КОНСОРЦИУМ ШТАММОВ УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS AERUGINOSA НД К3-1 И PSEUDOMONAS FLUORESCENS НД К3-2 В КАЧЕСТВЕ ДЕСТРУКТОРА НЕФТЕПРОДУКТОВ И СПОСОБ ОЧИСТКИ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННЫХ ПОДЗЕМНЫХ ВОД Российский патент 2007 года по МПК B09C1/10 C12N1/26 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способам очистки подземных вод, загрязненных нефтью, с помощью консорциума штаммов бактерий деструкторов нефти.

Известны способы очистки загрязненных подземных вод с помощью культур анаэробных (сульфатредуцирующих) микроорганизмов (пат. RU №2107042, МПК C02F 3/34, бюл. №8, 1998 г.; RU №1838598, МПК Е21В 43/28, 1984 г.; а.с. SU №1264634, МПК C02F 3/34, 1993 г). Недостатками данных способов являются, во-первых, большая трудоемкость и техническая сложность работ по выделению анаэробных микроорганизмов и наращиванию их биомассы. Во-вторых, использование анаэробных микроорганизмов оправдано для подземных вод, не содержащих растворенного кислорода, являющегося токсичным для данных микроорганизмов, и следовательно, они не могут быть использованы для обработки карстовых подземных вод, содержащих растворенный кислород.

Известен консорциум штаммов микроорганизмов BACILIUS BREVIS и ARTHROBACTER SPECITS, используемый для очистки воды и почв от нефти и нефтепродуктов (пат. RU №2232806, МПК C12N 1/20, C02F 3/34, бюл. №20, 2004 г.). В состав консорциума, депонированного, коллекции микроорганизмов Института биологии Уфимского научного центра РАН под № НБ ДТ-5, входят штаммы BACILIUS BREVIS ДТ-5-1 (51%) и ARTHROBACTER SPECITS ИБ ДТ-5-3 (49%). Консорциум выделен из почвы, загрязненной дизельным топливом. Прототип для заявляемого консорциума микроорганизмов. Недостатком способа следует признать его низкую эффективность в случаях высокой степени загрязненности нефтью.

Известен способ очистки грунтовых вод, загрязненных нефтепродуктами, с использованием бактериальных культур природных штаммов, выделенной из грунтовой воды (пат. RU №2043312 МПК C02F 3/34, E21B 43/22, бюл. №25, 1995 г.). Прототип для предлагаемого способа очистки нефтезагрязненных карстовых подземных вод. По способу проводят оценку степени загрязнения грунтовых вод, бурение скважин, откачку грунтовых вод, аэрацию и возврат их в водоносный горизонт. При этом предварительно выделяют бактериальную культуру природного штамма из грунтовой воды, определяют наиболее активные и нарабатывают их биомассу, после чего осуществляют откачку воды, удаляют из нее отстой и при остаточном содержании нефтепродуктов в воде 0,1-1,0 г/л вводят в воду биомассу в смеси с K, N, P-содержащими удобрениями и микроэлементами. Откачку воды, ее отстой и аэрацию производят в скважине, периодически повторяя процесс, с последующим введением туда же биомассы.

Недостатками способа являются большая трудоемкость работ и материальные затраты, связанные с предварительной откачкой воды, ее отстаиванием и аэрацией, добавочной аэрацией пласта для создания аэробных условий в объеме грунтов (вод), а также применимость способа только при низком остаточном содержании нефтепродуктов в воде (до 1 г/л).

Задачей создания изобретения является получение консорциума штаммов бактерий, обладающего высокой нефтедеструктирующей активностью, а также разработка на его основе высокоэффективного способа очистки нефтезагрязненных подземных вод.

Технический результат, получаемый в результате реализации изобретения, состоит в улучшении эффективности очистки за счет снижения затрат и повышения степени очистки.

Для достижения указанного технического результата предложен Консорциум штаммов углеводородокисляющих бактерий Pseudomonas aeruginosa. НД К 3-1 и Pseudomonas fluorescens НД К 3-2 [депонированного в коллекции лаборатории геологической микробиологии Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН под № НД-МК-17], в качестве деструктора нефтепродуктов.

Для достижения указанного технического результата предлагается использовать выделенный консорциум штаммов бактерий, обладающий высокой нефтедеструктирующей активностью, который вносят в нефтезагрязненные подземные воды через скважины и/или карстовые воронки. Способ очистки нефтезагрязненных подземных вод включает закачку через скважину и/или карстовую воронку деструктора нефтепродуктов. В качестве деструктора нефтепродуктов используют консорциум штаммов углеводородокисляющих бактерий Pseudomonas aeruginosa НД К 3-1 и Pseudomonas fluorescens НД К 3-2 в количестве 0,5-1,5 литра на 1 м³ подземных вод, затем из скважины устройством (например, пробоотборником) периодически отбирают пробы для оценки эффективности деструкции нефти и по результатам анализа осуществляют корректировку биологической очистки подземных вод.

Если взять консорциум штаммов в количестве менее 0,5 л/м³, то не достигается эффективная очистка подземных вод.

Если взять консорциум штаммов в количестве более 1,5 л/м³, то не оправданно возрастают затраты на очистку подземных вод.

Патентные исследования показали, что решений, имеющих признаки, сходные с отличительными признаками предлагаемого технического решения, не выявлены, что дает право судить о существенности отличий этих признаков, а совокупность всех признаков придает изобретению новый технический результат.

Вышеперечисленные признаки позволяют эффективно решать поставленную задачу.

Указанные выше отличительные признаки, каждый в отдельности и все совместно, направлены на решение поставленной задачи и являются существенными. Использование существенных отличительных признаков в известном уровне техники не обнаружено, следовательно, предлагаемое техническое решение соответствует критерию патентоспособности «новизна».

Единая совокупность новых существенных признаков с общими, известными обеспечивает решение поставленной задача и свидетельствует об успешном промышленном применении предлагаемого решения.

Полученный консорциум штаммов бактерий выделен из образцов почв и подземных вод карстовых полостей, отобранных на территории НГДУ (пос. Полазна Пермской обл.). Основная физиологическая особенность консорциума, имеющая практическое значение, - деструкция углеводородов нефти. Консорциуму присвоен номер МК-17, консорциум хранится в коллекции лаборатории геологической микробиологии Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН под коллекционным номером НД-МК-17. Для выделения консорциума применяли прямой высев из отобранных образцов почвы и воды с последующим получением накопительной культуры вначале на жидкой среде Раймонда с 0,5% сырой нефти, а затем на агаризованной среде того же состава.

Ступенчатую аналитическую селекцию вели по принципу отбора микроорганизмов с высокой деструктирующей активностью по отношению к углеводородам. Все культуры консорциума - мезофилы, с границами хорошего роста и высокой активности в пределах 15-35°С при оптимуме 26±2°С. Консорциум представляет собой естественное неделимое сообщество, состоящее из двух штаммов бактерий.

Высев моноколониальных изолятов на среды с различными источниками углерода, неспособность их к накоплению в качестве запасного источника углерода поли-β-оксибутирата, образование флуоресцирующих диффундирующих пигментов, грамотрицательная окраска клеточной стенки, отсутствие потребности в органических факторах роста, положительный результат теста на наличие оксидазы, наличие каталазы, дыхательный тип метаболизма, способность к денитрификации и росту при различных температурах, неспособность к фиксации атмосферного азота, неспособность к росту в кислой среде (рН 4,5), подвижность клеток при фазовоконтрастном микроскопировании обосновали определение видового состава консорциума.

Характеристика штамма Pseudomonas aeruginosa НД К 3-1. Подвижные палочки 0,5-0,6×1,5-3,0 мкм. Растет при +41°С, не растет при +4°С. Гидролизует желатину, не гидролизует крахмал. В качестве источника углерода использует глюкозу, β-кетоглюконат, L-валин, DL-аргинин. Не использует мезо-инозит, трегалозу. Обладает аргининдегидролазаой. Не обладает лецитиназной активностью. Способен к денитрификации нитрата. Сапрофит.

Характеристика штамма Pseudomonas fluorescens НД К 3-2. Подвижные палочки 0,5-1,0×1,5-5,0 мкм. Растет при +4°С, не растет при +41°С. Гидролизует желатину, не гидролизует крахмал. В качестве источника углерода использует глюкозу, трегалозу, β-кетоглюконат, мезо-инозит, L-валин, L-аргинин, L-арабинозу, сахарозу, сорбит, пропионат. Не использует бутират. Обладает аргининдегидролазаой и лецитиназой. Способен к денитрификации нитрата. Сапрофит.

Доминирующим компонентом консорциума являются бактерии штамма Pseudomonas aeruginosa НД К 3-1; количество их составляет 60-70%. Состав консорциума может меняться в зависимости от изменения фракционного состава используемой нефти. На более тяжелых нефтях доминирующим компонентом консорциума становятся бактерии штамма Pseudomonas fluorescens НД К 3-2; их количество составляет 55-65%.

Пример 1.

Для получения препарата консорциум штаммов бактерий НД-МК-17 выращивают на жидкой среде Раймонда с 1 мас.% глюкозы при комнатной температуре в течение 48-72 часов в аэробных условиях до достижения плотности популяции 10⁹-10¹⁰ кл/мл, вносят сырую нефть в количестве 0,5-1 мас.% и продолжают культивирование в тех же условиях еще 24 часа. Добавляют азотсодержащую композицию (например, минеральное удобрение "Нитроаммофоска") в количестве 5 мас.%. Полученный препарат готов для внесения в нефтезагрязненные карстовые подземные воды через скважины и/или карстовые воронки.

Способ в соответствии с настоящим изобретением дополнительно поясняется с помощью приведенного ниже примера, не имеющего ограниченного характера.

Пример 2.

Нефтедеструктирующую активность консорциума микроорганизмов определяли по убыли индивидуальных компонентов нефти, регистрируемой общепринятыми методами газо-жидкостной хроматографии и ИК-спектрометрии в хлороформенных экстрактах из опытных образцов воды, загрязненной 10 мас.% нефти и подвергнутой бактериальной обработке (2 об.% трехсуточной культуры консорциума с содержанием клеток 1,0·10⁸ КОЕ/мл), по сравнению с контрольными образцами, не подвергнутыми бактериальной обработке. За 18 сут инкубации содержание н-алканов в нефти снизилось в 4,2 раза по сравнению с контролем за счет деструкции главным образом средних по массе углеводородов (n-С_17-26). Далее в таблице приведены сравнительные данные по утилизации нефтепродуктов консорциумами микроорганизмов.

Полученный согласно примеру 1 препарат после иммобилизации на полимерном волокне вносили в нефтезагрязненные подземные воды через скважину (воронку) с помощью специального устройства для отбора проб в количестве 1 л на 1 м³ карстовых подземных вод.

Иммобилизованный препарат выдерживали в скважине в течение 2-х недель, после чего отбирали пробу нефти из скважины для анализа. Химические анализы пробы нефти показали следующие результаты. Повышение точки начала кипения с 71°С до 77°С, увеличение массовой доли парафинов с 1,82% до 2,24% и повышение плотности нефти с 0,8401 до 0,8518 г/см³ свидетельствуют о том, что в результате деятельности бактерий консорциума в нефти произошли изменения, а именно исчезли самые легкие фракции. Увеличение обводненности нефти произошло в результате выделения углеводородокисляющими бактериями консорциума поверхностно-активных веществ, способствующих образованию эмульсии «вода в нефти».

Как показали вышеприведенные примеры, полученный консорциум штаммов бактерий может быть использован как препарат для очистки подземных вод от нефтяных загрязнений. Препарат предложено вносить в нефтезагрязненные подземные воды через скважины и/или карстовые воронки в количестве 0,5-1,5 л на 1 м³ подземных вод.

Таблица
Утилизация нефти и нефтепродуктов консорциумами микроорганизмовКонсорциумУсловияСтепень утилизации, мас.%НД-МК-1710 мас.% нефти в природной воде76,35±5,95ИБ-ДТ 5 (Пат. RU 2232806; по прототипу)10 мас.% дизельного топлива в жидкой питательной среде59,37

Несмотря на то что были описаны предпочтительные варианты осуществления изобретения, совершенно ясно, что в него специалистами в данной области могут быть внесены изменения и дополнения, которые не выходят, однако, за рамки приведенной далее формулы изобретения.

Изобретение относится к биотехнологии. Консорциум штаммов углеводородокисляющих бактерий Pseudomonas aeruginosa НД К3-1 и Pseudomonas fluorescens НД К3-2 выделен из образцов почв и подземных вод карстовых полостей, отобранных на территории Пермской области, и депонирован в коллекции лаборатории геологической микробиологии Института экологии и генетики и микроорганизмов УрО РАН под номером НД-МК-17. Способ очистки нефтезагрязненных подземных вод включает закачку через скважину и/или карстовую воронку консорциума штаммов углеводородокисляющих бактерий Pseudomonas aeruginosa. НД К3-1 и Pseudomonas fluorescens НД К 3-2 в количестве 0,5-1,5 литра на 1 м³ подземных вод. Из скважины устройством периодически отбирают пробы для оценки эффективности деструкции нефти и по результатам анализа осуществляют корректировку биологической очистки подземных вод. Изобретение позволяет повысить эффективность очистки за счет снижения затрат и повышения степени очистки. 2 н.п. ф-лы, 1 табл.

1. Консорциум штаммов углеводородокисляющих бактерий Pseudomonas aeruginosa. НД К 3-1 и Pseudomonas fluorescens НД К 3-2 (депонированного в коллекции лаборатории геологической микробиологии Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН под № НД-МК-17), в качестве деструктора нефтепродуктов.2. Способ очистки нефтезагрязненных подземных вод, включающий закачку через скважину и/или карстовую воронку деструктора нефтепродуктов, отличающийся тем, что в качестве деструктора нефтепродуктов используют консорциум штаммов углеводородокисляющих бактерий Pseudomonas aeruginosa НД К 3-1 и Pseudomonas fluorescens НД К 3-2 в количестве 0,5-1,5 литра на 1 м³ подземных вод, затем из скважины устройством периодически отбирают пробы для оценки эффективности деструкции нефти и по результатам анализа осуществляют корректировку биологической очистки подземных вод.