КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ ПЕПТИД И ИНГИБИТОР ВИРУСНОЙ НЕЙРАМИНИДАЗЫ Российский патент 2016 года по МПК A61K38/19 

Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям для лечения гриппа.

У людей грипп является тяжелым заболеванием дыхательных путей и всего организма, которое вызывается вирусами гриппа. Вирусы гриппа относятся к семейству ортомиксовирусов, которые характеризуются сегментированным РНК геномом в отрицательной ориентации цепи. Типы, релевантные для людей, представляют собой вирусы группа типа А и В, из которых подтип А в особенности известен в качестве этиологического фактора чрезвычайно лихорадочных заболеваний дыхательных путей. Кроме значимости в ветеринарии, все вирусы гриппа имеют зоонитический потенциал, то есть существует возможность передачи от кур или свиней людям.

Грипп проявляется периодически в виде пандемии, которая в большинстве случаев возникает в Юго-восточной Азии и Китае и оттуда распространяется по всему миру. Пандемии вирусов гриппа связаны большим количеством смертельных исходов не только у пожилых людей, но также и у подростков. В соответствии с данными ВОЗ, ежегодный сезонный грипп приводит к всемирной частоте 3-5 миллионов случает тяжелых заболеваний, с частотой смертельных исходов 250-500 тыс. Наиболее частой причиной смерти является гриппозная пневмония с развивающейся вследствие этого легочной недостаточностью, но также могут встречаться сердечно-сосудистые повреждения, такие как миокардиты (воспаление миокарда) или перикардиты (воспаление околосердечной сумки). Другими менее частыми причинами смертельных исходов могут быть воспаление головного мозга или менингиты (менингоэнцефалиты) или поражения других систем органов (в особенности почек).

Обычно инкубационный период составляет от 4 до 5 дней, но он может быть более коротким. Заболевание начинается с внезапного наступления головных болей, дрожи, озноба и кашля. После этого наступает высокая температура вплоть до 41°С, мышечные боли, потеря аппетита и общее ощущение слабости. Эта фаза продолжается около 3 дней, после чего лихорадка спадает и в большинстве случаев отступает к нормальным значениям на шестой день, что обозначает элиминацию вируса с организма. Это может продолжаться в течение нескольких недель.

Тяжелый, опасный для жизни грипп может развиваться, если развивается первичное вирусное интерстициальное (в большинстве случаев геморрагическое) воспаление легких после вышеописанных симптомов. Кроме ослабленных лиц, оно также встречается у приблизительно 25% здоровых или ранее не пораженных лиц и может продолжаться вплоть до 2 недель. Такое воспаление легких может диагностироваться путем измерения повышения веса легких.

Пневмонии также могут развиваться вторично вследствие бактериальных суперинфекций (вызванные, в частности, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus и Hemophilus influenzae). Другими факторами, которые способствуют этим осложнениям, являются, в частности, другие заболевания легких (например, астма), иммунодефицит, возраст (несовершеннолетние и пожилые лица), диабет, повреждения легких, курение. Таким образом, лица, имеющие эти осложнения, являются основной целевой группой для вакцинации.

Вирусы гриппа попадают в организм путем воздушно-капельной инфекции и инфицируют путем связывания НА белка с концевыми остатками нейраминовой кислоты на эпителиальных клетках слизистой оболочки рта, носа и глотки. Отсюда они распространяются в нижние дыхательные пути. Деструкция клеток может наблюдаться в реснитчатом эпителии и в слизеобразующем поверхностном слое всех областей дыхательных путей. Если развивается первичное, интерстициальное воспаление легких, вирус передается в клетки паренхимы легких. Можно наблюдать сильное набухание стенок альвеол, эпителий которых часто становится полностью отсеченным вследствие деструкции клеток. Такое набухание ткани легких можно обнаружить путем повышения веса легких.

Доступны как профилактическое, так и терапевтическое лечение, и вакцины к обоим вирусам гриппа А и В. Они включают убитые вирусы, которые выращивали на куриных яйцах и/или клеточной культуре. Защита, обеспечиваемая вакциной, достигает своей максимальной эффективности приблизительно через две недели после вакцинации. Тем не менее, вследствие высокой вариабельности вирусов гриппа, вакцины должны адаптироваться ежегодно к циркулирующим в настоящее время подтипам вирусов или вариантам подтипов.

Кроме того, применяются ингибиторы вирусной нейраминидазы (Занамивир, Осельтамивир), которые предотвращают высвобождение вновь реплицированных вирусных частиц из клеток-хозяев. Они предпочтительно используются вскоре после проявления и обнаружения инфицирования вирусом гриппа для сдерживания распространения вируса на ранней стадии инфицирования (WO 2003/026567 А2).

Тем не менее, ингибиторы вирусной нейраминидазы только препятствуют пролиферации вирусов, но не инактивируют вирусы, которые уже находятся в организме. Ингибиторы нейраминидазы могут способствовать сокращению продолжительности заболевания только минимально (в среднем на один день у людей).

Задачей настоящего изобретения является существенное увеличение терапевтического эффекта таких ингибиторов пролиферации вирусов. Настоящее изобретение нацелено на обеспечение улучшенных фармацевтических композиций для лечения инфекций, вызванных вирусами гриппа.

Таким образом, настоящее изобретение относится к композиции, которая содержит

- пептид, который состоит из 7-17 смежных аминокислот и включает гексамер TX₁EX₂X₃E, где X₁, Х₂ и Х₃ могут представлять собой любую встречающуюся в природе или невстречающуюся в природе аминокислоту, и где пептид не имеет активности связываться с рецептором TNF и циклизирован, и

- ингибитор вирусной нейраминидазы,

в особенности для применения для предотвращения и лечения гриппа.

Сейчас было обнаружено в соответствии с изобретением, что влияние ингибиторов нейраминидазы неожиданно может быть улучшено путем применения пептида, как определено выше, в комбинации с ингибитором нейраминидазы для лечения гриппозных инфекций. Таким образом, также показано профилактическое применение соединения в соответствии с изобретением. Доказано, что настоящее изобретение является особенно эффективно для лечения воспаления легких, которые вызываются вирусами гриппа.

Пептиды, используемые в соответствии с изобретением, известны, например, из Европейского патента ЕР 1264599 В1 (или из US 2007/299003 А, WO 94/18325 А1 или WO 2008/148545 A1) и используются в уровне техники для лечения накопления жидкости (отек легких) и в особенности для реабсорбции этих накоплений жидкости. Неожиданно, эти пептиды также являются подходящими для воздействия на поток жидкости в обратном направлении через эндотелий капилляров в эндотелий легких и, следовательно, могут применяться для предотвращения и лечения повышенной проницаемости эпителиальных клеток, а также эндотелиальных клеток (WO 2010/099556 А).

Эти пептиды, которые известны per se и которые используются совместно с ингибитором нейраминидазы в соответствии с изобретением, не проявляют какой-либо активности связывать рецептор TNF (Hribar и др., Eur. J. Immunol. 1999; Elia и др., AJRCCM 2003; см. также: раздел примеров ниже) и циклизированы. Предпочтительные варианты этих пептидов состоят из 7-17 смежных аминокислот и включают гексамер TPEGAE (SEQ ID NO: 4).

Несмотря на то, что WO 2010/099556 А1 и ЕР 1264599 А1 нацелены на лечение определенных патологических симптомов в легких, а не на предотвращение и лечение заболевания, вызванного определенным патогеном, тем не менее, заявка в соответствии с настоящим изобретением является совершенно другой.

Как было показано при исследованиях касательно настоящего изобретения, пептиды в соответствии с формулой (в соответствии с WO 2010/099556 А1) поддерживают влияние ингибиторов нейраминидазы в комбинированном препарате согласно изобретению синергетическим образом. Таким образом, заявка в соответствии с настоящим изобретением нацелена непосредственно на инфекцию, вызванную вирусами гриппа, а не на общие симптомы, которые могут быть индуцированы несколькими различными патогенами (как в случае, например, в WO 2010/099556 А1 или в ЕР 1264599 А1).

Тем не менее, с точки зрения среднего специалиста в данной области техники является очевидным, что ингибиторы нейраминидазы могут только ингибировать пролиферацию вирусов гриппа, но они не могут таким образом уменьшать количество существующих вирусов; однако, является совершенно неожиданным и не показано в известном уровне техники, что комбинация ингибиторов нейраминидазы и пептидов в соответствии с изобретением приводит к существенному улучшению борьбы с гриппом. В известном уровне техники не представлено каких-либо предположений относительно этой комбинации для специалиста в данной области техники, наоборот.

В WO 2003/026567 А2 было описано, что ингибиторы нейраминидазы, используемые для лечения гриппа, также являются подходящими для предотвращения бактериальных инфекций, ассоциированных с гриппом. Исходя из этого документа, средний специалист в данной области техники не имеет совершенно никаких соображений, зачем добавлять дополнительные вспомогательные вещества к ингибиторам нейраминидазы, которые могут улучшить антивирусную эффективность или эффективность лечения гриппа. В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, композиция в соответствии с изобретением включает циклизированный пептид, состоящий из последовательности следующих друг за другом аминокислот, выбранных из группы, включающей

- QRETPEGAEAKPWY (SEQ ID NO: 5)

- PKDTPEGAELKPWY (SEQ ID NO: 6)

- CGQRETPEGAEAKPWYC (SEQ ID NO: 1), и

- CGPKDTPEGAELKPWYC (SEQ ID NO: 7)

и их фрагментов по меньшей мере из 7 аминокислот, где фрагменты включают гексамер TPEGAE.

Предпочтительно, пептид в композиции включает аминокислотную последовательность CGQRETPEGAEAKPWYC (SEQ ID NO: 1) и циклизирован посредством С-остатков. Таким образом, этот особенно предпочтительный имеет следующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 1) (NH2) Cys-Gly-Gln-Arg-Glu-Thr-Pro-Glu-Gly-Ala-Glu-Ala-Lys-Pro-Trp-Tyr-Cys (COOH). Этот пептид также обозначается как "АР301".

Таким образом, циклизация пептидов в соответствии с изобретением может осуществляться, например, путем прямой циклизации с помощью дисульфидного мостика между двумя С-остатками на N- и С-концах или путем связывания пептида с помощью обоих цистеинов с носителем. В пептидах в соответствии с изобретением, цистеиновые остатки предпочтительно обеспечены в начале и в конце молекулы. Также могут применяться другие функциональные группы, которые могут осуществлять циклизацию пептида; таким образом, например, кислотная группа может осуществлять замыкание кольца амида или сложного эфира с амином или спиртом (например, аминокислоты аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота могут быть циклизированы предпочтительно внутримолекулярно с серином, треонином, тирозином, аспарагином, глутамином или лизином). Циклизацию пептида предпочтительно осуществляют с помощью дисульфидного мостика между С-остатками пептида (если они присутствуют).

Таким образом, дополнительные предпочтительные пептиды в соответствии с изобретением представляют собой, например, CGQKETPEGAEAKPWYC (SEQ ID NO: 8), CGQRETPEGAEARPWYC (SEQ ID NO: 9), CGQRETPEGAEAKPC (SEQ ID NO: 10), CQRETPEGAEAKPWYC (SEQ ID NO: 11) или CGQRETPEGAEAKFWYC (SEQ ID NO: 12).

Тем не менее, циклизация также может осуществляться путем связывания пептида с носителем. В качестве носителей для циклизации такого рода могут быть выбраны все общепринятые фармацевтически приемлемые вещества, которые способны ковалентно связываться с SH группами цистеинов, например (или с другими присутствующими в природе или искусственно интродуцированными химически реакционноспособными группами пептидов); таким образом, особенно предпочтительными являются общепринятые белки-носители, такие как гемоцианин лимфы улитки (KLH), столбнячный токсин и др. Также могут быть предусмотрены смежные бифункциональные остатки на носителе (например, кислотная группа вслед за аминовой или спиртовой группой). В этом контексте, является важным понимать, что термин "циклизация" включает как внутримолекулярное замыкание кольца, так и связывание с носителем (откуда связанный пептид проектируется (посредством N- и С-конца пептида, который связан с носителем)); таким образом, пептид циклизированный таким способом проявляет циклическую пространственную структуру и стабилизирован надлежащим образом.

Ингибиторы вирусной нейраминидазы известны и уже доказана их эффективность для предотвращения и лечения гриппа. Такие ингибиторы вирусной нейраминидазы (такие как, например, Занамивир, Осельтамивир, Ланинамивир или Перамивир) предотвращают высвобождение thóe только что реплицированных вирусных частиц из клеток-хозяев. В особенности, распространение вирусов вскоре после проявления и обнаружение инфекции, вызванной вирусами гриппа, может быть заторможено ими на ранней стадии инфекции.

Тем не менее, эти ингибиторы нейраминидазы только затрагивают пролиферацию вирусов, но не могут инактивировать вирусы, которые уже присутствуют в организме. Таким образом, во многих случаях, это только продолжительность заболевания, которая может быть сокращена минимально (в среднем на один день у взрослых). Тем не менее, прежде всего, симптомы гриппа, в особенности пневмонии, которая в большинстве случаев приводит к конкретным осложнениям, как правило, не могут быть достаточно эффективно излечены или предотвращены.

Нейраминидаза представляет собой незаменимый фермент для репродукции вируса гриппа, и он был описан в качестве "молекулярных ножниц", которые отвечают за высвобождение вируса.

Ингибиторы нейраминидазы включают аналоги сиаловой кислоты, которая представляет собой новый класс второго поколения антивирусных средств, которые проявляют эффективность по отношению к вирусам гриппа А и В. Ингибиторы нейраминидазы в соответствии с настоящим изобретением могут представлять собой все соединения, которые предложены для этого до настоящего времени, как обобщено, например, в US 2008/0063722 А1 (а также для предпочтительных фармацевтических препаратов таких веществ). Эти вещества могут ингибировать по меньшей мере одну ферментативную активность белка нейраминидазы вирулентного штамма вириона гриппа типа А или типа В. Такие вещества могут использоваться как для профилактики, так и для лечения гриппа; тем не менее, в комбинации с вышеопределенными пептидами в соответствии с изобретением их влияние существенно улучшено.

Примеры ингибиторов нейраминидазы, которые могут применяться в композиции согласно настоящему изобретению, описаны, например, в патентах США №№5,453,533, 5,763,483, 5,952,375, 5,958,973, 5,512,596, 5,886,213, 5,602,277, 6,410,594, 5,360,817, 5,866,601, 6,340,702, 6,451,766, 6,455,571, 6,593,314, 6,509,359, 6,518,305 и 6,831,096. Вещества, которые уже применяются на людях (или по меньшей мере находятся на стадии клинических испытаний) и, следовательно, являются особенно предпочтительно, представляют собой, например, CS-8958 (RI 18958; US 2008/0063722 А1), Занамивир (GG167, RELENZA®), Перамивир (RWJ-270201, BCX-1812), Осельтамивир фосфат (Ro64-0796, GS4104), Осельтамивир карбоксилат (Ro64-0802, GS4071), или Осельтамивир (GS4104, TAMIFLU®). Понятно, что все эффективные клинические формы ингибиторов нейраминидазы включены в соответствии с изобретением, то есть соли, рацемические, оптически чистые и/или бессолевые формы (также, например, в форме энантиомеров или диастереомеров).

Предпочтительно, ингибитор вирусной нейраминидазы представляет собой Занамивир или Осельтамивир; эти вещества являются особенно предпочтительными в связи с тем, что они уже применяются чрезвычайно эффективно для лечения людей.

Предпочтительно, композиция в соответствии с изобретением включает фармацевтически приемлемый носитель и приготовлена в форме фармацевтической композиции, которая пригодна для введения людям.

Выражение "фармацевтическая композиция" относится к любой композиции, которая включает ингибитор нейраминидазы и пептид, как определено выше (несомненно, также к подходящим (то есть которые отрицательно не интерферируют друг с другом) смесям таких веществ), которые предотвращают, улучшают или лечат состояния, описанные в настоящей заявке. Выражение "фармацевтическая композиция" относится в особенности к композиции, которая включает ингибитор нейраминидазы и пептид, такой как описано выше, и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель (оба выражения могут использоваться взаимозаменяемо). Подходящие примеры носителей или наполнителей, которые известны специалисту в данной области техники, представляют собой воду, изотонический раствор, фосфат натрия, ацетат натрия, карбонат натрия, цитрат, глицин, глицилглицин, гистидин, лизин, аргинин, ТРИС и цитрат натрия или их смеси. Понятно, что также могут применяться раствор Рингера, раствор декстрозы или растворы невосстанавливаемых сахаров; соответственно, маннита, трегалозы, сахарозы, сорбита, фруктозы, мальтозы, лактозы или декстрана, раствора Хенкса, нелетучих масел, этил олеата, 5% декстрозы в изотоническом растворе, вещества, которые улучшают изотоничность и химическую стабильность, буферы и стабилизирующие агенты также пригодны в качестве таких носителей. Другие подходящие носители включают любые такие носители, которые сами не индуцируют продукцию антител, которые могут быть вредными для индивидуума, композицию, которая вводится, такие как белки, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты и сополимеры аминокислот. Для приготовления композиции в соответствии с изобретением, очевидно, необходимо соблюдать требования релевантных пособий (например, фармакопеи (европейской или США)). Таким образом, пептид, обеспеченный в композиции в соответствии с изобретением, также может быть циклизирован с этими носителями путем непосредственного ковалентного связывания.

Фармацевтическая композиция в соответствии с изобретением может вводиться (в виде лекарственного средства) с помощью любого подходящего метода, известного среднему специалисту в данной области техники, и в особенности является предпочтительно вводить пептид, используемый в соответствии с изобретением, или композицию в соответствии с изобретением в легкие. Несмотря на то, что грипп играет определенную роль также у животных, и композиция в соответствии с изобретением может, очевидно, применяться для предотвращения и профилактики животных, настоящее изобретение сфокусировано на предотвращении и лечении людей, то есть лиц, которые уже были инфицированы гриппом или которые имеют риск быть инфицированными этим вирусом (в особенности при эпидемии или пандемии гриппа). Предпочтительным путем введения является ингаляция (с помощью аэрозолей), за которым следует внутривенное введение, инстилляция, пероральное введение или их комбинация. При ингаляционном, парентеральном или пероральном введении лекарственное средство в соответствии с настоящим изобретением приготовлено в единичной дозированной форме, такой как раствор, суспензия или эмульсия, которая комбинирована с определенными выше фармацевтически приемлемыми наполнителями. В индивидуальных случаях, дозировка и форма введения может, несомненно, зависеть от соответствующей особи.

Таким образом, эффективное количество, необходимое в каждом случае, вводится индивидууму, который нуждается во введении. "Эффективное количество" понимается как количество, достаточно эффективное для обеспечения намеченного терапевтического или профилактического эффекта, например, для предотвращения дальнейшего распространения заболевания или для эффективного его лечения. В большинстве случае, для этого за основу принимается усредненный пациент; тем не менее, действительные эффективные количества компонентов в композиции могут быть приготовлены таки образом, что учитывается форма введения и возраст, вес, состояние пациента, а также степень и прогресс заболевания (например, с помощью адекватного, общепринятого фармакологического протокола).

Предпочтительно, фармацевтически приемлемый носитель в композиции в соответствии с изобретением выбирают из воды (особенно предпочтительно: воды для инъекций), хлорида натрия, фосфата натрия, ацетата натрия, карбоната натрия, цитрата, глицина, глицилглицина, гистидина, лизина, аргинина, ТРИС, цитрата натрия, раствора Рингера, декстрозы, маннита, трегалозы, сахарозы, сорбита, фруктозы, мальтозы, лактозы или декстрана, раствора Хенкса, нелетучих масел, этил олеата, веществ, которые улучшают изотоничность и химическую стабильность, стабилизирующих агентов, фармацевтически приемлемых белков, полисахаридов, полимолочных кислот, полигликолевых кислот, полимерных аминокислот и сополимеров аминокислот.

Композиция в соответствии с изобретением также может быть обеспечена путем расположения двух активных компонентов, а именно ингибитора нейраминидазы и пептида, как описано выше, в пространственно разделенной форме, то есть в форме наборе, который включает по меньшей мере ингибитор нейраминидазы и пептид (каждый обеспеченный в отдельном контейнере). Таким образом, настоящее изобретение также относится к набору, который включает по меньшей мере ингибитор нейраминидазы и пептид (каждый обеспеченный в отдельном контейнере). Раздельное введение (пространственное, а также временное) пептида и ингибитора, которое может быть возможно благодаря этому, главным образом является предпочтительным в тех случаях, в которых желательны различные пути введения двух активных компонентов в соответствии с изобретением для желательного пациента. Например, Осельтамивир вводят перорально в большинстве случаев, в то время как пептид, используемый в соответствии с изобретением, главным образом вводят ингаляционно. Тем не мерее, во многих случаях желательным является одновременное введение; Занамивир, например, также вводят ингаляционно. Очевидно, это может быть указано для обеспечения введения перорального ингибитора системно путем ингаляции. В некоторых случаях, пептид, используемый в соответствии с изобретением, может быть смешан с ингибитором нейраминидазы только с трудностями, например, если ингибитор вводят внутривенно или перорально и пептид ингаляционно. Тем не менее, во многих случаях, ингибитор и пептид могут вводиться ингаляционно в смеси, посредством чего ингибитор непосредственно доставляется в легкие и возможно через легкие в кровь (вирусы гриппа сначала присутствуют в ткани легких).

В таком наборе в соответствии с изобретением, содержащем компоненты нейраминидаза и пептид отдельно, характерные особенности, описанные в настоящей заявке, и предпочтительные варианты осуществления для смешанной композиции могут, несомненно, быть обеспечены во всех видах комбинаций, различимых средним специалистом в данной области техники.

Лекарственное средство в соответствии с изобретением может вводиться, например, путем предоставления пептида согласно настоящему изобретению в дозировке в диапазоне от 1 мкг/кг до 10 мг/кг, более предпочтительно в диапазоне от 10 мкг/кг до 5 мг/кг и наиболее предпочтительно в дозировке от 0,1 и 2 мг/кг. Предпочтительно, его вводят в виде болюса. Также может применяться непрерывная ингаляция или инфузия или повторяющаяся схема дозирования.

Особенно предпочтительно композиции в соответствии с изобретением содержат, независимо друг от друга,

- пептид в количестве от 1 мкг до 10 г, предпочтительно от 10 мкг до 1 г, в особенности от 1 мг до 100 мг, и

- ингибитор вирусной нейраминидазы в количестве от 1 мкг до 10 г, предпочтительно от 100 мкг до 1 г, в особенности от 1 мг до 200 мг.

Особенно предпочтительно композиции в соответствии с изобретением в жидкой форме содержат, независимо друг от друга,

- пептид в количестве от 1 мкг до 10 г, предпочтительно от 10 мкг до 1 г, в особенности от 1 мг до 100 мг, и

- ингибитор вирусной нейраминидазы в количестве от 1 мкг до 10 г, предпочтительно от 100 мкг до 1 г, в особенности от 1 мг до 200 мг,

и обеспечены в объеме от 0,5 до 10 мл, в особенности в объеме от 1 до 5 мл.

Композиция в соответствии с изобретением предпочтительно может вводиться в безводной форме с помощью ингалятора порошка. Примеры таких ингаляторов порошков, которые могут применяться в настоящем изобретении, описаны в патентах США №№4,995,385 и 4,069,819; уже разрешенные продукты представляют собой SPINHALER®, ROTAHALER®, FLOWCAPS®, INHALATOR®, DISKHALER® и AEROLIZER®.

Композиция в соответствии с изобретением предпочтительно может вводиться в виде аэрозоля также с помощью распылителя жидкости. Примерами таких распылителей жидкостей является разрешенные продукты, такие как Aeroneb® и Pari®.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления, композиция в соответствии с изобретением характеризуется пептидом и/или ингибитором вирусной нейраминидазы, которые обеспечены в распыляемом порошкообразном препарате или в распыляемом жидком препарате.

Композиция в соответствии с изобретением предпочтительно используется для лечения и профилактики инфекций, вызванных вирусом гриппа типа А и типа В, в особенности типа А. Тем не менее, в принципе, композиция пригодна для предотвращения или лечения инфекционного заболевания, вызванного любым возможным штаммом вируса гриппа, который может вызывать этого заболевание у животного или у человека. Базы данных, релевантные относительно информации, касающейся различных типов гриппа, хорошо известны специалисту в данной области техники; в частности, описаны или даже секвенированы многие выделенные штаммы типа А.

Далее изобретение поясняется более подробно с помощью последующих примеров и фигур, которые никоим образом его не ограничивают.

Показано на

Фиг.1: относительный вес легких C57BL/6 мышей в дни 3, 5, 7 и 9 после инфицирования гриппом А или (в качестве контроля) без инфекции;

Фиг.2: относительный вес легких C57BL/6 мышей в дни 5, 7 и 9 после инфицирования гриппом А и лечение с помощью Осельтамивира, лечение с помощью композиции в соответствии с изобретением и без лечения (с PBS, для контроля);

Фиг.3: относительный вес легких C57BL/6 мышей в дни 7 и 9 после инфицирования гриппом А и лечение с помощь. Занамивира, лечение с помощью композиции в соответствии с изобретением и без лечения (с PBS, для контроля).

Примеры

Представленные примеры обеспечены для того, чтобы показать на утвержденной экспериментальной мышиной модели, что задача настоящего изобретения решается путем введения мышам, которые были инфицированы вирусом гриппа, ингибитора нейраминидазы или комбинации ингибитора нейраминидазы и синтетического пептида АР301 (SEQ ID NO: 1).

Пример 1

Инфицирование вирусами гриппа вызывает развитие воспаления легких.

Лабораторных мышей (штамм C57BL/6, возраст 8 недель) инфицировали через нос штаммом гриппа A (PR8/34) в дозе 150 БОЕ. В дни 3, 5, 7 и 9 после инфицирования легкие отбирали у 8 мышей, соответственно, и определяли относительный вес легких в качестве критерия определения воспаления легких.

Исследование показало, что при увеличении продолжительности времени после инфицирования мышей вирусом гриппа вес легких сильно повышался по сравнению с контрольными легкими. Результаты представлены графически на фиг.1.

Пример 2

Лечение воспаления легких путем введения ингибитора нейраминидазы или введения комбинации ингибитора нейраминидазы и пептида АР301.

Лабораторных мышей (штамм C57BL/6, возраст 8 недель) инфицировали через нос штаммом гриппа А (PR8/34) в дозе 150 БОЕ. Позже каждому тестируемому животному перорально вводили 10 мг/кг Осельтамивира (ингибитор нейраминидазы) и внутритрахеально вводили 10 мкг/тестируемое животное пептида АР301. Лечение повторяли в тестируемые дни 2 и 4.

В дни 5, 7 и 9 после инфицирования легкие отбирали у 30 мышей, соответственно, и определяли относительный вес легких в качестве критерия определения воспаления легких. Результаты представлены графически на фиг.2.

Исследование показало, что ингибитор нейраминидазы проявляет только умеренное влияние на уменьшение воспаления легких, что измеряется посредством веса легких. Тем не менее, если мышам, инфицированным вирусом гриппа, вводили пептид АР301 дополнительно к ингибитору нейраминидазы, то воспаление легких значительно уменьшалось.

Пример 3

Ex vivo оценка провоспалительных свойств АР301 пептида в цельной крови человека.

Осуществляли исследование фармакологической безопасности ех vivo касательно АР301 пептида в цельной крови человека для оценки, будет ли АР301 пептид приводить к высвобождению провоспалительного маркера интерлейкин-6 (IL-6) из свежевзятой цельной крови (то есть будет ли APN 301 проявлять TNF-специфическую воспалительную активность (то есть активность связывания рецептора TNF)). В этом исследовании, использовали свежевзятую цельную кровь человека, поскольку она представляет утвержденную предсказывающую модельную систему для оценки воспалительного ответа in vivo.

Краткое изложение методологии

Задачей настоящего исследования является определение способности передавать провоспалительные сигналы пептида АР301. Использовали культуры цельной крови и секрецию интерлейкин-6 (IL-6), чрезвычайно чувствительного маркера для провоспалительной стимуляции, количественно определяли с помощью ELISA.

Тестируемая система

Тестируемая система В тесте использовали 25 мл свежей отобранной гепаринизированной крови от 5 здоровых добровольцев (HV).

Предмет исследования

Идентификация: АР301 пептид (доза: 1 нг/мл до 10 мкг/мл;   Однократное ведение в растворе) Описание: белый порошок, чистота 96%

Культура цельной крови

Культуры цельной крови (WB) осуществляли путем пипетирования 1 мл WB в лунки планшет на 24 лунки. В каждом эксперименте включали нестимулированные и контрольные стимулированные культуры.

Если это возможно, то все исследуемые вещества и стимуляторы всегда добавляли в идентичном объеме в каждую лунку данного эксперимента, который не превышает 10% общего объема, содержащегося в лунке. Нестимулированные контроли получали PBS. Доведение объемов и разбавлений для различных лечений также осуществляли с помощью PBS.

Содержимое каждой лунки смешивали и планшеты инкубировали при 37°С и 5% CO₂ в течение 24 часов. После инкубирования содержимое каждой лунки переносили в свежую микропробирку объемом 1,5 мл и центрифугировали при 8 тыс. - 9 тыс. g в течение 15 минут. Супернатант каждого образца переносили индивидуально в две микропробирки объемом 1,5 мл и поддерживали при -20°С до использования.

Определение интерлейкина-6

Интерлейкин-6 количественно определяли с помощью специфического ELISA (Human IL-6 ELISA Set, BD Biosciences, № кат. 555220), применяя анти-человеческое IL-6 антитело в качестве иммобилизованного антитела, биотинилированное анти-человеческое IL-6 идентифицирующее антитело, конъюгат авидин-пероксидаза хрена в качестве ферментного реагента и рекомбинантный IL-6 в качестве стандарта. Измерение абсорбции осуществляли при 450 нм, используя Packard FusionReader.

Анализ данных

Результаты для каждого планшета хранили и анализировали, используя программное обеспечение FusionDataAnalysis.

Краткое изложение результатов исследования

Задачей настоящего исследования было определение способности передавать провоспалительные сигналы АР301 пептида. Использовали культуры цельной крови и количественно определяли секрецию IL-6, чрезвычайно чувствительного маркера для провоспалительной стимуляции с помощью ELISA.

Образцы цельной крови пяти здоровых добровольцев либо оставляли нестимулированными (отрицательный контроль), либо стимулировали высокими и низкими дозами LPS (положительный контроль), или инкубировали с пептидом с девятью полулогарифмическими разведениями в диапазоне от 10 мкг/мл до 1 нг/мл. Результаты представлены в таблице ниже:

Таблица: Высвобождение интерлейкин-6 из свежевзятой цельной крови человека при добавлении пептида АР301 и LPS АР301 пептид Положительный контроль (LPS) Концентрация   концентрация IL-6 (пг/мл, n=5) 0 (отрицательный контроль) меньше чем 0,5 меньше чем 0,5 10 мг/мл меньше чем 0,5 195,640 1 мг/мл меньше чем 0,5 108,370 3 нг/мл меньше чем 0,5 34,867 1 нг/мл меньше чем 0,5 не определяли

Результаты убедительно свидетельствуют о том, что АР301 пептид не индуцирует какого-либо обнаруживаемого уровня секреции IL-6 в любой из тестируемых концентраций. Положительные контроли (LPS) указывают на сильную индукцию секреции IL-6.

Обсуждение

Эксперименты осуществляли на оценки того, будет ли АР301 пептид опосредовать индукцию провоспалительного каскада. Регистрируемым параметром была индукция секреции IL-6 в культурах цельной крови от пяти здоровых доноров. Результаты убедительно свидетельствуют о том, что АР301 пептид не индуцирует какого-либо обнаруживаемого уровня IL-6 в любой из донорских культур. Следовательно, это указывает на то, что АР301 пептид не индуцирует провоспалительного ответа на выбранной модели ex vivo и, таким образом, не проявляет какой-либо активности связывания рецептора TNF.

Пример 4

Лечение воспаления легких путем введения ингибитора нейраминидазы (Занамивир) или введения комбинации ингибитора нейраминидазы (Занамивир) и пептида АР301.

Лабораторных мышей (штамм C57BL/6, возраст 8 недель) инфицировали через нос штаммом гриппа A (PR8/34) в дозе 150 БОЕ. Позже каждому тестируемому животному вводили назально 1,5 мг/кг Занамивира (ингибитор нейраминидазы) и внутритрахеально вводили 50 мкг/тестируемое животного пептида АР301. Лечение повторяли в тестируемые дни 2 и 4.

В дни 7 и 9 после инфицирования легкие отбирали у 20 мышей, соответственно, и определяли относительный вес легких в качестве критерия определения воспаления легких. Результаты представлены графически на фиг.3.

Исследование показало, что ингибитор нейраминидазы (Занамивир) оказывает только умеренное действие на уменьшение воспаления легких, что измеряется по весу легких. Однако, если пептид АР301 вводят мышам, инфицированным вирусом гриппа, дополнительно к ингибитору нейраминидазы, то воспаление легких уменьшается более существенно.

Итоги

Пептиды в соответствии с изобретением проявляют синергетическое действие при лечении гриппозных инфекций в комбинации с ингибитором нейраминидазы.

В WO 2010/099556 А1 описано лечение различных легочных симптомов, как указано, которое нацелено на повышенную проницаемость эпителиальных клеток и эндотелиальных клеток при таких заболеваниях легких. В соответствии с WO 2010/099556 А1 было показано, что заявленные пептиды чрезвычайно пригодны для предотвращения и лечения этих симптомов. Несмотря на то, что, в соответствии с WO 2010/099556 А1, повышенную проницаемость эпителиальных клеток и эндотелиальных клеток также можно лечить в случае инфекций, вызванных вирусами гриппа (в контексте пневмонии, развивающейся при этой инфекции), настоящее изобретение, конечно, не предполагается на основе этих данных. Возможность общего лечения гриппа с помощью комбинированного препарата, содержащего этот пептид, является совершенно новым и имеет изобретательский уровень относительно применимости пептида для лечения - факультативно - проявляющихся симптомов гриппа.

Принципиальное отличие также можно рассмотреть при анализе подробных экспериментов в соответствии с WO 2010/099556 А1: В примерах WO 2010/099556 А1, экспериментально показано, что пептиды в легочной ткани:

i) повышают концентрацию реакционноспособного кислорода,

ii) влияние бактериальных грамположительных токсинов "листериолизин" и "пневмолизин" также оказывает влияние на повышенную проницаемость посредством регулирования уровня фосфорилированности легкой цепи миозина, инфильтрации лейкоцитов, активирования протеинкиназы С,

iii) влияние веса тела после гриппозной инфекции,

iv) влияние температуры тела после гриппозной инфекции,

v) влияние коэффициента выживаемости тестируемых животных после гриппозной инфекции.

Таким образом, во всей WO 2010/099556 А1 отсутствуют экспериментальные намеки относительно того, как инфицирование тестируемых животных вирусом гриппа приводит к изменению относительного веса легких и также к остановке и лечению такого процесса путем введения пептида. Только сейчас, с помощью настоящего изобретения, было показано, что инфицирование легких тестируемых животных вирусом гриппа приводит к существенному повышению относительного веса легких.

Легкие являются одними из наиболее важных органов в организме. Повышение относительного веса легких связано с повреждением функции легких, которая не может быть компенсирована каким-либо другим органом. Важным свойством здорового легкого является содержание максимально возможного количества наполненных воздухом пространств (альвеол). При повышении относительного веса легких, это очевидно указывает на то, что доля заполненных воздухом альвеол будет существенно снижаться, что будет ограничивать функцию легкого. Таким образом, относительный вес легких является существенным фактором для лечения гриппа. Следовательно, результаты, представленные в экспериментальной части настоящего изобретения, убедительно показывают синергетический эффект комбинированного препарата в соответствии с настоящим изобретением, на основе в высшей степени клинического и релевантного параметра.

До настоящего времени для ингибиторов нейраминидазы было известно, что они могут подавлять пролиферацию вируса гриппа. Ингибиторы нейраминидазы не вызывают уменьшение живых вирусов гриппа. До настоящего времени не было показано в известном уровне техники, что вирус гриппа приводит к повышению относительного веса легких. Только в настоящем изобретении неожиданно было показано, что введение ингибитора нейраминидазы после инфицирования гриппом уменьшает относительный прирост веса легких. Дополнительно, с помощью настоящего изобретения впервые может быть показано, что одновременное лечение тестируемых животных, которые были инфицированы вирусом гриппа, с помощью ингибитора нейраминидазы и пептида в соответствии с WO 2010/099556 А1 в комбинации приводит к существенному и непредвиденному синергетическому эффекту на относительный вес легких. В то время как ингибиторы нейраминидазы ингибируют пролиферацию вируса гриппа, без уменьшения количества уже существующих живых вирусов, синергетическая комбинация ингибитора нейраминидазы и пептида в соответствии с изобретением явно приводит к существенному улучшению лечения гриппа. Ни одно из лекарственных средств (ингибитор нейраминидазы и пептид в соответствии с изобретением), вводимых индивидуально, само не приводит к эффекту, показанному в настоящем изобретению.

Следовательно, настоящее изобретение никоим образом не может интерпретироваться как очевидное с учетом результатов, раскрытых в WO 2010/099556 А1.

Краткое изложение последовательностей:

SEQ ID NO: 1 CGQRETPEGAEAKPWYC SEQ ID NO: 2 KSPGGQRETPEGAEAKPWYE SEQ ID NO: 3 CGQREAPAGAAAKPWYC SEQ ID NO: 4 TPEGAE SEQ ID NO: 5 QRETPEGAEAKPWY SEQ ID NO: 6 PKDTPEGAELKPWY SEQ ID NO: 7 CGPKDTPEGAELKPWYC SEQ ID NO: 8 CGQKETPEGAEAKPWYC SEQ ID NO: 9 CGQRETPEGAEARPWYC SEQ ID NO: 10 CGQRETPEGAEAKPC SEQ ID NO: 11 CQRETPEGAEAKPWYC SEQ ID NO: 12 CGQRETPEGAEAKFWYC

Группа изобретений раскрывает композицию для предупреждения или лечения гриппа или воспаления легких, которое вызвано гриппом, которая содержит терапевтически эффективное количество пептида, который состоит из 17 смежных аминокислот и содержит гексамер ТХ₁ЕХ₂Х₃Е, где X₁, X₂ и Х₃ могут представлять собой любую встречающуюся в природе или невстречающуюся в природе аминокислоту, где пептид циклизирован и не имеет активности связываться с рецептором TNF, и ингибитора вирусной нейраминидазы, где циклизированный пептид состоит из последовательности следующих друг за другом аминокислот CGQRETPEGAEAKPWYC; набор, включающий данную композицию, а также их применение для предупреждения и/или лечения гриппа, при воспалении легких, вызванном гриппом. Применение изобретений согласно заявленной группе позволяет существенно увеличить терапевтический эффект при лечении инфекций, вызванных вирусами гриппа. 5 н. и 9 з.п. ф-лы, 1 табл., 3 ил., 4 пр.

1. Композиция для предупреждения или лечения гриппа или воспаления легких, которое вызвано гриппом, содержащая
- терапевтически эффективное количество пептида, который состоит из 17 смежных аминокислот и включает гексамер TX₁EX₂X₃E, где Х₁, Х₂ и Х₃ могут представлять собой любую встречающуюся в природе или невстречающуюся в природе аминокислоту, где пептид не имеет активности связываться с рецептором TNF и циклизирован, и
- ингибитора вирусной нейраминидазы;
где циклизированный пептид состоит из последовательности следующих друг за другом аминокислот CGQRETPEGAEAKPWYC.

2. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что пептид циклизирован с помощью С-остатков.

3. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что пептид циклизирован с помощью дисульфидного мостика между указанными С-остатками.

4. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что ингибитор вирусной нейраминидазы представляет собой Занамивир или Осельтамивир.

5. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что она включает фармацевтически приемлемый носитель и приготовлена в виде фармацевтической композиции, подходящей для введения людям.

6. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что она включает фармацевтически приемлемый носитель, который выбирают из воды, в особенности воды для инъекций, хлорида натрия, фосфата натрия, ацетата натрия, карбоната натрия, цитрата, глицина, глицилглицина, гистидина, лизина, аргинина, ТРИС, цитрата натрия, раствора Рингера, декстрозы, маннита, трегалозы, сахарозы, сорбита, фруктозы, мальтозы, лактозы или декстрана, раствора Хенкса, нелетучих масел, этил олеата, веществ, которые улучшают изотоничность и химическую стабильность, стабилизирующих агентов, фармацевтически приемлемых белков, полисахаридов, полимолочных кислот, полигликолевых кислот, полимерных аминокислот и сополимеров аминокислот.

7. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что она включает, независимо друг от друга,
- пептид в количестве от 1 мкг до 10 г, предпочтительно от 10 мкг до 1 г, в особенности от 1 мг до 100 мг, и
- ингибитор вирусной нейраминидазы в количестве от 1 мкг до 10 г, предпочтительно от 100 мкг до 1 г, в особенности от 1 мг до 200 мг.

8. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что она представлена в жидкой форме и включает, независимо друг от друга,
- пептид в количестве от 1 мкг до 10 г, предпочтительно от 10 мкг до 1 г, в особенности от 1 мг до 100 мг, и
- ингибитор вирусной нейраминидазы в количестве от 1 мкг до 10 г, предпочтительно от 100 мкг до 1 г, особенно предпочтительно от 1 мг до 200 мг,
и представлена в объеме от 0,5 до 10 мл, в особенности в объеме от 1 до 5 мл.

9. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что указанный пептид и/или указанный ингибитор вирусной нейраминидазы предоставляются в распыляемом порошкообразном препарате или в распыляемом жидком препарате.

10. Набор для предупреждения или лечения гриппа или воспаления легких, которое вызвано гриппом, содержащий следующие компоненты, каждый обеспечен в отдельных контейнерах:
- пептид, который состоит из 17 смежных аминокислот и включает гексамер ТХ₁ЕХ₂Х₃Е, где Х₁, Х₂ и Х₃ могут представлять собой любую встречающуюся в природе или невстречающуюся в природе аминокислоту, где пептид не имеет активности связываться с рецептором TNF и циклизирован, где циклизированный пептид состоит из последовательности следующих друг за другом аминокислот, CGQRETPEGAEAKPWYC, и
- ингибитор вирусной нейраминидазы.

11. Набор по п. 12, отличающийся тем, что указанные компоненты, каждый обеспечен в отдельных контейнерах, определены, как указано в любом из пп. 1-9.

12. Применение композиции, которая содержит
- пептид, который состоит из 17 смежных аминокислот и включает гексамер ТХ₁ЕХ₂Х₃Е, где X₁, Х₂ и Х₃ могут представлять собой любую встречающуюся в природе или невстречающуюся в природе аминокислоту, где пептид не имеет активности связываться с рецептором TNF и циклизирован, где циклизированный пептид состоит из последовательности следующих друг за другом аминокислот CGQRETPEGAEAKPWYC, и
- ингибитор вирусной нейраминидазы, для предупреждения или лечения гриппа.

13. Применение композиции, которая содержит
- пептид, который состоит из 17 смежных аминокислот и включает гексамер ТХ₁ЕХ₂Х₃Е, где Х₁, Х₂ и Х₃ могут представлять собой любую встречающуюся в природе или невстречающуюся в природе аминокислоту, где пептид не имеет активности связываться с рецептором TNF и циклизирован, где циклизированный пептид состоит из последовательности следующих друг за другом аминокислот, CGQRETPEGAEAKPWYC, и
- ингибитор вирусной нейраминидазы, при воспалении легких, которое вызвано гриппом.

14. Применение набора, содержащего следующие компоненты, которые помещены в отдельные контейнеры:
- пептид, который состоит из 17 смежных аминокислот и включает гексамер ТХ₁ЕХ₂Х₃Е, где Х₁, Х₂ и Х₃ могут представлять собой любую встречающуюся в природе или невстречающуюся в природе аминокислоту, где пептид не имеет активности связываться с рецептором TNF и циклизирован, где циклизированный пептид состоит из последовательности следующих друг за другом аминокислот, CGQRETPEGAEAKPWYC, и
- ингибитор вирусной нейраминидазы, для предупреждения или лечения гриппа.