СОЕДИНЕНИЕ И СПОСОБ ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ ПЕРЕДАЧИ ВИРУСА ГРИППА Российский патент 2024 года по МПК A61K31/55 A61P31/16 

Настоящее изобретение относится к способу предупреждения передачи вируса гриппа, где указанный способ включает введение пациенту, имеющему инфекцию вирусом гриппа, далее именуемому «нулевым пациентом», эффективного количества соединения, где данное соединение имеет одну из формул (I) и (II), или его фармацевтически приемлемой соли. Соединение, подлежащее применению в настоящем изобретении, снижает инфективность вируса гриппа нулевого пациента и, следовательно, снижает риск запуска нулевым пациентом эпидемии гриппа или пандемии гриппа по сравнению с контрольным пациентом. Следовательно, один аспект настоящего изобретения относится к способу предупреждения эпидемии гриппа или пандемии гриппа, где данный способ включает введение пациентам, имеющим инфекцию вирусом гриппа (нулевым пациентам), эффективного количества соединения, где данное соединение вводится по меньшей мере 10% всех инфицированных гриппом лиц населения города или страны, и где данное соединение имеет одну из формул (I) и (II), или его фармацевтически приемлемой соли.

Инфекция вирусом гриппа представляет собой острое респираторное инфекционное заболевание, вызванное вирусами гриппа, и она распространяется, главным образом, воздушно-капельной передачей, в частности, капельной инфекцией. Вирусы гриппа А и В являются высокозаразными (Vanderlinden, Med Res Rev 2014; 34(2):301-339). Следовательно, эпидемия гриппа часто возникает из-за сезонных вирусов гриппа и является тяжелым бременем для глобальной системы здравоохранения. Оценочно имеется 3-5 миллионов случаев тяжелого заболевания во всем мире, и приблизительно 290-650 тысяч человек умирают в год от гриппа (WHO News Release, Geneva, Switzerland, 14 December 2017; WHO Fact Sheet, Geneva, Switzerland, 31 January 2018; Baxter D, Hum Vaccin Immunother. 2016; 12(10):2712-2717). Грипп также каждый сезон налагает значительные потребности на службы здравоохранения и влияет на общество через потерю продуктивности рабочей силы (WHO Fact Sheet, Geneva, Switzerland, 31 January 2018).

Пандемии гриппа являются неожиданными и вплоть до настоящего времени неизбежными событиями. На протяжении последнего столетия они вызывали глобальные чрезвычайные ситуации санитарно-эпидемиологического характера. Оценивается, что первая и самая тяжелая из них привела к более чем 40-50 миллионам смертей во всем мире (Francis, Am J Hyg., 1945, 42:1-11). Эксперты предполагают то, что следующая пандемия будет связана с большим числом жертв и высоким уровнем заболеваемости, требующей госпитализации, таким образом, производя значительное напряжение на ресурсы системы здравоохранения. Пандемии являются глобальными по их природе, и, вероятно, мало стран останутся свободными от них. В развивающихся странах, где ресурсы здравоохранения уже напряжены, и широкие слои населения часто ослаблены плохим состоянием здоровья и питания, данное влияние, вероятно, будет огромным.

Условия, окружающие вспышку в 1997 году гонконгского «птичьего гриппа», подчеркивают необходимость предварительного планирования для обеспечения адекватного ответа на чрезвычайную ситуацию санитарно-эпидемиологического характера, которая определенно является непредсказуемой, сложной, быстро развивающейся и сопровождающейся значительной общественной обеспокоенностью. С началом пандемии в прошлом было слишком поздно осуществлять многие ключевые активности, требующиеся для минимизации влияния. Следовательно, планирование и осуществление подготовительных активностей должно начинаться значительно заранее. Планирование в отношении пандемии также будет увеличивать способность к ответу на другие крупномасштабные чрезвычайные ситуации санитарно-эпидемиологического характера, включая биотеррористические угрозы, которые требуют массового доступа к профилактическим и терапевтическим вмешательствам, и сильные национальные планы, которые включают компонент оповещения о рисках для того, чтобы помочь успокоить общественные страхи. Влияние пандемического гриппа вероятно является значительно большим - на порядки, чем обычные сценарии биотерроризма. В отличие от большинства других чрезвычайных ситуаций санитарно-эпидемиологического характера пандемии происходят в виде нескольких волн и длятся от одного до двух лет. Следовательно, ответные усилия будет нужно поддерживать в течение длительного периода. Кроме того, подготовка к пандемии гриппа будет усиливать ответ на эпидемию гриппа, которая случается каждый год и, как полагают, каждый год убивает от 500000 до 1 миллиона человек в мире. Инвестирование в подготовленность к пандемии, таким образом, имеет прямую и немедленную пользу в качестве меры для снижения влияния определенного и повторяющегося события.

Программы ежегодной вакцинации являются краеугольным камнем попыток предупреждать инфекции вирусом гриппа, но эффективность данных программ является переменной как из-за неоптимального получения вакцинаций, так и из-за несоответствия между вакциной и циркулирующими штаммами гриппа (Centers for Disease Control and Prevention "Vaccine effectiveness - how well does the flu vaccine work?" 3^rd October 2017). Ингибиторы M2, такие как амантадин, и ингибиторы нейраминидазы, такие как оселтамвир, представляют собой типичные лекарственные средства, которые используются против гриппа. Однако модельное исследование применения ингибитора М2 в условиях масштабной вспышки не обнаружило то, что одно лечение значимо влияло на ход вспышки, указывая то, что данное лечение лекарственным средством против гриппа не снижает вероятность передачи (Stilianakis, Journal of Infectious Diseases, 1 998, 177:863-873). В настоящее время нет средства с подтверждением снижения передачи гриппа. Следовательно, важной неудовлетворенной медицинской потребностью является идентификация противовирусных: средств, которые снижают передачу вируса гриппа и вследствие того предупреждают или ослабляют вспышку эпидемии гриппа во время сезонного гриппа или пандемии гриппа.

Таким образом, технической проблемой, лежащей в основе настоящего изобретения, является предложение средств и способов для сохранения здоровья в обществе.

Данная техническая проблема решается предложением воплощений, охарактеризованных в формуле изобретения.

Соответственно, настоящее изобретение относится к способу предупреждения передачи гриппа, где указанный способ включает введение эффективного количества соединения пациенту, имеющему инфекцию вирусом гриппа (нулевой пациент), где данное соединение имеет одну из следующих формул I и II:

или его фармацевтически приемлемой соли

Таким образом, настоящее изобретение относится к соединению для применения в лечении инфекции пациента (нулевого пациента) вирусом гриппа, где данное соединение имеет одну из формул (I) и (II), или к его фармацевтически приемлемой соли, и где данное соединение предупреждает (например, снижает) передачу вируса гриппа. Также настоящим изобретением охватывается фармацевтическая композиция, содержащая соединение, которое имеет одну из формул (I) и (II), или его фармацевтически приемлемую соль, и, возможно, содержащая фармацевтически приемлемый носитель, где данная фармацевтическая композиция предупреждает (например, снижает) передачу вируса гриппа. Данная фармацевтическая композиция является особенно полезной для лечения пациента, инфицированного гриппом (нулевого пациента), и предупреждает (например, снижает) передачу вируса гриппа указанного пациента.

Как показано в приложенных Примерах, соединение, подлежащее применению в настоящем изобретении, имеет полезный эффект в том, что оно снижает передачу. Следовательно, данное соединение снижает вероятность того, что возникнет эпидемия или пандемия гриппа, или снижает распространение существующей эпидемии или пандемии гриппа. Соединение, подлежащее применению в настоящем изобретении, также является ценным средством для ослабления влияний атаки биотеррористов, которая имеет дело с вирусом гриппа, таким как эпидемический или пандемический вирус гриппа. Таким образом, данное соединение является особенно полезным в лечении конкретного типа инфекции вирусом гриппа, т.е. инфекции, которая вызвана штаммом вируса гриппа, который имеет эпидемический или пандемический потенциал. Неожиданный технический эффект соединения, подлежащего применению в настоящем изобретении, для снижения передачи вируса гриппа явно приводит к новой клинической ситуации. В самом деле, имея в виду данный полезный технический эффект, лечащий врач, в частности, будет лечить данным соединением тех пациентов, которые могут причинять (например, экономический или социальный) ущерб, если его/ее контагиозность не снижается. Такие пациенты, например, представляют собой пациентов, которые имеют персональный контакт с индивидами группы риска поражения вирусом гриппа, такими как индивиды, которые подвержены высокому риску получения инфекции вирусом гриппа, или которые имеют повышенный риск получения тяжелых осложнений, связанных с гриппом (например, пожилые, маленькие дети, тяжелобольные люди или люди с ослабленным иммунитетом). Например, лечение соединением, подлежащим применению в настоящем изобретении, является весьма полезным для пациентов с гриппом, которые остаются дома во время их инфекции вирусом гриппа, но имеют контакт с домашними во время их инфекции вирусом гриппа, например, с маленькими детьми. Кроме того, из-за его полезного свойства снижать передачу гриппа, соединение по настоящему изобретению может использоваться в лечении лиц, которые являются важными для функционирования общества, что позволило бы этим важным лицам продолжать работать во время их инфекции вирусом гриппа без заражения коллег или других контактных лиц. Например, соединение, подлежащее применению в настоящем изобретении, может преимущественно использоваться для лечения медицинского персонала, в частности, в начале ситуации эпидемии или пандемии гриппа. Данное соединение также может использоваться для лечения пациента, который будет иметь много персональных контактов во время его/ее инфекции вирусом гриппа, например, из-за того, что он/она должен (должна) летать на самолете. В самом деле, в прошлом несколько самолетов должны были быть закрыты на карантин из-за внезапной вспышки заболевания, в частности, во время полетов на большое расстояние. Таким образом, средства и способы, предложенные в данном документе, преимущественно снижают социальные и экономические последствия, которые ассоциированы с инфекциями вирусом гриппа.

Демонстрируется то, что не может быть сделано заключение об эффекте лекарственного средства в снижении передачи из эффективности данного лекарственного средства против гриппа (например, из эффективности лекарственного средства в снижении симптомов гриппа, вирусной нагрузки, вирусовыделительства или уровня вирусной РНК). В самом деле, в приложенных Примерах показано то, что оселтамивир, который является общеизвестным и эффективным лекарственным средством против гриппа, совсем не предупреждает передачу вируса гриппа. В приложенных Примерах также продемонстрировано то, что вирусная РНК, присутствующая в назальном смыве субъектов, инфицированных гриппом, является идентичной у субъектов, подвергавшихся лечению соединением по настоящему изобретению (в частности, балоксавира марбоксилом), оселтамивиром или плацебо (см., например, Фиг. 6, 9 и 12). Однако из-за неизвестной причины передача вируса была значительно снижена у субъектов, обработанных балоксавиром, по сравнению с субъектами, обработанными оселтамивиром или плацебо.

Факт того, что лекарственное средство против гриппа снижает симптомы гриппа совсем не указывает на то, что данное лекарственное средство также подходит для снижения передачи вируса гриппа. Симптомы гриппа могут оставаться даже после клиренса вируса, вирусной нагрузки и вирусовыделительства, и, следовательно, нельзя прогнозировать эффективность на снижение передачи, если отсутствует хорошо организованное некпиническое исследование, которое имитирует модели у человека. На передачу (например, в домашнем хозяйстве) оказывают влияние много факторов. Следовательно, из того факта, что данное лекарственное средство снижает вирусовыделительство или вирусную нагрузку нельзя непосредственно сделать заключение о том, что это лекарственное средство также снижает передачу.

Кроме того, отсутствует абсолютная корреляция между вирусовыделительством в носу/глотке и передачей. У человека, например, вирусы H5N1 достигают очень высоких титров у инфицированных пациентов, но не передаются через воздух или между людьми. В хорьковой модели было показано узкое окно контагиозности, которая не обязательно коррелирует с временным паттерном пика вирусовыделительства (Roberts, PLoS One 7.8 (2012): е43303). Кроме того, авторами данного изобретения было показано то, что передача не коррелирует с клиническими признаками, таким образом, снижение симптомов не делает очевидным снижение передачи. В самом деле, имеется консенсус о том, что значительная часть передачи вируса гриппа является асимптоматической или предсимптоматической (Fraser, Proceedings of the National Academy of Sciences 101.16 (2004): 6146-6151). Таким образом, факт того, что известное лекарственное средство является эффективным в лечении гриппа совсем не указывает на то, что данное лекарственное средство также является эффективным в снижении передачи данного вируса гриппа. Однако в контексте настоящего изобретения неожиданно обнаружили то, что балоксавир марбоксил значительно снижает передачу вируса гриппа.

Как описано выше, настоящее изобретение направлено на лечение пациента с гриппом, инфективность которого следует предупреждать или снижать. В самом деле, согласно настоящему изобретению термин «предупреждает передачу» включает то, что данное соединение «снижает передачу» по сравнению с контрольным пациентом, которому не вводится соединение, подлежащее применению в настоящем изобретении. В данном документе пациент с гриппом, инфективность которого следует предупреждать или снижать, называется «нулевым пациентом» (или «пациентом ноль»). Данным пациентом, который дополнительно определен ниже, может быть любое лицо, которое имеет инфекцию вирусом гриппа, и инфективность которого подлежит предупреждению или снижению по любой причине.

Соединение, подлежащее применению в настоящем изобретении, снижает инфективность вируса гриппа нулевого пациента. В данном документе термин «инфективность» означает способность патогена, такого как вирус гриппа, устанавливать инфекцию у другого хозяина. В данном документе термин «инфективность» и «трансмиссивность» имеет одинаковое значение и определяет частоту распространения патогена среди хозяев, включая хозяев, которые находятся в связи родитель-ребенок, и хозяев, которые не находятся в связи родитель-ребенок. Таким образом, согласно настоящему изобретению данное соединение снижает способность вируса гриппа подвергавшегося лечению нулевого пациента устанавливать инфекцию у другого хозяина. Или, другими словами, соединение, подлежащее применению в настоящем изобретении, снижает частоту, с которой вирус гриппа нулевого пациента заражает других хозяев.

Приложенные Примеры неожиданно демонстрируют то, что передача вируса гриппа может снижаться сразу после введения соединения, подлежащего применению в настоящем изобретении. Кроме того, в приложенных Примерах также документально подтверждено то, что контагиозность подвергавшегося лечению нулевого пациента даже больше снижается в пределах 24 часов с момента введения данного соединения. Следовательно, в контексте настоящего изобретения предпочтительным является то, что нулевой пациент не имеет персонального контакта с другими лицами (т.е. контактными лицами) до 1 часа или до 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 или 32 часов после введения соединения, подлежащего применению в настоящем изобретении. Упомянутые здесь интервалы времени относятся к минимальным интервалам времени. Например, интервал времени «2 часа после введения» также включает более длительные периоды, такие как 2,5 часа после введения и так далее. В самом деле, данное изобретение охватывает то, что нулевой пациент не имеет персонального контакта с контактными лицами до одних или двух суток (или одного дня и одной или двух ночей) после введения соединения, подлежащего применению в настоящем изобретении. Например, нулевой пациент может оставаться в изоляции в больнице в течение одних суток (или в течение одного дня и одной или двух ночей), таким образом, что персональный контакт с другими лицами предупреждается на протяжении этого периода времени.

В соответствии с этим в одном аспекте настоящего изобретения скорость передачи вируса гриппа от нулевого пациента снижается в пределах от одного часа до 24 часов с 1-го введения данного соединения. Скорость передачи вируса гриппа от нулевого пациента также может снижаться в пределах 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 или 32 часов с 1-го введения данного соединения. Соответственно, данный промежуток времени может быть продлен. Таким образом, согласно настоящему изобретению скорость передачи вируса гриппа от нулевого пациента снижается в пределах от одного часа до 32 часов (например, в пределах 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 или 32 часов) с 1-го введения данного соединения.

Таким образом, соединение, подлежащее применению в настоящем изобретении, снижает скорость передачи вируса гриппа от подвергавшегося лечению нулевого пациента контактному лицу подвергавшегося лечению нулевого пациента. Скорость передачи вируса гриппа от подвергавшегося лечению нулевого пациента может быть снижена до 70% или менее, предпочтительно до 50% или менее, более предпочтительно до 30% или менее по сравнению со скоростью передачи вируса гриппа от контрольного пациента.

В данном документе «скорость передачи» (также именуемая «скоростью распространения») соответствует процентной доле инфицированных субъектов среди контактных лиц пациента, инфицированного гриппом (т.е. нулевого пациента или контрольного пациента соответственно) в пределах определенного периода времени. Таким образом, «скорость передачи» представляет собой число новых случаев (инфекции штаммом вируса гриппа, который происходит от нулевого пациента или от контрольного пациента соответстенно) в пределах определенного периода времени, поделенное на популяцию, подверженную риску. «Популяция, подверженная риску» предпочтительно представляет собой число лиц, которые имели персональный контакт с нулевым пациентом или с контрольным пациентом, соответственно, во время его/ее инфекции вирусом гриппа. Вирус гриппа обычно может передаваться за сутки до того, как возникают симптомы гриппа, на протяжении симптомов гриппа и до выздоровления от заболевания. Следовательно «популяцией, подверженной риску» может быть число лиц, которые имели персональный контакт с нулевым пациентом или с контрольным пациентом, соответственно, за сутки до возникновения симптомов гриппа и на протяжении симптомов гриппа. Предпочтительно «популяция, подверженная риску» не включает лиц, которые получали вакцинацию против гриппа. Как описано в данном документе выше и ниже, «скорость передачи» снижается после введения соединения, подлежащего применению в данном изобретении. Следовательно, влияние соединения на скорость передачи измеряется после введения данного соединения. В частности, для оценки влияния соединения на скорость передачи «популяция, подверженная риску» может быть определена как число людей (например, людей, которые не вакцинированы против гриппа), которые имели персональный контакт с нулевым пациентом на протяжении периода времени, начиная с введения соединения и заканчивая концом симптомов гриппа. Согласно этому «популяция, подверженная риску» контрольного пациента может быть определена как число людей (например, людей, которые не вакцинированы против гриппа), которые имели персональный контакт с контрольным пациентом на протяжении периода времени, начиная с введения отличного от данного соединения лекарственного средства против гриппа, или, если не вводится лекарственное средство против гриппа, начиная с соответствующего момента времени с учетом патогенеза заболевания гриппом и заканчивая окончанием симптомов гриппа и выздоровлением от заболевания.

Как описано выше, согласно настоящему изобретению данное соединение снижает скорость передачи вируса гриппа нулевого пациента (т.е. инфективность нулевого пациента) до 70% или менее, предпочтительно до 50% или менее, более предпочтительно до 30% или менее по сравнению со скоростью передачи вируса гриппа контрольного пациента, которого не лечили данным соединением (т.е. по сравнению с инфективностью контрольного пациента, которого не лечили данным соединением). При сезонном гриппе, включающем эпидемию гриппа, вирус гриппа передается от одного пациента приблизительно 1,35 субъектам за 5 суток. Таким образом, если нулевой пациент инфицируется штаммом гриппа сезонного гриппа (включая эпидемический штамм гриппа, но не пандемический штамм гриппа), тогда данное соединение снижает число субъектов, которым передается вирус, в среднем до приблизительно 0,945 субъектов (т.е. передача 70%) или меньше за 5 суток, предпочтительно в среднем до приблизительно 0,675 субъектов (т.е. передача 50%) или меньше за 5 суток, более предпочтительно в среднем до приблизительно 0,405 субъектов (т.е. передача 30%) или меньше за 5 суток. При пандемическом гриппе вирус гриппа передается от одного пациента приблизительно 2,9 субъектам за 6 суток. Таким образом, если нулевой пациент инфицируется штаммом гриппа пандемического гриппа, тогда данное соединение снижает число субъектов, которым передается вирус, в среднем до приблизительно 2,03 субъектов (т.е. передача 70%) или меньше за 6 суток, предпочтительно в среднем до приблизительно 1,45 субъектов (т.е. передача 50%) или меньше за 6 суток, более предпочтительно в среднем до приблизительно 0,87 субъектов (т.е. передача 30%) или меньше за 6 суток.

Большинству индивидов с инфекцией гриппом советуют оставаться дома до тех пор, пока они не были бестемпературными в течение по меньшей мере 24 часов, что подвергает других домашних риску инфекции (Centers for Disease Control and Prevention. The flu: what to do if you get sick. 9th March 2018). Как только один домашний инфицируется гриппом, риск передачи домашнему контакту может составлять вплоть до 38% с задержкой между началом у нулевого пациента и инфекцией домашнего контактного около 3 суток (Tsang, Trends Microbiol 2016; 24(2): 123-133). Как описывается выше, соединение, подлежащее применению в настоящем изобретении, снижало скорость передачи вируса гриппа от подвергавшегося лечению нулевого пациента до 70% или меньше, предпочтительно до 50% или меньше, более предпочтительно до 30% или меньше. Таким образом, лечение нулевого пациента указанным соединением снижает риск передачи вируса гриппа домашнему контактному до приблизительно 27% или меньше (т.е. 70%), предпочтительно до приблизительно 19% или меньше (т.е. 50%), более предпочтительно до приблизительно 11,4% или меньше (т.е. 30%). Это является значительным преимуществом в предупреждении эпидемии или пандемии гриппа.

В приложенных Примерах демонстрируется то, что соединение, подлежащее применению в настоящем изобретении, снижает нагрузку вируса, выделяемого в верхний респираторный тракт. Таким образом, согласно настоящему изобретению данное соединение снижает нагрузку вируса, выделяемого в верхний респираторный тракт нулевого пациента по сравнению с нагрузкой вируса, выделяемого в верхний респираторный тракт контрольного пациента, где данный контрольный пациент имеет инфекцию вирусом гриппа, и ему не вводилось данное соединение.

Контрольный пациент может представлять собой любого пациента, который имеет инфекцию вирусом гриппа, и которого не лечили соединением, подлежащим применению в настоящем изобретении. Таким образом, согласно настоящему изобретению контрольный пациент имеет инфекцию вирусом гриппа, и ему не вводили данное соединение. Однако контрольному пациенту может вводиться лекарственное средство против гриппа, за исключением соединения формулы (I) или (II), или его фармацевтически приемлемой соли. Например, контрольному пациенту может вводиться оселтамивир. Таким образом, в одном аспекте настоящего изобретения контрольному пациенту вводили лекарственное средство против гриппа, за исключением соединения формулы (I) или (II), или его фармацевтически приемлемой соли. Например, контрольному пациенту возможно вводили оселтамивир. В другом аспекте настоящего изобретения контрольному пациенту не вводили лекарственное средство против гриппа, например, не вводили оселтамивир. Оселтамивир может вводиться в дозе 75 мг дважды в сутки в течение 5 суток. Человеческая доза оселтамивира обычно известна в данной области. Например, для взрослых и подростков (13 лет и старше) 75 мг обычно дают дважды в сутки в течение 5 суток. Доза для педиатрических пациентов, которые находятся в возрасте от 2 недель до меньше, чем 1 года, обычно составляет 3 мг/кг в сутки в течение 5 суток. Контрольный пациент имеет штамм вируса гриппа, который идентичен штамму гриппа нулевого пациента, с которым сравнивают контрольного пациента. Например, если нулевой пациент имеет пандемический штамм вируса гриппа, тогда контрольный пациент, с которым сравнивают нулевого пациента, имеет тот же самый пандемический штамм вируса гриппа.

Специалист в данной области в состоянии легко распознать, произошла ли передача вируса гриппа от (подвергавшегося лечению) нулевого пациента или от контрольного пациента. Например, передача возможно произошла, когда по меньшей мере одно контактное лицо подвергавшегося лечению нулевого пациента или контрольного пациента получает инфекцию вирусом гриппа после наличия персонального контакта с подвергавшимся лечению нулевым пациентом или с контрольным пациентом соответственно. Контактным лицом подвергавшегося лечению нулевого пациента предпочтительно является человек, который:

(i) не имел инфекции вирусом гриппа в момент времени, когда данное соединение вводилось нулевому пациенту первый раз; и

(ii) имел персональный контакт с подвергавшимся лечению нулевым пациентом во время инфекции вирусом гриппа данного нулевого пациента.

В том, что касается (ii) непосредственно выше, предпочтительным является то, что контактное лицо имело персональный контакт с подвергавшимся лечению нулевым пациентом в пределах 10 суток с момента введения данного соединения нулевому пациенту. Таким образом, в том, что касается пункта (ii) непосредственно выше, предпочтительным является то, что контактное лицо имело персональный контакт с подвергавшимся лечению нулевым пациентом в пределах периода времени, начинающегося с введения соединения и заканчивающегося 5-10 сутками (например, 9 суток или 5 суток) после введения данного соединения.

Контактное лицо контрольного пациента предпочтительно представляет собой человека, который:

(i) не имел инфекции вирусом гриппа в момент времени, когда лекарственное средство против гриппа вводилось контрольному пациенту первый раз; или, если контрольному пациенту не вводилось лекарственное средство против гриппа, в соответствующий момент времени с учетом патогенеза заболевания гриппом; и

(ii) имел персональный контакт с контрольным пациентом во время инфекции вирусом гриппа данного контрольного пациента.

В том, что касается пункта (ii) непосредственно выше, предпочтительным является то, что контактное лицо имело персональный контакт с контрольным пациентом в пределах 10 суток с момента введения лекарственного средства против гриппа контрольному пациенту, или, если не вводилось лекарственное средство против гриппа, в пределах соответствующего периода времени с учетом патогенеза заболевания гриппом. Таким образом, в том, что касается пункта (ii) непосредственно выше, предпочтительным является то, что контактное лицо имело персональный контакт с контрольным пациентом в пределах периода времени, начинающегося с введения лекарственного средства против гриппа контрольному пациенту; или, если не вводилось лекарственное средство против гриппа, начинающегося с соответствующего момента времени с учетом патогенеза заболевания гриппом и заканчивающегося 5-10 сутками (например, 9 суток или 5 суток) после введения лекарственного средства против гриппа; или, если не вводилось лекарственное средство против гриппа, заканчивающегося в соответствующий момент времени с учетом патогенеза заболевания гриппом.

Естественно, контактному лицу не обязательно иметь персональный контакт с нулевым пациентом или контрольным пациентом, соответственно, в каждые сутки в пределах 10 суток, упомянутых выше. Скорее контактное лицо может, например, иметь персональный контакт с нулевым пациентом или контрольным пациентом, соответственно, только в одни сутки в пределах данных 10 суток. Например, контактное лицо может иметь персональный контакт с нулевым пациентом или с контрольным пациентом (например, из-за совместного ведения хозяйства) примерно в 7 из 9 суток.

В данном документе, при подсчете суток после введения данного соединения нулевому пациенту или другого лекарственного средства против гриппа контрольному пациенту, сутки введения считаются «сутками 0». Таким образом, сутки 1 (т.е. одни сутки после введения данного соединения или другого лекарственного средства против гриппа соответственно) представляют собой сутки после суток введения и так далее. Соответственно, 10 суток после введения данного соединения или другого лекарственного средства против гриппа относятся к суткам, которые начинаются приблизительно через 240 часов после введения данного соединения или другого лекарственного средства против гриппа соответственно.

Как упомянуто выше, согласно настоящему изобретению контактное лицо подвергавшегося лечению нулевого пациента или контрольного пациента представляет собой человека, который:

(i) по отношению к нулевому пациенту: не имел инфекции вирусом гриппа в момент времени, когда данное соединение первый раз вводилось нулевому пациенту; или

по отношению к контрольному пациенту: не имел инфекции вирусом гриппа в момент времени, когда лекарственное средство против гриппа первый раз вводилось контрольному пациенту; или, если контрольному пациенту не вводилось лекарственное средство против гриппа, в соответствующий момент времени с учетом патогенеза заболевания гриппом; и

(ii) по отношению к нулевому пациенту: имел персональный контакт с подвергавшимся лечению нулевым пациентом во время инфекции вирусом гриппа данного нулевого пациента; или

по отношению к контрольному пациенту: имел персональный контакт с контрольным пациентом во время инфекции вирусом гриппа данного контрольного пациента.

Согласно настоящему изобретению отсутствие инфекции вирусом гриппа предпочтительно означает ПЦР-негативность в отношении вируса гриппа (например, в носоглоточном мазке). Таким образом, предпочтительно, что в момент времени, как определено в (i) выше, контактное лицо было ПЦР-негативным в отношении гриппа.

Выявление и количественное измерение вируса гриппа посредством ПЦР является общеизвестным в данной области. Например, можно использовать ПЦР-амплификацию, сопряженную с обратной транскрипцией (ПЦР-ОТ), в реальном времени в качестве способа определения присутствия или отсутствия, или для количественного измерения РНК гриппа. Выделение и очистка РНК вируса гриппа представляет собой устоявшуюся методику, и она может проводиться, например, с использованием станции выделения MagNA Pure LC 1.0 или 2.0 (Roche Applied Science, № продукта 05197686001). Для осуществления данного анализа нуклеиновые кислоты выделяются из аликвот образца мазка с использованием станции выделения MagNA Pure LC и набора для выделения нуклеиновых кислот MagNA Pure LC согласно инструкциям изготовителя (Roche Applied Science). Реакции обратной транскрипции и амплификации можно ставить с использованием мастермикса для вирусов Taqman Fast. Во время клинического анализа можно использовать 4-точечную (низкое, среднее и высокое содержание) стандартную кривую вируса гриппа А и В с известным числом вирусных частиц/мл в качестве контроля, и она может сопровождать каждый запуск. Для отслеживания всего процесса от выделения до выявления в реальном времени в каждый изолят можно добавлять универсальный внутренний контроль - вирус чумы тюленей (PDV). Кроме того, для отслеживания загрязнения при каждом выделении можно включать контроль без амплификации (NAC) для каждой ПЦР-смеси, которая делается. Позитивные контроли должны давать положительный сигнал, который лежит между определенными пределами реагирования. Если значение позитивного контроля лежит вне предела реагирования, все образцы, анализируемые с использованием той же самой ПЦР-смеси, нужно переанализировать. Результатом анализа ПЦР-ОТ гриппа является то, что известно как пороговый цикл или значение Ct, и значение Ct записывается для каждого анализа. Значения Ct преобразуются в количественные значения числа вирусных частиц/мл со стандартными кривыми, прогоняемыми сопутствующе с образцами.

Для позитивных в отношении гриппа А субъектов также можно проводить ПЦР-анализ на подтип - грипп А. Более конкретно, для позитивных в отношении гриппа А субъектов субтипирование можно проводить непосредственно из образца мазка субъекта с использованием анализа ПЦР-ОТ в реальном времени. РНК можно выделять из клинических изолятов, как описано выше, с использованием набора для общих нуклеиновых кислот Roche MagNA Pure и можно осуществлять амплификацию с использованием одноэтапной ПЦР-ОТ с праймерами, специфичными в отношении подтипа А гриппа. Другие способы выявления конкретных подтипов вируса гриппа, включающие подходящие последовательности праймеров, являются общеизвестными в данной области и описываются, например, в "WHO information of the molecular detection of influenza viruses" от июля 2017 г.

Специалист может легко определять момент времени в пределах инфекции вирусом гриппа, который соответствует данному состоянию заболевания гриппом (т.е. который соответствует данному состоянию в пределах патогенеза заболевания гриппом). Более конкретно, в данной области общеизвестно то, что патогенез заболевания гриппом можно отслеживать. Например, патогенез заболевания гриппом можно отслеживать посредством отслеживания клинических симптомов и/или показателями вирусологии. Клинические симптомы можно отслеживать посредством следующего:

(i) определение балла для кашля и назальных симптомов (пункты 14 и 15 канадской шкалы острого респираторного заболевания и гриппа (CARIFS);

(ii) опрашивание пациента или осуществляющего на ним/ней уход, был ли (и когда) пациент способен возвращаться в амбулаторное учреждение/школу/на работу или возвращаться к его/ее нормальной ежедневной активности таким же образом, как осуществлялось до развития инфекции вирусом гриппа; и/или

(iii) если пациент уже вернулся к бестемпературному состоянию (и предпочтительно оставался в таком состоянии в течение по меньшей мере 21,5 часов), определение момента времени, когда пациент впервые возвращается к бестемпературному состоянию (т.е. тимпанальная температура, меньшая или равная 37,2°С).

CARIFS является общеизвестной в данной области и показана на Фиг. 18.

Можно отслеживать вирусологические измерения, например, посредством измерения вирусного титра или вирусовыделительства.

Согласно настоящему изобретению персональный контакт между контактным лицом и нулевым пациентом или контрольным пациентом, соответственно, представляет собой персональный контакт, который обеспечивает передачу вируса гриппа. Например, данный персональный контакт может представлять собой контакт, который обеспечивает воздушно-капельную передачу и/или прямую контактную передачу, предпочтительно только воздушно-капельную передачу. Контактная передача относится к прямому переносу вируса от инфицированного человека к восприимчивому индивиду, например, через загрязненные руки (прямая контактная передача), или к непрямому переносу вируса через промежуточные объекты (фомиты, непрямая контактная передача). Передача вируса через воздух (т.е. воздушно-капельная передача) может происходить через капельки или аэрозоли. Общепризнанный размер отсечения между большими капельками и мелкими аэрозолями составляет 5 мкм (Kutter, Current opinion in virology, 28 (2018): 142-151). Капельки, генерируемые во время кашля, чихания или говорения, не остаются суспендированными в воздухе. Они обычно остаются в воздухе меньше 17 минут и перемещаются на расстояние меньше, чем 1 м перед осаждением на слизистой близких контактов (т.е. людей, которые имеют личный контакт с инфицированным пациентом) или на окружающих поверхностях. Аэрозоли имеют низкую скорость осаждения, таким образом, они остаются суспендированными в воздухе дольше и могут перемещаться на длительные расстояния, которые больше, чем 1 м (Kutter, Current opinion in virology, 28 (2018): 142-151). В исследованиях для анализа передаваемости вируса гриппа РНК вируса гриппа выявляли в воздухе на расстоянии вплоть до 3,7 м от пациентов, причем большая часть вирусной РНК содержалась в аэрозолях (меньше 5 мкм) (Kutter, Current opinion in virology, 28 (2018): 142-151).

Таким образом, согласно настоящему изобретению персональный контакт, который обеспечивает прямую контактную передачу, представляет собой телесный контакт между пациентом, инфицированным гриппом (т.е. нулевым пациентом или контрольным пациентом соответственно), и контактным лицом, например, пожимание руки и т.д. Продемонстрировали то, что вирусы гриппа А выживают вплоть до 3 суток при их инокуляции на банкнотах (Thomas, Appl. Environ. Microbiol. 74.10 (2008): 3002-3007). Тот же самый инокулят в присутствии респираторной слизи демонстрировал потрясающее увеличение срока выживания (вплоть до 17 суток, Thomas, Appl. Environ. Microbiol. 74.10 (2008): 3002-3007). При использовании носоглоточных секретов инфицированных естественным путем детей вирус гриппа выживал в течение по меньшей мере 48 ч в одной трети случаев (Thomas, Appl. Environ. Microbiol. 74.10 (2008): 3002-3007). Соответственно, в контексте настоящего изобретения персональный контакт между пациентом, инфицированным гриппом (т.е. нулевым пациентом или контрольным пациентом), может обеспечивать непрямую контактную передачу. Указанный персональный контакт, который обеспечивает непрямую контактную передачу, может быть телесным контактом контактного лица с фомитом после того, как пациент, инфицированный гриппом (т.е. нулевой пациент или контрольный пациент) имел персональный контакт с фомитом. Например, пациент, инфицированный гриппом, возможно прикасался к фомиту его/ее руками или возможно дышал на фомит. Промежуток времени между персональным контактом пациента, инфицированного гриппом, и фомита, и персональным контактом контактного лица и фомита может составлять 3 суток или менее, предпочтительно 48 часов или менее.

Респираторные вирусы, подобные вирусу гриппа, реплицируются в респираторном тракте, откуда они затем выделяются и передаются через респираторные секреты посредством воздушно-капельной передачи. В настоящем изобретении персональный контакт, который обеспечивает воздушно-капельную передачу, представляет собой расстояние между пациентом, инфицированным гриппом (т.е. нулевым пациентом или контрольным пациентом соответственно), и контактным лицом, которое составляет вплоть до 3,7 метра. Грипп, главным образом, передается посредством передачи с респираторными капельками. Следовательно, предпочтительным является то, что во время персонального контакта контактного лица и нулевого пациента или контрольного пациента, соответственно, данные лица (т.е. контактное лицо и нулевой пациент или контрольный пациент, соответственно) имеют расстояние вплоть до 1 метра и, более предпочтительно, меньше, чем 1 метр.

С использованием улучшенного оборудования передача вируса гриппа может выявляться немедленно после передачи. Обычно передача выявляется через одни сутки после того, как случилась передача. В одном аспекте настоящего изобретения передача от подвергавшегося лечению нулевого пациента произошла, когда вирус гриппа может быть выявлен у по меньшей мере одного контактного лица подвергавшегося лечению нулевого пациента. В предпочтительном аспекте данного изобретения передача от подвергавшегося лечению нулевого пациента произошла, если вирус гриппа может быть выявлен у по меньшей мере одного контактного лица подвергавшегося лечению нулевого пациента в пределах 15 суток с момента введения соединения. В одном аспекте данного изобретения передача от подвергавшегося лечению нулевого пациента произошла, если вирус гриппа может быть выявлен у по меньшей мере одного контактного лица подвергавшегося лечению нулевого пациента в пределах 10 суток с момента введения соединения нулевому пациенту. Если произошла передача, вирус гриппа может быть выявлен у контактного лица даже в пределах более длительного периода времени, например, в пределах 15 суток с момента введения соединения нулевому пациенту. В частности, ожидается даже более длительный ход заболевания, например, вплоть до трех недель или дольше, если данный вирус мутирует.

В одном аспекте настоящего изобретения передача от контрольного пациента произошла, если вирус гриппа может быть выявлен у по меньшей мере одного контактного лица данного контрольного пациента. В предпочтительном аспекте данного изобретения передача от контрольного пациента произошла, если вирус гриппа может быть выявлен у по меньшей мере одного контактного лица контрольного пациента в пределах 15 суток с момента введения другого лекарственного средства против гриппа контрольному пациенту; или, если контрольному пациенту не вводили лекарственное средство против гриппа, в пределах соответствующего периода времени с учетом патогенеза заболевания гриппом. В одном аспекте данного изобретения передача от контрольного пациента произошла, если вирус гриппа может быть выявлен у по меньшей мере одного контактного лица контрольного пациента в пределах 10 суток с момента введения другого лекарственного средства против гриппа; или, если контрольному пациенту не вводили лекарственное средство против гриппа, в пределах соответствующего периода времени с учетом патогенеза заболевания гриппом. Как упомянуто выше, если случилась передача, вирус гриппа может быть выявлен у контактного лица даже в пределах более длительного периода времени, например, в пределах 15 суток с момента введения другого лекарственного средства против гриппа контрольному пациенту; или, если контрольному пациенту не вводили лекарственное средство против гриппа, в пределах соответствующего периода времени с учетом патогенеза заболевания гриппом. Как также упоминалось, в частности, ожидается даже более длительный ход заболевания, например, вплоть до трех недель или дольше, если данный вирус мутирует.

В контексте настоящего изобретения скорость передачи можно измерять посредством осуществления анализа по меньшей мере одного контактного лица подвергавшегося лечению нулевого пациента или контрольного пациента, соответственно, на инфекцию вирусом гриппа. Скорость передачи можно измерять посредством осуществления анализа по меньшей мере одного контактного лица подвергавшегося лечению нулевого пациента или контрольного пациента, соответственно, на инфекцию вирусом гриппа в пределах 10 суток с момента введения данного соединения подвергавшемуся лечению нулевому пациенту, или в пределах 10 суток с момента введения другого лекарственного средства против гриппа контрольному пациенту, или, если контрольному пациенту не вводилось лекарственное средство против гриппа, в пределах 10 суток с соответствующего момента времени с учетом патогенеза заболевания гриппом.

Грипп является тяжелым заболеванием, и на выздоровление может уходить от нескольких суток до недель. Следовательно, согласно настоящему изобретению скорость передачи также можно измерять посредством осуществления анализа по меньшей мере одного (например, по меньшей мере 2) контактного лица подвергавшегося лечению нулевого пациента или контрольного пациента, соответственно, на инфекцию вирусом гриппа в пределах 20 суток с момента введения данного соединения подвергавшемуся лечению нулевому пациенту или в пределах 20 суток с момента введения другого лекарственного средства против гриппа контрольному пациенту, или, если контрольному пациенту не вводилось лекарственное средство против гриппа, в пределах 20 суток с соответствующего момента времени с учетом патогенеза заболевания гриппом. Например, скорость передачи можно измерять посредством осуществления анализа нескольких контактных лиц (например, по меньшей мере 2) нулевого пациента и контрольного пациента, соответственно, на инфекцию вирусом гриппа. Например, контактных лиц можно анализировать на инфекцию вирусом гриппа в разные моменты времени, например, примерно 3 суток, 5 суток, 10 суток, 15 суток и/или 20 суток после введения данного соединения нулевому пациенту или после введения другого лекарственного средства против гриппа контрольному пациенту, или, если контрольному пациенту не вводилось лекарственное средство против гриппа, в соответствующий(щие) момент(ты) времени с учетом патогенеза заболевания гриппом.

В одном аспекте настоящего изобретения инфекция вирусом гриппа присутствует, если может быть выявлен вирус гриппа (например, у контактного лица нулевого пациента или контрольного пациента соответственно). Вирус гриппа может быть выявлен посредством ПЦР. Кроме того или альтернативно, вирус гриппа может быть выявлен посредством применения набора для анализа гриппа. Например, для выявления вируса гриппа можно использовать быстрые диагностические анализы на грипп (RIDT). RIDT представляют собой иммуноанализы, которые могут идентифицировать присутствие нуклеопротеиновых антигенов гриппа А или В в респираторных образцах, и они демонстрируют результат качественно (положительный по сравнению с отрицательным) (Ali Т, Clin Infect Dis. 2004 Mar 1; 38(5):760-2). Анализы RIDT представляют собой анализы на основе ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), которые являются менее точными, чем ПЦР, но имеют преимущество в том, что они дешевле и быстрее, что является значительным преимуществом, в частности, в эпидемической или пандемической ситуации.

Вирус гриппа может быть дополнительно выявлен посредством применения системы полимеразной цепной реакции (ПЦР) Roche cobas^® Liat^® point of care (РОС) (Chen, Eur J Microbiol Immunol (Bp). 2015; 5(4):236-245). Система cobas^® Liat^® обеспечивает быструю и точную диагностику вируса гриппа А или В образцов носоглоточных смывов. Данная система включает анализатор cobas^® Liat^® и анализ на грипп А/В cobas^®. Выявление вируса гриппа также может осуществляться с использованием молекулярного анализа на основе ПЦР (анализ Prodesse ProFlu+, Chen, Eur J Microbiol Immunol (Bp). 2015; 5(4):236-245) или системы быстрого ПЦР Alere i Influenza A & В (Merckx, Ann Intern Med. 2017; 167(6):394-409).

Выявление вируса гриппа может дополнительно осуществляться посредством осуществления анализа того, присутствуют ли инфекционные вирусные частицы, например, посредством измерения титра вируса и/или вирусовыделительства. Титр вируса (например, в слизистой носа) может быть определен посредством бляшечного анализа (например, как осуществляется в приложенных Примерах, и как описано ниже).

Определение инфекционного титра вируса обычно известно в данной области. Например, инфекционный титр вируса можно измерять посредством количественного анализа культуры, т.е. «бляшечного анализа». В частности, инфекционный титр вирусов можно определять с использованием количественного анализа культуры, который выражает количество присутствующего вируса в виде медианной инфицирующей дозы культуры ткани (TCID₅₀) на миллилитр. Для того, чтобы определять инфекционный титр данного образца, клинические образцы можно серийно разводить и инкубировать на клетках MDCK. В первичном показателе для данного анализа используется способность вирусов гриппа к связыванию с сиалированными гликанами на эритроцитах, вызывающему агглютинацию. Измерение агглютинации, опосредованной добавлением эритроцитов к серии разведения вируса гриппа, можно затем использовать для количественного измерения титра вируса. Для изолятов циркулирующего вируса, которые потеряли способность агглютинировать эритроциты (например, текущие изоляты соответствущего сезона), можно применять показатель нуклеопротеина (NP) вируса гриппа на основе ELISA. Способ анализа ТСЮ₅₀ можно осуществлять в качестве унифицированного протокола, который обеспечивает осуществление NP-ELISA с использованием того же самого планшета для анализа, если данный вирус представляет собой неагглютинирующий штамм. Для клинических исследований после анализа с использованием показателя агглютинации эритроцитов может следователь показатель МР-ЕЫЭАдля подтипов вируса гриппа (например, Н3) (и нетипируемых вирусов). Негативные контроли должны быть негативными, а позитивные контроли должны быть позитивными для того, чтобы планшет был правильным. Для расчета титра вируса (TCID₅₀) можно использовать способ Карбера (Karber, G., 1931, Beitrag zur kollektiven Behandlung Pharmakologischer Reihenversuche, Archiv fur Experimented Pathologie und Pharmakologie, 162, 480-487).

Например, для того, чтобы определять инфекционный титр вируса данный вирус можно сначала выращивать из образца назального смыва и затем можно измерять инфекционный титр вируса, как описано далее:

Выращивание вируса из образца назального смыва можно осуществлять следующим образом. Клетки MDCK можно поддерживать в среде для культуры клеток, пока они не используются. За 1 сутки до анализа клетки MDCK можно высевать в 96-луночные плоскодонные планшеты в количестве 3,5×10⁴ клеток на лунку в среде для культуры клеток. Для отделения клеток от культуральной колбы может потребоваться трипсин-EDTA. 24 ч инкубации при 37°С, 5% CO₂ приводит к монослоям клеток с конфлюентностью 80-100%. 20 мкл оттаявшего образца назального смыва в тройной повторности можно добавлять в 180 мкл инфекционной среды для осуществления 10-кратного серийного разведения. Монослои MDCK можно затем дважды промывать PBS, а 100 мкл разбавленных образцов добавлять к клеткам для 2 ч инкубации при 37°С, 5% CO₂. Последний ряд данного планшета можно оставлять без образца для того, чтобы он действовал в качестве негативного контроля. После этого инокулят вируса можно удалять и заменять 200 мкл свежей инфекционной среды. Планшеты затем можно инкубировать при 37°С, 5% CO₂ в течение 96 часов.

Измерение титров вируса в назальном смыве можно проводить следующим образом: после 96-часовой инкубации титры вируса образцов назального смыва, культивируемых в планшетах с MDCK, можно считывать посредством анализа гемагглютинации. Двадцать пять мкл супернатанта MDCK из каждой лунки можно переносить в соответствующие лунки нового 96-луночного планшета с U-образным дном и смешивать с 25 мкл 1% (об./об.) эритроцитов индейки посредством легкого постукивания. Планшеты можно инкубировать при комнатной температуре в течение 30 мин, и можно записывать картину агглютинации. Титры вируса можно рассчитывать с использованием способа, описанного Reed и Muench (Reed, L.J. and H. Muench, American Journal of Epidemiology, 1938. 27(3): p. 493-497), и можно выражать в виде log₁₀ TCID₅₀/мл.

Также присутствие по меньшей мере одного симптома гриппа указывает на то, что присутствует инфекция вирусом гриппа. Следовательно, согласно настоящему изобретению инфекция вирусом гриппа присутствует, если:

(i) вирус гриппа может быть выявлен; и/или

(ii) присутствует по меньшей мере один симптом вируса гриппа.

В одном аспекте настоящего изобретения инфекция вирусом гриппа присутствует, если применимы обе характеристики, т.е. может быть выявлен вирус гриппа, и присутствует по меньшей мере один симптом инфекции вирусом гриппа. Таким образом, скорость передачи (т.е. инфективность) подвергавшегося лечению нулевого пациента или контрольного пациента можно измерять посредством анализа того, может ли быть выявлен вирус гриппа и, возможно, дополнительного анализа того, присутствуют ли симптомы гриппа у лица(лиц), которое(рые) имело(ли) персональный контакт с подвергавшимся лечению нулевым пациентом или контрольным пациентом соответственно. Например, можно анализировать, присутствует ли по меньшей мере один симптом инфекции вирусом гриппа. Указанный по меньшей мере один симптом инфекции вирусом гриппа может представлять собой внезапное начало лихорадки, озноба, головной боли, боли в мышцах и/или суставах, кашля, слабости, боли в горле и/или заложенности носа. Также можно анализировать, достигает ли температура тела 38°С-40°С в пределах 24 часов от начала симптомов гриппа (Wright, Fields Virology. 5th ed. (2). Wolters Kluwer Health/Lippincott Williams & Wilkins; 2007. P. 1691-1740; Monto, Arch Intern Med. 2000; 160:3243-3247). На основе данных симптомов инфекция вирусом гриппа имеет тенденцию к тому, чтобы быть тяжелым заболеванием, и она может быть отличена от обычной простуды.

В данном документе начало симптомов гриппа может быть определено как одно из двух:

(i) момент времени первого увеличения температуры тела (увеличение на по меньшей мере 1°С от нормальной температуры тела); или

(ii) момент времени, когда пациент испытывает по меньшей мере один общий или респираторный симптом.

Предпочтительно момент времени начала симптомов гриппа подтверждается проверкой того, что в пределах 24 часов с момента времени (i) и (ii), приведенного выше, температура тела достигает от 38°С до 40°С.

Кроме того или альтернативно, диагноз грипп может быть подтвержден всем из следующего:

(i) Лихорадка (38°С или больше) (подмышечная) при осмотрах до дозы или больше, чем через 4 часа после дозирования жаропонижающих средств, если их принимали.

(ii) По меньшей мере один из следующих общих системных симптомов, ассоциированных с гриппом, с умеренной или большей тяжестью:

(ii)-1 головная боль;

(ii)-2 лихорадочность или озноб;

(ii)-3 Боль в мышцах или суставах;

(ii)-4 Слабость.

(iii) По меньшей мере один из следующих респираторных симптомов, ассоциированных с гриппом, с умеренной или большей тяжестью:

(iii)-1 Кашель;

(iii)-2 Боль в горле;

(iii)-3 Заложенность носа;

(iii)-4 Инфекция гриппом А или В, подтвержденная анализом ПЦР РОС.

Передача вируса гриппа от нулевого пациента или от контрольного пациента контактному лицу может быть проверена разными способами. Например, можно предположить, что передача произошла, если вирус гриппа выявляется у контактного лица (например, посредством ПЦР), и нулевой пациент или контрольный пациент был первым (или даже единственным) лицом, инфицированным гриппом, с которым контактное лицо имело персональный контакт непосредственно перед идентификацией вируса гриппа у контактного лица, например, в пределах последних четырех недель (предпочтительно в пределах последних двух недель или, более предпочтительно в пределах последних 7 суток) непосредственно перед идентификацией вируса гриппа у контактного лица. В одном аспекте настоящего изобретения передача от подвергавшегося лечению нулевого пациента произошла, если штамм вируса гриппа может быть выявлен у по меньшей мере одного контактного лица подвергавшегося лечению нулевого пациента, и когда указанный штамм вируса гриппа является идентичным штамму вируса гриппа подвергавшегося лечению нулевого пациента, и передача от контрольного пациента произошла, если штамм вируса гриппа может быть выявлен у по меньшей мере одного контактного лица контрольного пациента, и когда указанный штамм вируса гриппа является идентичным штамму вируса гриппа контрольного пациента. Таким образом, в одном аспекте настоящего изобретения передача от подвергавшегося лечению нулевого пациента произошла, если по меньшей мере одно контактное лицо подвергавшегося лечению нулевого пациента имеет инфекцию вирусом гриппа штаммом вируса гриппа, который является идентичным штамму вируса гриппа подвергавшегося лечению нулевого пациента, и передача от контрольного пациента произошла, когда по меньшей мере одно контактное лицо контрольного пациента имеет инфекцию вирусом гриппа штаммом вируса гриппа, который является идентичным штамму вируса гриппа контрольного пациента.

Например, если у контактного лица (например, у домашнего контакта) развивается грипп А или В, подтвержденный ПЦР, носоглоточный мазок контактного лица можно использовать для секвенирования вирусного генома для того, чтобы проанализировать, происходит ли (т.е. передается ли) вирус гриппа от нулевого пациента или контрольного пациента соответственно. Способы секвенирования вирусного генома являются общеизвестными в данной области и также описываются ниже. Специалист в состоянии легко определить то, происходит ли вирус гриппа от нулевого пациента или контрольного пациента соответственно. Например, специалист узнает то, что передача произошла, если вирусный геном вируса гриппа контактного лица является идентичным вирусному геному вируса гриппа нулевого пациента или контрольного пациента соответственно. Однако вирус гриппа также может мутировать во время или после передачи от нулевого пациента или контрольного пациента контактному пациенту. Следовательно, передача также произошла, если вирусный геном вируса гриппа контактного лица является идентичным вирусному геному вируса гриппа нулевого пациента или контрольного пациента, соответственно, кроме одного-нескольких отличий нуклеотидов (т.е. точечных мутаций).

Для того, чтобы определить случилась ли передача вируса гриппа нулевого пациента контактному лицу или контрольного пациента контактному лицу, можно выполнять получение филогенетического древа и измерение генетического расстояния. Более конкретно, для того, чтобы определять, случилась ли передача, можно использовать способы, как описано в Примере 4.

Например, для идентификации пар передачи можно проводить филогенетический анализ (полногеномное древо с бутстрепной поддержкой топлогии и кластеризации древа) и/или измерение генетического расстояния между парными популяциями (например, L1-Norm). На результат анализа влияют два фактора: во-первых, количество доступных данных по последовательности. Для максимизации этого может быть проведено полногеномное секвенирование следующего поколения (WGNGS) для увеличения глубины детализации и дискриминирующей способности (по сравнению с секвенированием по Сэнджеру и/или секвенированием одного гена). Во-вторых, может быть определено с высокой достоверностью разнообразие в отобранном сообществе/метапопуляции, как, например, оценка того, что вирусы в пределах домашних пар являются более сходными друг с другом по сравнению с внешней группой. Большее число последовательностей, полученных из сообщества, увеличивает разнообразие в данной группе и, таким образом, облегчает идентификацию фактических пар передачи.

Например, можно использовать 15 или больше нулевых пациентов (IP), предпочтительно по меньшей мере 30-40 нулевых пациентов (IP) для разработки распределения в сообществе попарных расстояний, отражающих разнообразие сообщества, таким образом, что можно вывести истинные события передачи (например, события домашней передачи) с данными последовательности, например, как описано в McCrone, John Т., et al. "Stochastic processes constrain the within and between host evolution of influenza virus." Elife 7 (2018): e35962. Можно использовать способы, как описано в McCrone (Elife 7 (2018): е35962), как, например, способ, который описывается там для секвенирования. В контексте настоящего изобретения данный анализ предпочтительно сосредоточен на анализе образцов вируса гриппа А.

И эпидемиологическую связь, и генетическое родство вирусов (например, в домашних хозяйствах) можно использовать для определения пар передачи и для исключения спутывания из-за фонового разнообразия в сообществе. Пару индивидов (например, в пределах домашнего хозяйства) можно рассматривать как эпидемиологически связанную пару передачи, если они имели персональный контакт, и оба являются позитивными в отношении того же самого подтипа вируса гриппа в пределах 7 суток друг от друга. Например, все индивиды, которые имели персональный контакт друг с другом (например, в домашнем хозяйстве) с началом симптома в пределах 7-суточного окна можно считать эпидемиологически связанными. Донор в каждой предположительной паре может быть определен как индивид с более ранним началом симптомов. Событие передачи можно игнорировать, если имелось много возможных доноров с теми же самыми сутками начала симптомов. Для донора и реципиентов может не допускаться наличие начала симптома в те же самые сутки, если оба индивида не были нулевыми пациентами (например, для анализируемого домашнего хозяйства).

Затем можно использовать данные последовательности для определения того, какие из эпидемиологически связанных пар представляют истинные события передачи, в отличие от совпадающих приобретенных сообществом инфекций. Генетическое расстояние между популяциями с гриппом из каждой предположительной пары передачи можно измерять посредством L1-norm, и данные расстояния можно сравнивать с расстояниями случайным образом назначенных пар сообществ в пределах каждого сезона. Индивиды могут рассматриваться как истинная пара передачи, только если они имеют генетическое расстояние меньше 5-го процентиля распределение в сообществе случайным образом назначенных пар.

Как упомянуто выше, вирус гриппа, главным образом, передается воздушно-капельной передачей, в частности, капельной инфекцией. Следовательно, в одном аспекте настоящего изобретения передача вируса гриппа представляет собой прямую контактную передачу и/или воздушно-капельную передачу, предпочтительно воздушно-капельную передачу. Более предпочтительно передача представляет собой капельную инфекцию.

В том виде, в котором оно предложено в данном документе, соединение, подлежащее применению в настоящем изобретении, имеет преимущественную характеристику в том, что оно значительно снижает передачу вируса гриппа. Таким образом, указанное соединение является особенно полезным для лечения конкретных пациентов, инфицированных гриппом, инфективность которых подлежит снижению. Например, особенно важно снизить инфективность пациентов, которые могут причинять значительный (например, социальный или экономический) ущерб из-за передачи их вируса гриппа. В одном аспекте настоящего изобретения подвергавшийся лечению нулевой пациент имеет персональный контакт с по меньшей мере одним лицом из группы риска по гриппу или с по меньшей мере одним лицом, которое важно для функционирования общества, после введения соединения нулевому пациенту и во время его/ее инфекции вирусом гриппа. По меньшей мере одно лицо группы риска по гриппу может представлять собой по меньшей мере одно лицо, имеющее повышенный риск получения инфекции вирусом гриппа или имеющее повышенный риск получения осложнения, связанного с гриппом. Указанное осложнение, связанное с гриппом, может представлять собой по меньшей мере одно осложнение, выбранное из группы, состоящей из госпитализации, синусита, среднего отита, бронхита и пневмонии. Указанный по меньшей мере один человек, имеющий повышенный риск получения осложнения, связанного с гриппом, может иметь повышенный риск смерти из-за инфекции вирусом гриппа. В одном аспекте настоящего изобретения указанный по меньшей мере один человек, имеющий повышенный риск получения осложнения, связанного с гриппом, представляет собой индивида:

(i) имеющего хроническое сердечно-сосудистое заболевание, хроническое легочное заболевание, хроническое метаболическое заболевание, хроническое почечное заболевание, кардиолегочное расстройство, и/или который имеет ослабленный иммунитет; и/или

(ii) который находится в возрасте по меньшей мере 65 лет или младше, чем 5 лет.

Кроме того или альтернативно, по меньшей мере один человек, имеющий повышенный риск получения осложнения, связанного с гриппом, может быть серьезно больным (например, госпитализированным) пациентом.

Как упомянуто выше, в одном аспекте настоящего изобретения подвергавшийся лечению нулевой пациент имеет персональный контакт с по меньшей мере одним человеком из группы риска по гриппу после введения соединения нулевому пациенту и во время его/ее инфекции вирусом гриппа, где указанный человек из группы риска по гриппу может представлять собой по меньшей мере одного человека, имеющего повышенный риск получения инфекции вирусом гриппа. В контексте настоящего изобретения указанный по меньшей мере один человек, имеющий повышенный риск получения инфекции вирусом гриппа, может представлять собой индивида, которому противопоказана вакцинация против гриппа. Указанный по меньшей мере один человек, имеющий повышенный риск получения инфекции вирусом гриппа, также может представлять собой человека, имеющего большую угрозу здоровью, маленького ребенка (например, ребенка, который младше 5 лет), пожилого человека (например, человека 65 лет или старше) или человека с ослабленным иммунитетом.

Как упомянуто выше, контактное лицо нулевого пациента может представлять собой по меньшей мере одного человека, который важен для функционирования общества. Такой человек, который важен для функционирования общества, может представлять собой человека, который важен для функционирования города или государства. Согласно настоящему изобретению указанный по меньшей мере один человек, который важен для функционирования общества, может работать в качестве важного поставщика услуг, включая человека, который принадлежит к персоналу пожарных, персоналу полиции, персоналу системы здравоохранения, персоналу аварийно-спасательной службы, армии или правительства.

Нахождение дома во время инфекции вирусом гриппа может быть вредным, если инфицированный пациент является важным поставщиком услуг. Это особенно применимо во время чрезвычайной ситуации. Следовательно сам/сама нулевой пациент может представлять собой человека, который важен для функционирования общества. Лечение такого нулевого пациента соединением, подлежащим применению в настоящем изобретении, будет снижать (или даже предупреждать) то, что вирус передается от нулевого пациента другим людям, таким образом, что нулевой пациент не обязательно будет должен оставаться дома во время его/ее инфекции вирусом гриппа. Например, данный нулевой пациент может работать в качестве важного поставщика услуг, например, может представлять собой человека, принадлежащего к персоналу пожарных, персоналу полиции, персоналу системы здравоохранения или к персоналу аварийно-спасательной службы.

Нулевой пациент может представлять собой человека в ситуации эпидемии гриппа или пандемии гриппа. Нулевой пациент также может представлять собой человека в ситуации биотеррористической угрозы или биотеррористической атаки, где вирус гриппа играет роль в биотеррористической угрозе или биотеррористической атаке соответственно. В самом деле, влияние пандемии гриппа, вероятно, значительно больше, на порядки, чем обычные сценарии биотерроризма. Следовательно, предупреждение или снижение передачи гриппа было бы важным преимуществом во время эпидемической, пандемической или биотеррористической ситуации. Как упомянуто выше, эксперты предполагают то, что следующая пандемия гриппа будет ассоциирована с большим числом погибших и высоким уровнем заболевания, требующего госпитализации, таким образом, производя значительное напряжение на ресурсы здравоохранения. Таким образом, нулевой пациент может принадлежать к персоналу системы здравоохранения, и лечение указанного нулевого пациента данным соединением может осуществляться во время эпидемии гриппа или во время пандемии гриппа. Как также упомянуто выше, в развивающихся странах, где ресурсы системы здравоохранения уже напряжены, и основное население часто ослаблено плохим состоянием здоровья и питания, влияние пандемии гриппа, вероятно, является наибольшим. Следовательно, нулевой пациент может принадлежать к населению развивающейся страны.

Естественно, снижение скорости передачи является особенно полезным (или даже необходимым), если нулевой пациент, инфицированный гриппом, имеет или будет иметь персональный контакт с большим числом людей. Предпочтительно данный нулевой пациент имеет персональный контакт с большим числом людей после введения соединения, подлежащего применению в настоящем изобретении. В одном аспекте настоящего изобретения подвергавшийся лечению нулевой пациент имеет персональный контакт со многими людьми, например, с более чем 10 людьми, после введения соединения (нулевому пациенту) и во время его/ее инфекции вирусом гриппа. Например, нулевой пациент может иметь персональный контакт со многими людьми в его/ее домашнем хозяйстве или на его/ее работе. В одном аспекте настоящего изобретения подвергавшийся лечению нулевой пациент посещает медицинское учреждение (такое как дом престарелых, комната для малышей с сиделкой или больница), образовательное учреждение (такое как школа или университет), публичное учреждение, транспортное средство, машину, самолет и/или магазин, и имеет персональный контакт с многими людьми, например, с более чем 10 людьми, после введения соединения нулевому пациенту и/или во время его/ее инфекции вирусом гриппа.

Предпочтительно скорость передачи вируса гриппа от подвергавшегося лечению нулевого пациента домашним контактам снижается. Соответственно, предпочтительным является то, что подвергавшийся лечению нулевой пациент имеет домашние контакты. Например, подвергавшийся лечению нулевой пациент может жить в одном домашнем хозяйстве с детьми (предпочтительно с детьми, которые не старше, чем 5 лет). Кроме того или альтернативно, подвергавшийся лечению нулевой пациент может иметь работу со множеством контактов с людьми. Предпочтительным является то, что по меньшей мере один человек из домашнего(них) контакта(тов) и/или контакта(тов) на работе подвергавшегося лечению нулевого пациента не является вакцинированным против гриппа.

Как упомянуто выше, подвергавшийся лечению нулевой пациент может иметь персональный контакт со многими людьми, например, с больше, чем 10 людьми (предпочтительно с больше, чем 30, более предпочтительно - больше, чем 50, даже более предпочтительно - больше, чем 100 людьми) после введения соединения и во время его/ее инфекции вирусом гриппа. В приложенных Примерах показано то, что скорость передачи снижается у подвергавшегося лечению субъекта непосредственно после введения соединения, подлежащего применению в настоящем изобретении. Согласно настоящему изобретению данное соединение может вводиться по меньшей мере за один час до указанного персонального контакта. В одном аспекте настоящего изобретения данное соединение вводится по меньшей мере за 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 или 32 часа до указанного персонального контакта. В данном отношении более длительные интервалы времени являются предпочтительными над более короткими. В контексте настоящего изобретения данное соединение может вводиться в пределах 48 часов с начала появления симптомов гриппа, предпочтительно пределах 24 часов с начала появления симптомов гриппа.

Настоящее изобретение не ограничивается какой-либо конкретной дозировкой соединения по настоящему изобретению. Эффективное количество соединения может быть выбрано и/или скорректировано лечащим врачом согласно его/ее опыту и применимому руководству. Однако данное соединение предпочтительно вводится один раз в виде однократной обработки. Данное соединение может вводиться пациенту в подходящей дозе. Данное соединение может вводиться в интервале дозы, варьирующем, в зависимости от массы тела, возраста, пола, состояния здоровья, диеты пациента, времени введения, способа введения, скорости экскреции и тяжести заболевания. Схема дозировки будет определяться лечащим врачом и клиническими факторами. Как хорошо известно в области медицины, дозировки для любого пациента зависят от многих факторов, включающих размер пациента, площадь поверхности тела, возраст, конкретное соединение, подлежащее введению, пол, время и путь введения, общее состояние здоровья и другие лекарственные средства, вводимые сопутствующе. Однако эффективное количество соединения, подлежащего применению в настоящем изобретении, предпочтительно составляет примерно 40 мг для пациентов легче 80 кг и примерно 80 мг для пациентов с массой 80 кг или больше. Дозирование балоксавира марбоксила у педиатрических пациентов может быть следующим. У пациента, который младше 1 года: (а) если пациент младше 4 недель, тогда эффективное количество может составлять примерно 1 мг/кг массы тела; (b) если пациент имеет возраст 4 недели или старше, но младше 3 месяцев, тогда эффективное количество может составлять примерно 1 мг/кг массы тела; (с) если пациент находится в возрасте 3 месяца или старше, но младше, чем 12 месяцев, тогда эффективное количество может составлять примерно 2 мг/кг массы тела. У пациента в возрасте 1 год или старше, но младше, чем 12 лет дозирование может быть основано на массе тела. В Японии были проведены два клинических испытания фазы III у педиатрических пациентов в возрасте от 6 месяцев до 12 лет (исследования 1618Т0822 и 1705Т0833). В первом исследовании 1618Т0822 одну таблетку балоксавира марбоксила вводили педиатрическим субъектам с гриппом в возрасте от 6 месяцев до меньше, чем 12 лет. Дозирование балоксавира марбоксила было следующим: 40 кг или больше: доза 40 мг, 20 кг - 40 мг: доза 20 мг, 10 кг - 20 мг: доза 10 мг, 5 кг - меньше 10 кг: 5 мг. Данная дозировка также может использоваться для педиатрических нулевых пациентов.

Данное изобретение также не ограничивается каким-либо конкретным путем введения соединения. Все возможные пути введения, которые лечащий врач считает полезными или необходимыми, находятся в пределах объема настоящего изобретения. Например, данное соединение может вводиться перорально, ректально, назально, местно, внутрикожно, в виде аэрозоля, вагинально или парентерально, как, например, внутримышечно, внутривенно, подкожно, внутриартериально или внутрисердечно. Предпочтительным является то, что данное соединение вводится перорально. Лекарственные формы для перорального введения включают покрытые и непокрытые таблетки, мягкие желатиновые капсулы, твердые желатиновые капсулы, пастилки, лепешки, растворы, эмульсии, суспензии, сиропы, эликсиры, порошки и гранулы для растворения, диспергируемые порошки и гранулы, медицинские жевательные резинки, жевательные таблетки и шипучие таблетки. Лекарственные формы для парентерального введения включают растворы, эмульсии, суспензии, дисперсии, порошки и гранулы для растворения. Лекарственные формы для ректального и вагинального введения включают суппозитории и овули. Лекарственные формы для назального введения могут вводиться посредством ингаляции и вдувания, например, дозирующим ингалятором. Лекарственные формы для местного введения включают кремы, гели, мази, бальзамы, пластыри и чрескожные системы доставки. Однако предпочтительным является то, чтобы соединение, подлежащее применению в настоящем изобретении, вводилось в виде таблетки, более предпочтительно - таблетки для перорального применения. Например, соединение, подлежащее применению в настоящем изобретении, может вводиться в виде 20 мг таблетки и/или 40 мг таблетки. Соединение, подлежащее применению в настоящем изобретении, также может вводиться в виде гранул. Гранулы являются особенно полезными, если соединение вводится людям, которые не способны проглатывать таблетки, например, детям или людям, имеющим назогастральный зонд. Таким образом, человек, имеющий массу тела меньше 80 кг, может получать две 20 мг таблетки или одну 40 мг таблетку в виде одной пероральной дозы. Пациент, имеющий массу тела 80 кг или больше, может получать четыре 20 мг таблетки или две 40 мг таблетки в виде одной пероральной дозы.

Нулевой пациент может представлять собой человеческого субъекта, имеющего инфекцию вирусом гриппа. Предпочтительным является то, что нулевой пациент находится в возрасте по меньшей мере 2 года. Более предпочтительным является то, что нулевой пациент находится в возрасте по меньшей мере 12 лет. Например, нулевой пациент может представлять собой человеческого пациента, который предпочтительно находится в возрасте от 12 лет или больше до 64 лет или меньше. Подвергавшийся лечению нулевой пациент предпочтительно является здоровым, кроме инфекции вирусом гриппа. Как упомянуто выше, предпочтительным является то, что подвергавшийся лечению нулевой пациент имеет по меньшей мере одно контактное лицо (например, домашний контакт), которое не является вакцинированным против гриппа. Даже более предпочтительно, подвергавшийся лечению нулевой пациент имеет по меньшей мере два контактных лица (например, домашних контакта), которые не являются вакцинированными против гриппа. Указанные контактные лица могут находиться в возрасте 2 года или больше.

Контрольный пациент представляет собой пациента, инфицированного гриппом, который является настолько сходным с нулевым пациентом, насколько это возможно, кроме того, что контрольного пациента не лечат соединением, подлежащим применению в настоящем изобретении. Таким образом, контрольный пациент имеет идентичный или по меньшей мере сходный (т.е. сравнимый) возраст и состояние здоровья, как и нулевой пациент, и данный контрольный пациент и данный нулевой пациент инфицированы тем же самым штаммом вируса гриппа.

Вирусы гриппа вызывают сезонные эпидемии и, в очень редких случаях, глобальные пандемии. Термин «мировая пандемия» (от греческого «пан», означающего «весь» и «демос», означающий «людей») описывает эпидемию, которая поражает все население. Соединение, подлежащее применению в настоящем изобретении, имеет преимущество в том, что оно снижает передачу вируса гриппа и, следовательно, может снижать риск того, что подвергавшийся лечению нулевой пациент приведет (или будет содействовать) развитию эпидемии гриппа или пандемии гриппа. Таким образом, в одном аспекте настоящего изобретения лечение (нулевого пациента) имеет тот эффект, что подвергавшийся лечению нулевой пациент имеет пониженный риск запуска эпидемии гриппа или пандемии гриппа по сравнению с контрольным пациентом. Таким образом, согласно настоящему изобретению подвергавшийся лечению нулевой пациент имеет пониженный риск запуска эпидемии гриппа или пандемии гриппа по сравнению с контрольным пациентом.

В данном документе «пандемия гриппа» представляет собой глобальную эпидемию, вызванную вирусом гриппа, к которому в человеческой популяции имеется малый или не имеется предсуществующего иммунитета. Пандемия определяется как эпидемия, происходящая во всем мире, или в очень обширной области, как, например, по всей стране. Пандемия часто пересекает международные границы и обычно поражает большое число людей. Истинная пандемия гриппа случается, когда происходит почти одновременная передача, например, во всем мире. Одновременная передача гриппа во всем мире является достаточной для того, чтобы определять пандемию гриппа, и она согласуется с классическим определением «эпидемии, случающейся во всем мире». Например, пандемия может быть вызвана вновь развившимся вирусом гриппа, что является результатом изменений в существующем вирусе гриппа. Такие изменения более подробно обсуждаются ниже. Пандемия может быть относительно умеренной или может вызывать тяжелое заболевание или смерть. Тяжелое заболевание может случаться в определенных группах риска, которые могут соответствовать группам, подверженным риску тяжелого заболевания из-за сезонного гриппа. Однако здоровые люди также вероятно испытают более серьезное заболевание, чем заболевание, вызванное сезонным гриппом.

«Эпидемия гриппа» представляет собой внезапное увеличение числа случаев инфекции вирусом гриппа выше того, что обычно ожидается. «Эпидемия гриппа» представляет собой широко распространенное появление гриппа в обществе в конкретное время. Эпидемия представляет собой событие, при котором заболевание активно распространяется. В отличие от этого, термин «пандемия» относится к географическому распространению и используется для описания заболевания, которое поражает целую страну или весь мир.

Имеется три типа вирусов гриппа: А, В и С. Типы А и В вызывают широко распространенные вспышки заболевания гриппом почти каждый год. Грипп С ассоциирован со спорадической, часто асимптоматической инфекцией с малой смертностью или без смертности и, следовательно, не является угрозой для здоровья общества. Пандемический грипп случается только с вирусами гриппа А. Однако вирусы гриппа В могут вызывать эпидемию гриппа. В самом деле, грипп В является частью сезонной эпидемии гриппа. Таким образом, согласно настоящему изобретению вирус гриппа может представлять собой вирус гриппа А или вирус гриппа В, предпочтительно вирус гриппа А. Предпочтительным является то, что вирус гриппа представляет собой эпидемический штамм вируса гриппа или пандемический штамм вируса гриппа.

Пандемия и эпидемия гриппа у людей возникают в результате изменений поверхностных гликопротеинов, что известно как «антигенный сдвиг» и «антигенный дрейф».

В частности, один способ, которым изменяются вирусы гриппа, называется «антигенным дрейфом». «Антигенным дрейфом» являются маленькие изменения генов вирусов гриппа, которые непрерывно происходят со временем, по мере того, как вирус реплицируется. Данные маленькие генетические изменения обычно производят вирусы, которые являются довольно близкородственными друг другу, что может быть проиллюстрировано по их расположению близко друг к другу на филогенетическом древе. Вирусы, которые являются близкородственными друг другу, обычно имеют те же самые антигенные свойства, и иммунная система, подвергнутая воздействию аналогичного вируса, обычно будет распознавать его и отвечать (это иногда называется перекрестной защитой). Но данные маленькие генетические изменения могут накапливаться со временем и приводить к вирусам, которые являются антигенно различными (т.е. более удаленными на филогенетическом древе). Когда это происходит, иммунная система организма может не распознавать данные вирусы, что может приводить к эпидемии гриппа.

Другой тип изменения вируса гриппа называется «антигенным сдвигом». Пандемический грипп является результатом антигенного сдвига, и он происходит только с вирусом гриппа А. Антигеный сдвиг представляет собой резкое большое изменение вируса гриппа А, приводящее к новому гемагглютининовому (НА) и/или новому НА и нейраминидазному (NA) белкам у вируса гриппа. Таким образом, антигенный сдвиг приводит к новому подтипу гриппа А или вирусу с гемагглютинином (НА) или комбинацией гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA), которая появилась из популяции животных, которая является слишком отличной от того же подтипа у человека, что большинство людей не имеют иммунитета к данному новому вирусу. Такой «сдвиг» произошел весной 2009 г., когда возник вирус H1N1 с новой комбинацией генов с инфицированием людей и быстрым распространением, вызывая пандемию. Когда происходит сдвиг, большинство людей имеют малую или не имеют защиты против данного нового вируса. Таким образом, антигенный сдвиг включает резкое изменение антигенов НА и возможно NA, которые полностью отличаются от антигенов, циркулирующих у людей в течение многих лет до этого. Антигенный сдвиг приводит к полностью новому вирусу, который серологически отличается от более ранних вирусов и не мог возникнуть от них посредством мутации. Пандемия вероятна, когда большие срезы популяции по всему миру не имеют иммунитета к новому вирусу (т.е. не имеют или имеют мало антител к НА данного нового вируса), и он легко передается от человека к человеку, вызывая серьезное заболевание. Пандемия считается неизбежной, когда новый вирус быстро распространяется за пределы общества, в котором он был впервые идентифицирован. В то время как вирусы гриппа все время изменяются посредством антигенного дрейфа, антигенный сдвиг случается только время от времени. Вирусы типа А подвергаются обоим видам изменений; вирусы типа В изменяются только посредством более постепенного процесса антигенного дрейфа.

Как упомянуто выше, пандемия гриппа обычно представляет собой результат антигенного «сдвига», а эпидемия гриппа обычно представляет собой результат антигенного «дрейфа». Следовательно, в контексте настоящего изобретения вирус гриппа является антигенно отличным по сравнению с родительским штаммом вируса гриппа в результате антигенного дрейфа и/или антигенного сдвига, предпочтиельно антигенного сдвига или обоих.

Специалист в данной области может легко определить, является ли данный вирус гриппа результатом антигенного дрейфа или антигенного сдвига. Как описано выше, антигенный сдвиг является резким, большим изменением вирусов гриппа А, приводящим к новым комбинациям белков гемагглютинина и нейраминидазы в вирусах гриппа А, которые инфицируют людей. Таким образом, для того, чтобы определить, является ли вирус гриппа А, который инфицирует людей, результатом антигенного сдвига, комбинации белка гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA) указанного вируса гриппа А можно сравнивать с комбинациями белка гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA) известных вирусов гриппа А, которые инфицируют людей. Если комбинация белка гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA) рассматриваемого вируса гриппа А не присутствует в известных вирусах гриппа А, инфицирующих человека, тогда рассматриваемый вирус гриппа А является результатом антигенного сдвига.

Антигенный сдвиг представляет собой точечные мутации в пределах генома вируса. Специалист может легко определять, является ли данный вирус гриппа результатом антигенного дрейфа посредством секвенирования генома данного вируса гриппа и сравнения полученной в результате последовательности с последовательностями вирусных геномов известных вирусов гриппа. Соответственно, для того, чтобы определять, является ли вирус гриппа, который инфицирует людей, результатом антигенного сдвига, последовательность вирусного генома указанного вируса гриппа можно сравнить с последовательностью вирусного генома известных вирусов гриппа, которые инфицируют человека. Если последовательность вирусного генома рассматриваемого вируса гриппа содержит замены нуклеотидов (т.е. точечные мутации) по сравнению с известными вирусами гриппа, инфицирующими человека, тогда рассматриваемый вирус гриппа является результатом антигенного дрейфа.

Антигенный дрейф является нормальным эволюционным процессом, когда геномы вируса мутируют (медленно по сравнению с антигенным сдвигом) из-за полимераз, подверженных ошибкам. Данные мутации могут изменять функциональные характеристики вируса, например, устойчивость ферментов против специфических лекарственных средств. Следовательно, для определения того, является ли вирус результатом антигенного дрейфа, можно определять функциональные характеристики вируса.

Кроме того, вирусы с антигенным сдвигом с пандемическим потенциалом также могут возникать посредством рециклирования вируса. Более конкретно, проверяя образцы крови от людей варьирующего возраста, можно показать, циркулировал ли ранее конкретный подтип гриппа, и, если так, когда он приблизительно прекратил циркулировать. Данный анализ, именуемый сероархеология, поддерживает теорию рециклирования вируса. Сероархеология установила за пределами обоснованных сомнений то, что подтипы Н2 и Н3 рециклировали у человека на протяжении 19-го и 20-го столетий. Кроме того, подтип Н1, который циркулировал у человечества на протяжении периода с 1918 г. по 1957 г. повторно возник или «рециклировал» в 1978 г. Анализ РНК вирусов, выделенных во время эпидемии 1977-78 гг., показал то, что данный вирус был более близкородственным вирусам, выделенным в 1950 г., чем штаммы, выделенные после этого времени. Из-за антигенного дрейфа предполагали то, что вирус H1N1 должно быть повторно возник из замороженного состояния в природе или где-нибудь еще. Однако имеется доказательство того, что вирусы гриппа могут оставаться неизменными в течение длительных периодов у свиней, которые могут служить в качестве резервуара для человеческой инфекции. Таким образом, в контексте настоящего изобретения штамм гриппа может представлять собой рециклирующий вирус, который вызвал в прошлом эпидемию или пандемию.

Например, штаммами вируса, которые могут рециклировать, являются A/Hong Kong/97 (H5N1), A/New Jersey/8/76 (H1N1), A/USSR/90/77 (H1N1), A/Hong Kong/68 (H3N2), A/Hong Kong/68 (H3N2), A/Hong Kong/68 (H3N2), A/Hong Kong/68 (H3N2), A/USSR/77 (H1 N1), A/USSR/77 (H1 N1) или A/USSR/77 (H1 N1).

Как упомянуто выше, согласно настоящему изобретению вирус гриппа может представлять собой вирус гриппа А или вирус гриппа В (например, B/Minnesota/23/2015). В приложенных Примерах неожиданно показано то, что соединение, подлежащее применению в настоящем изобретении, может снижать передачу штаммов вируса гриппа A/Perth/265/2009 (Н1 N1pdm09) и A/England/195/2009. Таким образом, согласно настоящему изобретению штамм вируса гриппа предпочтительно представляет собой вирус гриппа А, более предпочительно вирус гриппа А из подтипа H1N1 (например, A/Perth/265/2009 (H1N1pdm09) или A/England/195/2009). Однако вирус гриппа А также может быть подтипа H2N2, H3N2, H5N1 или H7N9.

В предпочтительном аспекте настоящего изобретения штамм вируса гриппа не несет мутацию I38X, включающую мутацию I38T. Таким образом, предпочтительным является то, что штамм вируса гриппа не несет мутацию I38T. Замена I38T представляет собой мутацию в пределах белка вирусной кислой полимеразы (РА) некоторых мутировавших штаммов гриппа А. Последовательность белка РА вируса гриппа А, имеющего мутацию I38T, показана в SEQ ID NO: 4. Таким образом, в предпочтительном аспекте настоящего изобретения штамм вируса гриппа не содержит белок РА, имеющий последовательность SEQ ID NO: 4. Также предпочтительным является то, что штамм вируса гриппа не содержит белок РА, имеющий последовательность, которая имеет по меньшей мере 80%-ную, предпочтительно по меньшей мере 90%-ную, более предпочтительно по меньшей мере 95%-ную, по меньшей мере 96%-ную, по меньшей мере 97%-ную, по меньшей мере 98%-ную или по меньшей мере 99%-ную идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 4 и содержащий Т в положении, соответствующем положению 38 SEG ID NO: 4. Фракция белка РА вируса гриппа А, содержащего мутацию 13 ВТ, показана в SEG ID NO: 5. Таким образом, в предпочтительном аспекте настоящего изобретения штамм вируса гриппа не содержит белок РА, содержащий последовательность, как показано в SEQ ID NO: 5.

Как упомянуто выше, соединение, подлежащее применению в настоящем изобретении, может использоваться для предупреждения эпидемии гриппа или пандемии гриппа. Таким образом, данное изобретение относится к способу предупреждения эпидемии гриппа или пандемии гриппа, где данный способ включает введение пациентам, имеющим инфекцию вирусом гриппа (нулевым пациентам), эффективного количества соединения, где данное соединение вводится по меньшей мере 13% всех инфицированных гриппом людей населения города или страны,

и где данное соединение имеет одну из следующих формул I и II:

или его фармацевтически приемлемой соли.

Таким образом, настоящее изобретение относится к соединению для применения в лечении пациентов, имеющих инфекцию вирусом гриппа (нулевых пациентов), где данное соединение подлежит введению по меньшей мере 10% всех инфицированных гриппом людей населения города или страны, где данное соединение предупреждает эпидемию гриппа или пандемию гриппа, и где данное соединение имеет одну из следующих формул I и II:

или его фармацевтически приемлемой соли.

В данном документе «предупреждать» эпидемию гриппа или пандемию гриппа также означает снижать вспышку эпидемии гриппа или пандемии гриппа, например, снижать последствия вспышки эпидемии гриппа или пандемии гриппа.

В приложенных Примерах приводится симуляция, которая демонстрирует то, что лечение 15% или 30% населения балоксавира марбоксилом предупреждало бы эпидемию или пандемию гриппа соответственно. В приложенных Примерах также демонстрируется то, что соединение, подлежащее применению в настоящем изобретении, имеет полезный эффект в том, что оно снижает передачу и, следовательно, снижает вероятность того, что возникает эпидемия или пандемия. Таким образом, средства и способы, предложенные в данном документе, преимущественно снижают экономические последствия, которые ассоциированы с инфекциями гриппом.

Как описано выше, условия, окружающие гонконгскую вспышку пандемического «птичьего гриппа» 1997 г., подчеркивают необходимость предварительного планирования для обеспечения адекватного ответа на чрезвычайную ситуацию санитарно-эпидемиологического характера, которая определенно является непредсказуемой, сложной, быстро развивающейся и сопровождающейся значительной тревогой в обществе. Как только начиналась пандемия, в прошлом было слишком поздно осуществлять многие ключевые активности, требующиеся для минимизации влияния. Следовательно, планирование и воплощение подготовительных активностей должно начинаться существенно заранее. Соответственно, для того, чтобы предупреждать пандемию гриппа, необходимо лечить инфицированных пациентов соединением, подлежащим применению в настоящем изобретении, на ранней стадии. Таким образом, согласно настоящему изобретению рассматривается то, что даже предупреждается эпидемия гриппа посредством лечения нескольких (например, по меньшей мере 10%) инфицированных гриппом людей во время сезонного гриппа. В одном аспекте настоящего изобретения вышеописанный способ (т.е. способ предупреждения эпидемии гриппа или пандемии гриппа) служит для предупреждения эпидемии гриппа, и по меньшей мере 10%, предпочтительно по меньшей мере 15%, более предпочтительно по меньшей мере 20% всех людей, инфицированных гриппом, населения города или страны (предпочтительно населения города) лечат данным соединением. В соответствии с этим, в одном аспекте настоящего изобретения вышеописанное соединение (т.е. соединение, которое предупреждает эпидемию гриппа или пандемию гриппа) предупреждает эпидемию гриппа, и по меньшей мере 10%, предпочтительно по меньшей мере 15%, более предпочтительно по меньшей мере 20% всех людей, инфицированных гриппом, населения города или страны (предпочтительно населения города) подлежат лечению данным соединением. Например, соединение, подлежащее применению в настоящем изобретении, может использоваться для предупреждения эпидемии гриппа (например, во время сезонного гриппа), если по меньшей мере 20% населения имеют эффективную вакцинацию, и если число восприимчивых людей составляет не больше, чем 30% населения.

Естественно, эффект соединения, подлежащего применению в настоящем изобретении, для предупреждения эпидемии (например, во время сезонного гриппа) или пандемии возрастает с процентной долей людей, инфицированных гриппом, которых лечат данным соединением. Следовательно, для того, чтобы предупреждать эпидемию гриппа (например, во время сезонного гриппа) по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40% или по меньшей мере 50% инфицированных людей населения города или страны (предпочтительно населения города) можно лечить данным соединением.

В одном аспекте данного изобретения вышеописанный способ (т.е. способ предупреждения эпидемии гриппа или пандемии гриппа) служит для предупреждения пандемии гриппа, и по меньшей мере 25%, предпочтительно по меньшей мере 30% и более предпочтительно по меньшей мере 35% всех людей, инфицированных гриппом, населения страны лечат данным соединением. В соответствии с этим, в одном аспекте данного изобретения вышеописанное соединение (т.е. соединение, которое предупреждает эпидемию гриппа или пандемию гриппа) служит для предупреждения пандемии гриппа, и по меньшей мере 25%, предпочтительно по меньшей мере 30% и более предпочтительно по меньшей мере 35% всех людей, инфицированных гриппом, населения страны подлежат лечению данным соединением. Например, соединение, подлежащее применению в настоящем изобретении, может использоваться для предупреждения пандемии гриппа, если нет доступной эффективной вакцинации, и если число восприимчивых людей составляет не больше, чем 30% населения. Как упомянуто выше, эффект соединения, подлежащего применению в настоящем изобретении, для предупреждения пандемии возрастает с процентной долей инфицированных гриппом людей, которых лечили данным соединением. Следовательно, для того, чтобы предупреждать пандемию гриппа, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 55% или по меньшей мере 65% инфицированных людей населения города или страны можно лечить данным соединением.

Предложенные в данном документе средства и способы являются особенно полезными, если штамм вируса гриппа не имеет резистентности против соединения, подлежащего применению в настоящем изобретении. Однако данный штамм вируса гриппа может иметь резистентность против других противовирусных лекарственных средств (таких как перемавир, ланинамивир, оселтамивир, занамивир, римантадин, умифеновир или амантадин). Анализы для определения того, имеет ли данный вирус резистентность против одного или более чем одного лекарственного средства, являются общеизвестными в данной области и включают, например, фенотипический анализ резистентности и анализ NA-Star, которые оба описываются ниже.

Фенотипический анализ резистентности можно проводить, как описано далее: фенотипический анализ резистентности (анализ снижения пятна/очага) можно проводить посредством применения чувствительной технологии выявления Virospot, которая объединяет классическую культуру вируса в многолуночных планшетах для микротитрования и вирусоспецифичное иммуноокрашивание с автоматической визуализацией, выявлением инфицированных клеток с использованием УФ (ультрафиолетовый) анализатора CTL Immunospot, оснащенного программой анализа Biospot. Платформа технологии Virospot определяет чувствительность изолятов вируса к противовирусным лекарственным средствам, измеряя IC₅₀(полумаксимальная ингибирующая концентрация)/IC₉₀(концентрация, ингибирующая на 90%). Вкратце, данный способ основывается на инокуляции инфекционного вируса на монослоях клеток MDCK в 96-луночных планшетах в присутствии интервала концентрации лекарственного средства. После инкубации клетки фиксируют и иммуноокрашивают вирусоспецифичными антителами, с последующим добавлением субстрата TrueBlue и фиксацией изображения с использованием УФ анализатора.

Анализ NA-Star является особенно полезным для определения фенотипической резистентности к ингибиторам нейраминидазы (таким как, например, оселтамивир) и может осуществляться следующим образом: в данном анализе используется хемилюминисцентный субстрат для высокочувствительного выявления активности фермента нейраминидазы. Активность нейраминидазы дает люминисцентное соединение, которое количественно измеряется с использованием ридера. Активность нейраминидазы вируса определяется в присутствии серийных разведений ингибитора нейраминидазы. Чувствительность к ингибитору нейраминидазы выражается как значения IC₅₀/IC₉₀.

Соединение, подлежащее применению согласно настоящему изобретению, можно объединять с другими лекарственными средствами против гриппа. В ЕС (Европейский Союз) в настоящее время одобрены четыре противовирусных лекарственных средства для предупреждения и лечения гриппа: ингибитор ионного канала М2 амантадин и NAI (ингибитор нейраминидазы) оселтамивир фосфат, занамивир и перамивир. Второй ингибитор М2 - римантадин - имеет регистрационные удостоверения в Чешской республике, Франции и Польше, но не распространяется на рынке в данных странах. Следовательно, соединение, подлежащее применению в настоящем изобретении, может вводиться в виде совместной терапии с амантадином, оселтамивира фосфатом, занамивиром, перамивиром и/или римантадином. Ингибиторы нейраминидазы (NAI) являются основной опорой лечения инфекций гриппом. Следовательно, если соединение, подлежащее применению в настоящем изобретении, вводится в виде совместной терапии, тогда оно предпочтительно объединяется с оселтамивира фосфатом или занамивиром. И оселтамивира фосфат, и занамивир вводятся дважды в сутки в течение 5 суток.

Как описано выше, согласно настоящему изобретению предложены средство и способ для снижения передачи вируса гриппа, т.е. для снижения инфективности пациента, инфицированного гриппом (т.е. нулевого пациента). В соответствии с этим данное изобретение также относится к следующим аспектам. Все объяснения, определения и предпочтительные аспекты, которые объясняются выше, также относятся, с учетом необходимых изменений, к аспектам изобретения, описанным ниже.

Данное изобретение также относится к способу лечения инфекции вирусом гриппа, где указанный способ включает введение эффективного количества соединения пациенту, имеющему инфекцию вирусом гриппа (нулевому пациенту), где данное соединение имеет одну из формул (I) и (II), или его фармацевтически приемлемой соли, и где данное соединение снижает передачу. Также настоящим изобретением охватывается способ лечения гриппа, включающий: прочтение инструкции по дозированию на листке-вкладыше в упаковке или на упаковке для фармацевтического препарата, содержащего соединение, имеющее одну из формул (I) и (II) или являющегося его фармацевтически приемлемой солью; и введение эффективного количества соединения пациенту, инфицированному гриппом (нулевому пациенту), инфективность которого подлежит снижению. Данное изобретение также относится к применению соединения, которое имеет формулы (I) и (II), или его фармацевтически приемлемой соли для получения лекарственного средства для лечения инфицированного гриппом пациента (нулевого пациента), инфективность которого подлежит снижению. Также настоящим изобретением предложена упаковка, содержащая фармацевтический препарат, содержащий соединение, которое имеет одну из формул (I) и (II) или его фармацевтическую соль, и дополнительно содержащая инструкцию по дозировке для введения эффективного количества соединения инфицированному гриппом пациенту (нулевому пациенту), инфективность которого подлежит снижению.

Как объясняется выше, нулевой пациент предпочтительно является здоровым, кроме инфекции вирусом гриппа. Предпочтительным является то, что нулевого пациента не лечат каким-либо лекарственным средством, кроме соединения, подлежащего применению в настоящем изобретении. Например, предпочтительным является то, что нулевого пациента не лечат экспериментальной терапией, системным противовирусным лекарственным средством (например, перамивир, ланинамивир, оселтамивир, занамивир, римантадин, умифеновир или амантадин), иммунодепрессантами, кортикостероидами, противогрибковыми лекарственными средствами или лекарственным средством, которое вводится в глаза, нос или уши, или посредством ингаляции.

Значение термина «инфекция вирусом гриппа» или его вариации является общеизвестным в данной области и относится к заболеванию, которое вызвано вирусом гриппа. Более конкретно, инфекция вирусом гриппа представляет собой острое респираторное инфекционное заболевание, вызванное вирусом семейства ортомиксовирусов. Известно, что человека принципиально инфицируют две формы и вызывают заболевание у человека: вирус гриппа А и вирус гриппа В. Вирусы гриппа имеют сегментированный, негативносмысловой, одноцепочечный, инкапсулированный липидами геном на основе рибонуклеиновой кислоты (РНК); они варьируют по размеру от 80 до 100 нм. Подтипы определяются согласно гликопротеинам гемагглютинину (НА) и нейраминидазе (NA), присутствующим в вирусной липидной оболочке. Вирусы гриппа поступают в клетку респираторного эпителия посредством присоединения вирусного НА к рецепторам, содержащим сиаловую кислоту, на клеточной мембране, с последующей интернализацией вируса в кислую эндосому. В кислотной среде эндосомы НА подвергается конформационному изменению, что высвобождает слитый пептид и приводит к слиянию вирусной оболочки с эндосомальной мембраной. В то же самое время белок матрикса-2 (М2) действует в качестве ионного канала, обеспечивающего поступление ионов водорода в вирион из эндосомы. Это обеспечивает то, что сегменты вирусного гена покидают вирион и поступают в цитоплазму - процесс, известный как «раздевание». Сегменты вирусного гена транспортируются в ядро, где комплекс вирусной полимеразы, состоящий из белков основной белок полимеразы 1 (РВ1), основной белок полимеразы 2 (РВ2) и кислотный белок полимеразы (РА) управляет синтезом плюс-смысловой матричной РНК (мРНК), а также, посредством плюс-смысловой полноразмерной комплементарной РНК, синтезом негативно-смысловых полноразмерных копий, которые будут служить в качестве потомства геномной РНК. Полимеразные белки также играют роль в нарушении синтеза белка клетки хозяина. Сборка вирионов потомства происходит на плазматической мембране, и вирусный белок NA играет роль в высвобождении вируса с поверхности клетки посредством расщепления поверхностной сиаловой кислоты.

Термин «соединение», подлежащий применению в настоящем изобретении, представляет собой соединение, которое имеет одну из следующих формул I и II:

или его фармацевтически приемлемую соль (т.е. соединения, имеющего формулу (I) или (II)). Соединение, подлежащее применению в настоящем изобретении, также называется в данном документе «соединение», «соединение для применения», «соединение, подлежащее применению (в данном документе/в настоящем изобретении)» или «соединение по настоящему изобретению».

Соединение, подлежащее применению в настоящем изобретении, действует в качестве селективного кэп-зависимого ингибитора эндонуклеазы (CEN), ингибирующего функцию «схватывания нэпа» субъединицы РА полимеразы гриппа, которая используется для отщепления структур 5' кэпа от мРНК клетки-хозяина, которые используются в качестве праймеров для транскрипции вирусной мРНК. Посредством ингибирования данной существенной функции соединение в том виде, в котором оно используется в данном документе, подавляет репликацию вирусов гриппа.

Соединение, подлежащее применению в настоящем изобретении, имеет широкий спектр активности против сезонных: (например, A/H1N1, A/H3N2 и В) и высокопатогенных вирусов птичьего гриппа (например, A/H5N1, A/H7N9) с более мощной противовирусной активностью (меньшая полумаксимальная ингибирующая концентрация [IC₅₀]) по сравнению с другими обычными противовирусными лекарственными средствами, такими как оселтамивир, занамивир или перамивир. Способность данного соединения быть эффективным в качестве однодозного введения упрощает лечение и улучшает следование пациентом схеме и режиму лечения по сравнению с ингибиторами нейраминидазы (NAI). Предпочтительно данное соединение имеет формулу (I) или (II), наиболее предпочтительно (I). Соединение формулы (I) также может быть показано следующим образом:

Данное соединение (т.е. соединение формулы (I)) имеет молекулярную формулу C₂₇H₂₃F₂N₃O₇S. Данное соединение представляет собой пролекарство, которое известно как балоксавир марбоксил. Балоксавир марбоксил известен в данной области и описан, например, в Noshi, Antiviral research 160 (2018): 109-117.

Балоксавир марбоксил (т.е. соединение формулы (I)) представляет собой лекарственное средство против вируса гриппа с новым механизмом действия. Оно было открыто и разрабатывается Shionogi & Co., Ltd. и F. Hoffman-La Roche, Ltd. Балоксавир марбоксил (S-033188) представляет собой пролекарство, и оно превращается в активную форму (S-033447) посредством метаболизма (гидролиз). Данная активная форма показана в данном документе как формула (II). Данная активная форма (S-033447) селективно ингибирует активность кэп-зависимой эндонуклеазы (CEN), необходимой для репликации вирусов гриппа (Omoto, Sci Rep. 2018; 8(1):9633). Широкий спектр активности против сезонных вирусов гриппа и облегчающие эффекты симптомов гриппа были показаны в неклинических исследованиях эффективности и клинических исследованиях у пациентов с гриппом, включающих исследование проверки концепции и обнаружения дозы фазы 2, двойное слепое исследование фазы 3 у здоровых в иных отношениях пациентов (Portsmouth S, Kawaguchi K, Arai М, Tsuchiya К, Uehara Т. Cap-dependent endonuclease inhibitor S-033188 for the treatment of influenza: results from a phase 3, randomized, double-blind, placebo- and active-controlled study in otherwise healthy adolescents and adults with seasonal influenza. Abstract LB-2. Oral presentation at ID Week 2017, October 4-8 2017, San Diego, CA, USA.) и открытое исследование Фазы 3 у здоровых в иных отношениях педиатрических пациентов.

Соединение, как показано в формуле (II), представляет собой активную форму балоксавира марбоксила (т.е. пролекарство формулы (I)). Соединение формулы (I) также может быть показано следующим образом:

Соединение формулы (II) также известно как балоксавировая кислота. Балоксавировая кислота известна в данной области и описывается, например, в Noshi, Antiviral research 160 (2013): 109-117.

Фармацевтически приемлемые соли соединений, используемых в настоящем изобретении, включают, например, соли со щелочным металлом (например, литий, натрий, калий или тому подобные), щелочноземельным металлом (например, кальций, барий или тому подобные), магнием, переходным металлом (например, цинк, железо или тому подобные), аммиаком, органическими основаниями (например, триметиламин, триэтиламин, дициклогексиламин, этаноламин, диэтаноламин, триэтаноламин, меглумин, этилендиамин, пиридин, пиколин, хинолин или тому подобные) или аминокислотами, или соли с неорганическими кислотами (например, соляная кислота, серная кислота, азотная кислота, угольная кислота, бромистоводородная кислота, фосфорная кислота, йодистоводородная кислота или тому подобные) или органическими кислотами (например, муравьиная кислота, уксусная кислота, пропионовая кислота, трифторуксусная кислота, лимонная кислота, молочная кислота, винная кислота, щавелевая кислота, малеиновая кислота, фумаровая кислота, миндальная кислота, глутаровая кислота, яблочная кислота, бензойная кислота, фталевая кислота, аскорбиновая кислота, бензол сульфоновая кислота, п-толуолсульфоновая кислота, метансульфоновая кислота, этансульфоновая кислота или тому подобные). В особенности, включаются соли с натрием, калием, кальцием, магнием, железом и тому подобным. Данные соли могут быть образованы обычными способами.

Получение соединения по настоящему изобретению хорошо известно в данной области. Например, соединение по настоящему изобретению может быть получено способами, описанными в патентной заявке PCT/JP2016/063139, которая опубликована как WO 2016/175224 А1.

Как упомянуто выше, согласно настоящему изобретению предпочтительным является то, что штамм вируса гриппа не содержит белок РА, имеющий последовательность, которая имеет по меньшей мере 80%-ную, предпочтительно по меньшей мере 90%-ную, более предпочтительно по меньшей мере 95%-ную, по меньшей мере 96%-ную, по меньшей мере 97%-ную, по меньшей мере 98%-ную или по меньшей мере 99%-ную идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 4 и содержит Т в положении, соответствующем положению 38 SEQ ID NO: 4. В частности, могут быть получены и выровнены последовательности FASTA двух последовательностей вирусных белков РА для того, чтобы оценить степень идентичности между данными двумя вирусными белками РА. Для определения процента идентичности двух последовательностей данные последовательности выравниваются в целях оптимального сравнения (например, можно вводить пробелы в одну или обе из первой и второй аминокислотной последовательности для оптимального выравнивания, а негомологичные последовательности можно проигнорировать в целях сравнения). Процент идентичности между двумя последовательностями является функцией числа идентичных положений, которые делят данные последовательности, принимая во внимание число пробелов и длину каждого пробела, который необходимо вводить для оптимального выравнивания двух данных последовательностей. Процент идентичности между двумя полипептидами/аминокислотными последовательностями определяется разными способами, которые известны специалисту, например, с использованием общедоступной компьютерной программы, такой как Smith Waterman Alignment (Smith, Т.F. and M. S. Waterman (1981) J Mol Biol 147:195-7); "BestFit" (Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics, 482 489 (1981)), в том виде, в котором она включена в GeneMatcher Plus™, Schwarz and Dayhof (1979), Atlas of Protein Sequence and Structure, Dayhof, M.O., Ed, pp 353-358; программа BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; (Altschul, S.F., W. Gish, et al. (1990) J Mol Biol 215: 403-10), BLAST-2, BLAST-P, BLAST-N, BLAST-X, WU-BLAST- 2, ALIGN, ALIGN-2, CLUSTAL, или программа Megalign (DNASTAR). Кроме того, специалисты в данной области могут определять подходящие параметры для измерения выравнивания, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по длине сравниваемых последовательностей. Предпочтительно последовательности вирусного белка РА сравниваются по всей их длине. В целях настоящего изобретения сравнение последовательностей и определение процента идентичности между двумя последовательностями может осуществляться с использованием матрицы подсчета Blossum 62 (со штрафом за пробел 12, штрафом за продление пробела 4 и штрафом за пробел со сдвигом рамки считывания 5).

Как упомянуто выше, один аспект настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей соединение, которое имеет одну из формул (I) и (II), или его фармацевтически приемлемую соль, и возможно содержащей фармацевтически приемлемый носитель, где данная фармацевтическая композиция предупреждает (например, снижает) передачу вируса гриппа. Данные фармацевтические композиции можно готовить с фармацевтически приемлемым носителем посредством известных способов. Например, данные композиции можно готовить посредством подходящего объединения ингредиентов с фармацевтически приемлемым носителем или средой, в частности, со стерильной водой или физиологическим раствором, растительными маслами, эмульгаторами, суспендирующими средствами, поверхностно-активными веществами, стабилизаторами, корригентами, эксципиентами, носителями, консервантами, связывающими агентами, и как, например, посредством их смешивания в единичной дозе и форме, требуемой общепринятыми фармацевтическим воплощениями. Конкретные примеры носителей включают светлую безводную кремниевую кислоту, лактозу, кристаллическую целлюлозу, маннит, крахмал, кармеллозу кальция, кармеллозу натрия, гидроксипропилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, поливинилацетальдиэтиламиноацетат, поливинилпирролидон, желатин, триглицерид со средней длиной цепи, касторовое масло, отвержденное полиоксиэтиленом, сахарозу, карбоксиметилцеллюлозу, кукурузный крахмал, неорганическую соль и подобные. Содержание активного ингредиента в таком препарате корректируется таким образом, что может быть получена подходящая доза в пределах требующегося интервала.

Данная фармацевтическая композиция возможно может содержать один или более чем один фармацевтически приемлемый эксципиент, такой как носители, разбавители, наполнители, разрыхлители, смазки, связывающие вещества, красители, пигменты, стабилизаторы, консерванты, антиоксиданты или усилители растворимости. Также данные фармацевтические композиции могут содержать один или более чем один усилитель растворимости, такой как, например, поли(этиленгликоль), включая поли(этиленгликоль), имеющий молекулярную массу в интервале от примерно 200 до примерно 5000 Да, этиленгликоль, про пилен гликоль, неионные поверхностно-активные вещества, тилоксапол, полисорбат 80, макрогол-15-гидроксистеарат, фосфолипиды, лецитин, димиристоилфосфатидилхолин, дипальмитоилфосфатидилхолин, дистеароилфосфатидилхолин, циклодекстрины, гидроксиэтил-β-циклодекстрин, гидроксипропил-β-циклодекстрин, гидроксиэтил-γ-циклодекстрин, гидроксипропил-γ-циклодекстрин, гидроксипропил-β-циклодекстрин, глюкозил-α-циклодекстрин, глюкозил-β-циклодекстрин, диглюкозил-β-циклодекстрин, мальтозил-α-циклодекстрин, мальтозил-β-циклодекстрин, мальтозил-γ-циклодекстрин, мальтотриозил-β-циклодекстрин, мальтотриозил-γ-циклодекстрин, димальтозил-β-циклодекстрин, метил-β-циклодекстрин, карбоксиалкилтиоэфиры, гидроксипропилметилцеллюлоза, гидроксипропилцеллюлоза, поливинилпирролидон, сополимеры винилацетата, винилпирролидон, натрия лаурилсульфат, диоктилнатрия сульфосукцинат или их любую комбинацию.

Данные фармацевтические композиции не ограничиваются средствами и способами, описанными в данном документе. Специалист может использовать его/ее знание, доступное в данной области, для того, чтобы создать подходящую композицию. В частности, данные фармацевтические композиции могут быть получены методиками, известными специалисту в данной области, такими как методики, опубликованные в Remington's Pharmaceutical Sciences, 20^th Edition.

Содержание любых документов, процитированных в данном документе выше и ниже, включается посредством ссылки во всей его полноте.

Настоящее изобретение дополнительно описывается посредством ссылки на следующие неограничивающие Графические материалы и Примеры.

На данных Графических материалах продемонстрировано:

Фиг. 1. Динамика и план исследования Примера 1. Динамика эксперимента Примера 1. Балоксавир вводили один раз в виде п.к. (подкожная) суспензии с дозировкой 1 мг/кг в 4 разных места на спине хорька. Оселтамивир фосфат (5 мг/кг) вводили перорально дважды в сутки в течение 5 суток. См. текст относительно подробностей. DF - хорек-донор; SF - индикаторный хорек; DC - прямой контакт; RD - респираторная капля.

Фиг. 2. Результаты бляшечного анализа Примера 1. (А) Контрольные хорьки. Все контрольные хорьки были позитивными в отношении гриппа при выявлении бляшечным анализом (донор: 4/4; индикаторный DC: 4/4; индикаторный RD: 3/4, здесь все (4/4) были позитивными в анализе ПЦР-ОТ). (В) Хорьки, обработанные оселтамивиром. Все хорьки, обработанные оселтамивиром, были позитивными в отношении гриппа при выявлении бляшечным анализом (донор: 4/4; индикаторный DC: 4/4; индикаторный RD: 3/4, здесь все (4/4) были позитивными в анализе ПЦР-ОТ). (С) Хорьки, обработанные балоксавиром. Только один индикаторный хорек, обработанный балоксавиром, был инфицирован респираторной капельной инфекцией при выявлении бляшечным анализом (донор: 3/4, здесь все (4/4) были позитивными в анализе ПЦР-ОТ; индикаторный DC: 4/4; индикаторный RD: 1/4). DF - хорек-донор; SF - индикаторный хорек; DC - прямой контакт; RD - респираторная капля.

Фиг. 3. Результаты кПЦР-ОТ Примера 1. (А) Контрольные хорьки. Все контрольные хорьки были позитивными в отношении гриппа при выявлении кПЦР-ОТ (донор: 4/4; индикаторный DC: 4/4; индикаторный RD: 4/4). (В) Хорьки, обработанные оселтамивиром. Все хорьки, обработанные оселтамивиром, были позитивными в отношении гриппа при выявлении кПЦР-ОТ (донор: 4/4; индикаторный DC: 4/4; индикаторный RD: 4/4). (С) Хорьки, обработанные балоксавиром. Только один индикаторный хорек, обработанный балоксавиром, был инфицирован респираторной капельной инфекцией при выявлении кПЦР-ОТ (донор: 4/4; индикаторный DC: 4/4; индикаторный RD: 1/4). (D) Обобщение результатов кПЦР-ОТ. Только один индикаторный хорек, обработанный балоксавиром, был инфицирован респираторной капельной инфекцией при выявлении кПЦР-ОТ. DF - хорек-донор; SF - индикаторный хорек; DC - прямой контакт; RD - респираторная капля.

Фиг. 4. Динамика Эксперимента 1 Примера 2. Балоксавир вводили в одной обработке, состоящей из 1 мг/кг п. к. инъекций в 4 отдельных местах на спине хорька (всего 4 мг/кг). Таким же способом вводили плацебо (1 мл/кг суспензии только носителя). Оселтамивир фосфат (5 мг/кг) вводили перорально дважды в сутки до конечного момента (исключая конечные сутки). Обработка донорских хорьков: 24 ч после инокуляции донора. Совместное содержание хорьков-реципиентов: 24 ч после инокуляции донора. См. текст относительно подробностей. ВХА - балоксавир; OST - оселтамивир.

Фиг. 5. TCID₅₀ донорских хорьков в Эксперименте 1 Примера 2. 0/4 доноров, обработанных балоксавиром, выделяли выявляемый инфекционный вирус в конечный момент времени 3 суток после инфекции (DPI). Титр группы группы балоксавира был значимо ниже, чем группы плацебо в 2 DPI (*р меньше или равно 0,05) и 3 DPI (***р меньше или равно 0,001). 4/4 обработанных оселтамивиром и 4/4 обработанных плацебо доноров выделяли инфекционный вирус в конечный момент времени 3 DPI. Не было значимого различия в титре групп, наблюдаемого между донорами, обработанными оселтамивиром и обработанными плацебо. ВХА - балоксавир; OST - оселтамивир.

Фиг. 6. Результаты кПЦР-ОТ донорских хорьков Эксперимента 1 Примера 2. Вирусная РНК присутствует в назальном смыве всех животных во все точки отбора образцов. Число копий вируса в группе балоксавира (*) и группе оселтамивира (*) было значимо снижено по сравнению с плацебо в 3 DPI (р меньше или равно 0,05). Порог числа копий позитивного выявления основывается на наименьшем числе копий РНК стандарта с получением значения Ct меньше 35 на анализ. Фармакокинетика (РК) группы балоксавира в 48 часов после обработки составляла 10,2 плюс/минус 2,8 нг/мл балоксавира в плазме плюс/минус SD (стандартное отклонение). ВХА - балоксавир; OST - оселтамивир.

Фиг. 7. Результаты хорьков-реципиентов Эксперимента 1 Примера 2 (А) Результаты TCID₅₀. Только 1/4 группы балоксавира хорьков-реципиентов выделяла выявляемый инфекционный вирус после контактного воздействия по отношению к донору по сравнению с 4/4 группы оселтамивира и 4/4 группы плацебо. (В) Результаты кПЦР-ОТ. РНК вируса гриппа выявляли только у 2/4 реципиентов группы балоксавира по сравнению с 4/4 группы оселтамивира и 4/4 группы плацебо. ВХА - балоксавир; OST - оселтамивир.

Фиг. 8. Динамика Эксперимента 2 Примера 2. Балоксавир вводили в одной обработке, состоящей из 1 мг/кг п.к. инъекций в 4 отдельных места на спине хорька (всего 4 мг/кг). Плацебо (1 мл/кг суспензии только носителя) вводили таким же способом. Оселтамивир фосфат (5 мг/кг) вводили перорально дважды в сутки до конечного момента (исключая последние сутки). Обработка донора: 24 ч после инокуляции донора.

Совместное содержание реципиента: 48 ч после инокуляции донора. См. текст относительно подробностей. ВХА - балоксавир; OST - оселтамивир.

Фиг. 9. Результаты хорьков-доноров Эксперимента 2 Примера 2. (А) Результаты TCID₅₀. 0/4 доноров, обработанных балоксавиром, выделяли выявляемый инфекционный вирус в конечный момент времени 4 DPI. Титр группы балоксавира был значимо ниже, чем титр группы плацебо в 2 DPI (*р меньше или равен 0,05), 3 DPI (**р меньше или равен 0,001) и 4 DPI (***р меньше или равен 0,001). Титр группы балоксавира был значимо ниже, чем титр группы оселтамивира в 3-4 DPI (р меньше или равен 0,01). Однако сразу перед обработкой (т.е. в 1 DPI) титры были значимо выше в группе балоксавира, чем в группе плацебо (р меньше или равен 0,001). 4/4 обработанных оселтамивиром и 4/4 обработанных плацебо доноров выделяли инфекционный вирус в конечный момент времени 4 DPI. Титр группы оселтамивира был значимо ниже, чем титр группы плацебо в 1 (DPI) (р меньше или равен 0,05), но не было различия в 2-4 DPI. (В) Результаты кПЦР-ОТ. Вирусная РНК была представлена в назальном смыве всех животных во все моменты отбора образцов. Среднее число копий вируса было снижено в группе балоксавира в 3 DPI, но различия не наблюдались в любые другие сутки. Фармакокинетика (РК) группы балоксавира в 72 ч после обработки составляла 12,5 плюс/минус 2,4 нг/мл балоксавира в плазме плюс/минус SD. ВХА - балоксавир; OST - оселтамивир.

Фиг. 10. Результаты хорьков-реципиентов Эксперимента 2 Примера 2.

(A) Результаты TCID₅₀. Только 1/4 группы балоксавира хорьков-реципиентов выделяла выявляемый инфекционный вирус после контактного воздействия с донором по сравнению с 4/4 хорьками группы оселтамивира и 4/4 группы плацебо.

(B) кПЦР-ОТ. РНК вируса гриппа выявляли у 1/4 реципиентов группы балоксавира по сравнению с 4/4 группы оселтамивира и 4/4 группы плацебо. (С) Серология. 2/4 реципиентов группы балоксавира демонстрировали антительные ответы на вирус донора по сравнению с 4/4 хорьков группы оселтамивира и 4/4 группы плацебо. Антительный ответ, выявленный у ТСЮ₅₀-негативного хорька, был пониженным (изменение больше, чем в 32 раза) по сравнению с ТСЮ₅₀-позитивными хорьками. «-» не наблюдали антительного ответа.

Фиг. 11. Динамика Эксперимента 3 Примера 2. Балоксавир вводили в одной обработке, состоящей из 1 мг/кг п. к. инъекций в 4 отдельных места на спине хорька (всего 4 мг/кг). Плацебо (1 мл/кг только суспензии носителя) вводили таким же способом. Оселтамивир фосфат (5 мг/кг) вводили перорально дважды в сутки до конечного момента времени (исключая последние сутки). Обработка донора: 48 ч после инокуляции донора. Совместное содержание реципиента: 48 ч после инокуляции донора. См. текст относительно подробностей. ВХА - балоксавир; OST - оселтамивир.

Фиг. 12. Результаты хорьков-доноров Эксперимента 3 Примера 2. (А)

Результаты TCID₅₀. Ни один (т.е. 0/4) донор, обработанный балоксавиром, не выделял инфекционный вирус в конечный момент времени 4 DPI. Титр группы балоксавира был значимо ниже, чем титр группы плацебо в 3 и 4 DPI (*р меньше или равен 0,001), и меньше, чем в группе оселтамивира в 4 DPI (***р меньше или равен 0,001). Все (т.е. 4/4) обработанных оселтамивиром и все (т.е. 4/4) обработанных плацебо донора выделяли инфекционный вирус в конечный момент времени 4 DPI. Титр группы оселтамивира был значимо ниже, чем титр группы плацебо в 3 DPI (р меньше или равен 0,05). (В) Результаты кПЦР-ОТ. Измерили вирусную РНК, присутствующую в назальном смыве всех животных во все моменты отбора образцов. Не было значимых различий между средним числом копий групп. Фармакокинетика (РК) группы балоксавира в 72 ч после обработки составляла 24,5 плюс/минус 4,03 нг/мл балоксавира в плазме плюс/минус SD. ВХА - балоксавир; OST - оселтамивир.

Фиг. 13. Результаты хорьков-реципиентов Эксперимента 3 Примера 2. (А) Результаты TCID₅₀. 2/4 доноров, обработанных балоксавиром, выделяли инфекционный вирус в конечный момент времени 4 DPI по сравнению с 4/4 донорами группы оселтамивира и 4/4 донорами группы плацебо. (В) кПЦР-ОТ. Вирусную РНК выявляли у 3/4 доноров, обработанных балоксавиром, по сравнению с 4/4 донорами группы оселтамивира и 4/4 донорами группы плацебо. (С) Серология. Сыворотки всех реципиентов из всех групп демонстрировали антительные ответы на вирус донора. TCID₅₀-негативные реципиенты группы балоксавира (2/4) демонстрировали пониженные титры антител (изменение больше, чем в 16 раз) по сравнению с TCID₅₀-позитивными хорьками. «-» не наблюдали антительного ответа. *Хорек 11333 (плацебо) достигал человеческого ожидаемого результата в 4 DPE, следовательно, был исключен из анализа серологии.

Фиг. 14. Обобщение эффекта балоксавира на хорьков-доноров в Экспериментах 1-3 Примера 2. Обработка балоксавиром быстро снижает выделение инфекционного вируса в верхних дыхательных путях. Ни один хорек, обработанный балоксавиром, не выделял выявляемый инфекционный вирус в конечный момент времени для донора в каждом эксперименте.

Фиг. 15. Обобщение эффекта балоксавира на контактную передачу в Экспериментах 1-3 Примера 2. Группа плацебо демонстрирует то, что частота контактной передачи A/Perth/265/2009 наивным хорькам составляет 100% в использованной модели. Обработка оселтамивиром не снижает контактную передачу наивным хорькам. 100% обработанных оселтамивиром реципиентов демонстрируют доказательство инфекции посредством TCID₅₀, кПЦР-ОТ и серологии во всех экспериментальных условиях. Обработка балоксавиром снижает частоту контактной передачи по сравнению с оселтамивиром или плацебо. Обработка балоксавиром в 1 DPI снижает частоту выделения инфекционного вируса у реципиентов до 25%. Не наблюдали различия при задержке совместного содержания реципиентов на 24 ч. Обработка балоксавиром в 2 DPI снижает частоту выделения инфекционного вируса у реципиентов до 50%. Однако копии вируса и антительные ответы сыворотки выявляли у реципиентов группы балоксавира, не демонстрирующих доказательства выделения инфекционного вируса в верхних дыхательных путях (URT), указывая на воздействие вируса, но не на продуктивную инфекцию.

Фиг. 16. Имитация предупреждения эпидемии гриппа во время сезонного гриппа посредством обработки балоксавиром. См. текст относительно подробностей.

Фиг. 17. Имитация предупреждения пандемии гриппа посредством обработки балоксавиром. См. текст относительно подробностей.

Фиг. 18. Канадская шкала острого респираторного заболевания и гриппа (CARIFS).

Примеры иллюстрируют данное изобретение.

Пример 1: балоксавир марбоксил предупреждает респираторную капельную передачу

Схема исследования

Схема исследования данного эксперимента показана на Фиг. 1(A) и (В). В данном эксперименте баклоксавир вводили хорькам один раз в виде п.к. суспензии с дозировкой 1 мг/кг в 4 разных места на спине. Оселтамивир фосфат (5 мг/кг) вводили перорально дважды в сутки в течение 5 суток.

Данный эксперимент планируется с 3 группами: балоксавира, оселтамивира и без лекарственного средства. Для каждой группы имелось 4 группы животных. В каждой группе имелись животные-доноры и индикаторные животные, которые подвергаются воздействию инфицированных доноров либо посредством прямого контакта, либо воздушно-капельного пути.

Данный эксперимент проводили следующим образом:

Сутки 0:

Всем животным имплантировали чип для отслеживания температуры и идентификации. Четырех хорьков (доноры) инфицировали вирусом гриппа А. Дикий тип (RG) A/England/195/2009 в дозе 10⁴ БОЕ давали интраназально под легкой анестезией (кетамин/ксилазин) в общем объеме 200 микролитров.

Сутки 1:

В 24 часа после инфекции у 4 инфицированных хорьков получали назальный смыв. Назальные смывы анализировали немедленно посредством нанесения в виде бляшки на свежие клетки MDCK для определения инфекционного вируса и проведения ПЦР-ОТ для определения нагрузки вирусной РНК. Каждого хорька-донора затем обрабатывали одним из балоксавира, оселтамивира фосфата или одного носителя. Балоксавир вводили один раз подкожно в 4 места на спине с использованием 1 мг/1 мл/кг на инъекцию (всего 4 мг/4 мл/кг). После дозирования балоксавира отбирали образцы крови (минимум 200 мкл) у животных-доноров в 48 ч и 144 ч, соответственно, для анализа фармакокинетики (РК).

5 мг/кг дозу оселтамивира фосфата вводили перорально дважды в сутки в течение 5 суток, что рассматривается эквивалентом стандартной человеческой взрослой дозы 75 мг для лечения (J Antimicrob Chemother 2014; 69: 2458-2469). После введения лекарственного средства в сутки 1 одно индикаторное животное вводили в ту же самую клетку, что и каждого инфицированного донора (животное DC), и одно индикаторное животное вводили в смежную клетку (животное RD). Индикаторных животных не обрабатывали каким-либо лекарственным средством.

Сутки 2:

У всех хорьков делали назальный смыв в сутки 2 и каждые последующие сутки до окончания эксперимента, начиная с животных RD, затем животных DC и заканчивая донорами. На назальном смыве немедленно проводили бляшечный анализ. Вирусную РНК также отслеживали ПЦР-ОТ. Осуществляли ежесуточное наблюдение клинических признаков, включающих температуру, потерю массы и респираторные признаки. Кроме того, выдыхаемый вирус у 4 животных-доноров отслеживали посредством их помещения в камеру на 10 минут и отбора воздуха с использованием индикаторых клеток MDCK.

Сутки 4:

Утром 4 животных DC и 4 RD удаляли и содержали отдельно. Таким образом, индикаторные животные подвергались воздействию в сутки 1 -4 после инфекции донора (72 часа).

Данный эксперимент заканчивали, когда все животные имели двое последовательных суток негативного в отношении вируса назального смыва.

Материалы и методы

Исследования на животных

Использовали самок хорьков (в возрасте 20-24 недели), весящих 750-1000 г. После акклиматизации получали сыворотки и анализировали посредством HAI на антитела против A/England/195/09 - пандемического H1N1. Все хорьки были негативными в отношении антител против вируса гриппа в начале экспериментов. Ежесуточно измеряли массу тела. Следовали строгим процедурам для предупреждения неправильного перекрестного загрязнения между животными. Манипуляции с индикаторными животными проводили до манипуляций с инокулированными животными, рабочие поверхности и перчатки проводящих манипуляции дезинфицировали между животными. Для инокуляции хорьков подвергали легкой анестезии кетамином (22 мг кг^-1) и ксилазином (0,9 мг кг^-1), и интраназально инокулировали вирус, разведенный в PBS (0,1 мл на ноздрю). У всех животных, находящихся в сознании, ежесуточно осуществляли назальный смыв посредством введения каплями 2 мл PBS в ноздри, а продукт отхаркивания собирали в модифицированные 250 мл центрифужные пробирки. Продукт отхаркивания назального смыва использовали для титрования вируса бляшечным анализом. Предел выявления вируса в бляшечных анализах составлял 10 БОЕ мл^-1.

Отслеживание хорьков и измерение активности

Хорьков ежесуточно взвешивали после инфекции. Температуру тела измеряли ежесуточно посредством подкожного транспондера IPTT-300 (Plexx B.V, Нидерланды). Активность хорьков подсчитывали вручную в то же самое время каждые сутки. Этот подсчет был основан на предыдущей публикации Oh DY, Barr IG, Hurt AC (2015) PLoS ONE 10(3): e0118780. Хорьков наблюдали при нахождении в их клетках, по меньшей мере через 4 часа после отбора назального смыва для того, чтобы минимизировать нарушение их активности.

Клетки

Клетки MDCK поддерживали в среде Игла, модифицированной по Дульбекко (DMEM; Gibco, Invitrogen), дополненной 10% FBS и 1% пенициллина/стрептомицина (Sigma-Aldrich).

Бляшечный анализ

Бляшечный анализ проводили с использованием клеток MDCK. На клеточные слои, инокулированные 100 мкл серийно разведенных образцов, наносили 0,6% агарозы (Oxoid) в DMEM, дополненной 2 мкг трипсина (Worthington) мл^-1, и инкубировали при 37°С в течение 3 суток.

Приготовление образцов для ПЦР в реальном времени

140 мкл назального смыва хорьков использовали для выделения РНК с использованием мининабора для вирусной PHKQiagen (кат. №/ID: 52904) согласно инструкциям изготовителя.

ПЦР в реальном времени

ПЦР в реальном времени проводили с использованием системы ПЦР в реальном времени 7500 (ABI) в 20 мкл реакциях с использованием реактивов для одноэтапной ПЦР-ОТ AgPath-ID™, 10 мкл буфера для ПЦР-ОТ (Thermo Fisher, кат. №4387391), 4 мкл РНК, 0,8 мкл прямого (5'GACCRATCCTGTCACCTCTGA 3', SEQ ID NO:1) и обратного праймеров (5' AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA3', SEQ ID NO:2), и 0,4 мкл зонда (5' FAM-TCGAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-BHQ1 3', SEQ ID NO:3). Обратную транскрипцию проводили при 45°С в течение 10 мин. Условия ПЦР-амплификации состояли из 95°С в течение 15 с и 60°С в течение 1 мин после исходной стадии денатурации при 95°С в течение 10 мин. Всего проводили 40 циклов. Для каждого образца определяли значение Ct в отношении гена М-мишени. Ген М представляет собой ген вируса гриппа, кодирующий 2 белка матрикса - М1 и М2. Ген М выявляется в ПЦР и может использоваться для количественного измерения вируса гриппа. На основе стандартных кривых рассчитывали абсолютное число копий для установления позитивных в отношении гриппа А хорьков.

Декларация по этике

Вся проведенная работа была одобрена местным комитетом по безопасности генетических манипуляий (GM) Imperial College London, St. Mary's Campus (номер центра GM77) и Комитетом по вопросам здравоохранения и безопасности Великобритании. Все исследование на животных, описанное в данной работе, было проведено согласно разрешению Министерства внутренних дел Великобритании, P48DAD9B4.

Все вышеописанные способы являются общеизвестными в данной области и описываются, например, в документе "Contact transmission of influenza virus between ferrets imposes a looser bottleneck than respiratory droplet transmission allowing propagation of antiviral resistance." Frise R, Bradley K, van Doremalen N, Galiano M, Elderfield RA, Stilwell P, Ashcroft JW, Fernandez-Alonso M, Miah S, LackenbyA, Roberts KL, Donnelly CA, Barclay WS. Sci Rep.2016 Jul 19;6:29793. doi: 10.1038/srep29793.PMID:27430528.

Результаты и обсуждение

Результаты Примера 1 демонстрируются на Фиг. 2 и 3. Данные результаты показывают то, что передача воздушно-капельным путем происходила менее часто у субъектов, обработанных балоксавиром, по сравнению с субъектами, обработанными оселтамивиром или плацебо (т.е. 25%-ная передача относительно 100%-ной передачи).

Кроме того, для индикаторных животных, подвергавшихся воздействию доноров, обработанных либо оселтамивиром, либо балоксавиром, наблюдали задержку во времени до вирусовыделительства по сравнению с контролем. Среднее время до вирусовыделительства составляло 4,25 суток по сравнению с 5,5 сутками для индикаторных животных, подвергавшихся прямому контакту, обработанных либо оселтамивиром, либо балоксавиром. Для индикаторных животных, подвергавшихся воздействию воздушно-капельной передачи, среднее время до вирусовыделительства составляло 4,5 суток от необработанных животных-доноров по сравнению с 9,3 сутками для животных, обработанных оселтамивиром, и 8 суток от одного обработанного балоксавиром индикаторного животного, которое приобрело инфекцию посредством RD пути.

В целом, это показывает то, что обработка балоксавиром хорьков-доноров, инфицированных вирусом рН1 N1 2009, задерживала передачу совместно содержащимся индикаторным хорькам и снижала вероятность передачи воздушно-капельным путем.

Пример 2: балоксавир марбоксил предупреждает прямую контактную передачу

Материалы и методы

Введение антивирусных препаратов и лекарственных средств Активная форма балоксавировая кислота (S-033447, далее ВХА) и пролекарство оселтамивир фосфат (далее OST) были любезно предоставлены Shionogi & Co., Ltd., Япония. Носителем для доставки ВХА была метилцеллюлоза (Sigma-Aldrich, Австралия) в 0,5%-ном (масс/об.) водном растворе, полученном с использованием стерильной воды (далее раствор МС). ВХА в суспензии с раствором МС (1 мг/мл) готовили с использованием агатовых ступки и пестика, и доставляли обратимо анестезированным животным за одну обработку, состоящую из 4 подкожных инъекций в 4 места на спинной области (общая доза 4 мг/кг на животное). Животным в группе плацебо дозировали идентичным образом с использованием одного раствора МС (1 мл/кг). Дозы OST (10 мг/мл) готовили в растворе сахара (1 г/мл) и доставляли дважды в сутки (интервал 8 часов) не подвергавшимся воздействию седативного средства хорькам посредством перорального пути (общая доза 10 мг/кг/сутки).

Клетки и вирус

Клетки собачьей почки Madin-Darby (MDCK) поддерживали в среде Игла, модифицированной по Дульбекко (DMEM, Gibco), дополненной 10% (об./об.) фетальной телячьей сыворотки, 2 мМ GlutaMAX, 0,05% бикарбоната натрия, 100 мкМ MEM (минимальная питательная среда) с заменимыми аминокислотами, 20 мМ HEPES и 50000 U пенициллина-стрептомицина (полная смесь, именуемая "ростовая среда»).

Для инокуляции животных использовали вирус гриппа A/Perth/265/2009 H1N1pdm09. Данный вирус выделяли из клинического образца (Lab#910894) в Центре сотрудничества Всемирной организации здравоохранения по эталонам и исследованию гриппа (WHOCCRRI, Мельбурн, Австралия). Вирусы очищали с использованием бляшек и размножали в клетках MDCK.

Животные

Аутбредных самцов хорьков (Mustela purtorius furo) старше 12 недель и весящих 600-1800 г, получали от независимых специалистов по разведению животных и подтверждали то, что они были серонегативными против антигенов недавно циркулирующего гриппа (A/Michigan/45/2015, A/Singapore/INFIMH-16-0019/2016, B/Phuket/3073/2013, B/Brisbane/60/2008) посредством анализа ингибирования гемагглютинации (HI). Подкожно имплантировали чипы для идентификации/отслеживания температуры (LifeChip, Bio-Thermo) на спинную область каждого хорька. Животных отслеживали по меньшей мере один раз в сутки на изменения температуры и массы, и обеспечивали неограниченный доступ к пеллетированному корму (Eukanuba) и воде с дополнительной влажной пищей (Hill's Pet Nutrition, Австралия), как требуется с этической точки зрения (до 90% исходной массы). Стандартный отбор образцов проводили под воздействием седативных средств с использованием внутримышечной инъекции ксилазина (5 мг/кг) (Troy Laboratories), тогда как инокуляцию вируса и подкожную доставку лекарственного средства проводили под обратимой анестезией посредством внутримышечной инъекции кетамина (10 мг/кг) (Troy Laboratories) в комбинации с мидазоламом (0,5 мг/кг) (Troy Laboratories) и мидетомидином (0,02 мг/кг) (Troy Laboratories), антагонистический эффект на которые оказывал атипамезол (0,01 мг/кг) (Troy Laboratories). Хорькам в конечный момент времени в.м. (внутримышечно) инъецировали необратимый анестетик, состоящий из кетамина (вплоть до 25 мг/кг) и ксилазина (вплоть до 5 мг/кг), перед умерщвлением избыточной дозой пентобарбитона натрия (Troy Laboratories) (вплоть до 1000 мг/кг) посредством внутрисердечной инъекции.

Исследования на хорьках проводили в помещении биоресурсов (уровень физической локализации 2) в Peter Doherty Institute (Мельбурн, Австралия), согласно кодексу практики правительства Австралии, Национального совета по здравоохранению и медицинским исследованиям в отношении ухода и применения животных для научных целей (8-е издание). Методики исследования были одобрены (АЕС#1714278) Комитетом по этике обращения с животными Университета Мельбурна в биохимии и молекулярной биологии, стоматологии, медицине, микробиологии, иммунологии и хирургии (Biochemistry & Molecular Biology, Dental Science, Medicine, Microbiology & Immunology, and Surgery Animal Ethics Committee of The University of Melbourne).

Вирусология

Образцы назальных смывов хранили с 1%-ным (масс./об.) бычьим сывороточным альбумином (BSA) при -80°С до определения вирусного титра посредством анализа TCID₅₀. Вкратце, образцы серийно разводили в 10 раз в бессывороточной ростовой среде, содержащей трипсин, обработанный ТРСК (4 мкг/мл; Sigma-Aldrich), и добавляли в тройной повторности в плоскодонные 96-луночные планшеты, содержащие конфлюентный монослой клеток MDCK в каждой лунке. После инфекции клетки поддерживали в бессывороточных ростовых средах (содержащих 4 мкг/мл трипсина, обработанного ТРСК) в течение 96 ч при 37°С, 5% CO₂, перед оценкой роста вируса посредством анализа гемагглютинации с использованием 1% эритроцитов (RBC) индейки. Титры TCID₅₀ рассчитывали способом Рида и Мюнха (1938) (Reed, L.J., and Muench, Н. (1938), American Journal of Epidemiology 27, 493-497).

Количественный ПЦР-ОТ в реальном времени

Вирусную РНК выделяли из 200 мкл образцов назальных смывов с использованием набора для выделения NucleoMag VET (Macherey Nagel) на платформе KingFisher Flex (ThermoFisher Scientific) согласно инструкциям изготовителя. Число копий гена М вируса гриппа в 4 мкл РНК определяли посредством количественной ПЦР-ОТ в реальном времени, проводимой с использованием набора SensiFAST Probe Lo-ROX One-Step qRT-PCR System (Bioline) на системе ПЦР в реальном времени ABI 7500 (Applied Biosystems) при следующих условиях циклирования: 45°С в течение 10 мин, 1 цикл; 95°С в течение 2 мин, 1 цикл; 95°С в течение 5 с, затем 60°С в течение 30 с, 40 циклов. РНК образца количественно измеряли с использованием стандартов РНК вируса гриппа А с известным числом копий, любезно предоставленных Seqirus, Австралия. Наборы универсальных праймеров/зондов для анализа в реальном времени вируса гриппа А были любезно предоставлены CDC Influenza Branch (Atlanta, США) (последовательности доступны по запросу). Результаты анализировали посредством программы v1.5.1 7500 Fast System SDS.

Серология

Сыворотки отбирали из образцов крови реципиента в конечный момент времени посредством центрифугирования, а неспецифичные ингибиторы агглютинации удаляли посредством обработки ферментом, разрушающим рецептор (RDE) (Denka Seiken) согласно инструкциям изготовителя. Обработанные сыворотки адсорбировали с использованием RBC индейки до анализа HI для удаления неспецифичных факторов агглютинации. Вкратце, сыворотку (исходно разведение 1:20) серийно двухкратно разводили в PBS в 96-луночных планшетах с V-образным дном (последний ряд оставляли в качестве негативного контроля - PBS). Вирус A/Perth/265/2009, доведенный до 4 гемагглютинирующих единиц в 25 мкл, смешивали во всех лунках с образцами в течение 1 ч инкубации при комнатной температуре, с последущей 45 мин инкубацией в 1% RBC индейки. Позитивное ингибирование определяли как появление картины бегущей «слезы», сравнимой с негативным контролем - PBS. Титр HI рассчитывали как обратное значение наибольшего разведения сыворотки, при котором ингибировалась агглютинация.

Анализ противовирусной фармакокинетики

Отобранные в конечный момент времени образцы крови донора, обработанного ВХА и плацебо, собирали в гепаринизированные пробирки, и плазму выделяли центрифугированием. Образцы плазмы хранили при -80°С до транспортировки в аналитические блоки Shionogu & Co., Ltd.

Статистические анализы

Анализ данных проводили с использованием Graphpad Prism (программа GraphPad, v5.01). Вирусные титры назальных смывов всех хорьков в каждые сутки после инокуляции/воздействия сравнивали посредством парного двухфакторного дисперсионного анализа (ANOVA), с последующим критерием множественных сравнений Тьюки. Количественную ПЦР-ОТ в реальном времени проводили на контрольной РНК вируса гриппа с известным числом копий для получения стандартной кривой (линейная регрессия значений порогового цикла (Ct) гриппа отосительно числа копий). Число копий вируса в образцах РНК назального смыва в том же самом анализе рассчитывали с использованием формулы стандартной кривой. Число копий вируса гриппа А для каждой группы хорьков сравнивали посредством парного двухфакторного ANOVA с последующим критерием множественных сравнений Тьюки. р меньше 0,05 считали статистически значимым.

Схема исследования

Динамика Экспериментов 1 -3 показана на Фиг. 4, 8 и 11.

Экспериментальные группы и схемы обработки

Данное исследование состояло из трех отдельных Экспериментов с использованием разных схем противовирусной обработки и расписания совместного содержания наивных животных. В каждом эксперименте двадцать четыре хорька случайным образом приписывали в три группы (n равно 8): ВХА, OST и плацебо. В пределах каждой группы n равно 4 хорьков назначали обработанными хорьками-донорами, а n равно 4 - наивными реципиентами. В 0 DPI (сутки после инокуляции) для каждого эксперимента всех хорьков-доноров (каждый содержался индивидуально) интраназально инокулировали гриппом A/Perth/265/2009 в 10³ дозах заражения 50% культуры ткани (TCID₅₀) в 40 мкл фосфатно-солевого буферного раствора (PBS). Как описано выше, доноры в группах ВХА и плацебо получали одну противовирусную обработку, тогда как доноров группы OST обрабатывали ежесуточно до конечного момента времени (исключая сутки забоя). В назначенный момент времени наивных хорьков-реципиентов совместно содержали с обработанными хорьками донорами (1:1 на клетку) в течение периода контактного воздействия 48 ч.

Эксперимент 1: противовирусная обработка всех доноров начиналась в 1 DPI, и наивных хорьков-реципиентов содержали совместно немедленно после обработки. Массу тела и температуру отслеживали ежесуточно у всех животных.

Образцы ежесуточных назальных смывов отбирали в 1 мл PBS с 1 DPI до 3 DPI для животных-доноров и от 1 суток после воздействия (DPE) до 10 DPE для животных-реципиентов. Доноров умерщвляли в 3 DPI (2 DPE), и кровь отбирали у хорьков, обработанных ВХА и плацебо, посредством прокола сердца. Реципиентов умерщвляли в 10 DPE.

Эксперимент 2: противовирусная обработка начиналась в 1 DPI, и совместное содержание с реципиентом задерживалось до 24 ч после обработки (2 DPI). У всех животных ежесуточно отслеживали массу тела и температуру. Образцы ежесуточных назальных смывов отбирали с использованием 1 мл PBS от 1 DPI до 4 DPI для животных-доноров, и от 1 DPI до 10 DPI для животных-реципиентов. Доноров умерщвляли в 4 DPI (2 DPI), и отбирали кровь у хорьков, обработанных ВХА и плацебо, посредством пункции сердца. Реципиентов поддерживали до 16 DPE, причем в данное время отбирали кровь посредством пункции сердца.

Эксперимент 3: противовирусная обработка начиналась в 2 DPI, и сразу после этого реципиенты содержались совместно. У всех животных ежесуточно отслеживали массу тела и температуру. Образцы ежесуточных назальных смывов отбирали с использованием 1 мл PBS от 1 DPI до 4 DPI для животных-доноров, и от 1 DPI до 10 DPI для животных-реципиентов. Доноров умерщвляли в 4 DPI (2 DPI), и отбирали кровь у хорьков, обработанных ВХА и плацебо, посредством пункции сердца. Реципиентов поддерживали до 16 DPE, причем в данное время отбирали кровь посредством пункции сердца.

Результаты и обсуждение

В трех независимых экспериментах одна обработка ВХА хорьков, инфицированных H1N1pdm09, значимо снижала титры патогенного вируса в URT по сравнению как с плацебо, так и с оселтамивиром (Фиг. 14). Средние титры вируса группы балоксавира были значимо снижены по сравнению с группой плацебо через 24 часа после обработки при всех экспериментальных условиях (р меньше или равно 0,05). В то время как высокие инфекционные титры поддерживались в конечный момент времени для донора для доноров группы оселтамивира и группы плацебо, доноры, обработанные балоксавиром, не были (т.е. 0/4) TCID₅₀-позитивными в конечный момент времени при всех экспериментальных схемах. Эффект балоксавира превосходит эффект оселтамивира у обработанных доноров (Фиг. 15). Все (т.е. 4/4) донора, обработанных оселтамивиром, были TCID₅₀-позитивными в конечный момент времени при всех условиях - не было снижения по сравнению со всеми (т.е. 4/4) донорами, обработанными плацебо.

В используемой хорьковой модели реципиенты группы плацебо демонстрируют то, что частота контактной передачи А/Perth/265/2009 наивным хорькам составляет 100% (Фиг. 14-15). Реципиенты группы плацебо демонстрируют надежную кинетику вируса, измеренную как посредством TCID₅₀, так и кПЦР-ОТ, и сывороточные антительные ответы с высоким титром (больше 1280) в конечный момент времени для реципиента (Фиг. 7, 10, 13). Авторы данного изобретения наблюдали то, что обработка оселтамивиром не снижает контактную передачу наивным хорькам. 100% реципиентов, обработанных оселтамивиром, демонстрировали параметры инфекции, которые являются очень сходными с плацебо, независимо от расписания противовирусной обработки (Фиг. 7, 10, 13). В отличие от этого, обработка балоксавиром в пределах 24 ч инфекции приводила к 75%-ному снижению передачи. В обоих Эксп. 1 и 2 только 1/4 реципиентов группы балоксавира демонстрировала кинетическую кривую TCID₅₀ вируса, указывающую на инфекцию, аналогичную плацебо (Фиг. 7, 10). При введении обработки балоксавиром через 48 ч после инфекции все еще наблюдалось 50%-ное снижение передачи (Фиг. 13).

Количество вирусной РНК в URT хорьков, обработанных балоксавиром, не коррелирует с изменениями титра патогенного вируса, измеренного посредством культивирования клеток.

В то время как вирусная РНК выявлялась у 2/4 реципиентов группы балоксавира в Эксп. 1, число копий приближалось к порогу позитивного выявления, и кинетика вируса не была сходной с кривой вируса группы плацебо (Фиг. 7).

Несмотря на присутствие вирусовыделительства в URT, выявленного посредством кПЦР-ОТ, данные вирусы, по-видимому, не способны продуцировать выявляемую инфекцию в культуре клеток.

Антительные ответы выявляли у TCID₅₀-негативных реципиентов группы балоксавира в Эксп. 2 (Фиг. 10, 15563) и 3 (Фиг. 13, 96642, 14779), но они были снижены в 16-32 раза по сравнению с титрами реципиентов группы плацебо.

Средняя плазматическая концентрация балоксавира достигала максимума через 3 часа после дозы (26,1 нг/мл) и затем постепенно снижалась к последнему моменту отбора образцов (168 часов после дозы, 9,08 нг/мл). Данный результат показывает то, что одно подкожное введение суспензии балоксавира в дозировке 4 мг/кг (4 места, 1 мг/кг на место) могло поддерживать плазматическую концентрацию балоксавира у хорька в течение одной недели или более.

Кроме того, данные ясно показывают то, что обработка балоксавиром снижает контактную передачу.

Пример 3: моделирование передачи гриппа для балоксавира

На основе неожиданной находки о том, что балоксавир марбоксил способен предупреждать передачу вируса гриппа, можно было осуществлять моделирование, которое показывает эффект обработки балоксавиром на вспышки гриппа. Для данного моделирования также рассматривалось влияние балоксавира на время прекращения вирусовыделительства (Tshed), наблюдающееся в Фазе 3 клинического испытания (NCT02954354).

Данное моделирование осуществляли посредством предоставления ожидаемой процентной доли инфицированных пациентов во время эпидемии гриппа и пандемии гриппа посредством разработки специфической модели, учитывающей

- грипп/социальные характеристики

- разные эффекты обработки

О модели

В Примерах 1 и 2, как описано выше, показано то, что обработка балоксавиром не только снижает вирусовыделительство, но также неожиданно снижает передачу. Удивительная и неожиданная информация о том, что балоксавир марбоксил может использоваться для снижения передачи, является предпосылкой для проведенного ниже моделирования, которое моделирует эффект обработки балоксавира марбоксилом во время (возникающей) эпидемии гриппа или пандемии гриппа.

Для этого моделирования использовали модель эпидемиологического SEIR. Впервые описанная в начале XX века (Kermack and McKendrick) такая модель характеризует число инфекций в популяции посредством интегрирования разных типов индивидов: чувствительных, подвергавшихся воздействию, инфицированных и выздоровевших индивидов. Такая модель фактически широко используется для планирования пандемии гриппа, политических решений относительно создания резервных запасов и перемещения противовирусных средств, и других вмешательств, и описывается, например, в Murillo, J TheorBiol. 2013. 332:267-290.

Предположения

1) Вирусовыделительство коррелирует с инфективностью с постоянной инфективностью во время периода вирусовыделительства.

2) Результаты Фазы 3 дают правильные оценки ожидаемого времени вирусовыделительства для обработок балоксавиром и оселтамивиром.

3) Все пациенты будут иметь:

- одинаковый латентный период

- одинаковую продолжительность естественного заболевания

- одинаковый показатель инфективности за время заболевания

- отсутствует специфическое вмешательство, отличное от обработки

- отсутствуют эффекты возраста, географии или состояния здоровья на чувствительность.

Результаты и обсуждение

Значимое снижение процентных долей инфицированных пациентов с балоксавиром по сравнению с плацебо или оселтамивиром как при сезонном (см. Фиг. 15), так и при пандемическом (см. Фиг. 16) сценариях.

Результаты показывают то, что % обработанных пациентов, требующийся для снижения наполовину числа инфицированных пациентов, составляет приблизительно 15% обработанных или 30% обработанных при эпидемии или пандемии соответственно. Точный порог для классификации вспышки гриппа как «эпидемической» или «пандемической» изменяется каждый год. Однако ввиду полученных результатов весьма вероятным является то, что обработка по меньшей мере 15% или по меньшей мере 30% инфицированных людей балоксавиром марбоксилом предупреждало бы эпидемию гриппа или пандемию гриппа соответственно.

Пример 4: идентификация передачи на основе последовательности

Для идентификации пар передачи может проводиться филогенетический анализ (полногеномное древо с бутстрепной поддержкой топологии древа или кластеризации) и/или измерение генетического расстояния между парными популяциями (L1-Norm). На результат данного анализа влияют два фактора: во-первых, количество доступных данных по последовательностям. Для максимизации этого может проводиться полногеномное секвенирование следующего поколения (WGNGS) для увеличения уровня детализации и дискриминативности (по сравнению с секвенированием по Сэнджеру и/или секвенированием одиночных генов). Во-вторых, анализируется разнообразие в сообществе/метапопуляции, таким образом, что с высокой достоверностью может быть осуществлена оценка того, что вирусы в пределах пар в домашнем хозяйстве являются более сходными друг с другом по сравнению с внешней группой. Больше последовательностей, полученных из сообщества, увеличивают разнообразие в данной группе и, таким образом, облегчают идентификацию фактических пар передачи. Поскольку секвенирование для лиц, не зарегистрированных в данном исследовании, не может проводиться, авторы данного изобретения проведут данный анализ в отношении подгруппы пациентов, сосредотачиваясь на местах, в которых зарегистрировалось адекватное число индикаторых пациентов (IP) с уникальными последовательностями. Кроме того, авторы данного изобретения попытаются получить последователности из общестенных баз данных для того же самого сезона (ожидается, что данный путь даст мало, но ему будут следовать).

В предыдущем исследовании, изучающем эволюцию вируса гриппа в когорте HIVE, проанализировали 47 пар передачи, и они могли быть различены на основе последовательности. Тридцать четыре пары из них были из одного сезона (H3N2, 2014/2015). На основе данных результатов ожидается, что будет достаточно 15 или больше индикаторных пациентов (IP), предпочтительно по меньшей мере 30-40 индикаторных пациентов (IP) для разработки распределения в сообществе парных расстояний, отражающих разнообразие сообщества, таким образом, что можно вывести фактические события передачи в домашнем хозяйстве с данными по последовательностям, как описано в McCrone, John Т., et al. "Stochastic processes constrain the within and between host evolution of influenza virus." Elife 7 (2018): e35962. Можно использовать способы, описанные в McCrone (Elife 7 (2018): е35962), как, например, способ, который описывается в том документе для секвенирования. В контексте настоящего изобретения данный анализ предпочтительно сосредоточен на анализе образцов вируса гриппа А.

Для того, чтобы лучше понять способ, который использовался для идентификации пар передачи, а также базовые аспекты данного способа, содержание документа McCrone (Elife 7 (2018): е35962) вкратце обсуждается ниже.

В McCrone (Elife 7 (2018): е35962) использовали и эпидемиологическую связь, и генетическое родство вирусов в домашних хозяйствах для определения пар передачи и исключения вмешательства фонового разнообразия в сообществе.

Более конкретно, в McCrone (Elife 7 (2018): е35962) описывается то, что исследования популяций вируса гриппа A (IAV) в животных и человеческих системах свидетельствуют о том, что большинство однонуклеотидных вариантов в хозяине (iSNV) являются редкими, и что популяции в хозяине подвергаются сильному очищающему отбору. В McCrone (Elife 7 (2018): е35962) использовали секвенирование следующего поколения популяций вируса гриппа в пределах хозяина для определения эволюционной динамики IAV в пределах и между человеческими хозяевами. Применяли цепочку процессов сравнительного анализа для идентификации iSNV и характеристики генетического разнообразия популяций H3N2 и H1N1, отобранных на протяжении пяти постпандемических сезонов от индивидов, зарегистрированных в проспективном исследовании гриппа в домашних хозяйствах. В McCrone (Elife 7 (2018): е35962) авторы обнаруживают то, что популяции внутри хозяина являются динамичными и ограниченными генетическим дрейфом и очищающим отбором. В исследовании McCrone (Elife 7 (2018): е35962) положительный отбор редко амплифицировал полезный вариант de novo до частоты, большей, чем 2%. В отличие от того, что раньше сообщали в отношении передачи человеческого гриппа, но в соответствии с тем, что наблюдали у многих других вирусов с отличными способами передачи, в McCrone (Elife 7 (2018): е35962) идентифицировали очень узкое эффективное бутылочное горлышко передачи, которое ограничивает передачу вариантов с низкой частотой.

В McCrone (Elife 7 (2018): е35962) индивиды в пределах домашнего хозяйства рассматривались как эпидемиологически связанная пара передачи, если они оба были позитивными в отношении того же самого подтипа вируса гриппа в пределах 7 суток друг от друга. Несколько домашних хозяйств имели 3 или четыре симптоматических случая в пределах данного однонедельного окна, свидетельствующих о более длительных цепях передачи.

Однонуклеотидные варианты внутри хозяина (iSNV) были идентифицированы в McCrone (Elife 7 (2018): е35962) 2014) с использованием их эмпирически подтвержденной цепочки анализа. В соответствии с предыдущими исследованиями природных инфекций и других инфекций авторы McCrone (Elife 7 (2018): е35962) обнаружили то, что разнообразие в пределах хозяина популяций сезонного вируса гриппа A (IAV) является низким. Двести сорок три из 249 образцов имели меньше, чем 10 минорных iSNV (медиана 2, IQR 1-3). Число минорных идентифицированных iSNV не подвергалось влиянию суток инфекции, вирусной нагрузки, подтипа или статуса вакцинации.

В McCrone (Elife 7 (2018): е35962) однонуклеотидные варианты были равномерно распределены по геному. Минорные варианты редко были общими среди многих индивидов. Девяносто восемь процентов минорных iSNV были обнаружены только один раз, 2,3% были обнаружены у двух индивидов, и минорные iSNV не были обнаружены у трех или более индивидов. Низкий уровень общего между индивидами разнообразия свидетельствует о том, что популяции в пределах хозяина используют отличные области пространства последовательности с малым доказательством параллельной эволюции. Отношение несинонимичных к синонимичным вариантам составляло 0,75, и, принимая во внимание избыток несинонимичных сайтов по геному и в пределах гена НА, эти данные свидетельствуют о значительном очищающем отборе в пределах хозяев.

В McCrone (Elife 7 (2018): е35962) обнаружили то, что большинство iSNV (68%), обнаруженных во втором образце, были либо новыми, либо присутствующими ранее меньше 2%-ного предела выявления. В целом, данные McCrone (Elife 7 (2018): е35962) свидетельствуют о том, что популяция, присутствующая в верхних дыхательных путях, является высокодинамичной при поддержании стабильного консенсуса, и что положительный отбор новых вариантов в пределах хозяев является неэффективным и редко амплифицирует вновь генерированный вариант до частоты больше, чем 2%.

Данные в пределах хозяина McCrone (Elife 7 (2018): е35962) свидетельствуют о том, что вновь возникающие iSNV с положительными эффектами приспособляемости вероятно присутствуют с низкими частотами (меньше 2%) во время острой инфекции. Поддержание данных мутаций в популяциях хозяина, следовательно, сильно зависит от бутылочного горлышка передачи.

В McCrone (Elife 7 (2018): е35962) все индивиды в домашнем хозяйстве с началом симптома в пределах 7-суточного окна рассматривались как эпидемиологически связанные. Донор в каждой предположительной паре был определен как индивид с более ранним началом симптомов. Событие передачи игнорировалось, если имелось много возможных доноров с теми же самыми сутками начала симптомов. Донору и реципиентам не разрешалось иметь начало симптомов в те же самые сутки, если данные индивиды оба не были индикаторными случаями для домашнего хозяйства. На основе данных критериев когорта McCrone (Elife 7 (2018): е35962) имела 124 предположительных события передачи в домашнем хозяйстве за пять сезонов. Из них 52 пары имели образцы достаточного качества для надежной идентификации iSNV от обоих индивидов.

Затем данные по последовательностям использовали в McCrone (Elife 7 (2018): е35962) для определения того, какие из данных 52 эпидемиологически связанных пар представляли истинные события передачи в домашнем хозяйстве, в отличие от совпадающих приобретенных в сообществе инфекций. Генетическое расстояние между популяциями гриппа из каждой пары домашнего хозяйства измеряли посредством L1-norm, и данные расстояния сравнивали с расстояниями случайно назначенных пар сообщества в пределах каждого сезона.

В McCrone (Elife 7 (2018): е35962) истинной парой передачи считались только индивиды, если они имели генетическое расстояние меньше 5-го процентиля распределения в сообществе случайно назначенных пар. Сорок семь событий передачи в домашнем хозяйстве удовлетворяли данному событию. Среди данных 47 пар передачи с подтвержденной последовательностью три не имели iSNV у донора, и один дополнительный донор, по-видимому, имел смешанную инфекцию. Эти четыре события передачи удаляли из анализа бутылочного горлышка, т.к. доноры без iSNV не являются информативными, и смешанные инфекции нарушают предположения модели о независимости места. Оценивали бутылочное горлышко передачи у остающихся 43 пар высокого качества (37 H3N2, 6 H1N1).

Бутылочное горлышко передачи ограничивает количество генетического разнообразия, которое является общим для обоих членов пары. В McCrone (Elife 7 (2018): е35962) обнаружили то, что незначительное число минорных iSNV были полиморфными в популяциях как донора, так и реципиента. Минорные iSNV у донора либо отсутствовали, либо фиксировались у реципиента. Отсутствие общих полиморфных сайтов свидетельствует о строгом эффективном бутылочном горлышке, в котором только один аллель передается от донора к реципиенту.

Авторы McCrone (Elife 7 (2018): е35962) заключают то, что острые гриппозные инфекции отличаются малым разнообразием, ограниченным положительным отбором и узкими бутылочными горлышками передачи. Поскольку использовали вирусы, собранные за пять сезонов гриппа у индивидов, зарегистрированных в проспективной когорте домашнего хозяйства, данная динамика, вероятно, является широко репрезентативной для многих сезонных инфекций гриппом в регионах с умеренным климатом. Данные McCrone (Elife 7 (2018): е35962) свидетельствуют о том, что даже если отбор действует ниже уровня выявления, маловероятно, что такие редкие варианты передаются. Принимая во внимание размер оценочного бутылочного горлышка, вероятность передачи составляет приблизительно 1,7% для варианта при частоте 1% и 3,3% для варианта при частоте 2%.

Пример 5: фармакокинетический анализ у хорька

Материалы, методы и результаты для животных

Аутбредные самки хорьков в возрасте 28 месяцев и весящие 650-802 г приобретали у Japan SLC, Inc. Идентификацию проводили мечением последовательными номерами спереди каждой клетки. Животных отслеживали по меньшей мере один раз в сутки в отношении их клинических наблюдений, и они имели неограниченный доступ к пеллетированному корму (LabDiet High Density Ferret Diet, Lab Supply, США) и воде. Хорьков в конечный момент времени умерщвляли посредством обескровливания под анестезией посредством ингаляции изофлурана (Pfizer). Исследования на хорьках проводили в Shionogi Pharmaceutical Research Center, Shionogi & Co., Ltd. (Осака, Япония) согласно протоколу исследования животных, который был одобрен Институциональным комитетом по уходу и применению животных в Шионогу.

Введение лекарственного средства и отборы крови

Активная форма балоксавировой кислоты (S-033447, далее ВХА) была предоставлена персоналом контроля анализируемых веществ, Shionogi & Co., Ltd., Япония. Носителем для доставки ВХА была метилцеллюлоза (Fuji-Film Wako, Япония) в 0,5% масс/об. водном растворе, полученном со стерильной водой (далее раствор МС). ВХА в суспензии с раствором МС (1 мг/мл) готовили с использованием агатовой ступки и пестика и доставляли обратимо анестезированным животным в одной обработке, состоящей из 4 подкожных инъекций в 4 места на спинной области (общая доза 4 мг/кг на животное). После дозирования укол иглой приводит к кровотечению из вены задней лапы для отбора крови, и затем образцы крови (приблизительно 60-100 мкл) отбирали из кровоточащей части с использованием гепаринизированных капиллярных трубок (Drummond Scientific Company, США) в запланированное время, и плазму отбирали центрифугированием. Образцы плазмы хранили в морозильнике при приблизительно -80°С до применения для анализа системой жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией (ЖХ-МС/МС).

Определение ВХА в плазме

Концентрацию ВХА в плазме определяли посредством ЖХ-МС/МС, состоящей из системы LC-20A (Shimadzu Corporation, Япония) и API 5000 (АВ SCIEX, США). Образцы плазмы получали осаждением белка. Хроматографическое разделение осуществляли на не содержащей металлы L-колонке 2 ODS (3 мкм, i.d. (внутренний диаметр) 2,0 мм × 50 мм, Chemicals Evaluation and Research Institute, Япония) при 40°С. Бинарные подвижные фазы - 0,1% муравьиной кислоты в воде и 0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле - доставляли при общей скорости тока 0,6 мл/мин в градиентном режиме. Масс-спектрометр работал в режиме электрораспылительной ионизации (ЭРИ) положительной полярности с использованием мониторинга множественных реакций (MRM). Отслеживали переходы предшественник/продукт (m/z) 484/247 и 490/247 для ВХА и внутреннего стандарта - ВХА-рацемат-d₄ ¹⁸О соответственно. Расчеты были основаны на отношениях площадей пиков ВХА ко внутреннему стандарту. Данный аналитический способ был подтвержден в интервале калибровки от 0,5 до 500 нг/мл в отношении селективности, выхода, аккуратности, точности и стабильности при целом ряде условий.

Фармакокинетический анализ

Плазматические концентрации ВХА для каждого индивидуального хорька рассчитывали программой Analyst (АВ SCIEX, США). Среднее значение и стандартное отклонение также рассчитывали с использованием индивидуальных данных посредством Microsoft Excel (Microsoft Co., США).

Результат и обсуждение

Средняя плазматическая концентрация достигала максимума через 3 часа после дозы (26,1 нг/мл) и затем постепенно снижалась к последней точке отбора образца (168 часов после дозы, 9,08 нг/мл). Данный результат показал то, что однократное подкожное введение суспензии ВХА в концентрации 4 мг/кг (4 места, 1 мг/кг на место) могло поддерживать плазматическую концентрацию ВХА у хорька в течение недели или более.

Настоящее изобретение относится к следующим нуклеотидным и аминокислотным последовательностям:

SEQ ID NO: 1: прямой праймер для ПЦР в реальном времени

5'G АСС R ATCCTGTCACCTCTG А 3'

SEQ ID NO: 2: обратный праймер для ПЦР в реальном времени

5' AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA3'

SEQ ID NO: 3: зонд для ПЦР в реальном времени («FAM» означает амидит флуоресцеина, т.е. флуоресцентный краситель для мечения олигонуклеотидов; «BHQ1» означает ловушку черная дыра 1, т.е. ловушку; BHQ1 и FAM совместно не являются флуоресцентными, только после расщепления зонда FAM будет флуоресцентным)

5' FAM-TCG AGTCCTCGCTCACTGGGCACG - В Н Q1 3'

SEQ ID NO: 4: вирус гриппа A (A/WSN/1933(H1N1)): GenBank: Х17336.1, содержащий мутацию I38T. Мутация I38T подчеркнута и показана жирным шрифтом.

SEQ ID NO: 5: доля последовательности вируса гриппа А (A/WSN/1933(H1N1)): GenBank: Х17336.1, содержащая мутацию I38T. Мутация I38T подчеркнута и показана жирным шрифтом.

FAATCTH

Изобретение относится к области медицины и фармацевтики, а именно к применению соединения формулы I или II или его фармацевтически приемлемой соли для снижения скорости передачи инфекции вируса гриппа, где соединение или его фармацевтически приемлемую соль вводят нулевому пациенту, инфицированному вирусом гриппа. Использование изобретения позволяет эффективно для снижения скорости передачи инфекции вируса гриппа от инфицированного пациента здоровому, предотвращая распространение вирусной инфекции. 48 з.п. ф-лы, 18 ил., 5 пр.

1. Применение соединения или его фармацевтически приемлемой соли для снижения скорости передачи инфекции вирусом гриппа, где соединение или его фармацевтически приемлемую соль вводят нулевому пациенту, инфицированному вирусом гриппа, где указанное соединение имеет одну из следующих формул I и II:

2. Применение по п. 1, где указанное соединение снижает инфективность вируса гриппа нулевого пациента.

3. Применение по п. 1 или 2, где скорость передачи вируса гриппа от нулевого пациента снижается в пределах от одного часа до 32 часов с момента 1-го введения указанного соединения.

4. Применение по любому из пп. 1-3, где скорость передачи вируса гриппа от нулевого пациента снижается в пределах 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 или 32 часов с момента 1-го введения указанного соединения.

5. Применение по любому из пп. 1-4, где скорость передачи вируса гриппа от подвергавшегося лечению нулевого пациента снижается до 70% или меньше, предпочтительно до 50% или меньше, более предпочтительно до 30% или меньше по сравнению со скоростью передачи вируса гриппа от контрольного пациента.

6. Применение по п. 5, где контрольный пациент инфицирован вирусом гриппа, и ему не вводили указанное соединение.

7. Применение по п. 5 или 6, где контрольному пациенту вводили лекарственное средство против гриппа, за исключением соединения формулы (I) или (II), или его фармацевтически приемлемой соли.

8. Применение по любому из пп. 5-7, где контрольному пациенту не вводили лекарственное средство против гриппа.

9. Применение по любому из пп. 1-8, где передача происходит, когда по меньшей мере одно контактное лицо подвергавшегося лечению нулевого пациента или контрольного пациента получает инфекцию вирусом гриппа после персонального контакта с подвергавшимся лечению нулевым пациентом или контрольным пациентом соответственно.

10. Применение по п. 9, где контактное лицо подвергавшегося лечению нулевого пациента представляет собой лицо, которое:

(i) не имело инфекции вирусом гриппа в момент времени, когда указанное соединение вводили нулевому пациенту первый раз; и

(ii) имело персональный контакт с подвергавшимся лечению нулевым пациентом во время инфекции вирусом гриппа нулевого пациента.

11. Применение по п. 10, где контактное лицо имело персональный контакт с подвергавшимся лечению нулевым пациентом в пределах 10 суток с момента введения указанного соединения нулевому пациенту.

12. Применение по п. 10 или 11, где контактное лицо имело персональный контакт с подвергавшимся лечению нулевым пациентом в пределах периода времени, начинающегося с введения указанного соединения и заканчивающегося 5-10 сутками после введения указанного соединения.

13. Применение по любому из пп. 9-12, где контактное лицо контрольного пациента представляет собой лицо, которое:

(i) не имело инфекцию вирусом гриппа в момент времени, когда лекарственное средство против гриппа вводили контрольному пациенту первый раз, или, если контрольному пациенту не вводили лекарственное средство против гриппа, в соответствующий момент времени с учетом патогенеза заболевания гриппом; и

(ii) имело персональный контакт с контрольным пациентом во время инфекции вирусом гриппа контрольного пациента.

14. Применение по п. 13, где контактное лицо имело персональный контакт с контрольным пациентом в пределах 10 суток с момента введения лекарственного средства против гриппа контрольному пациенту; или, если лекарственное средство против гриппа не вводили, в соответствующий период времени с учетом патогенеза заболевания гриппом.

15. Применение по п. 13 или 14, где контактное лицо имело персональный контакт с контрольным пациентом в пределах периода времени, начинающегося с момента введения контрольному пациенту лекарственного средства против гриппа; или, если лекарственное средство против гриппа не вводили, начиная с соответствующего момента времени с учетом патогенеза заболевания гриппом и заканчивая 5-10 сутками после введения лекарственного средства против гриппа; или, если лекарственное средство против гриппа не вводят, заканчивая в соответствующий момент времени с учетом патогенеза заболевания гриппом.

16. Применение по п. 10 или 13, где в момент времени, как определено в (i), контактное лицо было ПЦР-негативным в отношении гриппа.

17. Применение по любому из пп. 9-16, где персональный контакт представляет собой контакт, который обеспечивает передачу воздушно-капельным путем и/или прямую контактную передачу, предпочтительно только передачу воздушно - капельным путем.

18. Применение по любому из пп. 9-17, где передача от подвергавшегося лечению нулевого пациента произошла, если вирус гриппа может быть выявлен у по меньшей мере одного контактного лица подвергавшегося лечению нулевого пациента.

19. Применение по п. 18, где передача от подвергавшегося лечению нулевого пациента произошла, если вирус гриппа может быть выявлен у по меньшей мере одного контактного лица подвергавшегося лечению нулевого пациента в пределах 15 суток с момента введения указанного соединения.

20. Применение по любому из пп. 9-19, где передача от контрольного пациента произошла, если вирус гриппа может быть выявлен у по меньшей мере одного контактного лица контрольного пациента.

21. Применение по п. 20, где передача от контрольного пациента произошла, если вирус гриппа может быть выявлен у по меньшей мере одного контактного лица контрольного пациента в пределах 15 суток с момента введения другого лекарственного средства против гриппа контрольному пациенту; или, если контрольному пациенту не вводили лекарственное средство против гриппа, в пределах соответствующего периода времени с учетом патогенеза заболевания гриппом.

22. Применение по любому из пп. 3-21, где скорость передачи измеряется посредством тестирования по меньшей мере одного контактного лица нулевого пациента, подвергавшегося лечению, или контрольного пациента, соответственно, на наличие инфекции вирусом гриппа в пределах 10 суток с момента введения указанного соединения подвергавшемуся лечению нулевому пациенту, или в пределах 10 суток с момента введения другого лекарственного средства против гриппа контрольному пациенту, или, если контрольному пациенту не вводили лекарственное средство против гриппа, в пределах 10 суток с соответствующего момента времени с учетом патогенеза заболевания гриппом.

23. Применение по любому из пп. 1-22, где инфекция вирусом гриппа присутствует, если вирус гриппа может быть выявлен.

24. Применение по п. 23, где вирус гриппа выявляют посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР).

25. Применение по п. 23, где вирус гриппа выявляют посредством применения набора для анализа гриппа.

26. Применение по любому из пп. 1-25, где передача от подвергавшегося лечению нулевого пациента произошла, когда по меньшей мере одно контактное лицо подвергавшегося лечению нулевого пациента инфицировано вирусом гриппа штаммом вируса гриппа, который является идентичным штамму вируса гриппа подвергавшегося лечению нулевого пациента, и где передача от контрольного пациента произошла, когда по меньшей мере одно контактное лицо контрольного пациента инфицировано вирусом гриппа штаммом вируса гриппа, который является идентичным штамму вируса гриппа контрольного пациента.

27. Применение по любому из пп. 1-26, где передача вируса гриппа представляет собой прямую контактную передачу и/или передачу воздушно-капельным путем.

28. Применение по любому из пп. 1-27, где после введения указанного соединения и во время его/ее инфекции вирусом гриппа подвергавшийся лечению нулевой пациент имеет персональный контакт с по меньшей мере одним лицом из группы риска по гриппу или с по меньшей мере одним лицом, которое важно для функционирования общества.

29. Применение по п. 28, где по меньшей мере одно лицо из группы риска по гриппу представляет собой по меньшей мере одно лицо, имеющее повышенный риск получения инфекции вирусом гриппа или имеющее повышенный риск получения осложнения, связанного с гриппом.

30. Применение по п. 29, где осложнение, связанное с гриппом, представляет собой по меньшей мере одно осложнение, выбранное из группы, состоящей из госпитализации, синусита, среднего отита, бронхита и пневмонии.

31. Применение по п. 29 или 30, где по меньшей мере одно лицо, имеющее повышенный риск получения осложнения, связанного с гриппом, имеет повышенный риск смерти из-за инфекции вирусом гриппа.

32. Применение по любому из пп. 29-31, где по меньшей мере одно лицо, имеющее повышенный риск получения осложнения, связанного с гриппом, представляет собой индивида:

(i) имеющего хроническое сердечно-сосудистое заболевание, хроническое легочное заболевание, хроническое метаболическое заболевание, хроническое почечное заболевание, сердечно-легочное расстройство и/или который имеет ослабленный иммунитет; и/или

(ii) который находится в возрасте по меньшей мере 65 лет или младше, чем 5 лет.

33. Применение по любому из пп. 29-32, где по меньшей мере одно лицо, имеющее повышенный риск получения инфекции вирусом гриппа, представляет собой индивида, для которого вакцинация против гриппа является противопоказанной.

34. Применение по любому из пп. 28-33, где по меньшей мере одно лицо, которое является важным для функционирования общества, работает в качестве важного поставщика услуг, включая лицо, которое принадлежит к персоналу пожарных, персоналу полиции, персоналу системы здравоохранения, персоналу аварийно - спасательной службы, армии или правительству.

35. Применение по любому из пп. 1-34, где после введения указанного соединения и во время его/ее инфекции вирусом гриппа подвергавшийся лечению нулевой пациент имеет персональный контакт со многими людьми.

36. Применение по любому из пп. 1-35, где после введения указанного соединения и во время его/ее инфекции вирусом гриппа подвергавшийся лечению нулевой пациент

(i) посещает медицинское учреждение, образовательное учреждение, публичное учреждение, транспортное средство, машину, самолет и/или магазин, и

(ii) имеет персональный контакт со многими людьми.

37. Применение по п. 35 или 36, где указанное соединение вводят по меньшей мере за один час до указанного персонального контакта.

38. Применение по любому из пп. 35-37, где указанное соединение вводят по меньшей мере за 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 или 32 часа до указанного персонального контакта.

39. Применение по любому из пп. 1-38, где указанное соединение вводят в пределах 48 часов с момента наступления симптомов гриппа.

40. Применение по любому из пп. 1-39, где указанное соединение вводят один раз в виде однократного лечения.

41. Применение по любому из пп. 1-40, где эффективное количество составляет примерно 40 мг для пациентов меньше 80 кг и примерно 80 мг для пациентов 80 или больше кг.

42. Применение по любому из пп. 1-41, где указанное соединение вводят перорально.

43. Применение по любому из пп. 1-42, где нулевой пациент имеет возраст по меньшей мере 12 лет.

44. Применение по любому из пп. 1-43, где подвергавшийся лечению нулевой пациент имеет пониженный риск запуска эпидемии гриппа или пандемии гриппа по сравнению с контрольным пациентом.

45. Применение по любому из пп. 1-44, где вирус гриппа представляет собой вирус гриппа А или вирус гриппа В.

46. Применение по любому из пп. 1-45, где вирус гриппа представляет собой эпидемический штамм вируса гриппа или пандемический штамм вируса гриппа.

47. Применение по любому из пп. 1-46, где вирус гриппа является антигенно отличным по сравнению с родительским штаммом вируса гриппа в результате антигенного дрейфа и/или антигенного сдвига.

48. Применение по любому из пп. 1-47, где штамм гриппа представляет собой рециклирующий вирус, который вызывал в прошлом эпидемию или пандемию.

49. Применение по любому из пп. 1-48, где штамм вируса гриппа не несет мутацию I38X, включая мутацию I38T.