Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к области бактериальных препаратов для нитрификации и денитрификации воды.
Биогенные вещества (в частности азот) являются одними из основных составляющих компонентов сточной воды, присутствие которых в коммунальных или близких к ним по составу хозяйственно-бытовых водах фиксируется постоянно. Азот в сточной/загрязненной воде может быть представлен разными соединениями: азот аммонийный (NH4-), азот нитритов (NO2-), азот нитратов (NO3-), азот органический (в составе органических соединений).
Такие загрязнения также возникают при выращивании аквакультуры (рыба, креветки, гребешки, раки и др.). Из всего состава фекалий рыбы, которые загрязняют воду, наиболее критичными являются азотсодержащие загрязнения.
Для очистки воды в водоемах для выращивания аквакультуры строятся установки замкнутого водоснабжения (УЗВ). Обеспечение качественной и стабильной очистки воды от продуктов жизнедеятельности рыб, а также остатков корма является одной из основных задач для систем УЗВ. Биологическая очистка воды в биофильтре является обязательным процессом при работе УЗВ, в основе которого лежит способность микроорганизмов разлагать органические и неорганические вещества, образующиеся в воде при выращивании рыбы. Эффективность водоочистки значительно снижается при наличии условий, неблагоприятных для микроорганизмов, в частности низкая температура воды. Традиционным решением данной проблемы является добавление новой воды в систему для разбавления, что приводит к увеличению производственных затрат предприятия и повышению себестоимости продукции. Качество мяса рыбы и продуктивные показатели УЗВ напрямую зависят от чистоты воды, в которой она росла. Приобретенный характерный запах тины появляется у рыбы, если вода была недостаточно очищена и имела неприятный запах.
Во время эксплуатации в фильтрах УЗВ работает разнородная группа аэробных бактерий.
Роль нитрифицирующих бактерий - перевод аммония в нитрит и, затем, в менее токсичный нитрат. Данный механизм позволяет очистить поступающую в фильтр воду, снизить содержание аммония. Нитрификация может осуществляться двумя бактериальными фракциями: прикрепленной к субстрату и свободноплавающей. Основными лимитирующими факторами для работы нитрифицирующей биопленки служат уровни TAN (общий аммонийный азот) и DO (концентрация растворенного кислорода). Фактически этот процесс максимально активен при концентрации кислорода 80%, а при концентрации DO ниже 2 мг/л он прекращается.
Эффективность биофильтрации зависит также от таких факторов, как температура воды и уровень рН в системе УЗВ. Для достижения приемлемой скорости нитрификации температура воды в случае используемых в настоящее время коммерческих бактериальных препаратов должна быть в пределах 24-30°С, а уровень рН - между 7 и 8. Однако для максимально эффективного выращивания ценных видов рыбы необходимо поддерживать более низкую температуру воды, что негативно влияет на эффективность биофильтрации. Например, при товарном выращивании лососевых температурный оптимум составляет 8-12°С, а при выращивании малька семги 4-7°С.
Также важно регулировать рН для повышения эффективности биофильтра, поскольку низкий уровень рН снижает эффективность биофильтрации, а более высокий уровень рН приводит к постоянно растущему количеству свободного аммиака (NH3), что увеличивает токсичный эффект.
Известны различные типы бактерий, которые используются для нитрификации (микроорганизмы рода Nitrosomonas, Nitrosospira или Nitrosococcus; микроорганизмы рода Nitrobacter, Nitrospira или Nitrococcus) и для денитрификации (бактерии, способные к денитрификации, принадлежат, в том числе к родам Agrobacterium, Alcaligenes, Azospirillum, Bacillus, Flavobacterium, Hyphomicrobium, Paracoccus, Pseudomonas, Rhodopseudomonas, Thiobacillus, Thiomicrospira, Streptomyces или Actinomyces), что описывается в различных источниках, в частности перечисленные примеры бактерий представлены в описании к патенту RU 2714817 «Способ и реактор для биологического удаления азота путем автотрофного окисления аммония и последующей денитрификации» (опубл. 19.02.2020, МПК: C02F 3/30, C02F 3/08, C02F 3/10, C02F 1/72).
Также продолжаются развитие и поиск новых бактерий для нитрификации и/или денитрификации. В частности известен штамм бактерий Virgibacillus halodenitrificans CHEL 4-5 ВКМ B-3472D для денитрификации с образованием нитрита (патент RU 2774191, опубл. 16.06.2022, МПК: C12N 1/20).
Известна композиция (патент US 10479712, опубл. 19.11.2019, МПК: C02F 3/34, C02F 3/30, C02F 101/16, C02F 101/00, C02F 101/20, C02F 101/30), содержащая: бактерию Acidimicrobiaceae Feammox А6, имеющую регистрационный номер депозита РТА-122488, носитель и по меньшей мере одно вещество из почвы или воды, где бактерия способна окислять аммоний в сочетании с восстановлением Fe(III) до Fe(II), носитель содержит среду для культивирования бактерий, по меньшей мере, почва и вода содержат загрязняющее вещество, содержащее аммоний, а вода включает любую воду, на качество которой отрицательно повлияло антропогенное воздействие. Известная композиция предлагается для удаления азота, органических и не органических загрязнителей из сточных вод.
Однако не все известные бактерии или их сочетания будут эффективны в условиях, в которых происходит выращивание аквакультуры.
Известен биохимический способ денитрификации гиперсоленой композиции сточных вод, концентрация нитрата в которой составляет по меньшей мере 0,1% мас/об, а концентрация хлорида составляет по меньшей мере 5% (мас/об) (патент RU 2648902, опубл. 28.03.2018, МПК: МПК: C02F 3/30, C02F 3/34, C02F 101/12, C02F 101/16), который включает использование сообщества галофильных и/или солеустойчивых бактерий, где указанное сообщество выбрано из смеси ила, состоящей на от 85 до 95 мас. % из активированного ила, получаемого на этапе денитрификации при плановой обработке муниципальных сточных вод, и на приблизительно от 5 до 15 мас. % из солесодержащего ила, получаемого из кристаллизационного пруда «солнечной» солеварни. Ил включает бактерии по меньшей мере следующих родов: Pseudomonas, Bacillus и Halomonas. Изобретение позволяет быстро удалять нитраты в присутствии высокой концентрации хлоридов при обработке сточных вод, содержащих неорганические вещества, с помощью комбинации бактерий.
Однако применяемые в известном способе бактерии будут обладать более низкой эффективностью в условиях выращивания аквакультуры.
Известен способ аэробной денитрификации на месте и очистки сточных вод аквакультуры (патент CN 108545829B, опубл. 17.08.2021, МПК: C02F 3/30, C02F 3/34, A23K 10/16, C02F 103/20), включающий добавление микробного флокулянта в культуру, перемешивание для однородного смешивания микробного флокулянта и культуры, при этом осадок, полученный при культивировании, представляет собой микробный флокулянт с функцией гетеротрофной нитрификации-аэробной денитрификации; добавление источника органического углерода в культивируемый ферментационный раствор, равномерное перемешивание и распыление на поверхность корма для животных аквакультуры для получения гетеротрофных нитрифицирующих-аэробных денитрифицирующих бактерий, распыляющих корм; смешивание полученного микробного флокуляционного осадка с гетеротрофными нитрифицирующими-аэробными денитрифицирующими бактериями распыляемого корма. При этом микробный флокулянт представляет собой один или несколько флокулянтов NOC-1, продуцируемых Rhodococcus erythropolis, флокулянт AJ7002, продуцируемый Aspergillus sojae и флокулянт PF-101 продуцируемого Paecilomyces sp.
Однако известный способ сложен и используемые в нем микробиологические флокулянты, хотя и обеспечивают необходимый уровень значений рН, могут не обеспечивать эффективности нитрификации и денитрификации в условиях пониженных температур и снижения содержания кислорода.
Ближайшим аналогом (прототипом) выбран микроэкологический препарат, используемый для очистки аквакультурной воды в области аквакультуры, в состав которого входят фотосинтетическая бактерия, Bacillus subtilis, денитрифицирующая бактерия, коагулянт и вспомогательные компоненты.
Общими признаками известного и заявляемого препаратов является использование в составе бактерии Rhodopseudomonas palustris, а также денитрифицирующего агента (бактерии).
Однако, как указано выше, не все бактерии или их сочетания будут обладать эффективностью в условиях для выращивания аквакультуры, особенно при пониженных температурах воды, также известно, что для Bacillus subtilis характерен неполный путь денитрификации (особенность многих бацилл).
Технической задачей изобретения является разработка микробиологического препарата, который будет обладать эффективностью в процессах нитрификации и денитрификации и соответствовать всем вышеуказанным требованиям.
Технический результат заключается в разработке бактериального препарата, который будет обеспечивать высокую эффективность нитрификации и денитрификации воды при низкой температуре (ниже 20°С), характеризуется значениями рН порядка 7-8, может использоваться в биофильтрах для снижения уровня нитритов и аммиака, соответственно, обеспечивает качество воды не ниже питьевой воды и может использоваться в производственных процессах по разведению рыбы.
Технический результат достигается для бактериального препарата для нитрификации и денитрификации воды, который включает штаммы Bifidobacterium breve, Achromobacter denitrificans, Rhodepseudomonas palustris.
Смесь этих бактерий может рассматриваться как консорциум, т.к. именно их сочетание обеспечивает достижение технического результата.
Данные бактерии являются обитателями морей, в частности Баренцева моря, и как некоторые другие бактерии, обитающие в биопленке (иле) природных водоемов, могут быть использованы для полного цикла нитрификации и денитрификации. Примером таких бактерий является также, например, Pseudomonas fluorescens. Но как указано выше, не все бактерии, для которых характерны реакции нитрификации и денитрификации, будут активны в условиях пониженной температуры, сниженного содержания кислорода и могут использоваться в биофильтрах УЗВ.
Штамм Achromobacter denitrificans способен как к аэробной, так и анаэробной денитрификации, соответственно, он будет балансировать между концентрациями аммония, нитратов и нитритов в своей норме реакции (равной норме реакции рыб). Rhodopseudomonas palustris также обладает денитрифицирующей активностью (хоть и менее выраженной), также она способна избавлять внешнюю среду от токсичных побочных продуктов метаболизма (индола и других гетероциклических соединений). В результате не переваренного рыбами корма будет образовываться большое количество мономеров под действием гидролитических ферментов бактерий, в том числе и глюкоза. Глюкоза репрессирует процесс аэробной денитрификации у штамма Achromobacter denitrificans. Однако Bifidobacterium breve быстрее использует глюкозу в качестве источника энергии и строительного материала, в результате чего будет вырабатываться ацетат, который одновременно служит источником углерода и стимулятором процесса денитрификации. Таким образом, сочетание указанных трех штаммов обеспечивает эффективность процессов нитрификации и денитрификации.
Соотношение штаммов предпочтительно может составлять 1:1:1 по значениям КОЕ на грамм или близкие к нему. При повышении содержания Achromobacter denitrificans будет возрастать рН, при повышении Bifidobacterium breve рН будет падать, также будет выделяться токсичный лактат. Таким образом соотношение этих двух штаммов будет влиять на рН и специалисту известно, что оно может изменяться. Повышение Rhodepseudomonas palustris не оказывает влияния на рН среды, а также не вызывает других негативных последствий.
Т.е. изменение пропорции (соотношения) не является критичным, так как лимитирующими факторами кинетики роста и развития микроорганизмов будут являться питательный субстрат и ионное содержание в воде (в том числе нитратов, нитритов и аммония) и специалист может регулировать соотношение содержания штаммов в зависимости от условий.
Бактериальный препарат дополнительно может включать штамм Enterococcus gilvus и/или Bacillus cereus Frankland and Frankland как вспомогательные штаммы. Предпочтительно использование этих вспомогательных штаммов совместно. Содержание вспомогательных штаммов предпочтительно на порядок меньше по сравнению с содержанием штаммов бактериального препарата.
Добавление этих штаммов к бактериальному препарату связано с тем, что УЗВ имеют большое количество остатков кормов, что является органическим субстратом в форме труднодоступных биополимеров, которые заиливаются, приводя в дальнейшем к трудностям их уборки.
Расщепление избыточного количества биополимеров, которые не были реализованы рыбой, является важной задачей, так как это необходимый легкодоступный субстрат для набора биомассы бактерий, которые имеют потребность в незаменимых аминокислотах, метаболизируемом углероде, витаминах и т.д.
Не все штаммы могут обеспечить возможность расщепления труднодоступных биополимеров и сохранить эффективность бактериального препарата (достижение технического результата). Так, например, при добавлении в смесь штаммов препарата штаммов Bacillus amyloliquefaciens и Bacillus subtilis происходит репрессия роста поэтапно, в которых отмечалось только первоначальное развитие культуры в ранней лог-фазе, после чего количество клеток переставало возрастать. Из-за разного показателя удвоения клеток все доступные питательные вещества уходят на метаболизм вспомогательных штаммов. При добавлении их в поздней лог-фазе смеси штаммов бактерий соотношение оставалось на оптимальном уровне, но при этом снижалась продукция лактата, ацетата, снижались активность денитрификации. При добавлении дальнейшей подпитки, являющейся концентратом исходной питательной смеси, наблюдалось накопление только бацилл. При этом наблюдалось снижение активности липаз. При рассеве на агаровые среды с помощью метода Коха наблюдалось почти полное отсутствие роста клеток исходного консорциума. В связи с этим можно сделать вывод, что бациллы не только подавляют рост, но и вырабатывают антибиотики.
При добавлении к штаммам бактериального препарата штамма Enterococcus gilvus репрессии роста консорциума не наблюдается, при этом активность гидролитических ферментов высокая. Помимо этого, удлиняются лог- и стационарная фазы. Однако при понижении температуры рост Enterococcus gilvus прекращается, соответственно, гидролитические ферменты перестают выделяться в культуральную жидкость. В связи с чем необходимо проводить отдельно селекцию данного штамма для последующего добавления в бактериальный препарат.
При добавлении в бактериальный препарат штамма Bacillus cereus, в начале культивирования штаммов бактерий для бактериального препарата преимущественно происходило накопление клеток данной бактерии, а не биомассы консорциума штаммов, при этом активность денитрификации и нитрификации снижалась линейно. При добавлении Bacillus cereus в позднюю лог-фазу и начальную стационарную происходило и накопление биомассы, и повышение активности денитрификации и нитрификации. Данное явление можно объяснить следующим влиянием:
1) бактерии рода Bacillus медленно перестраивают метаболизм с аэробного на анаэробный, благодаря чему поддерживается оптимальное количество растворенного кислорода для высокой активности аэробной денитрификации и нитрификации;
2) в данном штамме описан продуцент веществ, обладающих антиоксидантной активностью, что в свою очередь влечет за собой метаболическую активность Bifidobacterium breve и продолжение продукции ацетата для поддержания аэробной денитрификации и нитрификации.
В связи с этим предпочтительно проводить отдельно культивирование консорциума штаммов бактериального препарата и отдельно культивирование вспомогательных штаммов (Enterococcus gilvus и Bacillus cereus), а затем добавлять в бактериальный препарат для использования в устройствах (биофильтрах) для нитрификации и денитрификации.
Культивирование штаммов бактериального препарата может проводиться раздельно, но возможно проводить совместно.
Для бактериального препарата могут быть использованы как выделенные в природе штаммы, так и доступные штаммы из коллекций.
Ниже представлены свойства основных штаммов бактериального препарата и вспомогательных штаммов.
Штамм Achromobacter denitrificans
Культурально-морфологические признаки штамма: грамотрицательные палочки. Рост на бульоне - клетки мелкие, по одной, могут быть в парах или цепочках. В первые сутки в колбе роста не наблюдается, питательная среда остается прозрачной. Оптимальное время выращивания в колбах на качалке 2-3 суток. По линии соприкосновения бульона с воздухом, на стенке флакона наблюдается бактериальная пленка. Лучший рост на триптон-соевый агар и среду №1 Оболенск. Колонии мелкие полупрозрачные, рост на агарах при оживлении из лиофильной ампулы заметен через трое суток (размер колоний 1-2 мм), на пятые сутки приобретают бежевый цвет (размер колоний 2-3 мм). Чем дольше культура на питательной среде, тем меньше размер клеток при микрокопировании.
Условия культивирования: оптимально при 18°С, 3-5 суток, рН-7,0.
Штамм Rhodopseudomonas palustris
Rhodopseudomonas palustris является пурпурной несерной бактерией, способной переключать четыре самых различных типа питания:
1) аэробные условия:
- хемогетеротрофное;
- хемоавтотрофное;
2) анаэробные условия:
- фотогетеротрофное;
- фотоавтотрофное.
Спектр используемых субстратов крайне разнообразный и обширный (лигнин, водород, тиосульфат и другие органические и неорганические соединения).
На первом этапе культура растет как нефотосинтезирующий аэроб в резком дефиците веществ в питательной среде. При полной утилизации кислорода наступает этап бескислородного фотосинтеза. Таким образом, культура проходит через две крайне продолжительные лог-фазы, причем смена метаболизма происходит не благодаря изобилию субстрата, а из-за резкого лимитирования по кислороду, однако на фотосинтез уже не хватает достаточного количества субстрата.
Помимо прочего, Rhodopseudomonas palustris обладает высокой активностью в биодеградации, что будет дополнительно очищать систему от неочевидных загрязнений. Также вырабатывает различные полезные биологически активные вещества, и имеются сообщения о пробиотической активности для широкого спектра позвоночных животных.
Штамм Bifidobacterium breve
Культурально-морфологические признаки штамма: грамположительные, неподвижные, анаэробные, слегка изогнутые палочки, с утолщением на конце в виде шаровидных вздутий или раздвоением, иногда ветвящиеся на концах. Спор не образуют.
Условия культивирования: оптимально при 20°С, 3-5 суток.
Штамм Bacillus cereus
Культурально-морфологические признаки штамма: грамположительная палочковидная, подвижная, спорообразующая бактерия. Споры округлые, овальной формы, расположены центрально или субтерминально. Оксидаза, каталаза положительные.
Условия культивирования: оптимально при 28-32°С, 12-24 часа, рН-7,0±0,2.
Для данного штамма дополнительно было проведено исследование на определение патогенных и вирулентных свойств штамма. Результат исследований - штамм непатогенный.
Штамм Enterococcus gilvus
Клетки - кокки расположены одиночно, парами, цепочками. Колонии мелкие, белого цвета или прозрачные, в зависимости от питательной среды. При оживлении из лиофильной ампулы предпочтительна инкубация в анаэростате. Агары, лучший рост на триптон-соевый агар и среду №1 Оболенск. Колонии мелкие полупрозрачные, рост на агарах заметен через трое суток.
Условия культивирования: оптимально при 37°С, 2-5 суток.
Ниже представлены конкретные примеры реализации заявляемого изобретения.
Штаммы Bifidobacterium breve, Achromobacter denitrificans, Rhodepseudomonas palustris были выделены из биопленки, найденной на берегу Баренцева моря.
Выделенные штаммы хранятся в пробирках в жидких питательных средах. Для культивирования их помещают в соответствующую питательную среду. Культивирование проходит в ферментере. Полученную в результате культивирования каждого штамма культуральную жидкость центрифугируют, биомассу смешивают с криопротектором и сушат в лиофильной сушке.
Культивирование штаммов в данном случае проводилось на разных питательных средах.
Для культивирования штамма Achromobacter denitrificans использовалась следующая питательная среда (среда Березовой): цитрат натрия (20,0 г), KNO3 (1,0 г), KH2PO4 (1,0 г), K2HPO4 (1,0 г), MgSO4 (2,0 г), CaCl2 (0,2 г), FeCl3 (следы).
Для культивирования штамма Bifidobacterium breve использовалась следующая питательная среда (MRS): гидролизат казеина (10 г), мясной экстракт (10 г), дрожжевой экстракт (5 г), глюкоза (20 г), ацетат натрия (5 г), цитрат аммония (двухзамещенный) (2 г), твин 80 (1 г), K2HPO4 (2 г), MgSO4 (0,2 г), MnSO4 (0,05 г), вода дистиллированная (1000 мл).
Для культивирования штамма Rhodopseudomonas palustris использовалась следующая питательная среда: дрожжевой экстракт (0,30 г), сукцинат натрия (1 г), ацетат аммония (0,50 г), 0,1% раствор цитрата железа (III) в воде (5 мл), KH2PO4 (0,50 г), MgSO4*7H2O (0,40 г), NaCl (0,40 г), NH4Cl (0,40 г), CaCl2*2H2O (0,05 г), раствор 10 мг витамина В12 в 100 мл Н2О (0,40 мл), раствор микроэлементов SL-6 (1 мл), L-цистеин хлорид (0,30 г), 0,1% резазурин (0,50 мл), дистиллированная вода (1000 мл).
При этом раствор микроэлементов SL-6 включает: ZnSO4*7H2O (0,10 г), MnCl2*4H2O (0,03 г), Н3ВО3 (0,30 г), CoCl2*6H2O (0,20 г) CuCl2*2H2O (0,01 г), NiCl2*6H2O (0,02 г), Na2MoO4*2H2O (0,03 г), дистиллированную воду (1000 мл).
Для культивирования штамма Bacillus cereus Frankland and Frankland использовалась следующая питательная среда (LB-бульон): триптон (10 г), дрожжевой экстракт (5 г), NaCl (10 г), дистиллированная вода (800 мл).
Для культивирования штамма Enterococcus gilvus использовались триптиказо-соевый бульон (30 г) и дистиллированная вода (1000 мл).
Полученную биомассу после центрифугирования смешивали в соотношении штаммов 1:1:1 по КОЕ/гр и добавляли на порядок меньше вспомогательных штаммов.
Проводили исследования в лаборатории, а также на модельных системах биофильтров.
Для лабораторных исследований полученные образцы бактериального препарата с помощью метода Коха разводились до 10-3.
Для сравнения эффективности бактериального препарата (консорциума штаммов) проводилась также оценка активности Pseudomonas fluorescens.
Pseudomonas fluorescens может применяться только для денитрификации, при этом только в анаэробных условиях. В связи с чем сравнительное лабораторное исследование проводилось только для процессов денитрификации.
Нитраты в анаэробной денитрификации переходят в нитриты, затем в газообразные формы азота (оксиды и молекулярный азот).
Для получения изолятов штамма Pseudomonas fluorescens использовалась питательная среда King В следующего состава: пептон (20,0 г), K2HPO4 (1,5 г), MgSO4 (1,5 г), глицерин (10,0 мл), агар (18,0 г), вода дистиллированная (1000 мл).
По 1 мл полученных изолятов, а также разведений консорциума 100, 10-1, 10-2, 10-3 вносилось в питательную среду Березовой для денитрификаторов следующего состава: цитрат натрия (20,0 г), KNO3 (1,0 г), KH2PO4 (1,0 г), K2HPO4 (1,0 г), MgSO4 (2,0 г), CaCl2 (0,2 г), FeCl3 (следы), вода дистиллированная (1000 мл). Исходная концентрация нитратов составляет 0,016 М.
Для учета нитратов и нитритов использовались качественные реакции на нитраты и нитриты.
Качественная реакция на нитраты
На белой керамической пластинке несколько кристаллов дифениламина растворяют в капле концентрированной серной кислоты и к смеси добавляют каплю исследуемой жидкой культуры. При наличии нитратов возникает синее окрашивание. Контролем служит исходная стерильная среда.
Качественные реакции на нитриты
1) Реакция на нитриты с реактивом Грисса основана на образовании в кислой среде в присутствии нитритов и ароматических аминов (сульфаниловой кислоты и а-нафтиламина) азотсоединения, окрашенного в красно-розовый цвет. Для обнаружения нитритов к капле реактива Грисса на керамической пластинке добавляют каплю выросшей жидкой культуры или культуральной жидкости. Появление красного окрашивания свидетельствует о присутствии нитритов;
2) крахмал-йодная реакция основана на том, что нитриты в кислой среде окисляют йодистый цинк с выделением йода, присутствие которого обнаруживают с крахмалом. Для проведения реакции к капле выросшей жидкой культуры на керамической пластинке добавляют каплю раствора, содержащего ZnCl2, KI, крахмал и каплю 5%-ного раствора HCl. При наличии в среде нитритов появляется синее окрашивание.
Также использовались тест-системы для оценки уровня нитратов и нитритов производства Red Sea и Salifer согласно инструкциям производителя тест-систем.
В таблице приведены результаты, полученные после пяти суток культивирования. Исходное количество нитратов 0,016 М.
Полученный результат связан с тем, что в данной питательной среде протекают два процесса: накопление биомассы и денитрификация. Для Pseudomonas fluorescens 2 с низким содержанием пиовердина процесс накопления биомассы проявляется сильнее, в связи с чем эффективность в процессе денитрификации практически не проявляется (на уровне погрешности). Эффективность первого этапа денитрификации измеряется в количестве нитритов.
Pseudomonas fluorescens 1 не очень эффективна, так как сохраняется высокая концентрация нитратов, которые не перевели в нитриты. У консорциума нулевого разведения эффективность тоже низкая - из-за бактерий, которые не пошли по пути денитрификации, а остались на накоплении биомассы. Так как изначальная концентрация нитратов была 0,016, а стала 0,014 - разница несущественна.
У второго разведения (10-2) почти весь азот пропал из жидкости и перешел в биомассу (полный путь денитрификации) - консорциум из разведения 10-2 оказался самым активным в полном цикле денитрификации. Это связано с тем, что бактерии помещаются в новые условия и доминация может смещаться. Как правило, она смещается в пользу тех, которые делятся быстрее. Также в консорциуме второго разведения уменьшаются или исчезают "нежелательные примеси", которые могут вырабатывать, например, антибиотики или другие метаболиты, которые негативно сказываются на эффективности процесса денитрификации. В консорциуме третьего разведения начинают утрачиваться штаммы, которые отвечают за процессы денитрификации.
Для консорциума штаммов бактериального препарата нулевого разведения процесс набора биомассы в данной питательной среде также проявляется сильнее, но при разведении и снижении общего количества бактерий в среде - наблюдается повышение эффективности денитрификации.
Дополнительно стоит отметить, что консорциум будет более эффективен в различных условиях биофильтра УЗВ по сравнению с Pseudomonas fluorescens, т.к. может работать как в анаэробных, так и в аэробных условиях.
Количество растворенного кислорода также влияет на активность денитрификации и нитрификации. Испытания проводились при 60%, 40% и 20% растворенного кислорода. При 20% активность была самой высокой. Взаимосвязь количества кислорода и эффективности процессов нитрификации и денитрификации является известной для специалистов.
Накопление общего азота в биомассе оказалось эквивалентным количеству биомассы, полученной после центрифугирования. Количество биомассы и количество клеток, подсчитанных в камере Горяева, оказались одинаковы в пределах погрешности у всех испытуемых изолятов Pseudomonas fluorescens и консорциумах бактериального препарата.
Значение рН соответствовало требованиям и составляло от 7-8.
Также проводилось исследование на модели наиболее распространенного в рыбоводческих хозяйствах биофильтра с плавающей загрузкой. Модель представляет собой емкости с водой, заполненные тонущей загрузкой марки Kelder в соотношении 1,4 литра воды на 1 литр загрузки. На дно емкости уложены аэраторы, в которые от компрессора подается воздух.
Для поддержания температуры в заданном диапазоне емкости помещены в короб с водой, которая охлаждается до 15°С во время периодической перекачки через чиллер.
Для этого штаммы бактериального препарата раздельно выращивались в соответствующих питательных средах, затем проводились центрифугирование культуральной среды и сушка.
Готовый бактериальный препарат, включающий три основных штамма и два вспомогательных, смешивается с криораствором в соотношении 1:1 и тщательно размешивается венчиком. Затем помещается на 2 часа в холодильник на 6°С. Состав криораствора: вода дистиллированная (1000 мл), пептон (30 г), дрожжевой экстракт (15 г). Титр измеряется с помощью камеры Горяева.
Исследование проводилось на трех образцах с использованием разработанного бактериального препарата и контрольного образца одновременно до 15 дней. Устанавливался режим дня с 6:00 до 23:00 и ночи включением-выключением по таймеру лампы дневного света в указанное время. Перед началом взвешивалась загрузка биофильтров.
Температура воды поддерживалась в интервале 15-16°С. Ежедневно в опытные и контрольную емкости вносилось по 0,08 г карбамида плюс 0,07 г корма рыб.
В первый день и на седьмой день в опытные емкости вносилось по 0,01 г бактериального препарата на основе консорциума на 1,4 литра воды емкости, в контрольную емкость - не вносится.
Ежедневно контролируются температура и рН воды, а также уровень ионов аммония, нитратов и нитритов (измеряется тест-системами производства Red Sea и Salifer согласно инструкциям производителя тест-систем).
Дополнительно, кроме ежедневных измерений, отбирается проба воды на выходе для количественной и качественной оценки микробиоценоза фильтра. Микробиоценоз оценивается качественно на наличие микроорганизмов препаратов на селективных средах, указанных в ТУ на препарат и отсутствие нежелательной микрофлоры.
Во время исследований разработанный бактериальный препарат показал стабильное качество воды в пределах норм для рыбоводства при низких температурах. Нитриты были не обнаружены, количество нитратов было на уровне 5 мг/л. Аммиак появлялся после внесения карбамида и возвращался к нулевым отметкам в течение последующих двух часов. Также одновременно происходила нейтрализация нитратов и нитритов.
В контрольной емкости количество нитратов превышало количество нитратов в опытных емкостях.
Таким образом, препарат обеспечивает стабильное качество воды в модели по аммиаку, нитритам и нитратам. Срок выхода модели на стационарную фазу был на 47% ниже, чем в контрольной емкости, что говорит об эффективности запуска биофильтра с разработанным бактериальным препаратом.
Приведенные примеры применения консорциума для нитрификации и денитрификации воды, который включает штаммы Bifidobacterium breve, Achromobacter denitrificans, Rhodepseudomonas palustris, а также вспомогательные штаммы, являются частными примерами реализации и не ограничивают заявляемого изобретения.
Примеры также подтверждают достижение технического результата, а именно, что разработан бактериальный препарат, который обеспечивает высокую эффективность нитрификации и денитрификации воды при низкой температуре (ниже 20°С), характеризуется значениями рН порядка 7-8, может использоваться в биофильтрах для снижения уровня нитритов и аммиака и обеспечения качества воды не ниже питьевой воды, и, соответственно, может использоваться в производственных процессах по разведению рыбы (т.к. соответствует всем требованиям, которые предъявляются для бактериальных препаратов в данной области).
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к области бактериальных агентов для нитрификации и денитрификации воды. По своим характеристикам может применяться в биофильтрах установок замкнутого водоснабжения, которые используются при выращивании аквакультуры. Бактериальный препарат для нитрификации и денитрификации воды, который включает штаммы Bifidobacterium breve, Achromobacter denitrificans, Rhodepseudomonas palustris. Изобретение позволяет обеспечить высокую эффективность нитрификации и денитрификации воды при температуре ниже 20°С. 4 з.п. ф-лы, 1 табл.
1. Бактериальный препарат для денитрификации воды, который включает Bifidobacterium breve, Achromobacter denitrificans, Rhodepseudomonas palustris.
2. Бактериальный препарат по п. 1, в котором соотношение Bifidobacterium breve, Achromobacter denitrificans, Rhodepseudomonas palustris составляет 1:1:1 КОЕ/гр.
3. Бактериальный препарат по п. 1, который дополнительно включает Enterococcus gilvus.
4. Бактериальный препарат по п. 1, который дополнительно включает Bacillus cereus Frankland and Frankland.
5. Бактериальный препарат по п. 1, в котором Bifidobacterium breve, Achromobacter denitrificans, Rhodepseudomonas palustris культивируются совместно на одной питательной среде.
| CN 108545829 В, 17.08.2021 | |||
| ДЕНИТРИФИКАЦИЯ СОЛЕСОДЕРЖАЩИХ ПРОМЫШЛЕННЫХ СТОЧНЫХ ВОД | 2015 |
|
RU2648902C1 |
| US 10479712 В2, 19.11.2019. | |||
