальных клеток из уже существующей сосудистой сети. Кроме того, VEGF опосредует проницаемость сосудов и связан со злокачественными эффузиями. Семейство генов, связанных с VEGF, включает шесть секретируемых гликопротеинов, называемых VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E и фактор роста плаценты (PIGF)-1 и -2. Известен ряд примерных антиангиогенных агентов, действующих на путь VEGR, любой из которых может использоваться в соответствии с изобретением, включая низкомолекулярный ингибитор, антисмысловые стратегии нейтрализующих антител, РНК-аптамеры и рибозимы против семейства генов, родственных VEGF (например, белки VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E). Также можно использовать варианты VEGF с антагонистическими свойствами, как описано в WO 98/16551. Дополнительные примеры антиангиогенных средств, которые можно использовать в сочетании с комбинированной терапией, перечислены в Таблице D из US 6524583. Особо предпочтительные антиангиогенные средства ингибируют передачу сигналов рецепторной тирозинкиназой, включая VEGFR1, VEGFR-2,3, PDGFR-бета, Flt-3, c-Kit, p38-альфа и FGFR-1, но не ограничиваясь ими. Дополнительный антиангиогенный агент может включать агенты, которые ингибируют один или несколько различных регуляторов экспрессии и продукции VEGF, таких как EGFR, HER-2, COX-2 или HIF-1. Другой предпочтительный класс агентов включает талидомид или аналог CC-5013.

В одном аспекте другой терапевтический агент представляет собой иммуномодулятор, включая ингибитор индоламиноксидазы, выбранные ингибиторы VEGF/VEGFR из моноклональных антител (mAb) и класса ингибиторов тирозинкиназы (TKI), которые включают бевацизумаб (Avastin) (mAb, ингибирующее VEGF-A, Genentech); IMC-1121B (mAb, ингибирующее VEGFR-2, ImClone Systems); CDP-791 (пегилированный DiFab, VEGFR-2, Celltech); 2C3 (mAb, VEGF-A, Peregrine Pharmaceuticals); PTK-787 (TKI, VEGFR-1, -2, Novartis); AEE788 (TKI, VEGFR-2 и EGFR, Novartis); ZD6474 (TKI, VEGFR-1, -2, -3, EGFR AstraZeneca); AZD2171 (TKI, VEGFR-1, -2, AstraZeneca); SU11248 (TKI, VEGFR-1,-2, PDGFR Pfizer); AG13925 (TKI, VEGFR-1, -2, Pfizer); AG013736 (TKI, VEGFR-1, -2, Pfizer); CEP-7055 (TKI, VEGFR-1, -2, -3, Cephalon); CP-547,632 (TKI, VEGFR-1, -2, Pfizer); VEGF-trap (растворимый гибридный рецептор VEGF-A, P1GF (фактор роста плаценты) Aventis/Regeneron); GW786024 (TKI, VEGFR-1, -2, -3, GlaxoSmithKline); Bay 93-4006 (TKI, VEGFR-1, -2, PDGFR Bayer/Onyx); и AMG706 (TKI, VEGFR-1, -2, -3, Amgen). Наиболее предпочтительными являются ингибиторы тирозинкиназы, которые ингибируют одну или несколько рецепторных тирозинкиназ, выбранных из группы, состоящей из VEGFR1, VEGFR-2,3, PDGFR-бета, Flt-3, c-Kit, p38 альфа и FGFR-1. Предпочтительные примеры включают SU11248 (Pfizer) и Bay 93-4006 (сорафениб, Bayer).

Способы использования композиции агониста TLR3, описанные в настоящей заявке, также могут включать комбинированное лечение проапоптотическим агентом. Таким образом, описанные выше композиции агониста TLR3 могут также включать проапоптотический агент. Ряд белков, используемых в качестве мишеней для модуляции фармацевтическими агентами, известен в данной области техники, включая любые из белков, рассмотренных в Green and Kroemer, J. (2005) Clin. Investig. 115(10):2610-2617. Примеры проапоптотических фармацевтических агентов включают препараты, которые индуцируют проницаемость внешней мембраны митохондрий, такие как облимерсен (антисмысловой олигонуклеотид Bcl-2, Genta), EGCG (малая молекула, нацеленная на Bcl-2, Burnham Inst./Mayo Clinic), госсипол (малая молекула, нацеленная на Bcl-2, Университет Мичигана), LY2181308 (антисмысловой олигонуклеотид, нацеленный на сурвивин (Eli Lilly / Isis) и триоксид мышьяка; препараты, регулирующие активность p53, такие как Advexin INGN201 (аденовирус-модулирующий p53, Introgen), SCH58500 (аденовирус-модулирующий p53, Schering-Plough), ONYX-015 (E1B мутантный аденовирус-модулирующий p53, Onyx Pharma); препараты, которые модулируют каспазы и/или эндогенные ингибиторы или каспазы, такие как AEG35156 (антисмысловой олигонуклеотид, нацеленный на XIAP, Aegara/Hybridon); препараты, которые модулируют сIAP1-, такие как биринапант; препараты, которые модулируют рецепторы смерти и/или их лиганды, такие как полипептиды TNF-альфа, HGS-ETR1 (агонистические mAb, нацеленные на TRAIL-R1, Human Genome Sciences), HGS-ETR2 и HGS-TR2J (два агонистические mAb, нацеленные на TRAIL-R2, Human Genome Sciences); PRO1764 (растворимые лиганды TRAIN, Genentech/Amgen); и препараты, нацеленные на поли(АДФ-рибоза) полимеразу (PARP), такие как AG014699 (малая молекула, Cancer Res. Tech.); препараты, нацеленные на протеосомы, такие как бортезомиб (Velcade) (ингибитор протеосомы 26S, Millennium Pharma); и ингибиторы киназ, такие как герцептин (mAb, нацеленное на HER2, Roche), цетуксимаб (mAb, нацеленное на HER1, Imclone/BMS), гефитиниб (Iressa) и эрлотиниб (Tarceva) (низкомолекулярные ингибиторы HER1, AstraZeneca и Genentech/OSI соответственно), CCI -779 (малая молекула, действующая на mTOR, Novartis), Bay 43-9006 (низкомолекулярный ингибитор киназ, включая Raf и VEGFR, и иматиниб мезилат (Gleevec, STI-571) (низкомолекулярный ингибитор cKit, PDGFR, Bcr-Abl, Novartis).

Композиции агониста TLR3, описанные выше, могут также включать другие терапевтические агенты, такие как иммуномодулирующие агенты, такие как фактор некроза опухоли, интерферон-альфа, бета и гамма, IL-2, IL-12, IL-15, IL-21, CpG-содержащая одноцепочечная ДНК, агонисты других TLR, включая, например, БЦЖ, другие цитокины и иммуностимулирующие агенты; F42K и другие аналоги цитокинов; или MIP-1, MIP-I бета, MCP-1, RANTES и другие хемокины; агенты, которые влияют на активацию рецепторов клеточной поверхности и соединений GAP; цитостатики и дифференцирующие агенты; или ингибиторы клеточной адгезии.

Также описана композиция вещества, содержащего агонист TLR3 и другой терапевтический агент, полезный при лечении рака в отдельных лекарственных формах, но связанных друг с другом. Используемый в настоящей заявке термин «связанные друг с другом» означает, что отдельные лекарственные формы упакованы вместе или иным образом соединены друг с другом, так что очевидно, что отдельные лекарственные формы предназначены для продажи и введения в рамках одного и того же режима. Агент и агонист TLR3 предпочтительно упакованы вместе в блистерную упаковку или другую многокамерную упаковку, или как соединенные, отдельно запечатанные контейнеры (например, пакеты из фольги или тому подобное), которые пользователь может разделить (например, разорвав по линии раздела между двумя контейнерами).

Композиции агониста TLR3, описанные выше, могут также включать другие терапевтические методы, включая использование ионизирующего излучения, инъекцию CAR-T-клеток и/или использование онколитических вирусов.

Рак и методы лечения

Настоящее описание охватывает агонист TLR3 для использования в профилактике, контроле, лечении или облегчении рака, или одного или нескольких его симптомов. Изобретение также включает применение агониста TLR3 для производства лекарственного средства для профилактики, контроля, лечения или облегчения рака, или одного или нескольких его симптомов. Оно также включает способы профилактики, контроля, лечения или облегчения рака, или одного или нескольких его симптомов.

Примеры рака, который можно предотвратить, контролировать, лечить или облегчить в соответствии со способами по изобретению, включают солидные опухоли, и в частности, раковые заболевания, такие как рак головы, шеи, глаз, рта, горла, пищевода, грудной клетки, кости, легкого, толстой кишки, прямой кишки, желудка, простаты, молочной железы, яичника, почки, печени, поджелудочной железы и головного мозга, но не ограничиваются ими.

Описаны способы профилактики, контроля, лечения или облегчения рака, который может обладать метастатическим потенциалом или метастазировать в орган или ткань (например, кость), или одного или нескольких его симптомов. Также описан агонист TLR3 для использования в профилактике, контроле, лечении или облегчении рака, который обладает метастатическим потенциалом или метастазировал в орган или ткань (например, кость), или одного или нескольких его симптомов.

Указанные способы и применения включают введение субъекту, нуждающемуся в этом, одной или нескольких доз профилактического или терапевтического количества агониста TLR3 согласно изобретению. Предпочтительно агонист TLR3 вводят более одного раза. При необходимости агонист TLR3 вводят с интервалом менее одного месяца, менее трех недель, менее двух недель или менее одной недели. При необходимости такое лечение можно повторять, например, каждые 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 дней, или каждые 1, 2, 3, 4 и 5 недель, или каждые 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяцев.

В настоящем описании представлены способы профилактики, контроля, лечения или облегчения рака, или одного или нескольких его симптомов, где указанные способы включают введение субъекту, нуждающемуся в этом, дозы профилактически или терапевтически эффективного количества агониста TLR3 в сочетании с введением дозы профилактически или терапевтически эффективного количества одного или нескольких других агентов, полезных для терапии рака. Описание также касается агониста TLR3 для применения с целью профилактики, контроля, лечения или облегчения рака, где указанный агонист TLR3 используют в комбинации с одним или несколькими агентами, полезными для терапии рака. Предпочтительно агонист TLR3 вводят более одного раза. При необходимости, агонист TLR3 вводят с интервалом менее одного месяца, менее трех недель, менее двух недель или менее одной недели. При необходимости такое лечение можно повторять, например, каждые 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 дней, или каждые 1, 2, 3, 4 и 5 недель, или каждые 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяцев.

Каждое соединение из комбинаций или фармацевтических композиций согласно изобретению можно вводить отдельно, последовательно или одновременно. В одном из вариантов осуществления агонист TLR3 по изобретению вводят до или после другого химиотерапевтического агента.

В одном варианте осуществления дцРНК вводят субъекту с использованием режима дозирования, который поддерживает концентрацию агониста в плазме на необходимом уровне. В конкретном варианте осуществления концентрация дцРНК в плазме поддерживается на уровне примерно 10 мкг/мл, 15 мкг/мл, 20 мкг/мл, 25 мкг/мл, 30 мкг/мл, 35 мкг/мл, 40 мкг/мл, 45 мкг/мл или 50 мкг/мл. Концентрация в плазме, которая необходима для субъекта, будет варьировать в зависимости от нескольких факторов, включая, помимо прочего, природу рака, тяжесть рака, период полувыведения (стабильность) и аффинность связывания агониста TLR3.

Предоставленные в настоящей заявке количества доз и частота введения охватываются терминами «терапевтически эффективный» и «профилактически эффективный». Дозировка и частота дополнительно обычно будут варьировать в соответствии с факторами, специфичными для каждого пациента, в зависимости от конкретных вводимых терапевтических или профилактических средств, тяжести и типа рака, пути введения, а также возраста, массы тела.

В частности, дозы агониста TLR3 согласно изобретению, которые можно вводить, составляют от 0,1 мг/кг до 10 мг/кг массы тела, например, 0,1; 0,5; 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9 или 10 мг/кг массы тела.

Предпочтительно терапевтически эффективное количество агониста TLR3 (при необходимости в комбинации с другим терапевтическим агентом или терапевтическим протоколом) уменьшает размер опухоли или распространение опухоли у субъекта по меньшей мере на 5%, предпочтительно по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 35%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 45%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 55%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 99% относительно контроля, такого как ФБР.

В рамках настоящего изобретения следует понимать, что выражение «агонист TLR3 для использования» эквивалентно «применению агониста TLR3» и, в частности, что выражение «агонист TLR3 для использования при лечении» эквивалентно «использованию агониста TLR3 для лечения». Изобретение также включает «применение агониста TLR3 для производства лекарственного средства, предназначенного для лечения» в соответствии с настоящим описанием.

Виды рака

В различных вариантах осуществления в настоящем описании представлены способы определения режимов лечения больных раком. Способы можно использовать для определения режимов лечения любого рака или опухоли, например, злокачественных новообразований и родственных заболеваний, включающих следующие, но не ограничивающихся ими, а также экспрессирующих TLR3.

Соответственно, эти способы полезны при лечении различных видов рака или других аномальных пролиферативных заболеваний, в том числе карциномы, включая рак мочевого пузыря, молочной железы, толстой кишки, почки, печени, легкого, яичника, поджелудочной железы, желудка, шейки матки, щитовидной железы и кожи; включая плоскоклеточный рак; гемопоэтических опухолей миелоидного происхождения, включая острые и хронические миелогенные лейкозы и промиелоцитарный лейкоз; опухолей мезенхимального происхождения, включая фибросаркому и рабдомиоскаркому; других опухолей, включая меланому, семиному, тетратокарциному, нейробластому и глиому; опухолей центральной и периферической нервной системы, включая астроцитому, нейробластому, глиому и шванномы; опухолей мезенхимального происхождения, включая фибросафкому, рабдомиосаркому и остеосаркому; и других опухолей, включая меланому, пигментную ксенодерму, кератоакантому, семиному, фолликулярный рак щитовидной железы и тератокарциному; но не ограничиваясь ими. В конкретных вариантах осуществления злокачественные или диспролиферативные изменения (такие как метаплазии и дисплазии) или гиперпролиферативные нарушения лечат в яичнике, мочевом пузыре, молочной железе, толстой кишке, легком, коже, поджелудочной железе или матке. В других конкретных вариантах осуществления лечат саркому, меланому или лейкоз.

Способы используют для TLR3-положительных солидных опухолей. Примеры опухолей включают рак молочной железы, толстой кишки, яичника, легкого, головного мозга и предстательной железы, и меланому. Предпочтительно способы направлены на лечение рака молочной железы.

Синтез дцРНК

Стандартные способы синтеза можно использовать для получения композиций дцРНК в соответствии со спецификациями изобретения. В качестве примера можно использовать стандартную технологию твердофазного фосфорамидитного синтеза. См. M. D. Matteucci et al., Tetrahedron Lett. 22, 1859-1862 (1981). Можно использовать химию синтеза 2'-АПФ РНК, основанную на схеме защитных групп, как описано в S.A. Scaringe, Ph.D Thesis, University of Colorado, 1996, «Dharmacon™ technology for RNAi, Gene Expression & Gene Editing, 2’-ACE RNA synthesis chemistry of GE Healthcare». Такие методы, как гель-электрофорез, например, в полиакриламидном геле, используемый в примерах, могут быть использованы для проверки чистоты.

Фигуры

Фигура 1: профиль дцРНК на 8% акриламидном геле (TBE 1X) для дцРНК размером 50 п.о. и коммерческой поли(A:U). 5 мкг дцРНК (345, 397, 398, 415, 418, 405, 411, 412, 413) и коммерческой поли(A:U) загружали на 8% акриламидный гель и окрашивали BET. Данные представляют 9 из 17 протестированных дцРНК размером 50 п.о.

Фигура 2: Секреция TNF-α мышиными макрофагами RAW264.7 в ответ на только дцРНК размером 50 п.о. Клетки RAW264.7 обрабатывали в течение 24 часов 10 мкг/мл каждой дцРНК и измеряли секрецию mTNF-α с помощью ИФА. Данные представляют два независимых анализа с использованием двух разных серий дцРНК 412 размером 50 п.о.

Фигура 3: Секреция IL6 клетками немелкоклеточного рака легкого человека NCI-H292 после обработки только 9 дцРНК длиной 50 п.о. Клетки NCI-H292 обрабатывали в течение 24 часов 10 мкг/мл каждой дцРНК, и секрецию hIL-6 измеряли с помощью ИФА. Данные представляют три независимых анализа.

Фигура 4: дцРНК 412 размером 50 п.о. не вызывает гибели клеток немелкоклеточного рака легкого человека NCI-H292. Клетки NCI-H292 обрабатывали в течение 24 часов 50 мкг/мл каждой дцРНК. Аннексин-V-позитивные клетки измеряли с помощью хемилюминесценции (набор Annexin V-Glo, Promega). Данные представляют три независимых анализа с использованием двух разных серий дцРНК 412 размером 50 п.о.

Фигура 5: профиль дцРНК при нативном электрофорезе на 6% акриламидном геле (TBE 1X) дцРНК 412, 432, 452 и коммерческой поли(A:U). 1 мкг дцРНК 412 (поли(A:U) 50 п.о.), 432 (поли(A:U) 70 п.о.), 452 (поли(A:U) 90 п.о.) и коммерческой поли(A:U) загружали на 6% полиакриламидный гель и окрашивали BET. Данные представляют два независимых эксперимента.

Фигура 6: Секреция TNF-α мышиными макрофагами RAW264.7 в ответ на обработку поли(A:U) увеличивающегося размера. Клетки RAW264.7 обрабатывали в течение 24 часов 10 мкг/мл каждой дцРНК и измеряли секрецию mTNF-α с помощью ИФА. Данные представляют три независимых анализа.

Фигура 7: Поли(A:U) увеличивающихся размеров по отдельности активирует ISRE-репортерный ген в макрофагах мыши RAW264.7. Клетки RAW264.7 обрабатывали в течение 24 часов 50 мкг/мл указанной дцРНК. Измеряли биолюминесценцию, управляемую ISRE (QUANTI-luc, Invivogen). Данные представляют три независимых анализа.

Фигура 8: Поли(A:U) увеличивающегося размера по отдельности запускает TLR3-зависимую секрецию IL-6 клетками немелкоклеточного рака легкого человека NCI-H292. Клетки WT или TLR3 KO NCI-H292 обрабатывали в течение 24 часов 10 мкг/мл каждой дцРНК, и секрецию hIL-6 измеряли с помощью ИФА. Данные представляют три независимых анализа.

Фигура 9: Поли(A:U) увеличивающегося размера по отдельности запускает TLR3-зависимую смерть клеток немелкоклеточного рака легкого NCI-H292. Клетки NCI-H292 обрабатывали в течение 24 часов 50 мкг/мл указанных дцРНК. Аннексин-V-позитивные клетки определяли с помощью хемилюминесценции (набор Annexin V-Glo, Promega). Данные представляют три независимых анализа.

Фигура 10: профиль дцРНК при нативном электрофорезе на 6% акриламидном геле (TBE 1X) дцРНК 422, 432, 442, 532, 533, 534, 535 и коммерческой поли(A:U). По 1 мкг каждой из этих дцРНК и коммерческой поли(A:U) наносили на 6% акриламидный гель и окрашивали BET. Данные представляют два независимых эксперимента.

Фигура 11: Секреция TNF-α мышиными макрофагами RAW264.7 в ответ на коммерческую поли(A:U) и дцРНК 422, 432, 442, 532, 533, 534, 535. Клетки RAW264.7 обрабатывали в течение 24 часов 10 мкг/мл каждой дцРНК и определяли секрецию mTNF-α с помощью ИФА. Данные представляют два независимых анализа.

Фигура 12: TLR3-зависимая секреция IL-6 клетками немелкоклеточного рака легкого человека NCI-H292 в ответ на коммерческую поли(A:U) и дцРНК 422, 432, 442, 532, 533, 534, 535. Клетки WT или TLR3 KO NCI-H292 обрабатывали в течение 24 часов 10 мкг/мл каждой дцРНК, и секрецию hIL-6 измеряли с помощью ИФА. Данные представляют два независимых анализа.

Фигура 13: TLR3-зависимая гибель клеток немелкоклеточного рака легкого человека NCI-H292 в ответ на коммерческую поли(A:U) и дцРНК 422, 432, 442, 532, 533, 534, 535. Клетки NCI-H292 обрабатывали в течение 24 часов 50 мкг/мл указанных дцРНК. Аннексин-V-позитивные клетки определяли с помощью хемилюминесценции (набор Annexin V-Glo, Promega). Данные представляют два независимых анализа.

Фигура 14: Секреция TNF-α мышиными макрофагами RAW264.7 в ответ на дцРНК 532, полученную с помощью двух различных технологий химического производства. Клетки RAW264.7 обрабатывали в течение 24 часов с диапазоном дозы от 1 до 100 мкг/мл указанной дцРНК 532, и секрецию mTNF-α измеряли с помощью ИФА. Данные являются средним значением по меньшей мере от трех независимых анализов и представляют собой по меньшей мере шесть независимых анализов.

Фигура 15: Секреция TNF-α мышиными макрофагами RAW264.7 в ответ на дцРНК 532, полученную от двух разных компаний-производителей. Клетки RAW264.7 обрабатывали в течение 24 часов в диапазоне дозы от 1 до 100 мкг/мл указанной дцРНК 532, и секрецию mTNF-α измеряли с помощью ИФА. Данные представляют собой среднее значение по меньшей мере пяти независимых анализов.

Фигура 16: дцРНК 532, полученная с помощью двух различных технологий химического синтеза или от двух разных компаний-производителей, вызывает одинаковый уровень гибели клеток немелкоклеточного рака легкого человека NCI-H292. Клетки NCI-H292 обрабатывали в течение 24 часов в диапазоне дозы от 1 до 100 мкг/мл указанных дцРНК. Аннексин-V-позитивные клетки измеряли с помощью хемилюминесценции (набор Annexin V-Glo, Promega). Данные представляют по меньшей мере четыре независимых анализа.

Фигура 17: дцРНК 532, полученная с помощью двух различных технологий химического синтеза, запускает одинаковый уровень снижения жизнеспособности клеток немелкоклеточного рака легкого человека NCI-H292. Клетки NCI-H292 обрабатывали в течение 24 часов в диапазоне доз от 1 до 100 мкг/мл указанных дцРНК. Жизнеспособность клеток измеряли с помощью MTS (водный раствор Cell Titer, Promega). Данные представляют по меньшей мере четыре независимых анализа.

Фигура 18: дцРНК 532, полученная от двух различных компаний-производителей, вызывает одинаковый уровень снижения жизнеспособности клеток немелкоклеточного рака легкого человека NCI-H292. Клетки NCI-H292 обрабатывали в течение 24 часов в диапазоне доз от 1 до 100 мкг/мл указанных дцРНК. Анализы жизнеспособности клеток проводили с помощью MTS (набор для определения клеточного титра, водный раствор, Promega). Данные представляют по меньшей мере пять независимых анализов.

Фигура 19: профиль дцРНК при нативном электрофорезе на 6% акриламидном геле (TBE 1X) поли(A:U) и дцРНК 532 после расщепления либо РНКазой I, либо РНКазой III. 1 мкг дцРНК и коммерческой поли(A:U) загружали в 6% акриламидный гель и окрашивали BET. Данные представляют по меньшей мере два независимых анализа.

Фигура 20: Профиль расчета Tm дцРНК для поли(A:U) и дцРНК 532. 1 мкг дцРНК смешивали с смесью SyBr зеленого Q-PCR и проводили анализ кривой плавления. Данные представляют по меньшей мере три независимых анализа. По горизонтальной оси указана температура в градусах Цельсия. По вертикальной оси указано значение -d(RFU)/dT. Указан пик расплава.

Примеры

Сокращения:

TLR3: толл-подобный рецептор 3 (CD283)

WT: дикий тип

KO: нокаут

TBE: трис-борат-ЭДТА

APS: Персульфат аммония

TEMED: Тетраметилэтилендиамин

ВЕТ: бромистый этидий

ДНК: дезоксирибонуклеиновая кислота

РНК: рибонуклеиновая кислота

дцРНК: двухцепочечная РНК

оцРНК: одноцепочечная РНК

Поли (A:U): полиадениловая полиуридиловая кислота

PAU: высокомолекулярная коммерческая поли(A:U)

Поли(I:C): полиинозиновая полицитидиловая кислота

PIC: Поли(I:C)

bp: пара оснований

mTNF-α: мышиный фактор некроза опухоли-альфа

hIL-6: человеческий интерлейкин-6

Å: Ангстрем

5’ppp: 5’три-фосфат

ISRE: элемент ответа, стимулированный интерфероном

Таблица 1: Последовательности 47 дцРНК размером 50 п.о., протестированных на их способность активировать воспалительный ответ в мышиных макрофагах RAW264.7.

Таблица 2: Последовательности поли(A:U) дцРНК в диапазоне от 60 до 90 п.о. (последовательности 422, 432, 442, 452) и последовательности семейства дцРНК 70 п.о. с возрастающим количеством поли(инозиновой кислоты: цитидиловой кислоты) (дцРНК 532, 533, 534, 535) в отношении последовательности дцРНК 432, и протестированные на их способность к активации воспалительного ответа мышиных макрофагов RAW264.7 и апоптоза с воспалительным ответом в клетках NCI-H292 рака легкого человека.

дцРНК ID# 422 Смысловая 60 оснований A Антисмысловая 60 оснований U 432 Смысловая 70 оснований A Антисмысловая 70 оснований U 442 Смысловая 80 оснований A Антисмысловая 80 оснований U 452 Смысловая 90 оснований A Антисмысловая 90 оснований U 532 Смысловая 70 оснований : 10 I - 50 A - 10 I Антисмысловая 70 оснований : 10 C - 50 U - 10 C 533 Смысловая 70 оснований : 35 A - 35 I Антисмысловая 70 оснований : 35 U - 35 C 534 Смысловая 70 оснований : 10 A - 50 I - 10 A Антисмысловая 70 оснований : 10 U - 50 C - 10 U 535 Смысловая 70 оснований I Антисмысловая 70 оснований C

Следующие другие цепи и их комплементарные цепи могут быть синтезированы таким же образом и затем гибридизированы:

5’ (I)10 - (U)50 - (I)10 3’

5’ (A)60 - (I)10 3’

5’ (A)50 - (I)20 3’

5’ (A)20 - (I)50 3’

5’ (A)10 - (I)60 3’

5’ (I)5 - (A)60 - (I)5 3’

5’ (I)15 - (A)40 - (I)15 3’

5’ (I)20 - (A)30 - (I)20 3’

5’ (I)25 - (A)20 - (I)25 3’

5’ (I)30 - (A)10 - (I)30 3’

5’ (I)5 - (A)50 - (I)15 3’

5’ (I)13 - (A)64 - (I)13 3’

5’ (I)10 - (A)70 - (I)10 3’

Пример 1 и Фигура 1: анализ дцРНК размером 50 п.о. и коммерческой поли(A:U) путем нативного электрофореза на 8% акриламидном геле (TBE 1X).

Лиофилизированные дцРНК, полученные от DHARMACON™ (Колорадо, США), ресуспендировали в стерильной, свободной от РНКаз, физиологической воде (INVIVOGEN, Франция) согласно протоколу производителя. После добавления буфера для загрузки нуклеиновой кислоты (Invitrogen, № по каталогу AM8556) 5 мкг дцРНК загружали в 8% акриламидный гель, приготовленный следующим образом: 9,3 мл стерильной воды, свободной от РНКаз (Sigma-Aldrich, каталог № W4502); 1,5 мл TBE 10x (Sigma-Aldrich); 4 мл 30% акриламида (Merck Chemicals, Германия, № по каталогу 1.00639.1000); 0,2 мл APS (Sigma-Aldrich); 20 мкл TEMED (Sigma-Aldrich). Лэддер РНК был получен от Invitrogen (кат. номер SM1833). Миграция образцов была установлена на уровне 100 В в течение 1 часа перед окрашиванием ВЕТ (Sigma-Aldrich) при 1 мкг/мл. Затем гель визуализировали с помощью анализатора GelDoc XR+ (BIORAD, Калифорния, США). Данные представляют 9 из 17 дцРНК размером 50 п.о.

Пример 2 и Фигура 2: Секреция TNF-α мышиными макрофагами RAW264.7 в ответ на обработку только дцРНК размером 50 п.о.

Лиофилизированные дцРНК были получены от IDT или DHARMACON. 5×10⁴ клеток RAW264.7 высевали в конечном объеме 200 мкл в 96-луночные планшеты (CORNING, США, кат.№ 353072). Через 24 часа клетки обрабатывали дцРНК без реагента для трансфекции в конечной концентрации 10 мкг/мл в течение 24 часов, и надосадочную жидкость собирали для измерения секреции мышиного TNF-α с помощью ИФА (BioLegend, USA кат.№ 430903). PAU = высокомолекулярная коммерческая поли(A:U). Данные представляют два независимых анализа с использованием двух разных серий дцРНК 412 размером 50 п.о.

Пример 3 и Фигура 3: Секреция IL-6 клетками немелкоклеточного рака легкого человека NCI-H292 после обработки PAU или только дцРНК размером 50 п.о.

3×10³ клеток NCI-H292 WT или TLR3 KO высевали в конечном объеме 300 мкл/лунку p48-луночных планшетов (CORNING, США, кат.№ 353078). Через 24 часа культуральную среду заменяли свежей, и клетки обрабатывали дцРНК без реагента для трансфекции до конечной концентрации 10 мкг/мл. Через 24 часа собирали надосадочную жидкость для измерения секреции человеческого IL-6 с помощью ИФА (BioLegend, США, кат.№ 430501). PAU = высокомолекулярная коммерческая поли(A:U). Данные представляют три независимых анализа.

Пример 4 и Фигура 4: дцРНК 412 длиной 50 п.о. не вызывает гибели клеток немелкоклеточного рака легкого человека NCI-H292.

1×10⁴ клеток NCI-H292 WT или TLR3 KO высевали в конечном объеме 100 мкл/лунку p96-луночных планшетов (GREINER, США, кат.№ 655098). Через 24 часа клетки обрабатывали дцРНК без реагента для трансфекции в конечной концентрации 50 мкг/мл в течение 24 часов, после чего измеряли апоптоз посредством считывания люминесценции Аннексин-V-положительных клеток с использованием набора Real-Time Glo AnnexinV от Promega (Франция, кат.№ JA1000). PAU = высокомолекулярная коммерческая поли(A:U). Данные представляют три независимых анализа с использованием двух разных серий дцРНК 412 размером 50 п.о.

Пример 5 и Фигура 5: анализ дцРНК 412, 432, 452 и поли(A: U) при нативном электрофорезе на 6% акриламидном геле (TBE 1X).

Лиофилизированные дцРНК, полученные от DHARMACON, ресуспендировали в стерильной физиологической воде, свободной от РНКаз (Invitrogen), в соответствии с протоколом производителя. После добавления буфера для загрузки РНК (Invitrogen) 1 мкг дцРНК загружали в 6% акриламидный гель, приготовленный следующим образом: 10,3 мл стерильной воды, свободной от РНКаз (Sigma-Aldrich); 1,5 мл TBE 10x (Sigma-Aldrich); 3 мл 30% акриламида (Merck Chemicals); 0,2 мл APS (Sigma-Aldrich); 20 мкл TEMED (Sigma-Aldrich). Лэддер РНК был приобретен у Invitrogen. Миграция образцов была установлена на уровне 100 В в течение 1 часа перед окрашиванием ВЕТ (Sigma-Aldrich) при 1 мкг/мл. Затем гель визуализировали с помощью анализатора Gel Doc (BIORAD).

Пример 6 и Фигура 6: Секреция TNF-α мышиными макрофагами RAW264.7 в ответ на обработку только поли(A: U) увеличивающегося размера.

5×10⁴ клеток RAW264.7 высевали в конечном объеме 200 мкл в 96-луночный планшет (CORNING, США, кат.№ 353072). Через 24 часа клетки обрабатывали дцРНК без реагента для трансфекции в конечной концентрации 10 мкг/мл в течение 24 часов и собирали надосадочную жидкость для измерения секреции мышиного TNF-α с помощью ИФА (BioLegend). PAU = высокомолекулярная коммерческая поли(A:U). Данные представляют три независимых анализа.

Пример 7 и Фигура 7: Поли(A:U) увеличивающихся размеров по отдельности активирует ISRE-репортерный ген в макрофагах мыши RAW264.7.

5×10⁴ клеток RAW264.7 (Invivogen, Франция, кат.№ rawl-isg) высевали в конечном объеме 100 мкл на лунку в 96-луночные планшеты (CORNING, США, 353072). Через 24 часа клетки обрабатывали дцРНК без реагента для трансфекции в конечной концентрации 50 мкг/мл в течение 24 часов перед анализом биолюминесценции, управляемой ISRE, с использованием набора QUANTI-Luc (Invivogen, кат.№ rep-qlc1) в соответствии с протоколом производителя. PAU = высокомолекулярная коммерческая поли(A:U). Данные представляют три независимых анализа.

Пример 8 и Фигура 8: Поли(A: U) увеличивающегося размера по отдельности запускает TLR3-зависимую секрецию IL-6 клетками немелкоклеточного рака легкого человека NCI-H292.

3×10⁴ клеток NCI-H292 WT или TLR3 KO высевали в конечном объеме 300 мкл на лунку в 48-луночные планшеты (CORNING, США, кат.№ 353078). Через 24 часа культуральную среду заменяли свежей, и клетки обрабатывали дцРНК без реагента для трансфекции до конечной концентрации 10 мкг/мл. Через 24 часа собирали надосадочную жидкость для измерения секреции человеческого IL-6 с помощью ИФА (BioLegend). PAU = высокомолекулярная коммерческая поли(A:U). Данные представляют три независимых анализа.

Пример 9 и Фигура 9: Поли(A:U) увеличивающихся размеров по отдельности запускает TLR3-зависимую гибель клеток немелкоклеточного рака легкого NCI-H292.

1×10⁴ клеток NCI-H292 WT или TLR3 KO высевали в конечном объеме 100 мкл/лунку p96-луночного планшета (CORNING, США, кат.№ 655098). Через 24 часа клетки обрабатывали дцРНК без реагента для трансфекции в конечной концентрации 50 мкг/мл в течение 24 часов перед измерением апоптоза с помощью считывания люминесценции Аннексин-V+ с использованием набора Real-Time Glo AnnexinV от Promega (Франция, кат.№ JA1000). PAU = высокомолекулярная коммерческая поли(A:U). Данные представляют три независимых анализа.

Пример 10 и Фигура 10: анализ дцРНК 422, 432, 442, 532, 533, 534, 535 и поли(A:U) при нативном электрофорезе на 6% акриламидном геле (TBE 1X).

Лиофилизированные дцРНК, полученные от DHARMACON, ресуспендировали в стерильной физиологической воде, свободной от РНКаз (Invitrogen), в соответствии с протоколом производителя. После добавления буфера для загрузки РНК (Invitrogen) 1 мкг дцРНК загружали в 6% акриламидный гель, приготовленный следующим образом: 10,3 мл стерильной воды, свободной от РНКаз (Sigma-Aldrich); 1,5 мл TBE 10x (Sigma-Aldrich); 3 мл 30% акриламида (Merck Chemicals); 0,2 мл APS (Sigma-Aldrich); 20 мкл TEMED (Sigma-Aldrich). Лэддер РНК был приобретен у Invitrogen. Миграция образцов была установлена на уровне 100 В в течение 1 часа перед окрашиванием ВЕТ (Sigma-Aldrich) при 1 мкг/мл. Затем гель визуализировали с помощью анализатора Gel Doc (BIORAD). Гель представляет результаты двух независимых анализов.

Пример 11 и Фигура 11: Секреция TNF-α мышиными макрофагами RAW264.7 в ответ на поли(A:U) и дцРНК 422, 432, 442, 532, 533, 534, 535.

5×10⁴ клеток RAW264.7 высевали в конечном объеме 200 мкл на лунку, используя p96-луночный планшет (CORNING, США, кат.№ 353072). Через 24 часа клетки обрабатывали дцРНК без реагента для трансфекции в конечной концентрации 10 мкг/мл в течение 24 часов и собирали надосадочную жидкость для измерения секреции мышиного TNF-α с помощью ИФА (BioLegend). PAU = высокомолекулярная коммерческая поли(A:U). Данные представляют два независимых анализа.

Пример 12 и Фигура 12: Поли(A: U) увеличивающихся размеров и дцРНК 422, 432, 442, 532, 533, 534, 535 по отдельности запускают TLR3-зависимую секрецию IL-6 клетками немелкоклеточного рака легкого человека NCI- H292.

3×10⁴ клеток NCI-H292 WT или TLR3 KO высевали в конечном объеме 300 мкл на лунку с использованием p48-луночного планшета (CORNING, США, кат.№ 353078). Через 24 часа клетки обрабатывали дцРНК без реагента для трансфекции в конечной концентрации 10 мкг/мл в течение 24 часов, и надосадочную жидкость собирали для измерения секреции человеческого IL-6 с помощью ИФА (BioLegend). PAU = высокомолекулярная коммерческая поли(A:U). Данные представляют по меньшей мере два независимых анализа.

Пример 13 и Фигура 13: Поли(A: U) увеличивающихся размеров и дцРНК 422, 432, 442, 532, 533, 534, 535 по отдельности запускают TLR3-зависимый апоптоз клеток немелкоклеточного рака легкого человека NCI-H292.

1×10⁴ клеток NCI-H292 WT или TLR3 KO высевали в конечном объеме 100 мкл на лунку с использованием p96-луночного планшета (GREINER, США, кат.№ 655098). Через 24 часа клетки обрабатывали дцРНК без реагента для трансфекции в конечной концентрации 50 мкг/мл в течение 24 часов перед измерением апоптоза с помощью считывания люминесценции Аннексин-V+ с использованием набора Real-Time Glo AnnexinV от Promega (Франция, кат.№ JA1000). PAU = высокомолекулярная коммерческая поли(A:U). Данные представляют по меньшей мере два независимых анализа.

Пример 14 и Фигура 14: Секреция TNF-α мышиными макрофагами RAW264.7 в ответ на 532, полученную с помощью двух различных химических технологий производства.

Лиофилизированные дцРНК были получены от DHARMACON с использованием двух различных химических технологий производства: TBDMS или 2’ACE. 5×10⁴ клеток RAW264.7 высевали в конечном объеме 200 мкл на лунку p96-луночных планшетов (CORNING, США, кат.№ 353072). Через 24 часа клетки обрабатывали дцРНК без реагента для трансфекции в конечной концентрации в диапазоне от 1 до 100 мкг/мл в течение 24 часов, и надосадочную жидкость собирали для измерения секреции mTNF-α с помощью ИФА (BioLegend, США, кат.№ 430903). Данные представляют собой среднее значение по меньшей мере трех различных анализов, и представляют по меньшей мере шесть независимых анализов. Статистический анализ выполняли с использованием двустороннего непарного t-критерия Стьюдента; NS = недостоверно при p> 0,05.

Пример 15 и Фигура 15: Секреция TNF-α мышиными макрофагами RAW264.7 в ответ на 532, полученную от двух разных компаний-производителей.

Лиофилизированные дцРНК были получены либо от DHARMACON, либо от BIOSPRING. 5×10⁴ клеток RAW264.7 высевали в конечном объеме 200 мкл на лунку p96-луночных планшетов (CORNING, США, кат.№ 353072). Через 24 часа клетки обрабатывали дцРНК без реагента для трансфекции в конечной концентрации в диапазоне от 1 до 100 мкг/мл в течение 24 часов, и надосадочную жидкость собирали для измерения секреции mTNF-α с помощью ИФА (BioLegend, USA кат.№ 430903). Данные представляют собой среднее значение по меньшей мере пяти различных экспериментов. Статистический анализ выполняли с использованием двустороннего непарного t-критерия Стьюдента; NS = недостоверно при p> 0,05.

Пример 16 и Фигура 16: 532 от различных химических производственных синтезов и от разных компаний-производителей вызывают одинаковый уровень апоптоза клеток немелкоклеточного рака легкого человека NCI-H292.

Лиофилизированные дцРНК были получены от DHARMACON с использованием двух различных технологий химического производства: TBDMS или 2’ACE; кроме того, лиофилизированные дцРНК были получены от BIOSPRING. 1×10⁴ клеток NCI-H292 WT высевали в конечном объеме 100 мкл на лунку с использованием p96-луночного планшета (GREINER, США, кат.№ 655098). Через 24 часа клетки обрабатывали дцРНК без реагента для трансфекции в конечной концентрации в диапазоне от 1 до 100 мкг/мл в течение 24 часов перед измерением апоптоза с помощью считывания люминесценции Аннексин-V+ с использованием набора Real-Time Glo AnnexinV от Promega (Франция, кат.№ JA1000). Данные представляют по меньшей мере четыре независимых анализа.

Пример 17 и Фигура 17: 532 от различных химических производственных синтезов запускают одинаковый уровень снижения жизнеспособности клеток немелкоклеточного рака легкого NCI-H292.

Лиофилизированные дцРНК были получены от DHARMACON с использованием двух различных технологий химического производства: TBDMS или 2’ACE. 1×10⁴ клеток NCI-H292 WT высевали в конечном объеме 100 мкл на лунку с использованием p96-луночного планшета (GREINER, США, кат.№ 655098). Через 24 часа клетки обрабатывали дцРНК без реагента для трансфекции в конечной концентрации в диапазоне от 1 до 100 мкг/мл в течение 24 часов, затем жизнеспособность клеток измеряли с помощью водного раствора Cell Titer от Promega (Франция, кат.№ G3580). Данные представляют по меньшей мере четыре независимых анализа. Статистический анализ выполняли с использованием двустороннего непарного t-критерия Стьюдента; NS = недостоверно при p> 0,05.

Пример 18 и Фигура 18: 532 от разных компаний-производителей вызывают одинаковый уровень снижения жизнеспособности клеток немелкоклеточного рака легкого NCI-H292.

Лиофилизированные дцРНК были получены либо от DHARMACON, либо от BIOSPRING. 1×10⁴ клеток NCI-H292 WT высевали в конечном объеме 100 мкл на лунку с использованием p96-луночного планшета (GREINER, США, кат.№ 655098). Через 24 часа клетки обрабатывали дцРНК без реагента для трансфекции в конечной концентрации в диапазоне от 1 до 100 мкг/мл в течение 24 часов, после чего определяли жизнеспособность клеток с помощью водного раствора Cell Titer от Promega (Франция, кат.№ G3580). Данные представляют по меньшей мере пять независимых анализов.

Пример 19 и Фигура 19: анализ чувствительности поли(A:U) и дцРНК 532 к РНКазе I и к РНКазе III и анализ посредством нативного электрофореза на 6% акриламидном геле (TBE 1X).

РНКаза I представляет собой РНКазу, которая демонстрирует высокое предпочтение одноцепочечной РНК перед двухцепочечной РНК независимо от последовательности, в то время как РНКаза III представляет собой РНКазу, которая расщепляет двухцепочечную РНК на короткие дцРНК по 12-30 оснований. Лиофилизированные дцРНК, полученные от DHARMACON, ресуспендировали в стерильной физиологической воде, свободной от РНКаз (INVIVOGEN), в соответствии с протоколом производителя. 1 мкг дцРНК сначала инкубировали либо с 1 единицей РНКазы I (ThermoFischer AMBION, кат.№ AM2294), либо с 1 единицей РНКазы III (ThermoFischer AMBION, кат.№ AM2290) в течение 10 или 30 минут при 37°C перед добавлением буфера для загрузки РНК (Invitrogen), и загружали на 6% акриламидный гель, приготовленный следующим образом: 10,3 мл стерильной воды, свободной от РНКаз (Sigma-Aldrich); 1,5 мл TBE 10x (Sigma-Aldrich); 3 мл 30% акриламида-бис (Merck Chemicals); 0,2 мл APS (Sigma-Aldrich); 20 мкл TEMED (Sigma-Aldrich). Лэддер РНК получали от Invitrogen. Миграция образцов была установлена при 100 В течение 45 минут перед окрашиванием ВЕТ (Sigma-Aldrich) при 1 мкг/мл. Затем гель визуализировали с помощью анализатора Gel Doc (BIORAD). PAU = высокомолекулярная коммерческая поли(A:U). Данные представляют по меньшей мере два независимых анализа.

Пример 20 и Фигура 20: анализ профиля кривой плавления РНК с использованием машинного анализа Q-PCR.

Лиофилизированные дцРНК, полученные от DHARMACON, ресуспендировали в стерильной физиологической воде, свободной от РНКаз (INVIVOGEN), в соответствии с протоколом производителя. 1 мкг дцРНК смешивали со смесью SyBr green PCR (Biorad, кат.№ 1725270) перед анализом кривой плавления с использованием Q-PCR машины от Biorad (Biorad, CFX Connect). Жирная линия соответствует названной дцРНК над соответствующим графиком. PAU = высокомолекулярная коммерческая поли(A:U). Данные представляют по меньшей мере три независимых анализа.

Таблица 3: Влияние длины и состава оснований дцРНК на активацию клеток RAW264.7 и NCI-H292. Обозначения: - = отрицательный эффект, от + до ++ = положительная активация.

Вещества Воспаление в мышиных макрофагальных миелоидных клетках RAW264.7 Человеческие эпителиальные клетки немелкоклеточного рака легкого NCI-H292 Воспаление Апоптоз Коммерческая поли(A:U) PAU ++ ++ ++ Поли(I:C) 50 п.о. #411 - - - Поли(I:C) 70 п.о. #535 - ++ ++ Поли(A:U) 50 п.о. #412 ++ - - Поли(A:U) 70 п.о. #432 ++ + + Поли(I10A50I10:C10U50C10) 70 п.о. #532 ++ ++ ++ Поли(A35I35:C35U35) 70 п.о. #533 ++ ++ ++ Поли(A10I50A10:U10C50U10) 70 п.о. #534 - ++ ++

Таблица 4: Влияние длины и состава оснований дцРНК на активацию клеток RAW264.7 и NCI-H292. Обозначения: - = отрицательный эффект, от + до +++ = положительная активация.

Состав оснований Вещества Воспаление в мышиных миелоидных макрофагальных клетках RAW264.7 Эпителиальные клетки немелкоклеточного рака легкого человека NCI-H292 Воспаление Апоптоз (A:U)>50% Коммерческая поли(A:U) PAU +++ +++ +++ Поли(AU:AU) 50 п.о. #413 - - - Поли(A:U) 50 п.о. #412 +++ - - Поли(A:U) 60 п.о. #422 +++ + + Поли(A:U) 70 п.о. #432 +++ ++ ++ Поли(A:U) 80 п.о. #442 +++ ++ +++ Поли(A:U) 90 п.о. #452 +++ ++ ++ Поли(I10A50I10:C10U50C10)
70 п.о. #532 +++ +++ +++ (A:U)=(I:C)=50% Поли(A35I35:C35U35)
70 п.о. #533 +++ +++ +++ (I:C)>50% Поли(I:C) 50 п.о. #411 - - - Поли(I:C) 70 п.о. #535 - +++ +++ Поли(A10I50A10:U10C50U10) 70 п.о. #534 - +++ +++

Таблица 5: Влияние длины и состава оснований дцРНК на активацию клеток RAW264.7 и NCI-H292. Обозначения: - = отрицательный эффект; + / - = граница; от + до +++ = увеличение положительной активации.

Состав оснований Вещества Воспаление в мышиных миелоидных макрофагальных клетках RAW264.7 Эпителиальные клетки немелкоклеточного рака легкого человека NCI-H292 Воспаление Апоптоз (A:U)>50% Коммерческая поли(A:U) PAU +++ +++ +++ Поли(AU:AU) 50 п.о. #413 - - - Поли(A:U) 50 п.о. #412 +++ - - Поли(A:U) 60 п.о. #422 +++ +/- +/- Поли(A:U) 70 п.о. #432 +++ + + Поли(A:U) 80 п.о. #442 +++ + ++ Поли(A:U) 90 п.о. #452 +++ ++ ++ Поли(I10A50I10:C10U50C10)
70 п.о. #532 +++ +++ +++ (A:U)=(I:C)=50% Поли(A35I35:C35U35) 70 п.о. #533 +++ +++ +++ (I:C)>50% Поли(I:C) 50 п.о. #411 - - - Поли(I:C) 70 п.о. #535 - +++ +++ Поли(A10I50A10:U10C50U10) 70 п.о. #534 - +++ +++

Изобретение относится к биотехнологии и медицине, в частности к композиции, содержащей двухцепочечную РНК (дцРНК), имеющую две комплементарные цепи, включающие по меньшей мере один блок поли(А) и комплементарный блок поли(U), причем каждая цепь имеет длину от 50 до 200 оснований, предпочтительно от 55 до 200 оснований, а также фармацевтически приемлемый растворитель, носитель или вспомогательное вещество для использования в способе лечения рака, экспрессирующего рецептор TLR3. Изобретение предлагает дцРНК, способные как активировать миелоидные клетки, так и запускать гибель эпителиальных раковых клеток. 3 н. и 16 з.п. ф-лы, 20 ил., 5 табл., 20 пр.

1. Двухцепочечная РНК (дцРНК), которая представляет собой агонист рецептора TLR3, имеющая две комплементарные цепи, где дцРНК содержит по меньшей мере один блок или гомополимер поли(А) и комплементарный блок или гомополимер поли(U), где каждый блок содержит по меньшей мере 15 A или U, и каждая цепь имеет определенную длину от 50 до 200 оснований, причем дцРНК имеет формулу (III):

[P]_a [A]_b [R]_c

[Y]_a [U]_b [Z]_c,

где P и R независимо выбраны из I и C, а Y и Z являются комплементарными основаниями,

b представляет собой целое число от 20 до 100, а

а и с независимо составляют примерно от 5 до 50.

2. ДцРНК по п. 1, отличающаяся тем, что выбрана из:

5' (I)10-(U)50-(I)10 3';

5' (I)10-(A)50-(I)10 3';

5' (I)5-(A)60-(I)5 3';

5' (I)15-(A)40-(I)15 3';

5' (I)20-(A)30-(I)20 3';

5' (I)25-(A)20-(I)25 3';

5' (I)5-(A)50-(I)15 3';

5' (I)13-(A)64-(I)13 3' и

5' (I)10-(A)70-(I)10 3'.

3. ДцРНК по п. 1, где A, U, I или C представляют собой модифицированные нуклеотиды, содержащие O-метилированные нуклеотиды или фосфоротиоатные нуклеотиды.

4. ДцРНК по п. 1, где a+b+c равно по меньшей мере 50.

5. ДцРНК по п. 1, где a+b+c равно по меньшей мере 60.

6. ДцРНК по п. 1, где a+b+c составляет от 70 до 100.

7. ДцРНК по п.1, где b представляет собой целое число от 35 до 100.

8. ДцРНК по п. 1, где b представляет собой целое число от 40 до 100.

9. ДцРНК по п. 1, где b представляет собой целое число от 50 до 100.

10. ДцРНК по п. 1, где b представляет собой целое число от 50 до 90.

11. Способ лечения TLR3-положительного рака, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества двухцепочечной РНК (дцРНК) по п. 1.

12. Способ по п. 11, где рак представляет собой рак, экспрессирующий рецептор TLR3.

13. Способ по п. 11, где рак представляет собой рак мочевого пузыря.

14. Способ по п. 11, где рак обладает метастатическим потенциалом или метастазировал в орган или ткань.

15. Способ по п. 11, где рак представляет собой эпителиальный рак.

16. Способ по п. 11, где рак представляет собой рак легких, немелкоклеточный рак легких или рак молочной железы.

17. Способ по п. 11, дополнительно включающий введение пациенту эффективного количества ингибитора контрольной точки иммунитета.

18. Способ по п. 17, где ингибитор контрольной точки иммунитета представляет собой моноклональное антитело против PD-1 или моноклональное антитело против PD-L1.

19. Композиция для лечения TLR3-положительного рака, содержащая дцРНК по п. 1 и фармацевтически приемлемый носитель, адъювант и/или наполнитель.