ВАКЦИННАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ НЕИММУНИЗИРОВАННЫХ ИНДИВИДУУМОВ Российский патент 2018 года по МПК A61K39/145 A61P31/16 

Область изобретения

Изобретение относится к вводимым назально вакцинным композициям, эффективным у неиммунизированных индивидуумов, таких как дети. Кроме того, вакцинная композиция является подходящей для вакцинации общей популяции при пандемии.

Уровень техники, предшествующий изобретению

Широко используемые в настоящее время вакцины против гриппа основаны на живом вирусе или инактивированном вирусе, и вакцины с инактивированным вирусом могут быть основаны на целом вирусе, "расщепленном" вирусе, субъединичных белках или на очищенных поверхностных антигенах (включая гемагглютинин и нейраминидазу).

В последнее время были признаны растущие социально-экономический эффект гриппа и его медицинские расходы у здоровых детей младшего возраста. Кроме того, у детей наблюдается наиболее высокая частота поражения гриппом во время периодов эпидемии, и передачи вирусов гриппа в обычной социальной среде другим группам риска.

Здоровые дети младшего возраста подвергаются повышенному риску инфекции гриппа, т.к. они не обладают полностью развитой иммунной системой. Груднички в первые три месяца своей жизни являются восприимчивыми к инфекциям, которые не являются широко распространенными у индивидуумов более старшего возраста, (таким как Streptococcus agalactiae), и груднички зависят от материнского антитела в течение первых нескольких месяцев жизни. Груднички не реагируют на определенные вакцины таким же образом как взрослые и неспособны вырабатывать эффективные антитела против полисахаридных антигенов приблизительно до возраста 5 лет. Иммунная система растет и развивается с ребенком и абсолютно не похожа на иммунную систему взрослого до пубертатного периода, когда половые гормоны могут обеспечивать полное созревание иммунной системы ребенка.

Американский консультативный комитет по проблемам вакцинации (ACIP) рекомендовал ежегодную вакцинацию против гриппа для всех детей в возрасте 6-59 месяцев, т.к. дети в возрасте 6-23 месяцев подвергаются по существу повышенному риску связанных с гриппом случаев госпитализации, и дети в возрасте 24-59 месяцев подвергаются повышенному риску связанных с гриппом случаев обращений в клиники и отделения неотложной помощи. Рекомендация была расширена на вакцинацию против сезонного гриппа для всех индивидуумов в возрасте ≥6 месяцев, у которых нет противопоказаний. Управление по контролю пищевых продуктов и лекарственных средств США классифицирует субпопуляции детей на основании следующих ниже возрастных диапазонов. Популяция новорожденных находится в диапазоне возраста от рождения до 1 месяца. Популяция грудничков находится в диапазоне возраста от 1 месяца до 2 лет. Популяция детей находится в диапазоне возраста от 2 лет до 12 лет. Популяция подростков находится в диапазоне возраста от 12 до 21 года. В Европе некоторые страны выпустили аналогичные рекомендации, как и ACIP, хотя с более ограниченным положением по отношению к всеобщей иммунизации детей младшего возраста. Европейское агентство по лекарственным средствам классифицирует лекарственные средства для детей в соответствии со следующими ниже популяциями. Популяция новорожденных включает от недоношенных до рожденных в срок и до 28 суток. Популяций грудничков составляет от 1 месяца до 23 месяцев. Популяция детей составляет от 2 лет до 11 лет. Подростки входят в группу от 12 лет до 18 лет.

Исследования показали, что обычные парентеральные вакцины обладают ограниченной способностью индуцировать удовлетворительный защитный иммунитет не контактировавших с антигеном (не получавших вакцинацию) детей, в частности у очень маленьких детей. ACIP рекомендовал двухдозовую схему вакцинации у неиммунизированных очень маленьких детей, но в последнее время такую рекомендацию расширили на детей в возрасте до 8 лет, вследствие накопления доказательств, указывающих на то, что для индукции иммунитета в этой популяции необходимыми являются 2 дозы.

Во время периодов между пандемиями циркулирующие вирусы гриппа являются родственными вирусам от предшествующих эпидемий. Вирусы распространяются среди людей с различными уровнями иммунитета против инфекций, перенесенных ранее. Такая циркуляция в явлении, известном как антигенный дрейф, в течение периода, как правило, 2-3 года способствует отбору новых штаммов, которые достаточно изменились, чтобы снова вызывать эпидемию в общей популяции. Варианты дрейфа могут оказывать различные воздействия в различных сообществах, областях, странах или континентах в течение одного года, хотя в течение нескольких лет их общее воздействие, как правило, является аналогичным. Характерные эпидемии гриппа вызывают увеличение частоты возникновения пневмонии и заболевания нижних дыхательных путей, о чем свидетельствует повышенная частота случаев госпитализации и смертности.

С непредсказуемыми интервалами возникают новые вирусы гриппа путем, известным как "антигенный сдвиг", и способны вызывать пандемии. Антигенный сдвиг представляет собой процесс, в результате которого два или более различных штаммов вируса объединяется с образованием нового подтипа, содержащего смесь поверхностных антигенов двух или более исходных штаммов. Антигенный сдвиг является частным случаем реассортации или изменчивости вирусов, которая обеспечивает фенотипическое изменение. Таким образом, пандемия гриппа возникает, когда появляется новый вирус гриппа, против которого популяция человека не обладает уже существующим иммунитетом. Когда произойдет антигенный сдвиг общая популяция будет являться неиммунизированной против нового штамма вируса.

Антигенный сдвиг отличается от антигенного дрейфа, который представляет собой естественную мутацию известных штаммов гриппа в течение длительного периода времени, которая может приводить к утрате иммунитета или несоответствию вакцины. Антигенный дрейф возникает во всех типах гриппа, включая вирус гриппа A, гриппа B и гриппа C. Однако антигенный сдвиг возникает только у вируса гриппа A вследствие того, что он инфицирует не только людей.

Во время пандемии противовирусные лекарственные средства не являются достаточными или достаточно эффективными, чтобы удовлетворить потребности и охватить число индивидуумов, подвергающихся риску потенциально опасного для жизни заболевания гриппа. Для получения защитных уровней антител у неиммунизированных индивидуумов важной является разработка подходящих вакцин.

Эти проблемы можно решать путем добавления адъювантов и/или оптимальной доставкой вакцины, целью которых является увеличение иммуногенности вакцины для того, чтобы иметь возможность уменьшать содержание антигена и, таким образом, увеличивать число доступных доз вакцины. Использование адъюванта также может облегчать праймирование иммунной системы против антигена в популяции, в которой не существует иммунитета к конкретному штамму гриппа. Адъювант также может увеличивать доставку вакцины и, таким образом, снижать количество антигена, необходимого для индукции иммунного ответа. Доставка вакцины и/или путь вакцинации может иметь большое значение. Многие вакцины против гриппа доставляют парентерально и, таким образом, в основном индуцируют иммунитет против гриппа в крови. Однако вирусы гриппа попадают в организм через нос или рот, т.е. через слизистые мембраны. Доставкой вакцины против гриппа в нос можно индуцировать специфический к гриппу иммунитет в слизистой оболочке и в крови. Это может являться полезным для индукции защитного иммунитета против гриппа, в частности, у индивидуумов без существующего ранее иммунитета против штамма вируса в вакцине или против любого гриппа.

Необходимыми являются новые неживые вакцины, такие как вакцина, основанная на целом инактивированном вирусе или на части инактивированного вируса, способны индуцировать защитный иммунитет против заболевания гриппом у индивидуумов с не существовавшим ранее иммунитетом против вакцинного антигена. Индивидуумы без достаточного существовавшего ранее иммунитета против гриппа и/или с ослабленным иммунным статусом включают иммунологически "скомпрометированных" индивидуумов, детей младшего возраста, пожилое население и большую часть населения во всем мире (или все население) в случае пандемии. Настоящее изобретение относится конкретно к детям с ограниченным или не существовавшем ранее иммунитетом против вирусных антигенов. Эта группа особенно нуждается в безопасной неживой вакцине, которая может праймировать иммунный ответ, например, против гриппа. Также необходимыми являются новые вакцины, которые можно использовать в качестве перипандемических вакцин для праймирования неиммунизированной популяции против пандемического штамма до или после объявления пандемии. Настоящее изобретение относится конкретно к неиммунизированным популяциям, и в частности его можно легко вводить вследствие того, что его формулируют для назального введения, и оно содержит только инактивированный вирус или части вирусов, таким образом, не требует обученного медицинского персонала. Составы вакцинных антигенов с эффективными адъювантами обеспечивают усиление иммунных ответов.

Сущность изобретения

Целью изобретения является получение вакцины, которая способна праймировать иммунный ответ и обеспечивать защитный иммунитет против сезонных и пандемических штаммов вируса и других патогенных организмов у индивидуумов с не существовавшим ранее иммунитетом к вакцинному штамму. В одном из аспектов изобретение относится к использованию в педиатрии вакцины по изобретению, включая эффективную у детей вакцину против штаммов сезонного вируса гриппа. В дополнительном аспекте изобретение относится к индивидуумам всех возрастных групп, где композиция предназначена для использования при пандемии.

В первом аспекте настоящее изобретение относится к композиции, содержащей:

i) один или более неживые антигены и

ii) адъювант, содержащий:

одну или более карбоновых кислот,

водную среду, и

необязательно один или более моноглицеридов, для применения в качестве интраназально вводимой вакцины для применения у неиммунизированных индивидуумов.

Композицию можно составлять для применения в качестве вакцины против всех подходящих патогенов. Таким образом, композицию можно составлять в виде вакцины для любого подходящего штамма вируса или бактерий. Композицию можно составлять для применения в качестве вакцины против гриппа для интраназального введения. Изобретение было осуществлено для применения в качестве вакцины для интраназальной иммунизации против патогенных инфекций, например, гриппа у индивидуумов с ограниченным или не существовавшем ранее иммунитетом против вакцинного штамма.

Во втором аспекте настоящее изобретение относится к композиции для применения в качестве интраназально вводимой вакцины для иммунологически скомпрометированных индивидуумов детского возраста, где композиция содержит:

один или более антигенов неживого вируса гриппа и

адъювант, содержащий:

одну или более карбоновых кислот,

водную среду, и

необязательно один или более моноглицеридов.

В третьем аспекте изобретение относится к композиции, содержащей:

i) один или более неживых антигенов и

ii) адъювант, содержащий:

одну или более карбоновых кислот,

водную среду, и

необязательно один или более моноглицеридов, для применения в качестве интраназально вводимой вакцины для применения у неиммунизированных пациентов с иммунной недостаточностью.

В дополнительном аспекте изобретение относится к композиции, где указанная композиция содержит:

i) один или более антигенов Streptococcus pneumoniae и

ii) адъювант, содержащий:

одну или более карбоновых кислот,

водную среду и

необязательно один или более моноглицеридов,

для применения в качестве интраназально вводимой вакцины для применения у неиммунизированных индивидуумов и/или у иммунологически скомпрометированных пациентов для профилактики инфекции Streptococcus pneumoniae или для уменьшения тяжести симптомов, ассоциированных с инфекцией Streptococcus pneumoniae.

Краткое описание чертежей

Фигура 1: Индукция титров HI-антител против H1N1 A/Ned/602/09 (A). Хорьков группы 1, 3-6 интраназально инокулировали назальными каплями на сутки 0, 21 и 42, а хорьков группы 2 подкожно инъецировали на сутки 21 и 42. Титры HI-антител определяли в сыворотке, собираемой до иммунизации на сутки 0, 21 и 42 и после последней иммунизации на сутки 64 и 70. Группа 1 (контроль, и/н физиологический раствор), группа 2 (п/к TIV), группа 3 (и/н расщепленный антиген с добавлением в качестве адъюванта Endocine™, 5 мкг HA), группа 4 (и/н расщепленный антиген с добавлением в качестве адъюванта Endocine™, 15 мкг HA), группа 5 (и/н расщепленный антиген с добавлением в качестве адъюванта Endocine™, 30 мкг HA) и группа 6 (и/н антиген инактивированного целого вируса с добавлением в качестве адъюванта Endocine™, 15 мкг HA). Столбы представляют собой геометрическое среднее 6 животных в группе с 95% CI (GMT+/-CI95).

Фигура 2: Титры HI против отдаленных вирусов.

Хорьков группы 1, 3-6 интраназально инокулировали назальными каплями на сутки 0, 21 и 42, и хорьков группы 2 подкожно инъецировали на сутки 21 и 42. Титры HI-антител определяли в сыворотке, собираемой до иммунизации на сутки 0, 21 и 42 и после последней иммунизации на сутки 64 и 70. Группа 1 (контроль, и/н физиологический раствор), группа 2 (п/к TIV), группа 3 (и/н расщепленный антиген с добавлением в качестве адъюванта Endocine™, 5 мкг HA), группа 4 (и/н расщепленный антиген с добавлением в качестве адъюванта Endocine™, 15 мкг HA), группа 5 (и/н расщепленный антиген с добавлением в качестве адъюванта Endocine™, 30 мкг HA) и группа 6 (и/н антиген инактивированного целого вируса с добавлением в качестве адъюванта Endocine™ 15 мкг HA). Столбы представляют собой геометрическое среднее в группе с 95% CI (GMT+/-CI95). Для вычислений GMT величину ≤5 заменяли абсолютной величиной 5. A: Титры антител против H1N1 A/Swine/Ned/25/80. B: Титры антител против H1N1 A/Swine/Italy/14432/76. C: Титры антител против H1N1 A/New Jersey/08/76.

Фигура 3: Индукция титров нейтрализующих вирус (VN) антител против H1N1 A/Ned/602/09.

Хорьков группы 1, 3-6 интраназально инокулировали назальными каплями на сутки 0, 21 и 42 и хорьков группы 2 подкожно инъецировали на сутки 21 и 42. Титры VN антител определяли в сыворотке, собираемой до иммунизации на сутки 0, 21 и 42 и после последней иммунизации на сутки 64 и 70. Группа 1 (контроль, и/н физиологический раствор), группа 2 (п/к TIV), группа 3 (и/н расщепленный антиген с добавлением в качестве адъюванта Endocine™, 5 мкг HA), группа 4 (и/н расщепленный антиген с добавлением в качестве адъюванта Endocine™, 15 мкг HA), группа 5 (и/н расщепленный антиген с добавлением в качестве адъюванта Endocine™, 30 мкг HA) и группа 6 (и/н антиген инактивированного целого вируса с добавлением в качестве адъюванта Endocine™, 15 мкг HA). Столбы представляют собой геометрическое среднее 6 животных в группе с 95% CI (GMT+/-CI95).

Фигура 4: Сравнение вакцины ImmunoseTM FLU, содержащей в данном случае 15 мкг HA расщепленного антигена гриппа с 20 мг/мл (2%) EndocineTM по настоящему изобретению с вакцинными продуктами с добавлением других адъювантов, FluMist (живой аттенуированной вакциной) и инъецируемыми вакцинами на страдающих гриппом неиммунизированных хорьках.

Таблица 3: Эффективность формулируемых с Endocine™ вакцин 2009 H1N1 на хорьках, демонстрируемая клиническими, вирусологическими и макропатологическими параметрами.

Группа 1 (контроль, и/н физиологический раствор), группа 2 (п/к TIV), группа 3 (и/н расщепленный антиген с добавлением в качестве адъюванта Endocine™, 5 мкг HA), группа 4 (и/н расщепленный антиген с добавлением в качестве адъюванта Endocine™, 15 мкг HA), группа 5 (и/н расщепленный антиген с добавлением в качестве адъюванта Endocine™, 30 мкг HA) и группа 6 (и/н антиген инактивированного целого вируса с добавлением в качестве адъюванта Endocine™, 15 мкг HA).

Клинические показатели. Выживание, число животных, которые выживали до 4 суток после инокуляции; лихорадка (°C), максимальное увеличение температуры, представленное в виде среднего значения со стандартным отклонением, в скобках число животных, у которых наблюдали лихорадку, (*), температура тела 1 животного в группе 4 являлась недоступной вследствие неисправности регистрирующего устройства; % потери массы тела от 0 до 4 суток после инокуляции, представленные в виде среднего значения со стандартным отклонением, в скобках число животных с потерей массы тела.

Вирусология. Вирус, закапываемый в нос, и мазки из горла, площадь под кривой (AUC) результатов титрования 1-4 после инокуляции, в скобах число животных, у которых выявляли 1 или более положительных по вирусу мазков; вирусная нагрузка в легкое и носовых раковинах (log₁₀TCID₅₀/г) на 4 сутки после инокуляции, представленная в виде среднего значения со стандартным отклонением, или нижний предел детекции в случае, когда все животные в группе являлись отрицательные по вирусу, в скобках число животных с вирусом в легком/носовой раковине.

Макропатология. % оцениваемой пораженной паренхимы легких при визуальном обследовании во время вскрытия на 4 сутки после инокуляции, представленный в виде среднего значения со стандартным отклонением, в скобах число животных с пораженными легкими; отношение массы легкого/массе тела (×10²) на 4 сутки после инокуляции, представленное в виде среднего значения со стандартным отклонением.

Таблица 4: Полуколичественная оценка гистопатологических параметров на 4 сутки после инокуляции. ^a: Группа 1 (контроль, и/н физиологический раствор), группа 2 (п/к TIV), группа 3 (и/н расщепленный антиген с добавлением в качестве адъюванта Endocine™, 5 мкг HA), группа 4 (и/н расщепленный антиген с добавлением в качестве адъюванта Endocine™, 15 мкг HA), группа 5 (и/н расщепленный антиген с добавлением в качестве адъюванта Endocine™, 30 мкг HA) и группа 6 (и/н антиген инактивированного целого вируса с добавлением в качестве адъюванта Endocine™, 15 мкг HA).

Гистопатология. Полуколичественная оценка гистопатологических параметров на 4 сутки после инокуляции. Степень альвеолита/альвеолярного поражения, балл: 0, 0%; 1, 25%; 2, 25-50%; 3, >50%; тяжесть альвеолита, балл: воспалительные клетки отсутствуют (0); несколько воспалительных клеток (1); умеренное число воспалительных клеток (2); много воспалительных клеток (3); альвеолярный отек, альвеолярное кровоизлияние и гиперплазию пневмоцитов II типа оценивали в виде положительных препаратов (нет = 0, да = 1). Все результаты гистопатологического исследования представлены в виде среднего значения со стандартным отклонением.

Подробное описание изобретения

В описываемых вариантах осуществления изобретения для ясности прибегают к конкретной терминологии. Однако не предполагают, что изобретение ограничено таким образом выбранными конкретными терминами, и следует понимать, что каждый конкретный термин включает все технические эквиваленты, которые используют аналогичным образом для достижения аналогичной цели.

Термин "неиммунизированные индивидуумы" означает индивидуумов, неиммунизированных против патогена, т.е. индивидуумов, которые не получали вакцинацию или не подвергались воздействию данного патогена, и, таким образом, не обладают существовавшим ранее иммунитетом против такого патогена.

Термин "неиммунизированные против гриппа индивидуумы" означает индивидуумов, неиммунизированных против конкретного вируса гриппа, т.е. индивидуумов, которые получали вакцинацию или подвергались воздействию конкретного гриппа, и, таким образом, не обладают существовавшим ранее иммунитетом против этого штамма гриппа. В отношении гриппа он означает грудничков и детей при вакцинации против сезонного гриппа и означает целые популяции в периоды перипандемий и пандемий, включая грудничков, детей, взрослых и людей пожилого возраста.

Термин "индивидуумы детского возраста" относится к детям в возрасте менее 21 года и включает следующие ниже субпопуляции: популяцию новорожденных в возрасте от первых суток рождения до 1 месяца, грудничков в возрасте от 1 месяца до 2 лет, ребенка в возрасте от 2 лет до 12 лет и подростка в возрасте от 12 лет до 21 года.

Термин "период перипандемии" относится к периоду времени, близкому к пандемии. Данные пандемии представляют собой периоды времени, официально установленные ВОЗ, термин относится к периоду времени непосредственно перед официальным признанием пандемии и непосредственно после пандемии, во время которых рекомендуют вакцинацию.

Термин "неживые антигены" относится к антигенам, получаемым из инактивированных неживых патогенов, включая вирусы, например, инактивированные целые вирусы, расщепленные антигены, субъединичные антигены, рекомбинантные антигены или пептиды, или бактерии, или паразиты.

Термин "Immunose™ FLU" относится к композиции, содержащей неживой антиген гриппа и Endocine™.

Термин "Endocine™" относится к адъюванту, содержащему эквимолярные количества моноолеата глицерина и олеиновой кислоты.

Один или более неживых антигенов вируса гриппа в композиции по изобретению можно получать из одного или более штаммов гриппа A, B и/или штамма C. Вакцинная композиция, которая способна праймировать иммунный ответ и обеспечивать защитный иммунитет против пандемических штаммов гриппа, обычно содержит только антигены из одного штамма гриппа A (моновалентная), тогда как вакцинная композиция, которая способна праймировать иммунный ответ и обеспечивать защитный иммунитет против штаммов сезонного гриппа, обычно содержит антигены из трех или более различных штаммов (трехвалентная или четырехвалентная). Наиболее распространены два различных штамма гриппа A и один или более штаммов гриппа B.

Изобретение относится к вакцинной композиции, для которой неожиданно выявили, что она является высокоэффективной для индивидуумов, не иммунизированных против штаммов вируса гриппа, таких как дети (младше 8 лет) и индивидуумов во время периода перипандемии или пандемии. Дети, как правило, являются не иммунизированными против сезонно циркулирующего штамма гриппа, при этом считают, что все индивидуумы являются неиммунизированными во время пандемии.

Изобретение дополнительно относится к способу иммунизации до или во время периода эпидемии или пандемии, включающему интраназальное введение вакцинной композиции, содержащей композицию по изобретению, а также к способу иммунизации индивидуума детского возраста, включающему интраназальное введение вакцинной композиции, содержащей композицию по изобретению, и еще дополнительно относится к способу иммунизации неиммунизированных индивидуумов, включающему интраназальное введение вакцинной композиции, содержащей композицию по изобретению.

Изобретение относится к популяциям грудничков, детей и подростков, т.к. эти популяции, когда являются неиммунизированными, в меньшей степени реагируют, когда в отношении них применяют общие схемы вакцинации. Иммунная система у грудничков и детей не является полностью развитой, и у них, таким образом, развивается менее эффективный иммунный ответ на общепринятые схемы парентеральной вакцинации. Однако настоящее изобретение обеспечивает конкретную возможность для грудничков и детей, вследствие того, что уникальная лимфоидная ткань в верхних дыхательных путях представлена с момента рождения и является хорошо развитой с раннего детства. Фарингеальная лимфоидная ткань, известная как аденоид (или носоглоточная миндалина) располагается в глотке у детей и является частью кольца Вальдейера, которое включает носоглоточную миндалину (аденоид(ы)), пару небных миндалин, пару трубных миндалин и язычные миндалины. Аденоид является активным при развитии иммунной системы и начинает исчезать в подростковом возрасте. Таким образом, назальная доставка вакцины может обеспечивать контурные преимущества для грудничков и детей. Субпопуляции детей младшего возраста можно определять в соответствии с Управлением по контролю пищевых продуктов и лекарственных средств США или в соответствии с Европейское агентство по лекарственным средствам, или в соответствии с сочетанием требований обеих организаций.

В одном из вариантов осуществления композиция предназначена для применения в качестве интраназально вводимой вакцины для использования у детей. В одном из вариантов осуществления композиция предназначена для применения в качестве интраназально вводимой вакцины у новорожденного ((рожденного в срок и недоношенного) в возрасте до 28 суток). В одном из вариантов осуществления композиция предназначена для применения в качестве интраназально вводимой вакцины у грудничков (в возрасте от 1 месяца до 23 месяцев). В одном из вариантов осуществления композиция предназначена для применения в качестве интраназально вводимой вакцины у детей (в возрасте от 2 лет до 11 лет). В одном из вариантов осуществления композиция предназначена для применения в качестве интраназально вводимой вакцины у подростка (в возрасте от 12 лет до 18 лет).

Существует необходимость в безопасной вакцине, подходящей для маленьких детей с ограниченным или не существовавшим ранее иммунитетом, например, против гриппа, и для неиммунизированных индивидуумов, которая в основном индуцирует защитный иммунитет, например, против заболевания гриппом.

Вакцины на основе живого аттенуированного вируса связаны с проблемами безопасности. Вследствие таких проблем безопасности Flumist® не была одобрена для применения у маленьких детей младше 2 лет. Парадоксально, они представляют собой наиболее часто неиммунизированных индивидуумов, которые являются особенно подверженными гриппу, и принадлежат к группе высокого риска заражения гриппом. Flumist® одобрена для детей более старшего возраста, но она представляет собой вакцину на основе живого аттенуированного вируса.

Неожиданно было выявлено, что интраназальное введение неживых вакцин против гриппа с добавлением адъювантов индуцировало очень сильные иммунные ответы и последующий полный иммунитет против заболевания гриппом у хорьков с не существовавшим ранее иммунитетом к вакцинному антигену. Обе вакцины на основе полного и расщепленного неживого антигена давали превосходные результаты по сравнению с инъецируемой коммерчески доступной вакциной против гриппа Fluarix®.

В композициях по изобретению не используют живой аттенуированный вирус, а используют неживые антигены вируса гриппа. Кроме того, их можно вводить интраназально. Интраназальное введение является особенно подходящим для введения детям у грудничков и детей вследствие наличия фарингеальной лимфоидной ткани, известной как аденоид. Интраназальное введение композиции по изобретению обеспечивает возможность ее широкого использования и введения без специальной подготовки, такого как для всей популяции во время периодов перипандемии и пандемии посредством самостоятельного введения. Использование антигенов неживого вируса гриппа обеспечивает возможность его использования у маленьких детей, не вызывая проблем безопасности, связанных с вакцинами на основе живого аттенуированного вируса. Авторы изобретения разработали вакцину, эффективную у неиммунизированных индивидуумов, которую можно вводить интраназально, таким образом, обладающую указанными выше преимуществами и отвечающую важным потребностям уязвимых популяций и классов пациентов.

В первом аспекте изобретение относится к композиции, где указанная композиция содержит:

i) один или более неживых антигенов и

ii) адъювант, содержащий:

одну или более карбоновых кислот,

водную среду и

необязательно один или более моноглицеридов,

для применения в качестве интраназально вводимой вакцины для применения у неиммунизированных индивидуумов.

В другом аспекте изобретение относится к композиции, содержащей:

i) один или более неживых антигенов и

ii) адъювант, содержащий:

одну или более карбоновых кислот,

водную среду и

необязательно один или более моноглицеридов,

для применения в качестве интраназально вводимой вакцины для применения у неиммунизированных индивидуумов.

Композиция по изобретению является пригодной для использования в качестве вакцины против инфекционных патогенов, например, вируса и бактерий. Композиция по изобретению является подходящей для вакцины против гриппа для интраназального введения. Композиция по изобретению предназначена для применения в качестве вакцины для интраназальной иммунизации против гриппа у неиммунизированных индивидуумов.

Вирусы гриппа состоят из трех типов A, B и C. Вирусы гриппа A инфицируют широкий спектр птиц и млекопитающих, включая людей, лошадей, свиней, хорьков и куриц. Грипп B представлен у людей, хорьков и тюленей, и грипп C представлен у людей, собак и свиней. Инфицированные гриппом А животные часто выступают в роли резервуара вируса гриппа, путем генерации совокупности генетически и антигенно различных вирусов, которые передаются популяции людей. Передача может происходить при близком контакте между людьми и инфицированными животными, например, при уходе за домашним скотом. Передача от человека человеку может происходить при близком контакте или при вдыхании капелек, образуемых в результате кашля или чиханья.

Внешняя поверхность частицы вируса гриппа A состоит из липидной оболочки, которая содержит гликопротеины гемагглютинин (HA) и нейраминидазу (NA). Гликопротеин HA состоит из двух субъединиц, называемых HA1 и HA2. HA содержит участок связывания сиаловой кислоты, который связывается с сиаловой кислотой, встречается на наружной мембране эпителиальных клеток верхних и нижних дыхательных путей, и поглощается клеткой путем опосредованного рецептором эндоцитоза. Оказавшись внутри клетки, частица вируса гриппа выделяет свой геном, который входит в ядро и инициирует продукцию новых частиц вируса гриппа. Также продуцируется NA, которая отщепляет сиаловую кислоту от поверхности клетки для предотвращения захвата выделяющихся частиц вируса гриппа. В характерном случае инкубация вируса происходит в течение короткого периода, приблизительно пять суток, хотя инкубационный период может изменяться в широких пределах. Вирус выделяется приблизительно за сутки до начала заболевания, и, как правило, продолжает выделяться до трех-пяти суток. Характерные симптомы включают лихорадку, усталость, недомогание, головную боль, ноющую боль и боли, кашель и боль в горле. Некоторые симптомы могут сохраняться в течение нескольких недель после инфекции.

Различные штаммы вируса гриппа характеризуются преимущественно мутациями в гликопротеинах HA и NA, и, таким образом, HA и NA используют для идентификации подтипов вируса (т.е. H5N1 означает подтип 5 HA и подтип 1 NA). В этой связи вакцины против гриппа, как правило, направлены на молекулы HA и NA. В общепринятых вакцинах против вируса гриппа, как правило, используют целые инактивированные вирусы, которые содержат подходящую молекулу HA и/или NA. Альтернативно, в качестве вакцины можно использовать рекомбинантные формы белков HA и NA или их субъединиц. Антиген в вакцинной композиции может представлять собой инактивированные антигены, такие как, например, целые инактивированные вирусы, расщепленные антигены, субъединичные антигены, рекомбинантные антигены или пептиды. Термин "антиген" или "иммуноген" определяют, как что-нибудь, что может служить в качестве мишени для иммунного ответа. Термин также включает белковые антигены, рекомбинантные белковые компоненты, вирусоподобные частицы (VLP), а также генетически конструированные РНК или ДНК, в случае которых - при инъекции в клетки организма - "внутренний механизм" клеток-хозяева "считывает" ДНК и использует ее для синтеза белков патогена. Вследствие того, что эти белки распознаются как чужеродные, когда они подвергаются обработке клетками-хозяевами и располагаются на их поверхности, развивается реакция иммунной системы, которая затем инициирует определенный диапазон иммунных ответов. Термин также включает вещество, которое имитирует инактивированные бактерии или вирусы, или их части. Иммунный ответ может являться клеточным и/или гуморальным, и его можно детектировать в общих компартментах и/или компартментах слизистой оболочки.

Однако грипп представляет собой РНК-вирус и, таким образом, является объектом частых мутаций, приводящих к постоянным и устойчивым изменениям антигенного состава вируса. Антигенный состав относится к участкам полипептида, которые распознаются иммунной системой, таким как связывающие антитело эпитопы. Небольшие, незначительные изменения антигенного состава часто обозначат как антигенный дрейф. Вирусы гриппа A также способны "обменивать" генетические материалы из других подтипов в процессе, называемом реассортацией, приводящем к значительному изменению антигенного состава, обозначаемому как антигенный сдвиг. Вследствие того, что иммунный ответ против вирусных частиц основан на образовании антител к гликопротеинам HA и NA, частые изменения гликопротеинов снижают эффективность иммунного ответа, приобретаемого против вирусов гриппа в течение длительного времени, что в конечном итоге приводит к отсутствию иммунитета. Способность гриппа A претерпевать быстрый антигенный дрейф и антигенный сдвиг часто может вызывать эпидемии гриппа вследствие отсутствия существующего ранее иммунитета к новому штамму.

Американский консультативный комитет по проблемам вакцинации (ACIP) рекомендовал ежегодную вакцинацию против гриппа для всех детей в возрасте 6-59 месяцев, т.к. дети в возрасте 6-23 месяцев подвергаются по существу повышенному риску связанных с гриппом случаев госпитализации, и дети в возрасте 24-59 месяцев подвергаются повышенному риску связанных с гриппом случаев обращений в клиники и отделения неотложной помощи. Рекомендация была расширена на вакцинацию против сезонного гриппа для всех индивидуумов в возрасте ≥6 месяцев. Таким образом, композиция по изобретению предназначена для применения в качестве вакцины для интраназального введения детям в возрасте 18 лет и младше, в частности в возрасте 12 лет и младше. Как правило, возраст детей составляет менее 8 лет, такой как 6 лет или меньше. Важным целевым классом пациентов для вакцины по изобретению являются дети, в частности дети в возрасте от 2 месяцев до менее 9 лет, как правило, дети в возрасте от 3 месяцев до менее 9 лет, такие как в возрасте от 6 месяцев до менее 8 лет, более предпочтительно в возрасте от 6 месяцев до менее 7 лет, такие как в возрасте от 6 месяцев до менее 72 месяцев, или в возрасте от 6 месяцев до 60 месяцев, или в возрасте от 6 месяцев до 24 месяцев. Композиция по изобретению по меньшей мере частично предназначена в качестве вакцины для использования в педиатрии.

Признаки штамма вируса гриппа, которые обеспечивает ему возможность вызывать вспышку пандемии, заключаются в следующем: он содержит новый гемагглютинин по сравнению с гемагглютинином в недавно циркулирующих штаммах, который может сопровождаться изменением подтипа нейраминидазы или не сопровождаться им; он способен горизонтально передаваться в популяции людей, и он является патогенным для людей. Новый гемагглютинин может представлять собой гемагглютинин, который не выявляли в популяции людей в течение длительного периода времени, возможно, несколько десятилетий, такой как H2. Или он может представлять собой гемагглютинин, который не циркулировал в популяции людей раньше, например, H5, H9, H7 или H6, который встречается у птиц. В любом случае основная часть или по меньшей мере большая часть, или даже вся популяция ранее не сталкивалась с антигеном и является не иммунизированной против него.

Изобретение относится к популяциям грудничков, детей и подростков, т.к. эти популяции, когда являются неиммунизированными, в меньшей степени реагируют, когда в отношении них применяют общие схемы вакцинации. Иммунная система у грудничков и детей не является полностью развитой, и, таким образом, у них развивается менее эффективный иммунный ответ на общепринятые схемы парентеральной вакцинации. Однако настоящее изобретение обеспечивает конкретную возможность для грудничков и детей, вследствие того, что уникальная лимфоидная ткань в верхних дыхательных путях представлена с момента рождения и является хорошо развитой с раннего детства. Фарингеальная лимфоидная ткань, известная как аденоид (или носоглоточная миндалина) располагается в глотке у детей и является частью кольца Вальдейера, которое включает носоглоточную миндалину (аденоид(ы)), пару небных миндалин, пару трубных миндалин и язычные миндалины. Аденоид является активным при развитии иммунной системы и начинает исчезать в подростковом возрасте. Таким образом, назальная доставка вакцины может обеспечивать контурные преимущества для грудничков и детей. Субпопуляции детей младшего возраста можно определять в соответствии с Управлением по контролю пищевых продуктов и лекарственных средств США или в соответствии с Европейским агентством по лекарственным средствам, или в соответствии с сочетанием требований обеих организаций.

Управление по контролю пищевых продуктов и лекарственных средств США классифицирует субпопуляции детей на основании следующих ниже возрастных диапазонов. Популяция новорожденных находится в диапазоне возраста от рождения до 1 месяца. Популяция грудничков находится в диапазоне возраста от 1 месяца до 2 лет. Популяция детей находится в диапазоне возраста от 2 лет до 12 лет. Популяция подростков находится в диапазоне возраста от 12 до 21 года. Европейское агентство по лекарственным средствам классифицирует лекарственные средства для детей в соответствии со следующими ниже популяциями. Популяция новорожденных включает от недоношенных до рожденных в срок и до 28 суток. Популяций грудничков составляет от 1 месяца до 23 месяцев. Популяция детей составляет от 2 лет до 11 лет. Подростки входят в группу от 12 лет до 18 лет.

В одном из вариантов осуществления композиция предназначена для применения в качестве интраназально вводимой вакцины для использования у детей. В одном из вариантов осуществления композиция предназначена для применения в качестве интраназально вводимой вакцины у новорожденного ((рожденного в срок и недоношенного) в возрасте до 28 суток) или альтернативно для применения у новорожденного в возрасте от первых суток рождения до 1 месяца. В одном из вариантов осуществления композиция предназначена для применения в качестве интраназально вводимой вакцины у грудничков в возрасте от 1 месяца до 23 месяцев или, альтернативно, в возрасте от 1 месяца до 2 лет. В одном из вариантов осуществления композиция предназначена для применения в качестве интраназально вводимой вакцины у детей в возрасте от 2 лет до 11 лет или, альтернативно, в возрасте от 2 лет до 12 лет. В одном из вариантов осуществления композиция предназначена для применения в качестве интраназально вводимой вакцины у подростка в возрасте от 12 лет до 18 лет, альтернативно, в возрасте от 12 лет до 21 года.

В частности вакцина по изобретению предназначена для неиммунизированных индивидуумов, например, детей в возрасте младше 8 лет, во время эпидемий сезонного гриппа. Композиция по изобретению также предназначена в качестве вакцины для применения в группах всех возрастов во время периодов пандемии или перипандемии. Важным целевым классом пациентов для вакцины по изобретению являются в частности дети в возрасте от 2 месяцев до менее 9 лет, как правило, дети в возрасте от 3 месяцев до менее 9 лет, такие как в возрасте от 6 месяцев до менее 8 лет, более предпочтительно в возрасте от 6 месяцев до менее 7 лет, такие как в возрасте от 6 месяцев до менее 72 месяцев, или в возрасте от 6 месяцев до 60 месяцев, или в возрасте от 6 месяцев до 24 месяцев. Композиция по изобретению по меньшей мере частично предназначена в качестве вакцины для использования в педиатрии.

Неиммунизированные индивидуумы могут относится ко всем возрастным группам, в частности, когда композиция предназначена в качестве вакцины для использования во время периодов пандемии или перипандемии.

Подразумевают, что интраназальное введение означает введение в нос любым способом введения, таким как распылением вакцины в носовой полости или введением вакцины через пипетку или аналогичное устройство путем закапывания вакцины в носовую полость или на стенку слизистой носа.

Композиция преимущественно содержит один или более антигенов неживого вируса гриппа, а не живого аттенуированного вируса. Как указано, это позволяет избежать проблем безопасности при выборе класса пациентов, а также в отношении получения, распространения, назального введения, обработки и утилизации. Антиген неживого вируса гриппа можно выбирать из группы, состоящей из целого инактивированного вируса, расщепленного вируса, субъединичного антигена гриппа и рекомбинантных антигенов. Применение рекомбинантных белков можно использовать для увеличения титра нейтрализующих антител, образуемых против заражения вирусом. Гликозилирование HA играет важную роль в способности иммунного ответа вызывать образование антител и способности вируса ускользать от иммунной системы. Таким образом, можно получать рекомбинантные белки HA, содержащие гликаны типа гетерогенного комплекса, а также рекомбинантные белки, которые являются моногликозилированными или негликозилированными с повышенной иммуногенностью.

Предпочтительно антиген неживого вируса гриппа представляет собой расщепленный антиген или субъединичный антиген гриппа, более предпочтительно расщепленный антиген.

Геном гриппа A содержит 11 генов на восьми участках РНК, кодирующих 11 белков: гемагглютинин (HA), нейраминидазу (NA), нуклеопротеин (NP), M1, M2, NS1, NS2 (NEP: белок ядерного экспорта), PA, PB1 (основную полимеразу 1), PB1-F2 и PB. Антигены неживого вируса гриппа можно выбирать из любого белка или комбинации белков из вируса.

Композиция по изобретению может содержать любой инактивированный вирус гриппа. Как понятно специалисту в данной области, вирус гриппа изменяется от сезона к сезону, а также по географической области и популяциям, которые он инфицирует. Настоящее изобретение относится к вакцинам, содержащим адъювант по изобретению и неживые антигены вируса гриппа из одного или более вирусом гриппа. Неживой антиген гриппа, используемый в вакцинной композиции по изобретению, представляет собой любое антигенный материал, получаемый из инактивированного вируса гриппа. Например, он может содержать инактивированные целые частицы вируса. Альтернативно, он может содержать разрушенный вирус (расщепленный вирус), где, например, сохраняются иммуногенный белок, например, белок ионного канала M2 или гликопротеины. Очищенные препараты гликопротеинов мембраны вируса гриппа гемагглютинин (HA) и/или нейраминидазу (NA) можно использовать в качестве антигенного материала в вакцинной композиции. Вакцинная композиция по изобретению может содержать один или более типов антигенного материала. Тип вируса гриппа, используемого для получения вакцинной композиции, как известно, зависит от гриппа, против которого необходимо защищать реципиента вакцины.

Например, антиген неживого вируса гриппа содержит один или более антигенов, например, генетическая основа одного или более следующих ниже вирусов гриппа: A/Ann Arbor/6/60 (A/AA/6/60), вируса B/Ann Arbor/1/66, FluMist MDV-A (ca A/Ann Arbor/6/60), FluMist MDV-B (ca B/Ann Arbor/1/66), основа донорного штамма A/Leningrad/17 и PR8.

В другом конкретном примере вакцинные композиции по изобретению содержат антиген неживого вируса гриппа, например, HA полипептидную последовательность или NA (или по меньшей мере на 90% идентичную или по меньшей мере на 95% идентичную таким последовательностям) из одного или более указанных ниже: B/Yamanashi; A/New Caledonia; A/Sydney; A/Panama; B/Johannesburg; B/Victoria; B/Hong Kong; A/Shandong/9/93; A/Johannesburg/33/94; A/Wuhan/395/95; A/Sydney/05/97; A/Panama/2007/99; A/Wyoming/03/2003; A/Texas/36/91; A/Shenzhen/227/95; A/Beijing/262/95; A/New Caledonia/20/99; B/Ann Arbor/1/94; B/Yamanashi/166/98; B_Johannesburg.sub.--5.sub.--99; BVictoria/504/2000; B/Hong Kong/330/01; B_Brisbane.sub.--32.sub.--2002; B/Jilin/20/03; вируса гриппа A H1N1, вируса гриппа A H3N2, вируса гриппа A H9N2, вируса гриппа A H5N1, вируса гриппа A H7N9; вируса гриппа B и пандемического штамма гриппа (обозначаемого ВОЗ или не циркулирующего в популяции людей).

В одном из вариантов осуществления штамм вируса гриппа может представлять собой один или более штаммов, содержащихся в вакцине 2013/2014: такой как подобный A/California/7/2009 (H1N1) вирус, (H3N2) вирус, антигенно подобный выращиваемому в клетках прототипу вируса A/Victoria/361/2011, или A/Texas/50/2012 и подобный B/Massachusetts/2/2012 (линия Yamagata) вирус.

В одном из вариантов осуществления штамм вируса гриппа может представлять собой один или более штаммов, ранее рекомендованных ВОЗ для применения в вакцине против гриппа.

В одном из вариантов осуществления штамм или штаммы вируса гриппа могут представлять собой штамм из четырехвалентной вакцины против гриппа и содержать антигены из любых четырех из следующих ниже пяти штаммов вируса гриппа: подобного A/California/7/2009 (H1N1) вируса, (H3N2) вируса, антигенно подобного выращиваемому в клетках прототипу вируса A/Victoria/361/2011, или A/Texas/50/2012 и подобного B/Massachusetts/2/2012 (линия Yamagata) вируса, подобного B/Brisbane/60/2008 (линия Victoria) вируса.

Адъювант композиции по изобретению является важным для ее пригодности для интраназального введения и для ее эффективности. Подходящий адъювант для интраназального введения может представлять собой адъювант, который необязательно содержит моноэфир глицерина в комбинации с жирной кислотой, или он может представлять собой комбинацию жирных кислот. Используемые в таких адъювантах карбоновые кислоты содержат длинноцепочечные (C4-C30) алкил-, алкенил- или алкинилкарбоновые кислоты, которые могут необязательно являться разветвленными или неразветвленными, циклическими или aциклическими, необязательно содержащие одну, две или много ненасыщенных связей (двойную или тройную связь), которые могут дополнительно необязательно являться другого типа.

Используемые в таких адъювантах моноглицериды могут представлять собой сложные эфиры карбоновых кислот и глицерина, где карбоновые кислоты могут представлять собой длинноцепочечные (C4-C30) алкил-, алкенил- или алкинилкарбоновые кислоты, которые могут необязательно являться разветвленными или неразветвленными, циклическими или aциклическими, необязательно содержащие одну, две или много ненасыщенных связей (двойную или тройную связь), которые могут дополнительно необязательно являться другого типа.

Концентрация моноглицерида в вакцинной композиции могут находиться в диапазоне, например, приблизительно от 1 приблизительно до 50 мг/мл, таком как, например, приблизительно от 1 приблизительно до 25 мг/мл, приблизительно от 5 приблизительно до 15 мг/мл или приблизительно 10 мг/мл.

Концентрация жирной кислоты в вакцинной композиции может находиться в диапазоне, например, приблизительно от 0,5 приблизительно до 50 мг/мл, таком как, например, приблизительно от 1 приблизительно до 25 мг/мл, приблизительно от 1 приблизительно до 15 мг/мл, приблизительно от 1 приблизительно до 10 мг/мл, приблизительно от 2 приблизительно до 8 мг/мл или приблизительно 6-7 мг/мл. В одном из вариантов осуществления концентрация жирной кислоты в вакцинной композиции в пересчете на моль соответствует концентрации (в пересчете на моль) моноглицерида.

Любая комбинация диапазонов концентраций, указанных выше для моноглицерида и жирной кислоты, находится в рамках настоящего изобретения. Кроме того, указанный наиболее широкий диапазон означает предпочтительный диапазон, а затем диапазон сужают до наиболее предпочтительного диапазона.

Авторы изобретения по настоящему изобретению обнаружили, что адъюванты, как описано выше и описано в WO 2012/042003 (которая, таким образом, полностью включена посредством ссылки) являются особенно пригодными, когда вакцинацию проводят назальным путем, например, нанесением на слизистую оболочку носовой полости. Авторы изобретения обнаружили, что использование таких адъювантов при вакцинации через назальный путь улучшает иммунный ответ после вакцинации. Авторы изобретения обнаружили, что использование таких адъювантов является безопасным и хорошо переносимым у нескольких видов, включая людей.

Таким образом, композиция может содержать моноглицериды, которые представляют собой глицериды, моноэтерифицированные карбоновыми кислотами, выбранными из группы, состоящей из лауриновой кислоты (C12), миристиновой кислоты (C14), пальмитиновой кислоты (C16), пальмитолеиновой кислоты (C16:1), олеиновой кислоты (C18:1), линолевой кислоты (C18:2), стеариновой кислоты, гексановой кислоты, каприловой кислоты, декановой кислоты (каприновой кислоты), арахидиновой кислоты, бегеновой кислоты, лигноцериновой кислоты, альфа-линоленовой кислоты, стеаридоновой кислоты, эйкозапентаеновой кислоты, докозагексаеновой кислоты, гамма-линоленовой кислоты, дигомо-гамма-линоленовой кислоты, арахидоновой кислоты, эруковой кислоты, нервоновой кислоты.

В дополнительном варианте осуществления моноглицериды представляют собой глицериды, моноэтерифицированные карбоновыми кислотами, выбранными из группы, состоящей из пальмитолеиновой кислоты (C16:1), олеиновой кислоты (C18:1) и линолевой кислоты (C18:2).

Предпочтительно моноглицерид представляет собой глицерид, моноэтерифицированный олеиновой кислотой (глицерилолеат).

Адъювант предпочтительно содержит одну или более карбоновых кислот, выбранных из группы, состоящей из лауриновой кислоты, миристиновой кислоты, пальмитиновой кислоты, пальмитолеиновой кислоты, олеиновой кислоты, линолевой кислоты, стеариновой кислоты, гексановой кислоты, каприловой кислоты, декановой кислоты (каприновой кислоты), арахидиновой кислоты, бегеновой кислоты, лигноцериновой кислоты, альфа-линоленовой кислоты, стеаридоновой кислоты, эйкозапентаеновой кислоты, докозагексаеновой кислоты, гамма-линоленовой кислоты, дигомо-гамма-линоленовой кислоты, арахидоновой кислоты, эруковой кислоты и нервоновой кислоты. Предпочтительно, одну или более карбоновых кислот выбирают из группы, состоящей из олеиновой кислоты и лауриновой кислоты.

В комбинации подходящих вариантов осуществления адъювант содержит глицерилолеат, олеиновую кислоту и водную среду. Вакцинная композиция по настоящему изобретению также может содержать дополнительные фармацевтические эксципиенты. Такие фармацевтические эксципиенты могут представлять собой:

1. Средства регуляции тоничности/осмоляльности вакцины. Такие средства представляют собой, например, физиологические соли, такие хлорид натрия. Другие физиологические соли представляют собой хлорид калия, дигидрофосфат калия, дифосфат натрия, хлорид магния и т.д. Такое средство также может представлять собой другие ионные вещества, которые влияют на ионную силу и стабильность. Осмоляльность вакцины можно регулировать до значения в диапазоне приблизительно от 200 приблизительно до 400 мОсм/кг, предпочтительно в диапазоне приблизительно от 240 приблизительно до 360 мОсм/кг, или осмоляльность должна быть близкой к физиологическому уровню, например, в физиологическом диапазоне приблизительно от 290 приблизительно до 310 мОсм/кг.

2. Средства регуляции pH или для забуферирования вакцинной композиции. Как правило, pH вакцинной композиции находится в диапазоне приблизительно от 5 приблизительно до 8,5. Подходящие средства регуляции pH или буферные вещества включают соляную кислоту, гидроксид натрия (для регуляции pH), а также фосфатный буфер, буфер Tris, цитратный буфер, ацетатный буфер, гистидиновый буфер и т.д. (для забуферирования вакцины).

3. Другие добавки, такие как, например, поверхностно-активные средства, антиоксиданты, хелатирующие средства, антибактериальные средства, инактивирующие вирус средства, консерванты, красители, противовспениватели, стабилизаторы или поверхностно-активные средства или их сочетания.

Поверхностно-активное средство может являться гидрофильным, инертным и биосовместимым, таким как, например, полоксамеры, такие как, например, плюроник F68 или плюроник 127.

Антибактериальные средства могут представлять собой, например, амфотерицин или любое его производное, хлортетрациклин, формальдегид или формалин, гентамицин, неомицин, полимиксин B или любое его производное, стрептомицин или любое их сочетание.

Антиоксиданты могут представлять собой, например, аскорбиновую кислоту или токоферол или любое их сочетание.

Инактивирующие вирус средства могут представлять собой, например, формалин, бета-пропиолактон, УФ-излучение, нагревание или любое их сочетание.

Консерванты могут представлять собой, например, хлорид бензетония, EDTA, фенол, 2-феноксиэтанол или тимеросал или любое их сочетание. Также продемонстрировано, что EDTA является хелатирующим средством, антиоксидантом и стабилизатором.

Красители могут представлять собой, например, любые индикаторы (такие как, например, феноловый красный) или бриллиантовый зеленый, или любое их сочетание.

Противовспениватели могут представлять собой, например, полидиметилсилозон.

Поверхностно-активные вещества могут являться, например, анионными, катионными или неионными или цвиттер-ионными, такими как, например, полиоксиэтилен и его производные, полисорбаты (такие как, например, полисорбат 20 или полисорбат 80), Tween 80, полоксамеры (такие как, например, плюроник F68) или любое их сочетание.

Как правило, концентрация моноглицерида в вакцинной композиции представляет собой количество в диапазоне приблизительно от 0,1 г приблизительно до 5,0 г на 100 мл или в диапазоне приблизительно 0,1 г приблизительно 2,0 г на 100 мл, или приблизительно от 0,5 г приблизительно до 2,0 г, такое как 0,5 г приблизительно до 1,5 г на 100 мл вакцинной композиции.

Кроме того, концентрация одной или более карбоновых кислот представляет собой количество в диапазоне приблизительно от 0,1 г приблизительно до 5,0 г на 100 мл или в диапазоне приблизительно от 0,1 г приблизительно до 2,0 г на 100 мл, или приблизительно от 0,5 г приблизительно до 2,0 г, таком как 0,5 г приблизительно до 1,5 г на 100 мл вакцинной композиции.

Один или более моноглицеридов совместно с одной или более карбоновых кислот в вакцинной композиции могут находиться в количестве не более 10% масс./об. или не более 5% масс./об., или не более 4% масс./об., или не более 3% масс./об., или не более 2% масс./об. или не более 1% масс./об. или не более 0,5% масс./об. или не более 0,1% масс./об. или не более 0,05% масс./об.

Адъювант может содержать комбинацию липидов, выбранных из группы, состоящей из моноолеина, олеиновой кислоты, лауриновой кислоты и соевого масла. В одном подходящем варианте осуществления адъювант содержит олеиновую кислоту, лауриновую кислоту в буфере Tris. Соответственно этот вариант осуществления содержит от 0,25 г до 0,75 г олеиновой кислоты, от 0,25 г до 0,75 г лауриновой кислоты в 7-15 мл буфера Tris (pH 7-9). Конкретный пример содержит от 0,4 г до 0,5 г олеиновой кислоты, от 0,3 г до 0,4 г лауриновой кислоты в 8-10 мл 0,1 M буфера Tris (pH 7-9). В дополнительном подходящем варианте осуществления адъювант содержит олеиновую кислоту и моноолеин в буфере Tris. Соответственно этот вариант осуществления содержит от 0,25 г до 0,75 г олеиновой кислоты, от 0,25 г до 0,75 г моноолеина в 7-15 мл буфера Tris. Конкретный пример содержит от 0,3 г до 0,4 г олеиновой кислоты, от 0,4 г до 0,5 г моноолеина в 8-10 мл 0,1 M буфера Tris (pH 7-9). Дополнительный вариант осуществления содержит от 0,5 г до 0,25 г моноолеина, от 0,5 г до 0,25 г олеиновой кислоты и от 0,25 г до 0,75 г соевого масла в 7-15 мл буфера Tris. Конкретный пример этого варианта осуществления содержит от 0,1 г до 0,2 г моноолеина, от 0,8 г до 1,5 г олеиновой кислоты и от 0,5 г до 0,6 г соевого масла в 8-12 мл буфера Tris (pH 7-9).

Три типа адъювантов успешно использовали в указанных ниже примерах: адъювант примера A, содержащий от 0,4 г до 0,5 г олеиновой кислоты, от 0,3 г до 0,4 г лауриновой кислоты в 8-10 мл 0,1 M буфера Tris (pH 7-9); адъювант примера B, содержащий от 0,3 г до 0,4 г олеиновой кислоты, от 0,4 г до 0,5 г моноолеина в 8-10 мл 0,1 M буфера Tris (pH 7-9), и адъювант примера C, содержащий от 0,1 г до 0,2 г моноолеина, от 0,8 г до 1,5 г олеиновой кислоты и от 0,5 г до 0,6 г соевого масла в 8-12 мл буфера Tris (pH 7-9). Эти адъюванты, как правило, получают в концентрации масс./об. 2-12% содержания липида (6 г - 12 г на 100 мл), более предпочтительно 3-10%, такой как 4%, 5%, 6%, 7, 8% или 9%. Эти концентрации представляют собой концентрации самой смеси адъювантов. Затем такой адъювант смешивают с содержащей антиген композицией в отношениях от 2:1 до 1:8, таких как, например, в отношении 1:1, таким образом, чтобы обеспечивать вакцинную композицию с 4% содержанием липидов, в случае, когда начинают с адъюванта с концентрацией липидов 8%. Как правило, содержание липидов в вакцинной композиции по изобретению составляет от 0,5% до 6% масс./об., как правило, такое как от 1% до 6% масс./об., более предпочтительно от 1% до 4%.

Композиция примера B представляет собой состав Endocine™, содержащий эквимолярные количества моноолеата глицерина и олеиновой кислоты, и было выявлено, что она является крайне эффективной у неиммунизированных индивидуумов. В очень предпочтительном варианте осуществления такой 8% липидный состав разбавляют содержащими антиген композициями, таким образом, чтобы получать вакцинную композицию с концентрацией липидов 1-4% масс./об.

Как указано, композиция является пригодной для использования в способе иммунизации во время периода перипандемии или пандемии, включающему интраназальное введение вакцинной композиции по изобретению. Способ иммунизации во время периода перипандемии или пандемии можно использовать для индивидуумов любого возраста. Кроме того изобретение относится к способу иммунизации во время сезонных эпидемий индивидуумов детского возраста, включающему интраназальное введение вакцинной композиции, как описано.

Как указано, изобретение относится к способу иммунизации неиммунизированных индивидуумов, включающему интраназальное введение вакцинной композиции.

В указанных ниже примерах продемонстрирована эффективность такой вакцинной композиции у неиммунизированных индивидуумов.

Неожиданная эффективность в отношении индукции иммунного ответа у неиммунизированных индивидуумов свидетельствует о том, что вакцина по изобретению способна вызывать иммунный ответ у индивидуумов, которые имеют ослабленную иммунную систему, в том отношении, что она способна реагировать на инвазивные патогены, такие как вирусы, в том случае, когда они еще не имели сильного существовавшего ранее иммунитета. Таким образом, композиция по изобретению является подходящей для иммунологически скомпрометированных индивидуумов. Таким образом, дополнительный аспект изобретения относится к вакцинной композиции, содержащей неживые антигены гриппа с добавлением адъювантов, интраназально вводимой иммунологически скомпрометированным пациентам детского возраста, включая пациентов с ВИЧ; индивидуумов, принимающих иммуносупрессорные лекарственные средства, пациентов, недавно перенесших пересадку органа; недоношенных детей и послеоперационных пациентов.

Этот аспект относится к композиции, где указанная композиция содержит:

i) один или более неживых антигенов и

ii) адъювант, содержащий:

одну или более карбоновых кислот,

водную среду, и

необязательно один или более моноглицеридов,

для применения в качестве интраназально вводимой вакцины для иммунологически скомпрометированных пациентов детского возраста.

Иммунологически скомпрометированные индивидуумы характеризуются повышенной восприимчивостью к условно-патогенным микроорганизмам например, вирусу гриппа, и подвергаются повышенному риску госпитализации и смерти от гриппа. Иммунологически скомпрометированные индивидуумы и в частности иммунологически скомпрометированные индивидуумы детского возраста могут являться подходящим классом пациентом для иммунизации композицией по настоящему изобретению. Таким образом, один из вариантов осуществления настоящего изобретения может представлять собой композицию, содержащую:

i) один или более антигенов неживого вируса гриппа и

ii) адъювант, содержащий:

одну или более карбоновых кислот,

водную среду, и

необязательно один или более моноглицеридов,

для применения в качестве интраназально вводимой вакцины у иммунологически скомпрометированных пациентов детского возраста.

Неожиданный эффект настоящего изобретения, как проиллюстрировано примером 2, заключается в том, что композиция по настоящему изобретению способна снижать выделение вируса в окружающую среду. Дети выделяют в окружающую среду больше вируса, чем иммунокомпетентные здоровые взрослые, что приводит к повышенному распространению вируса на других людей в непосредственной близости с ними. Таким образом, настоящее изобретение может являться подходящим для лечения популяций детей, таких как груднички, дети младшего возраста и подростки. Настоящее изобретение может являться подходящим для предотвращения распространения вируса популяцией детей. В одном из вариантов осуществления композиция по настоящему изобретению предназначена для применения у индивидуумов, являющихся детьми, таких как груднички, дети и подростки. В одном из вариантов осуществления композиция по настоящему изобретению предназначена для применения у неиммунизированных индивидуумов для уменьшения выделения вируса в окружающую среду. В одном из вариантов осуществления композиция по настоящему изобретению предназначена для применения у страдающих гриппом неиммунизированных индивидуумов для уменьшения выделения вируса в окружающую среду. Кроме того, композиция по настоящему изобретению может являться особенно подходящей для сдерживания пандемии посредством уменьшения распространения вируса. В одном из вариантов осуществления композиция по настоящему изобретению предназначена для применения у неиммунизированных индивидуумов для уменьшения выделения вируса в окружающую среду в зоне пандемии. В одном из вариантов осуществления композиция по настоящему изобретению предназначена для применения у неиммунизированных индивидуумов для уменьшения выделения вируса в окружающую среду во время периода перипандемии. В одном из вариантов осуществления композиция по настоящему изобретению предназначена для применения у индивидуумов детского возраста для уменьшения выделения вируса в окружающую среду во время периода перипандемии.

Способ иммунизации против гриппа у иммунологически скомпрометированных пациентов детского возраста путем интраназального введения композиции, как описано выше, представляет собой интересный аспект неожиданного результата.

Как правило, композиция предназначена для применения в качестве интраназально вводимой вакцины против гриппа иммунологически скомпрометированным индивидуумам детского возраста. Иммунологически скомпрометированные индивидуумы детского возраста предпочтительно выбраны из группы, состоящей из людей, которые являются инфицированными ВИЧ; индивидуумов, принимающих иммуносупрессорные лекарственные средства, таких как пациентов, недавно перенесших пересадку органа; недоношенных детей и послеоперационных пациентов.

Дополнительный аспект изобретения относится к вакцине для применения у неиммунизированных индивидуумов и иммунологически скомпрометированных индивидуумов детского возраста. Для адъюванта по изобретению была продемонстрирована его эффективность у инфицированных гриппом неиммунизированных индивидуумов. Это делает его подходящим для классов неиммунизированных пациентов и иммунологически скомпрометированных пациентов детского возраста.

Таким образом, дополнительный аспект изобретения относится к композиции для применения в качестве интраназально вводимой вакцины для применения у неиммунизированных индивидуумов и пациентов детского возраста с иммунной недостаточностью, где указанная композиция содержит:

i) один или более неживых антигенов и

ii) адъювант, содержащий:

одну или более карбоновых кислот,

водную среду, и

необязательно один или более моноглицеридов.

Подходящие типы вакцин для иммунизации неиммунизированных индивидуумов и пациентов детского возраста с иммунной недостаточностью в соответствии с настоящим изобретением содержат антиген соответственно релевантного патогена, предназначенный для иммунизации или обработанный в виде вакцины. Он включает без ограничения иммуногены, получаемые из вирусов, выбранных из группы, состоящей из вируса гепатита B, гепатита A, гепатита C, гепатита D и E, вируса гепатита не-A/не-B, поксвирусов и вирусов натуральной оспы, вируса полиомиелита, вируса кори, вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), энтеровирусов, ретровирусов, респираторно-синцитиального вируса, ротавируса, вируса папилломы человека, вирусов ветряной оспы, вируса желтой лихорадки, вируса SARS, вирусов животных, вирусов герпеса, цитомегаловируса, ветряной оспы, вируса Эпштейна-Барра, вирусов парагриппа, аденовирусов, вирусов коксаки, пикорнавирусов, риновирусов, вируса краснухи, паповируса и вируса эпидемического паротита. Некоторые неограничивающие примеры известных вирусных антигенов, отличных от антигенов вируса гриппа, указанных выше, могут включать следующие ниже: антигены, получаемые из ВИЧ-I, такие как tat, nef, gpl20 или gpl[бета]0, gp40, p24, gag, env, vif, vpr, vpu, rev или их часть и/или сочетания; антигены, получаемые из вирусов герпеса человека, такие как gH, gL gM gB gC gK gE или gD, или их часть и/или сочетания, или предранний белок, такой как ICP27, ICP47, ICP4, ICP36 из HSVI или HSV2; антигены, получаемые из цитомегаловируса, в частности цитомегаловируса человека, такие как gB или его производные; антигены, получаемые из вируса Эпштейна-Барра, такие как gp350 или его производные; антигены, получаемые из вируса ветряной оспы, такие как gpl, 11, 111 и IE63; антигены, получаемые из вируса гепатита, такие как антиген вируса гепатита B, гепатита C или гепатита E (например, белок оболочки E1 или E2, сердцевинный белок, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, NS5b, p7 или их часть и/или сочетания HCV); антигены, получаемые из вирусов папилломы человека (например, HPV6, 11, 16, 18, например, L1, L2, E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7 или их часть и/или сочетания); антигены, получаемые из других вирусных патогенов, таких как респираторно-синцитиальный вирус (например, белки F и G или их производные), вирус парагриппа, вирус кори, вирус эпидемического паротита, флавивирусы (например, вирус желтой лихорадки, вирус денге, вирус клещевого энцефалита, вирус японского энцефалита) или их часть и/или сочетания.

Композиция по изобретению может содержать неживые антигены следующих вирусов, но не ограничены ими: неживые антигены из вируса опоясывающего лишая, HIB, коклюша, полиомиелита, столбняка, дифтерии, гепатита A, сезонного гриппа, гриппа A, гриппа B, респираторно-синцитиального вируса (RSV), метапневмовируса человека (hMPV), вируса папилломы человека (HPV), ротавируса, норовируса, вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), простого герпеса и/или вируса парагриппа (OIV), риновируса, синдрома атипичной пневмонии (SARS), коронавирусов, опоясывающего лишая/ветряной оспы, гепатита A-E, хантавируса и/или цитомегаловируса, или их смесей.

Композиция по изобретению может содержать неживые антигены следующих ниже бактерий, но не ограничены ими: неживые антигены из пневмококков, менингококков, Haemophilus influenzae b, (Hib) Bacillus anthracis, Chlamydia trachomatis, Pseudomonas aeruginosa, Mycobacterium tuberculosis, дифтерии, Escherichia coli., группы стрептококков, Neisseria gonorrhoeae, Bordetella pertussis или их смесей.

Антигены могут представлять собой, например, целые неживые антигены, такие как, например, целые инактивированные вирусы. Антиген также может являться частью патогена, такой как, например, часть инактивированного вируса. Антигенные компоненты, которые можно использовать представляют собой, но не ограничиваются ими, например, вирусные, бактериальные, микробактериальные или паразитарные антигены. Бактериальные патогены могут представлять собой, например, микобактерию, вызывающую туберкулез и лепру, пневмококки, аэробные грамотрицательные или грамположительные бациллы, микоплазму, стафилококковые инфекции, стрептококковые инфекции, Helicobacter pylori, сальмонеллу, Bordetella pertussis и хламидии. Заболевания также могут представлять собой бактериальные инфекции, такие как инфекции, вызываемые микробактериями, вызывающими туберкулез и лепру, пневмококки, аэробные грамотрицательные бациллы, микроплазма, стафилококковые инфекции, стрептококковые инфекции, Helicobacter pylori, сальмонелла, дифтерия, Bordetella pertussis, вызывающая судорожный кашель и хламидии.

Предпочтительные типы вакцин для иммунизации неиммунизированных индивидуумов и иммунологически скомпрометированных пациентов можно выбирать из группы, состоящей из пневмококковой вакцины, вакцины против гепатита A-E, менингококковой вакцины, вакцины на основе Haemophilus influenzae b (Hib), дифтерийной вакцины и вакцины DTaP (защищает от дифтерии, столбняка и коклюша (судорожный кашель)).

Заболевания также могут являться паразитарными, такими как, например, малярия, лейшманиоз, трипаносомоз, токсоплазмоз, шистозоматоз, филяриоз, или различными типами злокачественной опухоли, такой как, например, рак молочной железы, рак желудка, рак толстого кишечника, рак прямой кишки, рак головы и шеи, злокачественная опухоль почки, злокачественная меланома, рак гортани, рак яичника, рак шейки матки, рак предстательной железы.

Заболевания также могут представлять собой аллергии, обусловленные клещом домашней пыли, пыльцой и другими аллергенами окружающей среды, и аутоиммунные заболевания, такие как, например, системная красная волчанка.

Антиген в вакцинной композиции может представлять собой целые неживые антигены, такие как, например, целые инактивированные вирусы, расщепленные неживые антигены или субъединичные неживые антигены. Способы инактивации хорошо известны в данной области, такие как тепловая инактивация, инактивация облучением посредством УФ-излучения или инактивация посредством инактивации формалином или обработки бета-пропиолактоном.

Композиция по изобретению предназначена для применения в качестве вакцин для иммунизации неиммунизированных индивидуумов и иммунологически скомпрометированных индивидуумов детского возраста. Иммунологически скомпрометированные пациенты детского возраста предпочтительно выбирают из группы, состоящей из людей, которые представляют собой инфицированных ВИЧ индивидуумов; индивидуумов, принимающих иммуносупрессорные лекарственные средства, такие как пациенты, недавно перенесшие пересадку органа; недоношенные дети и послеоперационные пациенты. Неиммунизированные индивидуумы также могут представлять собой детей младше 18 лет, таких как дети от 0 до 18 лет, в частности дети 12 лет и младше. Как правило, возраст детей составляет менее 8 лет, такой как 6 лет или менее. Важным целевым классом пациентов для вакцины по изобретению являются дети, в частности в возрасте от 2 месяцев до менее 9 лет, как правило, дети в возрасте от 3 месяцев до менее 9 лет, такие как в возрасте от 6 месяцев до менее 8 лет, более предпочтительно в возрасте от 6 месяцев до менее 7 лет, такие как в возрасте от 6 месяцев до менее 72 месяцев, или в возрасте от 6 месяцев до 60 месяцев, или в возрасте от 6 месяцев до 24 месяцев. Композиция по изобретению по меньшей мере частично предназначена в качестве вакцины для использования в педиатрии.

Неиммунизированные индивидуумы могут принадлежать группам любого возраста, когда композиция относится конкретно к вакцине для использования во время периода пандемии или перипандемии.

Streptococcus pneumoniae является основной причиной заболеваемости и смертности во всем мире, где по оценкам 1,6 миллионов людей умирает от инвазивного пневмококкового заболевания (IPD) каждый год (WHO, 2002). IPD наиболее распространено среди очень маленьких детей (<24 месяцы) и пожилых людей (>65 лет); уровни смертности пожилых людей от IPD являются наиболее высокими. В настоящее время доступными являются четыре вакцины для профилактики инфекции Streptococcus pneumoniae. Для Streptococcus pneumoniae доступны не являющиеся интраназальными вакцины.

Один из представляющих интерес вариантов осуществления изобретения относится к интраназальному альтернативному варианту для профилактики инфекции Streptococcus pneumoniae, в частности предназначенному для грудничков, детей, подростков и других неиммунизированных Streptococcus pneumoniae индивидуумов. В композиции по изобретению не используют живые аттенуированные бактерии, а используют неживые антигены Streptococcus pneumoniae. Неожиданная эффективность вакцины по изобретению обусловлена используемым адъювантом, и неожиданный результат являлся специфическим для неиммунизированных индивидуумов. Аналогичные результаты также предполагают для иммунологически скомпрометированных индивидуумов.

Таким образом, дополнительный аспект изобретения относится к композиции для применения в качестве неживой интраназально вводимой вакцины для применения у неиммунизированных индивидуумов и иммунологически скомпрометированных пациентов детского возраста для профилактики инфекции Streptococcus pneumoniae или для уменьшения тяжести симптомов, ассоциированных с инфекцией Streptococcus pneumoniae, где указанная композиция содержит:

i) один или более антигенов Streptococcus pneumoniae и

ii) адъювант, содержащий:

одну или более карбоновых кислот,

водную среду и

необязательно один или более моноглицеридов.

Иммунологически скомпрометированных пациентов предпочтительно выбирают из группы, состоящей из грудничков, детей и подростков, которые представляют собой инфицированных ВИЧ индивидуумов; индивидуумов, принимающих иммуносупрессорные лекарственные средства, таких как пациентов, недавно перенесших пересадку органа; недоношенных детей и послеоперационных пациентов.

Один из важных вариантов осуществления изобретения относится к вакцине против пневмококковой инфекции для профилактики и/или уменьшения симптомов состояний болезни, выбранных из группы, состоящей из бронхита, пневмонии, сепсиса, перикардита, менингита и перитонита.

Один из вариантов осуществления относится к использованию пневмококковой вакцины, такой как вакцина на основе полисахаридов пневмококка (PPV), индивидуумов детского возраста, в частности для применения у индивидуумов в возрасте от 4 недель до 6 лет (например, для индивидуумов, которые являются неиммунизированными против пневмококковых антигенов, и с неполностью развитой иммунной системой.

Вакцинная композиция по изобретению может дополнительно содержать фармацевтически приемлемые эксципиенты, такие как, например, среда, которая может представлять собой водную среду, дополнительно содержащую поверхностно-активное средство, которое может являться гидрофильным и инертным, и биосовместимым, таким как, например, полоксамеры, такие как, например, плюроник F68 или плюроник 127.

Пневмококковая вакцина по настоящему изобретению может дополнительно содержать антибактериальные средства, антиоксиданты, инактивирующие вирус средства, консерванты, красители, стабилизаторы, противовспениватели, поверхностно-активные вещества (неионные, анионные или катионные), как описано в настоящем документе, или любое их сочетание. Антибактериальные средства могут представлять собой, например, амфотерицин или любое его производное, хлортетрациклин, формальдегид или формалин, гентамицин, неомицин, полимиксин B или любое его производное, стрептомицин или любое их сочетание. Антиоксиданты могут представлять собой, например, аскорбиновую кислоту или токоферол, или любое их сочетание. Инактивирующие патоген, например, вирусы и/или бактерии, средства могут представлять собой, например, формалин, бета-пропиолактон, УФ-излучение, нагревание или любое их сочетание.

При описании вариантов осуществления настоящего изобретения комбинации и перестановки всех возможных вариантов осуществления не были явно описано. Однако тот факт, что определенные признаки перечислены во взаимно различных зависимых пунктах формулы изобретения или описаны в различных вариантах осуществления, не указывает на то, что комбинацию этих признаков нельзя использовать для получения преимущества. Настоящее изобретение предусматривает все возможные комбинации и перестановки описываемых вариантов осуществления.

Примеры

Пример 1

Задача

Задачей настоящего исследования являлось исследование иммуногенности и защитной эффективности интраназально вводимого формулируемого с адъювантом расщепленного антигена гриппа и формулируемого с адъювантом антигена убитого целого вируса гриппа антиген на модели на хорьках по настоящему изобретению.

Вакцину на основе расщепленного антигена H1N1/California/2009 (вакцина A) исследовали с дозами антигена 5, 15 или 30 мкг HA и вакцину на основе антигена убитого целого вируса H1N1/California/2009 (вакцина B) исследовали с дозой антигена 15 мкг HA. Эффективность вакцины исследовали с использованием вируса дикого типа H1N1 A/The Netherlands/602/2009 в качестве контрольного заражения.

Адъювант Endocine™ содержал эквимолярные количества моноолеата глицерина и олеиновой кислоты с конечной концентрацией 20 мг/мл (2%) в вакцинной композиции. В этом эксперименте Immunose™ FLU означает неживые антигены гриппа, смешанные с Endocine™.

Экспериментальные группы. Фаза иммунизации

Таблица 1 Номер группы Число животных Тестируемое вещество Доза антигена (мкг HA) Путь иммунизации 1 6 Физиологический раствор 0 Назальный 2 6 Fluarix® 15 на штамм Подкожный 3 6 Вакцина A 5 Назальный 4 6 Вакцина A 15 Назальный 5 6 Вакцина A 30 Назальный 6 6 Вакцина B 15 Назальный

Получение и введение вакцины

Физиологический раствор: 0,9% физиологический раствор pH 5-5,5.

Fluarix®: парентеральная вакцина (состоящая из подобного A/California/7/2009(H1N1), подобного A/Perth/16/2009(H3N2) и подобного B/Brisbane/60/2008 вакцинных штаммом, по 15 мкг HA каждого вакцинного штамма в 0,5 мл). Животных группы 2 вакцинировали подкожно на сутки 21 и 42 0,5 мл Fluarix (GlaxoSmithKline Biologicals).

Вакцина A: вакцина против гриппа в форме назальных капель, 5, 15 и 30 мкг HA/0,2 мл, где состав адъюванта содержал состав Endocine эквимолярных количеств моноолеата глицерина и олеиновой кислоты (pH 8, в Tris 0,1 M) с конечной концентрацией 20 мг/мл в вакцинной композиции; расщепленный антиген H1N1/California/2009.

Вакцина B: вакцина против гриппа в форме назальных капель, 15 мкг HA/0,2 мл, где состав адъюванта содержит состав Endocine эквимолярных количеств моноолеата глицерина и олеиновой кислоты (pH 8, в Tris 0,1 M) с конечной концентрацией 20 мг/мл в вакцинной композиции, антиген целого убитого вируса H1N1/California/2009.

Хорьки

Использовали здоровых самок хорьков (Mustela putorius furo: беспородных) в возрасте приблизительно 12 месяцев с массой тела 760-1210 г и серонегативных к антителам против циркулирующих вирусов гриппа B, A/H1N1, A/H3N2 и A/pH1N1, как продемонстрировано анализом ингибирования гемагглютинации (HI). Животных содержали в обычных клетках в группах с максимальным количеством 8 животных во время фазы предварительной иммунизации и в исследуемых группах по 6 животных во время фазы иммунизации. Исследуемые группы переносили в перчаточные камеры-изоляторы с отрицательным давлением на сутки заражения. Во время всего исследования животных содержали на коммерческом гранулированном корме и воде в свободном доступе.

Иммунизация

Пять групп по шесть хорьков получали три интраназальные иммунизации (капли: 100 мкл в каждую ноздрю с использованием пипетки с фильтром) под анестезией кетамином и домитор на сутки 0, 21 и 42. Животные группы 1 получали 200 мкл стерильного физиологического раствора (0,9% физиологический раствор pH5-5,5). Группу 3, 4 и 5 интраназально иммунизировали 200 мкл формулируемого с Endocine™ расщепленного антигена H1N1/California/2009, содержащего 5, 15 и 30 мкг HA, соответственно. Группу 6 was интраназально иммунизировали 200 мкл формулируемого с Endocine™ антигена целого вируса H1 N1/California/2009, содержащего 15 мкг HA. Контрольная группа 1 получала 200 мкл физиологического раствора интраназально. Одну группу из шести хорьков (группа 2) вакцинировали подкожно на сутки 21 и 42 0,5 мл Fluarix® (GlaxoSmithKline Biologicals) сезон 2010/2011 трехвалентной вакциной против гриппа (TIV) без добавления адъюванта, которая содержала 15 мкг HA каждого вакцинного штамма.

Образцы крови для получения сыворотки собирали до иммунизации на сутки 0, 21 и 42 и перед заражением на сутки исследования 64 и 70.

Получение и введение вируса экспериментального заражения

На сутки исследования 70 всех животных подвергали экспериментальному заражению полевым изолятом вируса гриппа (H1N1 штамм A/The Netherlands/602/2009) внутритрахеальным путем. Для получения вируса для экспериментального заражения исходный раствор для экспериментального заражения H1N1 A/The Netherlands/602/2009 (7,8 log10 TCID50/мл) разводили ледяным PBS до концентрации 3,3×105 TCID50/мл. Всех животных подвергали экспериментальному заражению с использованием 3 мл препарата вируса для контрольного заражения, содержащего 106 TCID50, вводимого с использованием небольшого катетера в трахею с использованием трахеоскопа и выделяемого чуть выше ветвления. Получение и введение вируса для экспериментального заражения проводили в условиях BSL3. Через сутки после контрольного заражения образец оставшегося разведения вируса контрольного заражения титровали на клетках Мадин-Дарби почек собак (MDCK) для подтверждения инфицирующей способности вируса. Обратное титрование разведения контрольного заражения через сутки после инокуляции демонстрировало, что материал все еще содержал 4,8 log10 TCID50.

Способы и сбор образцов

В ходе эксперимента на хорьках проводили несколько процедур. Для имплантации датчиков температуры, иммунизации, экспериментального вирусного заражения и компьютерно-томографической (CT) визуализации животных анестезировали смесью кетамина (4-8 мг/кг: в/м, Alfasan, Woerden, The Netherlands) и домитора (0,1 мг/кг: в/м, Orion Pharma, Espoo, Finland). Для получения образцов (кровь, мазки и назальные мазки) и эвтаназии путем кровопускания животных анестезировали кетамином. За две недели до начала эксперимента в брюшную полость хорьков помещали регистрирующее температуру устройство (ультра-маленькое регистрирующее температуру устройство DST micro-T, Star-Oddi, Reykjavik, Iceland). Это устройство регистрировало температуру тела животных каждые 10 минут. Хорьков взвешивали перед каждой иммунизацией (на сутки 0, 21 и 42) и на сутки экспериментального заражения и эвтаназии (на сутки 70 и 74). За животными групп 1, 2 и 4 наблюдали посредством CT визуализации на сутки 64, 71, 72, 73 и 74. Образцы крови собирали до иммунизации на сутки 0, 21 и 42, на сутки 64 и перед экспериментальным заражением на сутки 70. Мазки из носовой полости и горла собирали перед экспериментальным заражением на сутки 70 и каждые сутки после экспериментального заражения.

Сбор образцов крови и сыворотки

Образцы крови собирали и разделяли на 2 равных объема. Один объем, используемый для выделения PBMC, немедленно переносили в пробирку, содержащую антикоагулянт EDTA. Другой объем, используемый для сбора сыворотки, переносили в пробирку для сыворотки, содержащую активатор свертывания. Все пробирки для сыворотки центрифугировали приблизительно при 2000×g в течение 10 минут при комнатной температуре. Сыворотку разделяли на аликвоты по 0,1 мл образцов и хранили приблизительно при -80°C.

Выделение PBMC и плазмы

Образцы крови, используемые для выделения PBMC, немедленно переносили в пробирку, содержащую антикоагулянт EDTA, центрифугировали при 880×g течение 5 минут, плазму хранили приблизительно при -80°C. Осадок клеток ресуспендировали в 3,5 мл буфера для промывания (D-PBS: № партии: RNBB7791, V-CMS: 10700395 и EDTA: № партии: 079K8712, V-CMS: 10700037), наносили слоями на 3 мл Lymphoprep и центрифугировали при 800×g в течение 30 минут. После центрифугирования собирали содержащую клетки границу раздела фаз, переносили в новую пробирку и 4 раза промывали буфером для промывания. В последующие этапа промывания включали центрифугирование при 600×g, 465×g и 350×g в течение 10 минут и при 250×g в течение 15 минут. После последнего этапа промывания, осадок клеток ресуспендировали, помещали на лед в течение по меньшей мере 10 минут, ресуспендировали в 1 мл ледяной замороженной среды (RPMI, № партии 1MB078, 20% ЭТС VC № 201110194, 10% DMSO VC № 10700203), переносили в ампулу и хранили при -80°C.

Серология

Титры антител против H1N1 A/The Netherlands/602/2009 и 2 отдаленных вирусов H1N1 A/Swine/Ned/25/80 и H1N1 A/Swine/Italy/14432/76 определяли анализом ингибирования гемагглютинации (HI) и анализом нейтрализации вируса (VN). Титры антител против отдаленного вируса H1N1 A/New Jersey/08/76 определяли анализом ингибирования гемагглютинации.

Анализ HI

Анализ HI представляет собой стандартный анализ связывания, основанный на способности специфических к гемагглютинину вируса гриппа антител блокировать индуцируемую гриппом агглютинацию эритроцитов. Образцы предварительно обрабатывали холерным фильтратом (получаемым из культур холерного вибриона) для удаления неспецифической антигемагглютининовой активности. После инкубации в течение 16 часов при 37°C холерный фильтрат инактивировали инкубацией образцов в течение 1 часа при 56°C. Проводили серийные двукратные разведения образцов в фосфатно-солевом буфере (PBS) (в двух повторениях 96-луночные планшеты, начиная с разведения 1:20), а затем для образцов демонстрировали a-специфическую гемагглютинацию, их предварительно обрабатывали эритроцитами индейки. После удаления этих эритроцитов образцы инкубировали с установленными концентрациями 4 единицы гемагглютинации (HAU) описываемого вируса гриппа в течение 1 часа при 4°C. В заключении планшеты независимо оценивали на ингибирование гемагглютинации, как продемонстрировано седиментацией эритроцитов. Для отслеживания изменений во все измерения включали сыворотку контрольных хорьков.

Анализ VN

Анализ VN представляет собой стандартный анализ, основанный на способности субпопуляции специфических к вируса гриппа антител нейтрализовать вирус, таким образом, что в культуре клеток больше не происходит репликации вируса. Образцы инактивировали нагреванием в течение 30 минут при 56°C, а затем проводили серийные двукратные разведения образцов в инфекционной среде (минимальной питательной среде Игла с добавлением 20 мМ Hepes, 0,075% бикарбоната натрия, 2 мМ L-глутамина, 100 МЕд./мл пенициллина и стрептомицина, 17,5 мкг/мл трипсина и 2,3 мкг/мл амфотерицина B) в трех повторениях в 96-лунучных планшетах, начиная с разведения 1:8. Затем разведенные образцы инкубировали с 25-400 TCID50 рассматриваемого вируса в течение 1 часа при 37°C, 5% CO₂. После окончания периода инкубации 1 час смеси вирус-антитело переносили в планшеты с монослоями культуры клеток Мадин-Дарби почек собак (MDCK), которые являлись на 95-100% конфлюэнтными. Затем эти планшеты инкубировали в течение 1 часа при 37°C, 5% CO₂, а затем удаляли смеси вирус-антитело и заменяли инфекционной средой. После периода инкубации 6 суток при 37°C, 5% CO₂ планшеты считывали с использованием эритроцитов индейки для детекции присутствия гемагглютинина вируса гриппа. Титры VN рассчитывали в соответствии со способом, описанным Reed and Muench (Reed L.J., Muench, H. (1938). "A simple method of estimating fifty percent endpoints". The American Journal of Hygiene 27: 493-497).

Репликация вируса в верхних и нижних дыхательных путях

На сутки 0, 1, 2, 3 и 4 после экспериментального заражения у животных получали мазки носовой полости и горла под анестезией. Через четверо суток после экспериментального заражения хорьков подвергали эвтаназии путем кровопускания под анестезией, после чего проводили общие макропатологические исследования и собирали ткани. Собирали образцы правой носовой раковины и всех долей правого легкого и добавочной доли и хранили при -80°C до дальнейшей обработки. Образцы раковины и легкого взвешивали, а затем гомогенизировали с использованием FastPrep-24 (MP Biomedicals, Eindhoven, The Netherlands) в сбалансированном солевом растворе Хэнка, содержащем 0,5% лактальбумина, 10% глицерина, 200 Ед/мл пенициллина, 200 мкг/мл стрептомицина, 100 Ед/мл сульфата полимиксина B, 250 мкг/мл гентамицина и 50 Ед/мл нистатина (ICN Pharmaceuticals, Zoetermeer, The Netherlands) и перед разведением быстро центрифугировали.

После сбора мазки из новой полости и горла хранили при -80°C в той же самой среде, которую использовали для обработки образцов ткани. 10-кратные серийные разведения супернатантов легких и мазков в четырех повторениях использовали для определения титров вируса в конфлюэнтных слоях клеток MDCK, как описано ранее (Rimmelzwaan GF et al., J. Virol. Methods, 1998 Sep; 74(1)57-66).

Результаты титрования антител

Уровни антител в сыворотке определяли на сутки 0, 21, 42, 64 и 70 перед каждой иммунизацией. Титры против H1N1 A/The Netherlands/602/2009 и 2 отдаленных вирусов (H1N1 A/Swine/Ned/25/80 и H1N1 A/Swine/Italy/14432/76 определяли анализом ингибирования гемагглютинации (HI) и анализом нейтрализации вируса (VNT). Титры антител против отдаленного вируса H1N1 A/New Jersey/08/76) определяли анализом ингибирования гемагглютинации (HI).

Титры HI-антител - Гомологичные: H1N1 A/The Netherlands/602/2009

Геометрическое среднее титров HI проиллюстрировано на фигуре 1. Для расчета геометрического среднего значение ≤5 заменяли соответствующей абсолютной величиной 5. Все серологические уровни до обработки (сутки 0) являлись отрицательными по отношению к HI-антителам (титр: ≤5).

Анализ титров HI по группам выявлял следующие ниже результаты:

Группа 1 (физиологический раствор, инфекционный контроль)

Все образцы сыворотки являлись отрицательными по отношению к HI-антителам.

Группа 2 (Fluarix®; парентеральный контроль)

Один образец сыворотки, собранный после первой иммунизации (сутки 42), являлся слабоположительными по отношению к HI-антителам (титр: 13). После второй иммунизации детектировали низкие тиры HI (в диапазоне 13-70) в сыворотке пяти из шести животных.

Группа 3 (вакцина A, 5 мкг HA; интраназально)

Все образцы, собранные после первой иммунизации, являлись положительными по отношению к HI (сутки 21; GMT: 477, диапазон 160-1120). Титры HI-антител значительно повышались после второй иммунизации (сутки 42; GMT: 1669, диапазон 1120-2560) и у четырех из шести животных также после третьей иммунизации (сутки 64; GMT: 2158, диапазон 1280-3840). Для образцов, собранных на сутки 70 (сутки экспериментального заражения), демонстрировали титры HI, сравнимые с титрами, измеряемыми на сутки 64 (сутки 70; GMT: 2103, диапазон 1120-3840).

Группа 4 (вакцина A, 15 мкг HA; интраназально)

Пять из шести образцов, собранных после первой иммунизации, являлись положительным по отношению к HI (сутки 21; GMT: 1130 диапазон, 5-5760). Все образцы, собранные после второй иммунизации, являлись положительными по отношению к HI-антителам. Титры HI-антител значительно увеличивались у пяти животных (сутки 42; GMT: 3673, диапазон, 1120-5760). Третья иммунизация не приводила к повышенным титрам HI-антител (сутки 64; GMT: 2386, диапазон 1920-4480). Для образцов, собранных на сутки 70 (сутки экспериментального заражения) демонстрировали титры HI, сравнимые с титрами, измеряемыми на сутки 64 (сутки 70; GMT: 2281, диапазон 1280-2560).

Группа 5 (вакцина A, 30 мкг HA; интраназально)

Все образцы, собранные после первой иммунизации, являлись положительными по отношению к HI-антителам (сутки 21; GMT: 1249, диапазон 400-3200). Титры HI-антител повышались у пяти из шести животных после второй иммунизации (сутки 42; GMT: 1874, диапазон 640-3840), а также у двух животных после третьей иммунизации (сутки 64; GMT: 1837 диапазон 1280-3200). Для образцов, собранных на сутки 70 (сутки экспериментального заражения), демонстрировали титры HI, сравнимые с титрами, измеряемыми на сутки 64 (сутки 70; GMT: 1699, диапазон 640-3200).

Группа 6 (вакцина B, 15 мкг HA; интраназально)

Пять из шести образцов, собранных после первой иммунизации, являлись положительными по отношению к HI-антителам (сутки 21; GMT: 87, диапазон 5-1280). Титры HI-антител значительно повышались у всех животных после второй иммунизации (сутки 42; GMT: 577, диапазон 100-2880), а также у двух животных после третьей иммунизации (сутки 64; GMT: 626, диапазон 160-2560). Для образцов, собранных на сутки 70 (сутки экспериментального заражения), демонстрировали титры HI, сравнимые с титрами, измеряемыми на сутки 64 (сутки 70; GMT: 583, диапазон 160-2240).

Гетерологичные: H1N1 A/Swine/Ned/25/80, H1N1 A/Swine/Italy/14432/76 и H1N1 A/New Jersey/08/76

Детектировали титры HI-антител против отдаленных вирусов H1N1 A/Swine/Ned/25/80, H1N1 A/Swine/Italy/14432/76 и H1N1 A/New Jersey/08/76. Геометрическое среднее титров HI против отдаленных вирусов проиллюстрировано на фигуре 2. Для расчета геометрического среднего значение ≤5 заменяли соответствующей абсолютной величиной 5. Все серологические уровни до обработки (сутки 0) являлись отрицательными по отношению к антителу HI (титр: ≤5). Титры поперечно-реагирующих HI-антител являлись значительно ниже, чем титры HI-антител к гомологичному H1N1 A/The Netherlands/602/2009.

Анализ титров HI по группам выявлял следующие ниже результаты:

Группа 1 (физиологический раствор; инфекционный контроль)

Все образцы сыворотки являлись отрицательными по отношению к HI-антителу, за исключением одного. Для одного образца, собранного на сутки 64, демонстрировали очень низкий титр 7,5 HI-антител против H1N1 A/Swine/Italy/14432/76.

Группа 2 (Fluarix®; парентеральный контроль)

Все образцы являлись отрицательными по отношению к антителам против H1N1 A/Swine/Ned/25/80 и H1N1 A/Swine/Italy/14432/76. Низкие титры HI против H1N1 A/New Jersey/08/76 детектировали у троих из шести животных после первой иммунизации в сыворотке, собираемой на сутки 42.

Группа 3 (вакцина A, 5 мкг HA; интраназально)

У всех животных образовывались перекрестно-реагирующие HI-антитела против трех отдаленных вирусов. Наиболее высокие титры измеряли после второй и/или третьей иммунизации. Титры HI-антител (GMT) против H1N1 A/Swine/Ned/25/80 на сутки 21, 42, 64 и 70 составляли 6 (диапазон 5-7,5), 24 (диапазон 5-60), 32 (диапазон 20-80) и 19 (диапазон 5-70), соответственно. Титры HI-антител (GMT) против H1N1 A/Swine/Italy/14432/76 на сутки 21, 42, 64 и 70 составляли 16 (диапазон 5-50), 38 (диапазон 10-80), 63 (диапазон 40-160) и 42 (диапазон 20-120), соответственно. Титры HI-антител (GMT) против H1N1 A/New Jersey/08/76 на сутки 21, 42, 64 и 70 составляли 5, 26 (диапазон 7,5-70), 39 (диапазон 5-80) и 29 (диапазон 20-50), соответственно.

Группа 4 (вакцина A, 15 мкг HA; интраназально)

У всех животных образовывались перекрестно-реагирующие HI-антитела против трех отдаленных вирусов после второй иммунизации. Третья иммунизация не приводила к повышению титров HI. Титры HI-антител (GMT) против H1N1 A/Swine/Ned/25/80 на сутки 21, 42, 64 и 70 составляли 42 (диапазон 5-90), 239 (диапазон 20-1120), 88 (диапазон 50-160) и 75 (диапазон 40160), соответственно. Титры HI-антител (GMT) против H1N1 A/Swine/Italy/14432/76 на сутки 21, 42, 64 и 70 составляли 78 (диапазон 5-280), 327 (диапазон 35-1280), 153 (диапазон 80-320) и 105 (диапазон 70-160), соответственно. Титры HI-антител (GMT) против H1N1 A/New Jersey/08/76 на сутки 21, 42, 64 и 70 составляли 25 (диапазон 5-80), 176 (диапазон 60-400), 64 (диапазон 40-140) и 63 (диапазон 40-160), соответственно.

Группа 5 (вакцина A, 30 мкг HA; интраназально)

У всех животных, за исключением одного, образовывались перекрестно-реагирующие HI-антитела против H1N1 A/Swine/Ned/25/80. У всех животных образовывались перекрестно-реагирующие HI-антитела против H1N1 A/Swine/Italy/14432/76 и H1N1 A/New Jersey/08/76. Наиболее высокие титры измеряли после второй и/или третьей иммунизации. Титры HI-антител против (GMT) H1N1 A/Swine/Ned/25/80 на сутки 21, 42, 64 и 70 составляли 23 (диапазон 5-80), 41 (диапазон 5-320), 42 (диапазон 5-320) и 34 (диапазон 5-320), соответственно. Титры HI-антител (GMT) против H1N1 A/Swine/Italy/14432/76 на сутки 21, 42, 64 и 70 составляли 39 (диапазон 5-160), 54 (диапазон 5-640), 78 (диапазон 20-720) 50 (диапазон 5-480), соответственно. Титры HI-антител (GMT) против H1N1 A/New Jersey/08/76 на сутки 21, 42, 64 и 70 составляли 9 (диапазон 5-30), 40 (диапазон 5-400), 35 (диапазон 5-160) и 27 (диапазон 5-160), соответственно.

Группа 6 (вакцина B, 15 мкг HA; интраназально)

У всех животных образовывались перекрестно-реагирующие HI-антитела против H1N1 A/Swine/Italy/14432/76. У всех животных, за исключением одного, образовывались перекрестно-реагирующие HI-антитела против H1N1 A/Swine/Ned/25/80, и у всех животных, за исключением одного, образовывались перекрестно-реагирующие HI-антитела против H1N1 A/New Jersey/08/76. Наиболее высокие титры измеряли после второй и/или третьей иммунизации. Титры HI-антител (GMT) против H1N1 A/Swine/Ned/25/80 на сутки 21, 42, 64 и 70 составляли 7 (диапазон 5-40), 19 (диапазон 5-80), 15 (диапазон 5-80) и 9 (диапазон 5-40), соответственно. Титры HI-антител (GMT) против H1N1 A/Swine/Italy/14432/76 на сутки 21, 42, 64 и 70 составляли 9 (диапазон 5-160), 32 (диапазон 5-160), 27 (диапазон 5-160), 15 (диапазон 5-80), соответственно. Титры HI-антител (GMT) против H1N1 A/New Jersey/08/76 на сутки 21, 42, 64 и 70 составляли 8 (диапазон 5-80), 47 (диапазон 10-240), 19 (диапазон 5-140) и 13 (диапазон 580), соответственно.

Титры VN антител:

Гомологичные: H1N1 A/The Netherlands/602/2009

Титры VN антител измеряли в образцах сыворотки от всех экспериментальных животных. Все серологические уровни до обработки (сутки 0) являлись отрицательными по отношению к VN антителам (титр: ≤8).

Анализ титров VN по группам выявлял следующие результаты:

Группа 1 (физиологический раствор; инфекционный контроль)

Все образцы сыворотки являлись отрицательными по отношению к VN антителам, за исключением одного, собранного на сутки 42, который измеряли как ≤64.

Группа 2 (Fluarix®; парентеральный контроль)

Все образцы сыворотки являлись отрицательными по отношению к VN антителам.

Группа 3 (вакцина A, 5 мкг HA; интраназально)

Четыре из шести образцов, собранных после первой иммунизации, являлись слабоположительными по отношению к VN антителам (сутки 21; GMT: 19 диапазон, 8-64). Все образцы, собранные после второй иммунизации, являлись положительными по отношению к VN антителам. Титры VN антител значительно повышались у пяти животных после второй иммунизации (сутки 42; GMT: 242, диапазон, 64-859) и после третьей иммунизации (сутки 64; GMT: 995, диапазон 362-2436). Для образцов, собранных на сутки 70 (сутки экспериментального заражения), демонстрировали сравнимые или более низкие титры VN по сравнению с титрами, измеряемыми на сутки 64 (сутки 70; GMT: 535, диапазон 304-859).

Группа 4 (вакцина A, 15 мкг HA; интраназально)

Пять из шести образцов, собранных после первой иммунизации, являлись положительными по отношению к VN антителам (сутки 21; GMT: 147 диапазон, 8-724). Все образцы, собранные после второй иммунизации, являлись положительными по отношению к VN антителам. Титры VN антител значительно повышались у пяти животных после второй иммунизации (сутки 42; GMT: 2376, диапазон, 64-8192) и у двух животных после третьей иммунизации (сутки 64; GMT: 1688, диапазон 662-4871). Для образцов, собранных на сутки 70 (сутки экспериментального заражения), демонстрировали титры VN сравнимые с титрами, измеряемыми на сутки 64 (сутки 70; GMT: 1581, диапазон 351-3444).

Группа 5 (вакцина A, 30 мкг HA; интраназально)

Все образцы, собранные после первой иммунизации, являлись положительными по отношению к VN антителам (сутки 21; GMT: 74, диапазон 11-627). Титры VN антител значительно повышались у пяти из шести животных после второй иммунизации (сутки 42; GMT: 504, диапазон 41-3435) и у троих из шести животных после третьей иммунизации (сутки 64; GMT: 1673 диапазон 724-4884). Для образцов, собранных на сутки 70 (сутки экспериментального заражения), демонстрировали титры VN сравнимые с титрами, измеряемыми на сутки 64 (сутки 70; GMT: 1699, диапазон 304-5793).

Группа 6 (вакцина B, 15 мкг HA; интраназально)

Два из шести образцов, собранные после первой иммунизации, являлись слабоположительными по отношению к VN антителам (сутки 21; GMT: 12, диапазон 8-64). Все образцы, собранные после второй иммунизации, являлись положительными по отношению к VN антителам (сутки 42; GMT: 78, диапазон 32-304). Титры VN антител повышались после третьей иммунизации (сутки 64; GMT: 242, диапазон 113-747). Для образцов, собранных на сутки 70 (сутки экспериментального заражения), демонстрировали сравнимые или более низкие тиры VN по сравнению с титрами, измеряемыми на сутки 64 (сутки 70; GMT: 177, диапазон 91-362).

Гетерологичные: H1N1 A/Swine/Ned/25/80, H1N1 A/Swine/Italy/14432/76. Тестировали титры VN антител против отдаленных вирусов H1N1 A/Swine/Ned/25/80 и H1N1 A/Swine/Italy/14432/76 (данные не показаны). Все группы 3, 4, 5 и 6 превосходили по группы 1 и 2 на сутки 42, 64 и 70.

Пример 2

Для всех экспериментальных животных определяли определенные клинические и патологические параметры, т.е. смертность, температуру тела, массу тела, вентилируемые объемы легких, вирусную нагрузку в носовых раковинах и легких, выделение вируса в верхних дыхательных путях, посмертное макроскопическое анатомо-патологическое исследование массы легких, среднего процента повреждения пораженной ткани легкого. Макроскопическое исследование параметров воспаления носовых раковин и легких. Группы животных 3, 4 и 5 превосходили группы 1 и 2 по всем макроскопическим и большей части микроскопических тестируемых параметров (данные не показаны).

Репликация вируса в верхних и нижних дыхательных путях

На сутки 0, 1, 2, 3 и 4 после экспериментального заражения у животных получали мазки из носовой полости и горла под анестезией. Через четверо суток после экспериментального заражения хорьков подвергали эвтаназии путем кровопускания под анестезией, после чего проводили общие макропатологические исследования и собирали ткани. Собирали образцы правой носовой раковины и всех долей правого легкого и добавочной доли и хранили при -80°C до дальнейшей обработки. Образцы раковины и легкого взвешивали, а затем гомогенизировали с использованием FastPrep-24 (MP Biomedicals, Eindhoven, The Netherlands) в сбалансированном солевом растворе Хэнка, содержащем 0,5% лактальбумина, 10% глицерина, 200 Ед/мл пенициллина, 200 мкг/мл стрептомицина, 100 Ед/мл сульфата полимиксина B, 250 мкг/мл гентамицина и 50 Ед/мл нистатина (ICN Pharmaceuticals, Zoetermeer, The Netherlands) и перед разведением быстро центрифугировали.

После сбора мазки из новой полости и горла хранили при -80°C в той же самой среде, которую использовали для обработки образцов ткани. 10-кратные серийные разведения супернатантов легких и мазков в четырех повторениях использовали для определения титров вируса в конфлюэнтных слоях клеток MDCK, как описано ранее (Rimmelzwaan GF et al., J. Virol. Methods, 1998 Sep; 74(1)57-66).

Макропатология и гистопатология

Проводили вскрытие животных в соответствии со стандартным протоколом, как описано ранее (van den Brand JM et al., PLoS One 2012; 7(8)e42343). В кратком изложении, трахею пережимали, таким образом, чтобы легкие не опускались при открытии плевральной полости, что обеспечивало точное визуальное количественное определение областей пораженной паренхимы легких. Получали образцы для гистологического анализа левого легкого и хранили в 10% нейтральном забуференном формалине (после медленной инфузии формалина), погружали в парафин, делали срезы толщиной 4 мкм и окрашивали гематоксилином и эозином (HE) для анализа посредством световой микроскопии. Образцы получали стандартизированным образом, не руководствуясь изменениями, наблюдаемыми при макропатологическом исследовании. Полуколичественную оценку связанного с вирусом гриппа воспаления в легком проводили, как описано ранее (таблица 4) (Munster V.J. et al., Science, 2009 Jul 24; 325(5939):481-3). Все микроскопические препараты анализировали, не зная принадлежности или вида обработки животных.

Результаты вирусной нагрузки в легких и верхних дыхательных путях

Для всех хорьков контрольных групп 1 (и/н физиологический раствор) и 2 (парентерально TIV) демонстрировали высокие титры компетентного по репликации вируса в легком (средние титры: 5,7 и 5,5 log10TCID50/грамм ткани, соответственно) и в носовых раковинах (средние титры: 7,2 и 6,9 log10TCID50/грамм ткани, соответственно) (таблица 3). У хорьков групп 3, 4 и 5 (и/н вакцины на основе расщепленного антигена pH1N1/09 с добавлением в качестве адъюванта Endocine™) не детектировали инфекционного вируса в их легких и носовых раковинах. У хорьков группы 6 (и/н целый вирус с добавлением в качестве адъюванта Endocine™, 15 мкг HA) не детектировали инфекционного вируса в их легких и детектировали средний титр 4,1 log10TCID50/грамм ткани значительно более низкий титр вируса в носовых раковинах по сравнению с контрольной группой 1 (p=0,02).

Интраназальная иммунизация вакцинами pH1N1/09 с добавлением в качестве адъюванта Endocine™ снижала титры вируса в мазках, получаемых из носовой полости и горла по сравнению с введением физиологического раствора или TIV. Вирусные нагрузки, выраженные в виде площади под кривой (AUC) в определенные интервалы времени 1-4 суток после инокуляции, в мазках из носовой полости и горла представлены в таблице 3. Вирусные нагрузки в мазках из носовой полости групп 3, 4 и 5 (и/н расщепленный антиген с добавлением в качестве адъюванта Endocine™, 5, 15 и 30 мкг HA, соответственно), но не групп 2 и 6 являлись значительно ниже, чем в контрольной группе 1 (группа 1 в сравнении с группами 3-5; p≤0,03). Вирусные нагрузки в мазках из горла группы 1 и 2 являлись сравнимыми и значительно выше, чем в группах 3, 4, 5 и 6 (p≤0,03).

Результаты макропатологии и гистопатологии

Пониженная репликация вируса в группах, которые интраназально иммунизировали вакцинами pH1N1/09 с добавлением в качестве адъюванта Endocine™, соответствовала снижению макропатологических изменений в легких (таблица 3).

Макроскопические посмертные повреждения легких состояли из очагового или множественного уплотнения легкого, характеризующихся хорошо выраженным покраснением паренхимы. Для всех хорьков в контрольной группе 1 (и/н физиологический раствор) и группе 2 (парентерально TIV) демонстрировали пораженную легкую ткань со средним процентом 50% и 37%, соответственно, и он соответствовал со средней относительной массы легких (RLW) 1,5 и 1,3, соответственно (таблица 3). В противоположность этому легкие в группах 3, 4, 5 и 6 (и/н вакцины pH1N1/09 с добавлением в качестве адъюванта Endocine™) поражались гораздо в меньшей степени, где средние проценты пораженной ткани легкого составляли 7-8%. RLW в этих четырех вакцинированных Endocine™ группах находились в соответствии с этими наблюдениями (в близком диапазоне от 0,8 до 0,9).

Уплотнение легкого соответствовало острой бронхо-интерстициальной пневмонии при микроскопическом анализе. Оно характеризовалось наличием воспалительных клеток (главным образом макрофагов и нейтрофилов) в просвете и стенках альвеол, и отеком или потерей выстилающих пневмоцитов. Кроме того, как правило, в более тяжелых случаях альвеолита наблюдали отечную жидкость с высоким содержанием белка, нити фибрина и экстравазатные эритроциты в альвеолярных пространствах и гиперплазия пневмоцитов II типа. Гистологические параметры, которые оценивали, обобщены в таблице 4. Наиболее тяжелые альвеолярные повреждения выявляли в контрольных группах 1 (и/н физиологический раствор) и 2 (парентерально TIV). Все параметры альвеолярных повреждений оценивали как наиболее низкие в группе 5, но фактически различия между группами 3, 4, 5 и 6 являлись незначительным.

Достоверно в легких - внутритрахиальное экспериментальное заражение вирусом гриппа H1N1 A/Netherlands/602/2009 на такой модели на хорьках приводило к пневмонии от легкой до тяжелой формы. Однако несколько животных, все из вакцинированных групп, совсем не поражалось в отношении макроскопически заметных повреждений легких. На основании макроскопической посмертной оценки повреждений легких (оцениваемый % пораженного легкого) вакцинированная (вакцина A 15 мкг HA) группа 4 и вакцинированная (вакцина A 30 мкг HA) группа 5 в равной степени страдали минимальными повреждениями легких с очень низким баллом 7%, за которыми сразу следуют вакцинированная (вакцина A 5 мкг HA) группа 3 и вакцинированная (вакцина B 15 мкг HA) группа 6 с 8% в обеих группах. Обрабатываемые плацебо-PBS животные группы 1 страдали наиболее сильными повреждениями легких с заметным средним баллом 50%. Парентерально вакцинированная контрольная группа 2 страдала немного меньше, но все еще заметными поражениями легких со средним значением 37%. Средние относительные массы легких (RLW), очевидно, находились в соответствии с этими оцениваемыми процентами пораженной ткани легких, подтверждая достоверность этих оцениваемых процентов пораженной ткани легких.

Результаты макроскопического анализа легких для большего числа оцениваемых параметров поражений легких подтверждали лучшие оценки для вакцинированной высокими наиболее высокими дозами (вакцина A 30 мкг HA) группы 5, и постепенное прогрессирование расстройства дыхания коррелировало с уменьшением дозы HA вакцины A (группы 3 и 2, соответственно). Вакцинация вакциной B 15 мкг HA приводила к практически равным результатам наиболее низкой дозы вакцина A 5 мкг HA (группа 3). Обработку плацебо-PBS (группа 1) оценивали как самую худшую для всех оцениваемых гистопатологических параметров, за которой близко следовала парентерально вакцинированная контрольная группа 2. Следует отметить, что все интраназально вакцинированные животные (группы 3, 4, 5 и 6) являлись защищенными от альвеолярной геморрагии.

Общие заключения - таким образом, в заключении на основании усредненных патологических оценок на этой модели экспериментального заражения вирусом на хорьках вакцинация вакциной A 30 мкг HA (группа 5) давала лучшие результаты и приводила к минимальным расстройствам дыхания, тогда как обработка плацебо-PBS давала худшие результаты и приводила к наиболее сильным расстройствам дыхания. Вакцинация вакциной A 15 мкг HA (группа 4) давала немного худшие результаты по сравнению с группой 5, с последующей вакцинацией вакциной A 5 мкг HA (группа 3), которая давала практически аналогичные результаты по сравнению с вакцинацией вакциной B 15 мкг HA (группа 6). Все интраназально вакцинированные животные независимо от дозы и типа вакцины являлись защищенными от альвеолярной геморрагии. Парентеральная контрольная вакцинация (группа 2) давала слабые результаты с заметными расстройствами дыхания и только несколько лучшие по сравнению с обработкой плацебо-PBS (группа 1).

Пример 3

В таблице 2 ниже и на фигуре 4 сравнивают вакцину по настоящему изобретению с другими продуктами, FluMist и инъецируемыми вакцинами на неиммунизированных хорьках.

Таблица 2 Форма вакцины Хорьки (неиммунизированные) Доза Путь Вакцинный штамм (H1N1) Оценочный штамм (H1N1) Оценка титра NT GSK* (GSK H1N1) N=6 15 мкг HA, с добавлением адъюванта в/м A/California/7/09 A/The Netherlands/602/ 09 Перед экспериментальным заражением (после 2 вакцинации) GSK* N=6 15 мкг HA, AS03 A в/м Novartis# (Novartis TIV) N=3 15 мкг HA, с добавлением адъюванта в/м A/Brisbane/59/07 A/California/7/09 Перед экспериментальным заражением (после 2 вакцинации Medimmune# (пандемическая LAIV) N=3 1×10⁷ TCID₅₀ и/н A/California/7/09 (ca) GSK (GSK TIV) N=6 15 мкг HA, с добавлением адъюванта п/к A/California/7/09 A/The Netherlands/602/09 На сутки 42 (после 2 вакцинации Вакцины Eurocine (Immunose™ FLU) N=6 15 мкг HA, Endocine 20 мг/мл и/н * Baras et al., Vaccine 29, (2011) 2120-2126
# Chen et al., JID 2011:203
Вакцины Eurocine: настоящее исследование

Группы моновалентной пандемической вакцины GSK (GSK H1N1), трехвалентной инактивированной вакцины Novartis (Novartis TIV), трехвалентной инактивированной вакцины GSK (GSK TIV) имели титр нейтрализующих антител (NT) менее 15.

Результаты демонстрируют, что для вакцинной композиции по настоящему изобретению ImmunoseTM FLU содержащей в данном случае 15 мкг HA расщепленного антигена гриппа с 20 мг/мл (2%) EndocineTM, демонстрируют аналогичные титры нейтрализующих антител по сравнению с пандемической LAIV вакциной FluMist от Medimmune (см. фигуру 5) и более высокие титры по сравнению с инъецируемыми вакцинами, тогда как TIV без добавления адъюванта вызывала слабую реакцию.

Используемые в примерах сокращенные обозначения:

HA белок гемагглютинина вируса гриппа

TCID50 тканевая культура, инфицированная дозой 50%

PBMC мононуклеарные клетки периферической крови

HI анализ ингибирования гемагглютинации гриппа

SOP стандартная рабочая процедура

PBS фосфатно-солевой буфер

EDTA этилендиаминтетрауксусная кислота

GMT средние геометрические титры (используемые для выражения серологических данных)

FCS эмбриональная телячья сыворотка (добавка в среду для культивирования)

VN анализ нейтрализации вируса

DMSO диметилсульфоксид

Изобретение относится к медицине и касается вводимых назально вакцинных композиций против вируса гриппа, эффективных у неиммунизированных индивидуумов, таких как дети. Для этого композицию, содержащую один или более антигенов неживого вируса гриппа, выбранных из группы, состоящей из целого инактивированного вируса, расщепленного вируса, субъединичного антигена гриппа и рекомбинантных антигенов, и адъювант, содержащий одну или более карбоновых кислот, водную среду и один или более моноглицеридов, вводят интраназально индивидуумам детского возраста в возрасте от новорожденного до 18 лет. Изобретение обеспечивает уменьшения выделения вируса в окружающую среду. 16 з.п. ф-лы, 6 ил., 2 табл., 3 пр.

1. Применение композиции, содержащей:

один или более антигенов неживого вируса гриппа, выбранных из группы, состоящей из целого инактивированного вируса, расщепленного вируса, субъединичного антигена гриппа и рекомбинантных антигенов, и

адъювант, содержащий:

одну или более карбоновых кислот,

водную среду и

один или более моноглицеридов,

в качестве интраназально вводимой вакцины, где указанная вакцина предназначена для иммунизации индивидуумов детского возраста в возрасте от новорожденного до 18 лет против гриппа для уменьшения выделения вируса в окружающую среду.

2. Применение по п.1, где указанные индивидуумы детского возраста являются неиммунизированными против гриппа индивидуумами.

3. Применение по п.1, где указанные индивидуумы детского возраста являются детьми.

4. Применение по п.1, где указанные индивидуумы детского возраста имеют возраст менее 8 лет, такой как 6 лет или менее.

5. Применение по п.1, где указанные индивидуумы детского возраста имеют возраст от 2 месяцев до менее 9 лет, такой как от 6 месяцев до менее 8 лет, предпочтительно от 6 месяцев до менее 7 лет.

6. Применение по п.1, где указанные индивидуумы детского возраста являются грудничками.

7. Применение по п.1, где антиген неживого вируса гриппа представляет собой расщепленный антиген.

8. Применение по п.1, где один или более моноглицеридов представляют собой глицериды, моноэтерифицированные карбоновыми кислотами, выбранными из группы, состоящей из лауриновой кислоты (C12), миристиновой кислоты (C14), пальмитиновой кислоты (C16), пальмитолеиновой кислоты (C16:1), олеиновой кислоты (C18:1), линолевой кислоты (C18:2), стеариновой кислоты, гексановой кислоты, каприловой кислоты, декановой кислоты (каприновой кислоты), арахидиновой кислоты, бегеновой кислоты, лигноцериновой кислоты, альфа-линоленовой кислоты, стеаридоновой кислоты, эйкозапентаеновой кислоты, докозагексаеновой кислоты, гамма-линоленовой кислоты, дигомо-гамма-линоленовой кислоты, арахидоновой кислоты, эруковой кислоты, нервоновой кислоты.

9. Применение по п.1, где один или более моноглицеридов представляют собой глицериды, моноэтерифицированные карбоновыми кислотами, выбранными из группы, состоящей из пальмитолеиновой кислоты (C16:1), олеиновой кислоты (C18:1) и линолевой кислоты (C18:2).

10. Применение по п.1, где один или более моноглицеридов представляют собой глицерид, моноэтерифицированный олеиновой кислотой (глицерилолеат).

11. Применение по п.1, где одну или более карбоновых кислот выбирают из группы, состоящей из лауриновой кислоты, миристиновой кислоты, пальмитиновой кислоты, пальмитолеиновой кислоты, олеиновой кислоты, линолевой кислоты, стеариновой кислоты, гексановой кислоты, каприловой кислоты, декановой кислоты (каприновой кислоты), арахидиновой кислоты, бегеновой кислоты, лигноцериновой кислоты, альфа-линоленовой кислоты, стеаридоновой кислоты, эйкозапентаеновой кислоты, докозагексаеновой кислоты, гамма-линоленовой кислоты, дигомо-гамма-линоленовой кислоты, арахидоновой кислоты, эруковой кислоты и нервоновой кислоты.

12. Применение по п.1, где одну или более карбоновых кислот выбирают из группы, состоящей из олеиновой кислоты и лауриновой кислоты.

13. Применение по п.1, где карбоновая кислота представляет собой олеиновую кислоту.

14. Применение по п.1, где адъювант содержит глицерилолеат, олеиновую кислоту и водную среду.

15. Применение по п.1, где вакцинная композиция содержит моноглицериды в количестве в диапазоне от приблизительно 0,1 г до приблизительно 5,0 г на 100 мл, или в диапазоне от приблизительно 0,1 г до приблизительно 2,0 г на 100 мл, или от приблизительно 0,5 г до приблизительно 2,0 г, таком как от 0,5 г до приблизительно 1,5 г на 100 мл вакцинной композиции.

16. Применение по п.1, где вакцинная композиция содержит карбоновые кислоты в количестве в диапазоне от приблизительно 0,1 г до приблизительно 5,0 г на 100 мл, или в диапазоне от приблизительно 0,1 г до приблизительно 2,0 г на 100 мл, или от приблизительно 0,5 г до приблизительно 2,0 г, таком как от 0,5 г до приблизительно 1,5 г на 100 мл вакцинной композиции.

17. Применение по п.1, где один или более моноглицерид совместно с одной или более карбоновой кислотой в смеси адъювантов составляют не более 10% мас./об., или не более 5% мас./об., или не более 4% мас./об., или не более 3% мас./об., или не более 2% мас./об., или не более 1% мас./об. вакцины.