ПОЛИМЕРНЫЕ НАНОЧАСТИЦЫ, ПОКРЫТЫЕ ОКСИДОМ МАГНИТНОГО МЕТАЛЛА, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2013 года по МПК A61K47/48 A61K47/30 A61K47/02 A61K38/19 A61P35/00 B82B3/00 B82Y5/00 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение обеспечивает наночастицы, состоящие из полимера, являющегося веществом, образующим комплексы с металлом, покрытого оксидом магнитного металла, где по меньшей мере одно активное вещество ковалентно связано с данным полимером, а также фармацевтические композиции и их применения.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Наночастицы представляют собой сферические частицы размером от нескольких нанометров до 0,1 мкм. Полимерные частницы наномасштаба с узким распределением по размеру обычно создаются посредством методов контролируемого осаждения или технологий гетерофазной полимеризации, например, посредством методов оптимальной или обратной эмульсионной полимеризации. Когда размеры твердых веществ уменьшают до порядка нанометров, их свойства подвергаются коренным изменениям. Важно иметь в виду, что чем меньше размер частиц, тем большая часть их конституэнтных атомов находится на поверхности. Наночастицы, в частности, размером меньше приблизительно 20 нм, преимущественно проявляют свойства поверхности и границы раздела фаз, которые не наблюдаются у исходных веществ, например, более низкие точки плавления и кипения, более низкая температура спекания и сниженное сопротивление текучести.

Ввиду их сферической формы и большой площади поверхности, частицы наномасштаба могут обеспечивать аккуратные решения различных проблем в науке о материалах, например, использование композиционных материалов, катализа, пространственных структур и фотонных материалов, и могут быть в дальнейшем использованы в биомедицинских применениях, например, для специфического мечения и разделения клеток, выращивания клеток, аффинной хроматографии, диагностики, специфической очистки крови путем гемоперфузии, доставки и контролируемого высвобождения лекарственного средства (Bockstaller et al., 2003; Hergt et al., 2004; Margel et al., 1999). Для каждого практического применения требуются наночастицы с различными оптимальными физическими и химическими свойствами. Уже описаны синтез и применение многочисленных типов частиц нано-масштаба с различной химией поверхности, например, многообразие поверхностных функциональных групп, таких как гидроксильная группа, карбоксильная группа, пиридин, амид, альдегид и фенил-хлорметил (Margel et al., 1999). Такие наночастицы предназначены для различных промышленных и медицинских применений, например, иммобилизации ферментов, синтеза олигонуклеотидов и пептидов, доставки лекарственного средства, специфического мечения и разделения клеток, медицинской диагностической визуализации, биологических клеящих веществ и негорючих полимеров (Bunker et al., 1994; Szymonifka and Chapman, 1995; Margel et al., 1999; WO 2004/045494; Galperin et al., 2007).

Особенный интерес представляют наночастицы с магнитными свойствами, которые обычно используют для отделения данных частиц и/или их конъюгатов от нежелательных соединений с помощью магнитного поля. Благодаря своим магнитным свойствам, эти частицы имеют несколько дополнительных важных применений, таких как магнитная регистрация, магнитная сварка, защита от электромагнитного излучения и биомедицинские применения. Наночастицы оксида магнитного железа, а именно магнетида и оксимагнетида, являются основными частицами, которые были изучены для биомедицинских применений, например, для магнитной гипертермии, магнитной целевой доставки лекарственного средства, магнитного разделения клеток и в качестве контрастных веществ при МРТ (Lacoste et al. 1993; Green-Sadan et al. 2005; Leemputten and Horisberger, 1974; Hergt et al. 2004). Наночастицы оксида магнитного железа являются нетоксичными и поддаются биологическому разложению, и уже одобрены для клинического применения в качестве контрастных веществ при МРТ. Эти наночастицы обычно получают посредством добавления в водный раствор, содержащий стехиометрические концентрации ионов двухвалентного и трехвалентного железа, и полимерный стабилизатор, такой как декстран, в который добавляют основание, например, NaOH или аммиак, до тех пор, пока не достигнуто щелочное значение рН (обычно выше 8,0). Полученные наночастицы, покрытые оксидом магнитного железа, затем отмывают различными способами, например, с использованием магнитных колонок или диализа. За прошедшие несколько лет были приложены значительные усилия для синтеза эффективных магнитных наночастиц оксида железа, однако большинство из этих наночастиц обладают существенными недостатками, такими как широкое распределение размеров, что считается токсичным для медицинских применений in vivo, выщелачивание ионов железа и нестабильности относительно процессов агглютинации.

WO 99/062079 и соответствующая заявка EP 1088315B1 того же Заявителя, полностью включенные в настоящее описание посредством ссылки, как если бы полностью раскрытые в настоящем описании, раскрывают новые единообразные магнитные комплексные наночастицы желатин/оксид железа, полученные посредством контролируемого образования активных центров оксида железа на полимере, хелатирующем ионы железа, например, желатине, растворенном в водном растворе, с последующим поэтапным наращиванием тонких слоев пленки оксида железа на данных ядрах желатин/оксида железа. Эти магнитные наночастицы можно изготовить с очень узким распределением размеров в диапазоне приблизительно от 10 нм до 100 нм.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает наночастицы, состоящие из полимера, который является веществом, хелатирующим металл, покрытого оксидом магнитного металла, где по меньшей мере одно действующее вещество ковалентно связано с данным полимером.

В других аспектах настоящее изобретение обеспечивает фармацевтические композиции, включающие наночастицы, согласно вышеприведенному определению, и фармацевтически приемлемый носитель, а также различные способы их применения.

Данные фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно применять, наряду с прочим, для выявления опухоли; уменьшения или ингибирования роста опухоли, или для уменьшения или ингибирования роста опухолевых клеток, оставшихся у пациента, после удаления опухоли хирургическим путем; уменьшения или ингибирования роста опухоли и контролирования ее размера; оценки восприимчивости опухолевых клеток к обработке испытываемым соединением. Дополнительно, эти композиции можно использовать для выявления очага воспаления и лечения данного воспаления, а также для лечения сахарного диабета 2 типа, ожирения и анорексии.

В следующем аспекте настоящее изобретение обеспечивает наночастицу, состоящую из полимера, являющегося веществом, хелатирующим металл, покрытого оксидом магнитного металла, где по меньшей мере одно вещество, имеющее противоопухолевую активность, выбранное из пептида, пептидомиметика, полипептида или малой молекулы, связано с внешней поверхностью данного оксида магнитного металла. Настоящее изобретение дополнительно обеспечивает фармацевтические композиции, включающие эти наночастицы и фармацевтически приемлемый носитель, для уменьшения или ингибирования роста опухоли, а также различные способы их применения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг.1А-1D представлены полученные с помощью трансмиссионной электронной микроскопии (ТЕМ) микроснимки магнитных композитных наночастиц желатин/оксид железа с увеличенным средним диаметром, изготовленных как описано в примере 1, посредством повторения процесса нанесения тонкого магнитного покрытия на этапе роста 4, 5, 6 и 7 раз (1A, 1B, 1C и 1D), соответственно.

На фиг.2 представлена гистограмма диаметра композитных наночастиц желатин/оксид железа, полученных как описано в примере 1, и диспергированных в воде.

На фиг.3A-3B представлены полученные посредством ТЕМ высокого разрешения (HTEM) (3A) и структурной электронографии (ED) (3B) изображения магнитных композитных наночастиц желатин/оксид железа, полученных как описано в примере 1.

На фиг.4 представлено рентгеновское дифракционное (XRD) изображение магнитных композитных наночастиц желатин/оксид железа, полученных как описано в примере 1.

На фиг.5 представлен мессбауэровский спектр магнитных композитных наночастиц желатин/оксид железа, полученных как описано в примере 1.

На фиг.6 представлена петля магнитизации (VSM) при комнатной температуре, полученная для магнитных композитных наночастиц желатин/оксид железа, полученных как описано в примере 1.

На фиг.7 изображен этап образования активных центров при получении меченных флуоресцентным красителем магнитных композитных наночастиц желатин/оксид железа, приготовленных как описано в примере 2.

На фиг.8 изображена стабильность несвязанного родственного фактору некроза опухоли лиганда, индуцирующего апоптоз (TRAIL) в сравнении с TRAIL, конъюгированным с магнитными композитными наночастицами желатин/оксид железа (NP-TRAIL), при 10°C в течение 35 дней.

На фиг.9A-9B изображен апоптоз клеток глиомы человека A172 (9A) и глиомных сфероидов, образованных из первичных опухолей HF2020 (9B), индуцированный посредством магнитных композитных наночастиц желатин/оксид железа (NP), несвязанного TRAIL (100 нг/мл) и конъюгированных с TRAIL магнитных композитных наночастиц желатин/оксид железа (NP-TRAIL, 10 нг/мл).

На фиг.10 представлено действие несвязанного TRAIL и конъюгированных с TRAIL магнитных композитных наночастиц желатин/оксид железа (NP-TRAIL) на апоптоз глиомных сфероидов, образованных из образцов глиомы человека HF1254, HF1308 и HF2020. Сфероиды помещали в 24-луночные планшеты и обрабатывали средой (контроль), TRAIL (100 нг/мл), магнитными композитными наночастицами желатин/оксид железа (NP) и конъюгированными с TRAIL магнитными композитными наночастицами (NP-TRAIL, 10 нг/мл). Клеточную гибель определяли через 24 часа обработки, используя анализ LDH. Результаты представлены как среднее±SE между тремя экземплярами в двух различных экспериментах.

На фиг.11 представлен цитотоксический эффект несвязанного TRAIL (100 нг/мл) и конъюгированных с TRAIL магнитных композитных наночастиц желатин/оксид железа (NP-TRAIL, 10 нг TRAIL/мл) на клетки глиомы U87, A172 и U251, а также на первичные клеточные культуры клеток глиомы HF1308, HF1254 и HF1316. В качестве контроля использовали магнитные композитные наночастицы желатин/оксид железа в чистом виде (NP) или PBS (контроль). Клеточную гибель определяли посредством анализа FACS через 24 часа обработки.

На фиг.12 представлен цитотоксический эффект конъюгированных с TRAIL магнитных композитных наночастиц желатин/оксид железа с наличием или без флуоресцентной метки, на клетки A172. Клетки A172 инкубировали в течение 5 ч. с контрольными наночастицами (NP-контроль), конъюгированными с TRAIL наночастицами без флуоресцентной метки (NP-TRAIL), контрольными наночастицами, меченными родамином (NPR-контроль) или конъюгированными с TRAIL меченными родамином наночастицами (NPR-TRAIL). Клеточный апоптоз определяли, используя окрашивание пропидиумом йодидом и анализ FACS, и результаты представлены как среднее±SE в трех независимых экспериментах.

На фиг.13 представлена специфическая интернализация конъюгированных с TRAIL меченных родамином магнитных композитных наночастиц желатин/оксид железа (NPR-TRAIL) клетками глиомы, по сравнению с нормальными астроцитами. NPR-TRAIL инкубировали с клетками A172 и с нормальными астроцитами в течение 30 мин, и иммунофлуоресценцию данных клеток определяли, используя конфокальный микроскоп. Результаты представляют один из трех экспериментов, продемонстрировавших аналогичные результаты.

На фиг.14 изображено синергетическое действие γ-облучения и конъюгированных с TRAIL магнитных композитных наночастиц желатин/оксид железа (NP-TRAIL) на клеточные линии глиомы U87, A172, U251 и LN-18. Клетки инкубировали с NP-TRAIL (5 нг TRAIL/мл) или с магнитными композитными наночастицами желатин/оксид железа в чистом виде (NP) в течение 24 ч, или облучали γ-облучением (10 Гр в течение 2 ч), а затем обрабатывали с NP-TRAIL (NP-TRAIL+Rad, 5 нг TRAIL/мл) или только NP (NP-Rad) в течение 24 ч. Клеточный апоптоз определяли посредством анализа FACS.

На фиг.15 показано, что и cRGD-пептид (cRGD), и конъюгированные с cRGD-пептидом магнитные композитные наночастицы желатин/оксид железа (NP-cRGD), индуцируют аутофагию, а именно, увеличивают неравномерное окрашивание, в клетках глиомы U251, по сравнению с контролем, или клетками, обработанными только магнитными композитными наночастицами желатин/оксид железа (NP).

На фиг.16 изображено действие конъюгированных с TRAIL магнитных композитных наночастиц желатин/оксид железа (NP-TRAIL) на апоптоз клеточной линии карциномы шейки матки HeLa, клеточной линии рака молочной железы MCF-7 и клеток рака легких A549. Эти различные клеточные линии инкубировали с TRAIL (100 нг/мл), NP-TRAIL (50 нг TRAIL/мл), наночастицами в чистом виде (NP) или PBS (контроль), в течение 24 ч, и результаты представлены как среднее±SE.

На фиг.17A-17B представлено синергетическое действие γ-облучения и конъюгированных с TRAIL магнитных композитных наночастиц желатин/оксид железа (NP-TRAIL) на сфероиды глиомы стволовых клеток, образованных из образцов опухоли 2355 (17A) и 2303 (17B). Клетки обрабатывали либо TRAIL (100 нг/мл), наночастицами в чистом виде (NP) (контроль)или NP-TRAIL (50 нг/мл) в течение 24 ч, затем собирали супернатанты и проводили анализ LDH. Для оценки эффекта совместного действия облучения (IR) и TRAIL, клетки сначала облучали излучением 5 Гр и через 4 ч обрабатывали либо TRAIL, либо NP-TRAIL в течение дополнительных 24 ч. Клеточную гибель определяли, используя уровни LDH в культуральных супернатантах. Результаты представляют один из трех аналогичных экспериментов, который был проведен в трех параллелях.

На фиг.18 показано действие IL-12 и конъюгированных с IL-12 магнитных композитных наночастиц желатин/оксид железа (NP-IL-12) на апоптоз клеток рака яичников. Клетки рака яичников обрабатывали только средой, IL-12 (50 нг/мл), наночастицами в чистом виде (NP, 50 мкг/мл), или NP-IL-12 (50 нг связанного IL-12/мл), инкубировали в течение 24 ч, а затем проводили оценку клеточной гибели, используя анализ LDH.

На фиг.19 представлены срезы опухоли крыс, обработанных либо конъюгированными с TRAIL магнитными композитными наночастицами желатин/оксид железа (NP-TRAIL), или наночастицами в чистом виде (NP). Клетки глиомы человека U251 использовали в качестве ксенотрансплантата в головной мозг крыс, ожидали развитие опухолей в течение 7 дней, после чего либо NP, либо NP-TRAIL инъецировали интракраниально в область опухоли. Степень клеточного апоптоза в опухолях контрольных крыс, обработанных с использованием PBS (не представлено), NP или NP-TRAIL определяли через 7 дней после обработки, и клеточный апоптоз был определен посредством окрашивания TUNEL (коричневое окрашивание), которое специфически выявляет апоптотические клетки.

На фиг.20 представлено действие конъюгированных с TRAIL магнитных композитных наночастиц (NP-TRAIL) на выживаемость крыс с имплантами U251 человека. Наночастицы в чистом виде (NP), NP-TRAIL или PBS инъецировали непосредственно в опухоль через 7 дней после имплантации опухолевых клеток, за животными наблюдали на предмет выявления признаков патологического состояния и/или заболеваемости, и в момент их проявления безболезненно умерщвляли.

На фиг.21A-21C представлено действие конъюгированных с TRAIL магнитных композитных наночастиц (NP-TRAIL) (21C) в сравнение с применением наночастиц в чистом виде (NP) (21B) или PBS (21A), на опухолевый объем в момент заболеваемости. Во время умерщвления, крысам проводили перфузию формалином, извлекали головной мозг и проводили окрашивание гематоксилин-эозином. Представлены характерные срезы опухолевого объема. Номера над сериями изображений означают день, на который произвели умерщвление.

На фиг.22 показано, что применение конъюгированных с TRAIL магнитных композитных наночастиц желатин/оксид железа (NP-TRAIL) приводит к снижению в целом опухолевой нагрузки, по сравнению с применением наночастиц в чистом виде (NP) или PBS. Крысам интракраниально имплантировали клетки человека U251, и через 7 дней вводили NP-TRAIL, NP или PBS. На 21 день животных безболезненно умерщвляли, выделяли ткани головного мозга и изготавливали срезы для определения объема. В этом исследование предметные стекла были сфотографированы при одинаковых настройках для всех предметных стекол. Объем определяли, измеряя наибольшую ширину и высоту опухоли для каждого 15-го среза толщиной 5 мкм. Определяли объем для каждого среза и умножали на число срезов до следующего измеренного среза, до тех пор, пока не достигли конца опухоли.

На фиг.23 представлена способность магнитных композитных наночастиц желатин/оксид железа (NP) сопрягаться с областями опухолевого роста. Через 7 дней после имплантации опухолевых клеток U251, меченные родамином NP (NPR) имплантировали в противоположное полушарие головного мозга крыс. Через четыре дня животных безболезненно умерщвляли, головной мозг удаляли и мгновенно замораживали для изготовления срезов и визуализации. На панелях A, D и G представлены изображения NPR в мозолистом теле поблизости от места инъекции NPR; на панелях B, E и H изображены участки имплантации NPR; и на панелях C, F и I представлены изображения NPR в мозолистом теле поблизости от области опухолевых клеток. Увеличение 4X (панели A, B, C); 10X (панели D, E, F); и 20X (панели G, H, I).

На фиг.24 показано, что применение конъюгированных с TRAIL магнитных композитных наночастиц желатин/оксид железа (NP-TRAIL) ведет к образованию больших областей деструкции ткани, что в частности, показано на панелях b, d и f, чего не наблюдали ни при применении наночастиц в чистом виде (NP), ни при применении PBS. Крысам линии nude имплантировали опухоли U251n в день 0; в день 7 внутрь новообразования вводили NP-TRAIL, NP в чистом виде или PBS; в день 14 животных умерщвляли и собирали ткани. NP-TRAIL (панели a-f); NP (панели g-l); PBS (панели m-r). Увеличение 1X (панели a, c, e, g, i, k, m, o, q); 10X (панели b, d, f, h, j, l, n, r). Стрелками указана нижняя часть опухолевой массы.

На фиг.25 показана повышенная деструкция опухолевых клеток у крыс, получавших конъюгированные с TRAIL магнитные композитные наночастицы желатин/оксид железа (NP-TRAIL) по сравнению с только наночастицами (NP) или PBS. Животным имплантировали клетки человека U251n в день 0, в день 7 им вводили PBS, NP или NP-TRAIL. На 14 день животных безболезненной умерщвляли и ткани мозга окрашивали гематоксилином и эозином. PBS (панели a-b); NP (панели c-e); NP-TRAIL (панели f-h). Увеличение 40X.

На фиг.26A-26B показано, что конъюгированные с TRAIL магнитные композитные наночастицы желатин/оксид железа (NP-TRAIL) (26B) индуцируют сигнал более низкой интенсивности как на границе, так и внутри опухоли, по сравнению с наночастицами в чистом виде (NP) (26A), как показано посредством МРТ, свидетельствуя о том, что NP-TRAIL подходят к границе и проникают внутрь ксенотрансплантатов глиомы человека, имплантированных крысам линии nude. Клетки глиомы человека U251n были имплантированы крысам линии nude, и через 11 дней интракраниально в противоположную опухоли сторону вводили NP или NP-TRAIL. MP-изображения получали через 8 дней. На каждой фигуре представлены 4 последовательных среза МРТ, для каждого среза имеется 4 изображения с различным временем задержки эхо-импульса (TE). Более длинное TE (нижнее правое изображение в маленьком квадрате). Значительная потеря интенсивности сигнала (черный) из-за железа. R - право; L - лево; IS - область инъекции (слева); Tm - опухоль (справа); LV - боковой желудочек; и 3V - 3-ий желудочек.

На фиг.27 представлена способность конъюгированных с TRAIL меченных родамином магнитных композитных наночастиц желатин/оксид железа (NPR-TRAIL) быть поглощенными опухолевыми клетками in vivo. Меченные родамином магнитные композитные наночастицы желатин/оксид железа (NPR) в чистом виде, или NPR-TRAIL были имплантированы непосредственно в опухолевую массу через 7 дней после имплантации опухолевых клеток GFP-U251. Через четыре дня животных безболезненно умерщвляли, головной мозг извлекали и быстро замораживали для изготовления срезов и визуализации (красное окрашивание и зеленое окрашивание означает присутствие NPR и опухолевых клеток GFP-U251, соответственно). Как показано на панелях G, Н и I, NPR-TRAIL были обнаружены не только в областях опухолевых масс, но также колокализованы вместе с опухолевыми клетками (панель I). Однако NPR в чистом виде обнаружены в областях опухолевых масс, но не колокализованы с опухолевыми клетками (панели D, E и, в частности, F). Контрольных животных обрабатывали с использованием PBS.

На фиг.28 показано, что конъюгированные с cRGD-пептидом меченные родамином магнитные композитные наночастицы желатин/оксид железа (NPR-cRGD) мигрируют по направлению к опухолевым клеткам in vivo. Через 7 дней после имплантации в головной мозг крысам линии nude опухолевых клеток GFP-U251, NPR-cRGD (10 мкл, содержащие 0,05 мг наночастиц, связанных с приблизительно 2 мкг cRGD-пептида) инъецировали в противоположную сторону. Через четыре дня животных безболезненно умерщвляли, головной мозг извлекали и мгновенно замораживали для изготовления срезов и визуализации (красное окрашивание и зеленое окрашивание означает присутствие меченных родамином магнитных композитных наночастиц желатин/оксид железа (NPR) и опухолевых клеток GFP-U251, соответственно).

На фиг.29 показано, что конъюгированные с cRGD-пептидом магнитные композитные наночастицы желатин/оксид железа (NPR-cRGD) и конъюгированные с TRAIL меченные родамином магнитные композитные наночастицы желатин/оксид железа (NPR-TRAIL) мигрируют по направлению к области повреждения in vivo. Повреждение было вызванно посредством инъекции PBS с помощью иглы в левую часть головного мозга, и последующие 4 дня в противоположную сторону головного мозга вводили 5 мкл (25 мкг) меченных родамином магнитных композитных наночастиц желатин/оксид железа (NPR) отдельно, NPR-TRAIL (50 нг связанного TRAIL), и NPR-cRGD. Через 4 дня животных безболезненно умерщвляли и флуоресценцию NPR наблюдали посредством флуоресцентного микроскопа. Как показано, незначительное количество NPR присутствовало в другой части головного мозга, но их распределение было обширным. NPR-TRAIL располагались, главным образом, вдоль участка повреждения. В отличие от этого, NPR-cRGD были распределены по всему участку повреждения головного мозга, а также вдоль мозолистого тела.

На фиг.30A-30B представлено действие TRAIL (10-100 нг/мл), магнитных композитных наночастиц желатин/оксид железа (NP) и конъюгированных с TRAIL магнитных композитных наночастиц желатин/оксид железа (NP-TRAIL, 10-40 нг связанных с TRAIL/мл), как в присутствии, так и в отсутствии ингибитора протеасом (PS, 5 мМ), на опухолевые клетки карциномы мочевого пузыря TSU-PR1 (30A), а также на клетки рака молочной железы MDA-MB и нормальные клетки молочной железы MCF10A (30B). Клеточную гибель определяли через 24 ч, используя анализ LDH. 100% клеточная гибель была определена в клетках, обработанных с помощью Triton X-100, и результаты были стандартизированы.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает наночастицы, состоящие из полимера, который является веществом, хелатирующим металл, покрытого оксидом магнитного металла, где по меньшей мере одно активное вещество ковалентно связано с данным полимером.

Магнитные композитные наночастицы полимер/оксид металла по настоящему изобретению основаны на магнитных композитных наночастицах полимер/оксид металла, раскрытых в WO 99/062079, включенном в настоящее описание полностью в качестве ссылки; однако дополнительно включающие по меньшей мере одно активное вещество, которое ковалентно связано с данным полимером внутри данной наночастицы. Такие наночастицы можно получить посредством любого подходящего способа, известного в уровне техники, например, с помощью процесса, подробно описанного далее в примерах 1-3, а именно посредством контролируемого образования активных центров оксида магнитного металла, например, оксида железа, на полимере, хелатирующем металл, например желатине, с которым ковалентно связано по меньшей мере одно активное вещество, где указанный полимер растворен в водном растворе, с последующим поэтапным наращиванием тонких слоев пленок оксида металла на данном ядре полимер/оксид металла. Как показано в этих примерах выход составляет почти 100%.

В примерах 1-2 ниже описывается получение магнитных наночастиц по настоящему изобретению, состоящих из желатина в качестве полимера, хелатирующего металл, и оксида железа в качестве оксида магнитного металла. Как показано в этих примерах, данные магнитные наночастицы по настоящему изобретению можно изготовить с очень узким распределением размеров и с размером в диапазоне от приблизительно 10 нм до приблизительно 100 нм. Более того, эти примеры, в частности, демонстрируют однородность, атомный порядок, магнитные характеристики и кристаллические свойства данных наночастиц. Наночастицы по настоящему изобретению являются супемагнетиками, а именно: они намагничиваются в присутствии магнитного поля, но в отсутствии магнитного поля не наблюдается остаточный магнетизм.

Анализ поверхности магнитных композитных наночастиц желатин/оксид железа, выполненный как описано в примерах 1-2, демонстрирует присутствие желатина и внутри, и на поверхности данной наночастицы. Обнаружено, что поверхностный желатин обеспечивает дополнительную стабилизацию против аггломерации наночасти, а также функциональные группы, такие как карбоксилат и первичные амины, посредством которых соответствующие лиганды могут быть ковалентно связаны.

Предпочтительно размер наночастиц по настоящему изобретению менее 300 нм, более предпочтительно, менее 100 нм.

В соответствии с настоящим изобретением полимер, хелатирующий металл, используемый для получения наночастиц по настоящему изобретению, может быть полимером, имеющим функциональные группы, способные связывать ионы металлов, в частности ионы железа, выбранные из амино, гидроксильной, карбоксилатной, -SH, эфирной, иминнной, фосфатной или сульфидной групп. В предпочтительных вариантах осуществления данный полимер, хелатирующий металл, отобран из желатина, полиметиленимина, хитозана или полилизина, более предпочтительным является желатин.

В одном варианте осуществления данный оксид магнитного металла, покрывающий вышеуказанный полимер, хелатирующий металл, представляет собой оксид железа, или феррит, происходящий из оксида железа. Оксид железа может представлять собой магнетит, оксимагнетит или их смесь, и данный феррит является оксидом по формуле (Fe,M)₃O₄, где М представляет собой ион металла переходной валентности, предпочтительно выбранный из Zn²⁺, Co²⁺, Mn²⁺ или Ni²⁺. В предпочтительном варианте осуществления данный оксид магнитного металла, используемый для изготовления наночастиц по настоящему изобретению, представляет собой оксид железа.

В соответствии с настоящим изобретением по меньшей мере одно активное вещество, ковалентно связанное с полимером, хелатирующим металл, может быть выбрано, без ограничений, из флуоресцентного красителя, контрастного вещества, пептида, пептидомиметика, полипептида или малой молекулы.

В одном варианте осуществления данной активное вещество, ковалентно связанное с полимером, хелатирующим металл, представляет собой флуоресцентный краситель. Примеры флуоресцентных красителей включают, но не ограничиваются перечисленным, родамин или флуоресцеин.

В другом варианте осуществления данное активное вещество, ковалентно связанное с полимером, хелатирующим металл, представляет собой контрастное вещество, а именно соединение, используемое для улучшения видимости внутренних органов либо при рентгенологическом исследовании, либо при магнитно-резонансной томографии (МРТ). Примеры контрастных веществ для рентгенологического исследования включают, но не ограничиваются перечисленным, контрастные вещества на основе сульфата бария, которые нерастворимы в воде, вводимые в организм только через пищеварительный тракт, либо путем глотания, либо с помощью клизмы, и растворимые в воде контрастные вещества на основе йода, которые можно использовать почти во всем организме, в частности внутривенно, а также внутриартериально, интратекально (позвоночник), и внутрибрюшинно. Общеупотребительными йодсодержащими контрастными веществами являются диатризоат (Гипак 50), метризоат (Изопак Коронар 370), йоксаглат (Гексабрикс), йопамидол (Isovue 370), йогексол (Омнипак 350), йоксилан (Оксилан), йопромид и йодиксанол (Визипак 320).

В следующем варианте осуществления данное активное вещество, ковалентно связанное с полимером, хелатирующим металл, представляет собой пептид или пептидомиметик.

Мотив аргинин-глицин-аспарагиновая кислота (Arg-Gly-Asp; RGD) компонентов внеклеточного матрикса, таких как фибронектин и витронектин, связывается с интегринами, и интегринопосредованная адгезия вызывает внутриклеточные сигнальные события, которые регулируют клеточную сохранность, пролиферацию и миграцию. Данные, полученные в результате скрининга посредством методов фагового дисплея для RGD-содержащих пептидов, показали их селективное связывание с эндотелиальной выстилкой кровеносных сосудов опухоли. RGD-пептиды также задерживают передачу сигналов, воздействуют на клеточную миграцию, и индуцируют регрессию опухолевых клеток или апоптоз. Связываясь с интегрином либо эндотелиальных, либо опухолевых клеток, пептиды RGD способны модулировать движение клеток in vivo, ингибируя присоединения опухолевая клетка-внеклеточный матрикс и опухолевая клетка-эндотелиальная клетка, которые являются обязательными для процессов метастазирования. Несколько исследований показали, что RGD-содержащие соединения могут препятствовать процессам метастазирования опухолевых клеток in vitro и in vivo. Пептиды, которые являются специфическими для характериных интегринов, представляют собой значительный интерес и возможное медицинское значение. Интегрин α_vβ₃ был первым интегрином, для которого доказана связь с опухолевым ангиогенезом, и RGD-пептиды, которые специфически блокируют интегрин α_vβ₃, являются перспективными в качестве ингибиторов опухолевого и ретинального ангиогенеза, остеопороза и для направленной доставки лекарственного средства в сосудистую сеть опухоли. Соответственно, большой объем работы был проделан для конструирования и получения интегрин-связывающих пептидов и пептидомиметиков.

В одном предпочтительном варианте осуществления данный пептид или пептидомиметик представляет собой, таким образом, пептид или пептидомиметик, содержащий циклический RGD (cRGD), или пептид или пептидомиметик, содержащий ациклический RGD. В более предпочтительном варианте осуществления, данный cRGD-пептид представляет собой cRGD-пептид с последовательностью цикло(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys) (SEQ ID NO:1).

В еще одном варианте осуществления данное активное вещество, ковалентно связанное с полимером, хелатирующим металл, представляет собой полипептид.

Родственный фактору некроза опухоли лиганд, индуцирующий апоптоз (TRAIL, также называемый лиганд Apo-2, Apo-2L или TRAIL/Apo2L), является членом семейства факторов некроза опухоли (TNF) цитокинов, способен инициировать апоптоз посредством взаимодействия его рецепторов смерти. Дополнительными членами этого семейства являются, например, TNFα (также называемый TNF), TNFβ, TL1A (TNF-подобный лиганд), лимфотоксин-β (LTβ), лиганд CD30, лиганд CD27, лиганд CD40, лиганд OX-40, лиганд 4-1BB, лиганд Apo-1 (также называемый лиганд Fas или лиганд CD95), лиганд Apo-3 (также называемый лиганд RANK, ODF или TRANCE) и TALL-1 (также называемый BlyS, BAFF или THANK) (WO 2004/001009; Wang and El-Deiry, 2003).

TRAIL представляет собой трансмембранный белок типа II, изначально идентифицированный и клонированный на основе гомологичности последовательности его внеклеточного домена с CD95L (идентичность 28%) и TNF (идентичность 23%). Естественная последовательность полипептида TRAIL человека состоит из 281 аминокислоты; однако некоторые клетки могут вырабатывать природную растворимую форму данного полипептида, посредством ферментативного расщепления внеклеточной области полипептида. Как и большинство других членов семейства TNF, TRAIL образует гомотримеры, которые связывают рецепторные молекулы, каждый на границе между двумя его субъединицами. Действительно, TRAIL, как и большинство лигандов семейства TNF, находится и в мембран-ассоциированной, и в растворимой формах, которые могут обладать различной биоактивностью. Четыре члена семейства TNF, а именно лиганд Fas, TNFα, TL1A и TRAIL, выделяются своей способностью индуцировать апоптоз. В отличие от других членов семейства TNF растворимая форма TRAIL (sTRAIL) обладает уникальной особенностью структуры, в которой остатки цистеина вместе взаимодействуют с атомом Zn, который является необходимым для стабильности трехзвенного полимера и оптимальной биологической активности. Функциональные исследования показали, что TRAIL обладает потенциальной способностью индуцировать апоптоз, in vitro, в разнообразных опухолевых клеточных линиях, в том числе опухолях толстой кишки, легких, молочной железы, предстательной железы, мочевого пузыря, почек, яичников и опухолях мозга, а также при меланоме, лейкемии и множественной миеломе, но не в большинстве нормальных клетках, что выделяет его потенциальное терапевтическое применение при лечении рака (WO 2004/001009; Wang and El-Deiry, 2003; Ashkenazi et al., 1999; Carlo-Stella et al., 2007; Smyth et al., 2003). Существует всего лишь несколько веществ, которые на самом деле специфичны для раковых клеток с точки зрения эффективности или индукции клеточной гибели, как TRIAL. В отличие от других членов семейства TNF, чья экспрессия сильно регулируется, и которые зачастую только временно экспрессируются на активированных клетках, мРНК TRIAL нерегулируемо экспрессируется в широком диапазоне тканей. Несмотря на то, что главной биологической функцией TRIAL считается индукция апоптоза, полная физиологическая роль этого лиганда еще полностью не изучена. Кажется вероятным, что экспрессия TRIAL клетками природными киллерами (NK) печени регулируется посредством IFNγ, секретируемым NK-клетками аутокринно, поскольку большая часть NK-клеток конститутивно продуцирует и TRIAL и IFNγ у мышей дикого типа и мышей с дефицитом Т-клеток. Исследования на мышах с нокаут геном показали, что TRIAL играет важную роль в противоопухолевом контроле иммунными клетками, и что он опосредует апоптоз тимоцитов и является важным в индукции аутоиммунных заболеваний.

TRAIL индуцирует апопотоз, взаимодействуя со своими рецепторами. До настоящего времени выявлено четыре гомологичных рецептора человека для TRIAL, включающие DR4, KILLER/DR5, DcR1 (Trail-R3 TRID) и DcR2 (TRAIL-R4), а также пятый растворимый рецептор, называемый остеопротегерин (OPG), первоначально обозначаемый как рецептор RANKL/OPGL. И DR4, и DR5 содержат мотив консервативного домена смерти (DD) и могут давать сигнал для апоптоза. Другие три рецептора выступают в роли «ложных» для их способности ингибировать TRIAL-индуцированный апоптоз в случае сверхпродукции. Ложный рецептор 1 (DcR1) и DcR2 имеют близкую гомологичность с внеклеточными доменами DR4 и DR5. DcR2 имеет укороченный, нефункциональный цитоплазматический DD, в то время, как DcR1 не имеет цитозольную область и заякорен на плазматической мембране посредством гликофосфолипидного компонента. Физиологическая значимость OPG, в качестве рецептора для TRIAL, неясна, потому что аффинность для этого лиганда при физиологических температурах очень низка. Возможным объяснением селективной противоопухолевой активности TRIAL является то, что эти ложные рецепторы предпочтительно экспрессируются в нормальных клетках по сравнению с опухолевыми клетками, и препятствуют действию TRIAL (WO 2004/001009; Wang and El-Deiry, 2003; Carlo-Stella, 2007; Shah et al., 2003). Другим возможным объяснением является то, что большинство опухолевых клеточных линий экспрессируют агонисты рецепторов к TRIAL, но не экспрессируют, или экспрессируют неопределяемые уровни, антагонистов рецепторов, в то время как было обнаружено, что нормальные клетки экспрессируют антагонисты рецептров к TRIAL, и следовательно, TRAIL может позволить селективное уничтожение только опухолевых клеток (Wei et al., 2006).

Несмотря на ранее полученные многообещающие результаты, недавние исследования выявили несколько устойчивых к TRIAL раковых клеток в различных опухолях. Показано, что резистентность раковых клеток к TRIAL возникает посредством модуляции различных молекулярных мишеней, которые могут включать дифференциальную экспрессию рецепторов смерти. Основываясь на молекулярном анализе сигнальных путей рецепторов смерти было разработано несколько новых способов увеличения эффективности TRIAL, в том числе применение стандартных противоопухолевых лекарственных средств или облучения в сочетании с TRIAL (Shankar and Srivastava, 2004; Smyth et al., 2003).

Таким образом, в одном предпочтительном варианте осуществления, данный полипептид представляет собой цитокин, например, фактор некроза опухоли (TNF)-α, TNF-β; цитокин, родственный TNF, или интерлейкин (IL). Неограничивающие примеры цитокинов, родственных TNF, включают родственный TNF лигад, индуцирующий апоптоз (TRAIL), TALL-1, TNF-подобный лиганд TL1A, лимфотоксин-бета (LT-β), лиганды CD30, лиганды CD27, лиганды CD40, лиганды OX40, лиганды 4-1BB, лиганды Apo-1 и лиганды Apo-3, с предпочтением TRAIL. В наиболее предпочтительном варианте осуществления данный цитокин представляет собой TRAIL. Неограничивающие примеры интерлейкинов включают любой интерлейкин, который имеет противоопухолевую активность, с предпочтением IL-12, IL-23 и IL-27.

В другом варианте осуществления данный полипептид представляет собой фермент.

В следующем варианте осуществления данный полипептид представляет собой антитело, например, авастин или ремикад. Авастин представляет собой моноклональное антитело против сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF), которое применяют при лечении рака для ингибирования роста опухолей, посредством блокирования формирования новых кровеносных сосудов. Ремикад представляет собой моноклональное антитело, которое используют при лечении аутоиммунных заболеваний, посредством связывания с TNFα, одним из ключевых цитокинов, который запускает и поддерживает воспалительную реакцию, и препятствуя его связыванию с рецепторами TNFα.

В еще одном варианте осуществления данный полипептид представляет собой гормон, а именно полипептидный гормон, такой как инсулин, обестатин или грелин.

В другом варианте осуществления данное активное вещество, ковалентно связанное с полимером, хелатирующим металл, является малой молекулой.

В одном предпочтительном варианте осуществления данная малая молекула представляет собой химиотерапевтическое вещество антрациклинового ряда. Данное химиотерапевтическое вещество антрациклинового ряда может представлять собой любое химиотерапевтическое вещество, принадлежащее к антрациклиновому ряду, в том числе даунорубицин (также известный как адриамицин), доксорубицин, эпирубицин, идарубицин и митоксантрон. В более предпочтительном варианте осуществления, данное химиотерапевтическое вещество антрациклинового ряда представляет собой доксорубицин, который является хининсодержащим антрациклином и наиболее широко предписываемым и эффективным химиотерапевтическим веществом, используемым в онкологии. Применение доксорубицина показано в широком спектре злокачественных новообразований человека, в том числе при опухолях мочевого пузыря, желудка, яичников, легких и щитовидной железы, и он является наиболее активным веществом, доступным при лечении рака молочной железы и других показаниях, в том числе острой лимфобластной и миелогенной лейкимии, ходжкинской и неходжкинской лимфомы, саркомы Юинга и остеогенной опухоли кости, саркомах мягких тканей и злокачественных опухолей в педиатрии, таких как нейробластома и опухоль Вильмса.

В другом предпочтительном варианте осуществления, данная малая молекула представляет собой антифолатное лекарственное средство, а именно, лекарственное средство, которое ослабляет функцию фолиевой кислоты. Хорошо известным и предпочтительным примером антифолатного лекарственного средства является метотрексат, который представляет собой аналог фолиевой кислоты, ингибирующий фермент дигидрофолатредуктаза, и таким образом препятствует образованию тетрагидрофолата, который является необходимым для синтеза пуринов и пиримидинов, и, следовательно, приводит к ингибированию продукции ДНК, РНК и белков. Другие примеры антифолатных агентов включают триметоприм, пириметамин и пеметрексед. Поскольку антифолаты нарушают метаболизм нуклеотидов, их действие специфически направлено на быстроделящиеся клетки.

В другом предпочтительном варианте осуществления данная малая молекула представляет собой антибиотик.

В еще одном варианте осуществления данная малая молекула представляет собой гормон аминного происхождения, а именно производное аминокислот тирозин и триптофан. Неограничивающие примеры гормонов аминного происхождения включают катехоламины, например, эпинефрин, норэпинефрин и допамин, и тироксин.

В другом предпочтительном варианте осуществления данная малая молекула представляет собой гормон липидного или фосфолипидного происхождения, а именно гормон, происходящий из липидов, таких как линолевая кислота и арахидоновая кислота, и фосфолипидов. Основными группами гормонов липидного и фосфолипидного происхождения являются стероидные гормоны, происходящие из холестерина, например, тестостерон и кортизол, и эйкозаноиды, а именно простагландины.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления данная малая молекула представляет собой противовоспалительное средство.

Данное противовоспалительное средство может быть выбрано из кортикостероида, алкалоида колхицин, который является стандартным лекарственным средством при подагре или нестероидных противовоспалительных лекарственных средств (НСПВП), таких как, но не ограничиваясь перечисленными, аспирин, салицилаты холина и магния, салицилат холина, целекоксиб, диклофенак, дифлунисал, этодолак, фенопрофен кальция, флурбипрофен, ибупрофен, индометацин, кетопрофен, салицилат магния, меклофеманат натрия мефенаминовая кислота, мелоксикам, набуметон, напроксен, оксапрозин, пироксикам, рофекоксиб, салсалат, салицилат натрия, сулиндак, толметин натрия и вальдекоксиб.

В свете всего вышеизложенного, в одном предпочтительном варианте осуществления данный полимер, хелатирующий металл, представляет собой желатин, данный оксид металла представляет собой оксид железа, и данное вещество, ковалентно связанное с желатином, выбрано из (i) флуоресцентного красителя, предпочтительно, родамина или флуоресцеина; (ii) TNF или цитокина, родственного TNF, предпочтительно TRAIL; (iii) химиотерапевтического средства антрациклинового ряда, предпочтительно доксорубицина; (iv) антифолатного лекарственного средства, предпочтительно метотрексата; или (v) их комбинации. В более предпочтительном варианте осуществления указанное по меньшей мере одно вещество, ковалентно связанное с желатином, представляет собой флуоресцентный краситель или TRAIL.

В соответствии с настоящим изобретением, вышеописанные наночастицы могут дополнительно включать по меньшей мере одно вещество, физически или ковалентно связанное с внешней поверхностью оксида магнитного металла, где указанное по меньшей мере одно активное вещество может быть таким же или отличаться от данного по меньшей мере одного активного вещества, ковалентно связанного с данным полимером.

В одном предпочтительном варианте осуществления указанное активное вещество ковалентно связано с внешней поверхностью данного оксида магнитного металла.

Как показано далее в примере 4, были отработаны различные технологические приемы для стабилизации и ковалентного связывания внешних функциональных групп с этими магнитными наночастицами, покрывая их различными полимерами, например, полисахаридами, белками и полиэтиленгликолями. Функциональные группы этих покрытий затем использовали для ковалентного связывания различных реагентов, например, белков, ферментов и лекарственных средств, для биомедицинских применений.

Таким образом, в одном варианте осуществления данное активное вещество, ковалентно связанное с внешней поверхностью данного оксида магнитного металла, связано, фактически, посредством молекулы, содержащей функциональную группу, прикрепленную к поверхности данного оксида магнитного металла. В некоторых вариантах осуществления эти молекулы включают полимер, выбранный из полисахарида, более предпочтителен хитозан, белка, более предпочтительны желатин или альбумин, пептида или полиаминов.

В другом варианте осуществления данное активное вещество, ковалентно связанное с внешней поверхностью данного оксида магнитного металла, связано, фактически, посредством активирующего лиганда, прикрепленного к внешней поверхности данного оксида магнитного металла. В предпочтительных вариантах осуществления данный активирующий лиганд представляет собой акрилоилхлорид, дивинилсульфон (DVS), дикарбонил имидазол, этиленгликоль бис (сульфосукцинимидилсукцинат) или N-гидроксисульфосукцинимидный эфир m-малеимидобензойной кислоты. В более предпочтительном варианте осуществления данный активирующий лиганд представляет собой DVS.

Как сказано выше, в некоторых случаях данные активирующие лиганды могут дополнительно быть присоединены к полимеру, продлевая внешнее покрытие оксида металла.

Как показано в примере 5, данное активное вещество также может быть физически связано с внешней поверхностью данного оксида магнитного металла. В основе этой физической связи лежат нековалентные взаимодействия, например, гидрофобные связи, межионные взаимодействия и водородные связи, между данным активным веществом (веществами) и внешней поверхностью данного оксида магнитного металла.

Таким образом, в другом варианте осуществления данное активное вещество (вещества) в (b) физически связаны с внешней поверхностью данного оксида магнитного металла.

В соответствии с настоящим изобретением по меньшей мере одно активное вещество, связанное с внешней поверхностью оксида магнитного металла, может быть выбрано, без каких-либо ограничений, из пептида, пептидомиметика, полипептида или малой молекулы, как определено выше для активного вещества, ковалентно связанного с полимером. В одном варианте осуществления указанный пептид или пептидомиметик представляет собой пептид или пептидомиметик, содержащий циклический RGD (cRGD), предпочтительно cRGD-пептид с последовательностью SEQ ID NO:1, или пептид или пептидомиметик, содержащий ациклический RGD; указанный полипептид представляет собой цитокин, фермент, антитело, предпочтительно авастин или ремикад, или гормон, предпочтительно инсулин, обестатин или грелин; указанный цитокин выбран из фактора некроза опухоли (TNF)-α, TNF-β, TNF-родственного цитокина, отобранного из родственного TNF лиганда, индуцирующего апоптоз (TRAIL), TALL-1, TNF-подобного лиганда TL1A, лимфотоксина-бета (LT-β), лиганда CD30, лиганда CD27, лиганда CD40, лиганда OX40, лиганда 4-1BB, лиганда Apo-1, или лиганда Apo-3, предпочтительно TRAIL, или интерлейкина (IL), предпочтительно IL, имеющего противоопухолевую активность, более предпочтительно IL-12, IL-23 или IL-27; и указанная малая молекула выбрана из антифолатного лекарственного средства, такого как метотрексат, антибиотика, гормона аминного происхождения, противовоспалительного вещества, или химиотерапевтического вещества антрациклинового ряда, выбранного из даунорубицина, доксорубицина, эпирубицина, идарубицина или митоксантрона, предпочтителен доксорубицин.

Концентрации активного вещества (веществ), связанного либо ковалентно, либо физически, с поверхностью оксида магнитного металла, можно контролировать, изменяя параметры связывания, например, концентрацию активного вещества (веществ) в процессе.

В одном предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает наночастицы, согласно вышеприведенному определению, где указанный полимер представляет собой желатин, указанный оксид магнитного металла представляет собой оксид железа, указанное по меньшей мере одно активное вещество, ковалентно связанное с данным полимером, выбрано из (i) флуоресцентного красителя, предпочтительно из родамина или флуоресцеина; (ii) TNF или родственного TNF цитокина, предпочтительно TRAIL; (iii) химиотерапевтического вещества антрациклинового ряда, предпочтительно доксорубицина; (iv) антифолатного лекарственного средства, предпочтительно метотрексата; или (v) их комбинации, и указанное по меньшей мере одно активное вещество, связанное с внешней поверхностью оксида магнитного металла, выбрано из: (vi) TNF или родственного TNF цитокина, предпочтительно TRAIL; (vii) cRGD-пептида, предпочтительно cRGD-пептида с последовательностью SEQ ID NO:1; (viii) интерлейкина, имеющего противоопухолевую активность, предпочтительно IL-12; или (ix) их комбинации. В более предпочтительном варианте осуществления указанное по меньшей мере одно активное вещество, ковалентно связанное с данным полимером, представляет собой флуоресцентный краситель или TRAIL, и указанное по меньшей мере одно активное вещество, связанное с внешней поверхностью оксида магнитного металла, представляет собой TRAIL.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, включающую магнитные композитные наночастицы полимер/оксид металла, согласно вышеприведенному определению, и фармацевтически приемлемый носитель.

Данную фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно использовать для различных биологических, медицинских или терапевтических применений.

В одном варианте осуществления данную фармацевтическую композицию по настоящей заявке используют для диагностики, стабилизации лекарственного средства, доставки лекарственного средства и контролируемого высвобождения лекарственных средств.

В одном варианте осуществления данная фармацевтическая композиция по настоящему изобретению включает магнитные композитные наночастицы полимер/оксид металла, согласно вышеприведенному определению, предпочтительно композитные наночастицы желатин/оксид железа, где по меньшей мере одно активное вещество, ковалентно связанное с полимером, представляет собой флуоресцентный краситель. Эту фармацевтическую композицию можно использовать для обнаружения опухоли.

В одном варианте осуществления данная фармацевтическая композиция по настоящему изобретению включает магнитные композитные наночастицы полимер/оксид металла, согласно вышеприведенному определению предпочтительно композитные наночастицы желатин/оксид железа, где по меньшей мере одно активное вещество, ковалентно связанное с полимером, представляет собой контрастное вещество. Эту фармацевтическую композицию можно использовать для рентгеновской визуализации или магнитно-резонансной томографии (МРТ). Настоящее изобретение, таким образом, относится к способу рентгеновской визуализации или магнитно-резонансносной визуализации (МРТ), включающему введение в организм индивидуума, нуждающегося в таком исследовании, указанной фармацевтической композиции.

В предпочтительном варианте осуществления эта композиция может дополнительно содержать молекулу, способную связывать опухолеспецифический клеточный маркер, прикрепленную к внешней поверхности оксида магнитного металла. Эту композицию можно использовать для обнаружения опухоли. Настоящее изобретение, таким образом, относится к способу обнаружения опухоли, включающему введение в организм нуждающегося в этом индивидуума фармацевтической композиции, определенной выше.

Термин «молекула, обладающая способностью связывать опухолеспецифический клеточный маркер», используемый в настоящем описании, относится к антителам и их фрагментам, направленным против опухолеспецифических антигенов; рецепторам или их фрагментам, специфичным для опухолеспецифических лигандов; или лигандам опухолеспецифических рецепторов.

В следующем варианте осуществления данная фармацевтическая композиция по настоящему изобретению включает магнитные композитные наночастицы полимер/оксид металла, согласно вышеприведенному определению предпочтительно композитные наночастицы желатин/оксид железа, где по меньшей мере одно активное вещество, ковалентно связанное с данным полимером, и указанное по меньшей мере одно активное вещество связанное с внешней поверхностью оксида магнитного металла, являются одинаковыми или разными, выбраны из TNF-α, TNF-β, цитокина, родственного TNF, выбранного из родственного TNF лиганда, индуцирующего апоптоз (TRAIL), TALL-1, TNF-подобного лиганда TL1A, лимфотоксина-бета (LT-β), лиганда CD30, лиганда CD27, лиганда CD40, лиганда OX40, лиганда 4-1BB, лиганда Apo-1, или лиганда Apo-3, интерлейкина, имеющего противоопухолевую активность, отобранного из IL-12, IL-23 или IL-27, cRGD-пептида, предпочтительно cRGD-пептида с последовательностью SEQ ID NO:1, cRGD-пептидомиметика, пептида или пептидомиметика, содержащего RGD, антитела, предпочтительно авастина, химиотерапевтического вещества антрациклинового ряда, отобранного из даунорубицина, доксорубицина, эпирубицина, идарубицина или митоксантрона, антифолатного лекарственного средства, или их комбинации. В предпочтительном варианте осуществления указанное по меньшей мере одно активное вещество, ковалентно связанное с данным полимером, выбрано из TRAIL, доксорубицина, метотрексата или их комбинации, и указанное по меньшей мере одно активное вещество, связанное с внешней поверхностью оксида магнитного металла, выбрано из TRAIL, cRGD-пептида с последовательностью SEQ ID NO:1, IL-12, или их комбинации. Эту фармацевтическую композицию можно использовать для уменьшения или ингибирования роста опухоли или для уменьшения или ингибирования роста опухолевых клеток, оставшихся в организме пациента после удаления опухоли хирургическим путем. Настоящее изобретение, таким образом, относится к способу уменьшения или ингибирования роста опухоли, или уменьшения или ингибирования роста опухолевых клеток, оставшихся в организме пациента после удаления опухоли хирургическим путем, включающему введение в организм указанного пациента указанной фармацевтической композиции.

В еще одном варианте осуществления данная фармацевтическая композиция по настоящему изобретению включает магнитные композитные наночастицы полимер/оксид металла, согласно вышеприведенному определению, предпочтительно композитные наночастицы желатин/оксид железа, где по меньшей мере одно активное вещество, ковалентно связанное с данным полимером, представляет собой флуоресцентный краситель или контрастное вещество, и вышеуказанное по меньшей мере одно активное вещество, связанное с внешней поверхностью оксида магнитного металла, выбрано из TNF-α, TNF-β, цитокина, родственного TNT, отобранного из родственного TNF лиганда, индуцирующего апоптоз (TRAIL), TALL-1, TNF-подобного лиганда TL1A, лимфотоксина-бета (LT-β), лиганда CD30, лиганда CD27, лиганда CD40, лиганда OX40, лиганд4-1BB, лиганда Apo-1, или лиганда Apo-3, интерлейкина, имеющего противоопухолевую активность, выбранного из IL-12, IL-23 или IL-27, cRGD-пептида, предпочтительно cRGD-пептида с последовательностью SEQ ID NO:1, cRGD-пептидомиметика, пептида или пептидомиметика, содержащего RGD, антитела, предпочтительно авастина, химиотерапевтического вещества антрациклинового ряда, отобранного из даунорубицина, доксорубицина, эпирубицина, идарубицина или митоксантрона, антифолатного лекарственного средства, или их комбинации. В предпочтительном варианте осуществления указанное по меньшей мере одно активное вещество, связанное с внешней поверхностью оксида магнитного металла, выбрано из TRAIL, cRGD-пептида с последовательностью SEQ ID NO:1, IL-12, или их комбинации. Эту фармацевтическую композицию можно использовать для уменьшения или ингибирования роста опухоли и контролирования ее размера. Настоящее изобретение, таким образом, дополнительно относится к способу уменьшения или ингибирования роста опухоли и контролирования ее размера у пациента, включающему введение в организм указанного пациента вышеуказанной фармацевтической композиции.

Термин «опухоль», используемый в настоящем описании, относится к любой опухоли, таким как, но не ограничиваясь перечисленным, опухоли мозга, предпочтительно глиома, рак толстой кишки, рак легкого, рак молочной железы, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, рак почек, рак яичников, меланома, лейкемия или множественная миелома, предпочтительно глиома, и их метастазы. В предпочтительном варианте осуществления данная опухоль представляет собой глиому.

Опухоли мозга, в частности, злокачественные глиомы, относятся к наиболее агрессивным злокачественным новообразованиям человека. Пациенты со злокачественной глиомой имеют неблагоприятный прогноз, поскольку эти опухоли мозга слабо реагируют на облучение и химиотерапию, которые являются стандартным способом лечения злокачественных новообразований (Wei et al., 2006). Свойства, ответственные за агрессивный характер глиомы, включают быструю пролиферацию, диффузный рост и инвазию в отдаленные области мозга, в дополнение к обширному отеку мозга и интенсивному ангиогенезу. Средний срок дожития среди пациентов со злокачественными глиомами составляет менее одного года, среди пациентов встречаются случайные долгожители. Сложности дифференциации опухолевой и нормальной тканей мозга, и выдающаяся способность глиом инфильтрировать мозг, создают серьезную проблему в лечении глиомы и диагностике (Giese et al., 2003), и в настоящее время не ожидается, что дальнейшие достижения в области нейрохирургии, радиационной терапии или химиотерапии, смогут значительно улучшить прогноз для этих пациентов (Desjardins et al., 2005).

Кроме того, в современной клинической нейроонкологии, гистопатологический диагноз влияет на выбор метода лечения и оценку прогноза, сильнее, чем любой другой параметр. К сожалению, широкая гетерогенность астроцитарных опухолей делает их гистопатологическую классификацию достаточно затрудненной (Sanson et al., 2004). В настоящее время не существует специфических маркеров для глиобластом, и диагноз таких пациентов устанавливают, основываясь на гистопатологической оценке образцов опухоли. Более того, не существует маркеров для прогноза развития слабовыраженных астроцитом в глиобластомы. Таким образом, выявление глиомаспецифических маркеров может помочь в диагностике опухолей мозга и в определении прогноза и опухолевого прогрессирования слабовыраженных астроцитом.

Злокачественные глиомы, в том числе атипическая астроцитома и глиобластома полиморфная, представляют собой наиболее частые первичные опухоли мозга. Современные терапевтические решения включают хирургию, радиационную терапию и химиотерапию; однако прогноз остается чрезвычайно неблагоприятным и развитие альтернативных лечебных подходов, таким образом, является чрезвычайно ожидаемым. Генную терапию рассматривали как инновационный терапевтический подход в лечении злокачественных глиом, и в последнее десятилетие проявлялся большой интерес к разработке систем доставки, которые делают возможным экспрессию экзогенных генов в центральной нервной системе. Для этой цели были разработаны плазмида или вектор, кодирующий родственный фактору некроза опухоли лиганд, индуцирующий апоптоз (TRAIL), встроенный в катионные альбуминовые ноночастицы, липосомы и вирус простого герпеса (HSV) с дефицитом репликации (Shah et al, 2003; Van Meir and Bellail, 2004; Carlo-Stella et al., 2007; Wei Lu et al., 2006; Zhang et al., 2002). Тем не менее, не прошло ни одного убедительного клинического испытания, обеспечивающего объективное доказательство преимущества генной терапии по сравнению с традиционными способами лечения. Альтернативный генной терапии подход включает прямую доставку TRAIL внутрь опухоли. Этот подход, однако, представляет собой трудную задачу вследствие ограниченной стабильности TRAIL, а так же из-за его низкой биологической доступности, неспособности проникнуть через клеточные мембраны и слабой метаболической стабильности in vivo (Denicourt and Dowdy, 2004; Shir and Levitzki, 2001; Shah et al., 2003; WO 2004/045494).

Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления, опухоль является глиомой.

Данную фармацевтическую композицию по настоящему изобретению, когда она предназначена для уменьшения или ингибирования роста опухоли, либо с, либо без контроля ее размера, или для уменьшения или ингибирования роста опухолевых клеток, оставшихся у пациента после удаления опухоли хирургическим путем, можно использовать в комбинации с радиотерапией. Ввиду этого различные способы, определенные выше для (i) уменьшения или ингибирования роста опухоли; (ii) уменьшения или ингибирования роста опухолевых клеток, оставшихся у пациента после удаления опухоли хирургическим путем; или (iii) уменьшения или ингибирования роста опухоли и контроля ее размера, можно осуществить в комбинации с радиационной терапией.

Поскольку известно, что оксид железа притягивается в очаги воспаления, в еще одном варианте осуществления данная композиция по настоящему изобретению включает магнитные композитные наночастицы полимер/оксид металла, согласно вышеприведенному определению, где указанный оксид магнитного металла представляет собой оксид железа, указанное по меньшей мере одно активное вещество, ковалентно связанное с данным полимером, представляет собой флуоресцентный краситель или контрастное вещество, и указанное по меньшей мере одно активное вещество, связанное с внешней поверхностью оксида магнитного металла, представляет собой противовоспалительное средство. Эту фармацевтическую композицию можно использовать для обнаружения области воспаления и лечения указанного воспаления у индивидуума. Настоящее изобретение, таким образом, относится к способу обнаружения области воспаления и лечения указанного воспаления, включающему введение в организм индивидуума, нуждающегося в таком лечении, указанной фармацевтической композиции.

В другом варианте осуществления данная композиция по настоящему изобретению включает магнитные композитные наночастицы полимер/оксид металла, согласно вышеприведенному определению, предпочтительно композитные наночастицы желатин/оксид железа, где указанное по меньшей мере одно активное вещество, ковалентно связанное с данным полимером, и указанное по меньшей мере одно активное вещество, связанное с внешней поверхностью оксида магнитного металла, каждое независимо друг от друга, представляет собой инсулин. Эту фармацевтическую композицию можно использовать при лечении сахарного диабета 2 типа. Настоящее изобретение, таким образом, относится к способу лечения сахарного диабета 2 типа, включающему введение в организм нуждающегося в этом индивидуума указанной фармацевтической композиции.

В еще одном варианте осуществления данная композиция по настоящему изобретению включает магнитные композитные наночастицы полимер/оксид металла, согласно вышеприведенному определению, предпочтительно композитные наночастицы желатин/оксид железа, где указанное по меньшей мере одно активное вещество, ковалентно связанное с данным полимером, и указанное по меньшей мере одно активное вещество, связанное с внешней поверхностью оксида магнитного металла, каждое независимо друг от друга, представляет собой обестатин. Эту фармацевтическую композицию можно использовать при лечении ожирения. Настоящее изобретение, таким образом, относится к способу лечения ожирения, включающему введение в организм нуждающегося в этом индивидуума указанной фармацевтической композиции.

В следующем варианте осуществления данная композиция по настоящему изобретению включает магнитные композитные наночастицы полимер/оксид металла, согласно вышеприведенному определению, предпочтительно, композитные наночастицы желатин/оксид железа, где указанное по меньшей мере одно активное вещество, ковалентно связанное с данным полимером, и указанное по меньшей мере одно активное вещество, связанное с внешней поверхностью оксида магнитного металла, каждое независимо друг от друга, представляет собой грелин. Эту фармацевтическую композицию можно использовать при лечении анорексии. Настоящее изобретение, таким образом, относится к способу лечения анорексии, включающему введение в организм нуждающегося в этом индивидуума указанной фармацевтической композиции.

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к способу оценки восприимчивости опухолевых клеток к обработке кандидатным соединением, который включает взаимодействие клеток из биоптата, полученного из указанной опухоли, с магнитными композитными наночастицами полимер/оксид металла, согласно вышеприведенному определению, предпочтительно композитными наночастицами желатин/оксид железа, и контроль выживаемости опухолевых клеток, где данное активное вещество, связанное с внешней поверхностью оксида магнитного металла в данных наночастицах, является оцениваемым кандидатным соединением и выбрано из TNF-α, TNF-β, цитокина, родственного TNF, отобранного из родственного TNF лиганда, индуцирующего апоптоз (TRAIL), TALL-1, TNF-подобного лиганда TL1A, лимфотоксина-бета (LT-β), лиганда CD30, лиганда CD27, лиганда CD40, лиганда OX40, лиганда 4-1BB, лиганда Apo-1, или лиганда Apo-3, интерлейкина, имеющего противоопухолевую активность, выбранного из IL-12, IL-23 или IL-27, cRGD-пептида, предпочтительно cRGD-пептида с последовательностью SEQ ID NO:1, cRGD-пептидомиметика, пептида или пептидомиметика, содержащего RGD, антитела, предпочтительно авастина, химиотерапевтического вещества антрациклинового ряда, отобранного из даунорубицина, доксорубицина, эпирубицина, идарубицина или митоксантрона, антифолатного лекарственного средства, или их комбинации, и данные наночастицы включают флуоресцентный краситель или контрастное вещество, ковалентно связанное с данным полимером.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает наночастицы, состоящие из полимера, являющегося веществом, хелатирующим металл, покрытого оксидом магнитного металла, где по меньшей мере одно активное вещество, имеющее противоопухолевую активность, отобранное из пептида, пептидомиметика, полипептида или малой молекулы, связано с внешней поверхностью данного оксида магнитного металла.

Различные определения относительно размера наночастиц, имеющих противоопухолевое вещество, связанное исключительно с их внешней поверхностью, а также с полимером, хелатирующим металл, и оксидом магнитного металла, идентичны таковым, определенным относительно магнитных наночастиц, описанных выше, в которых по меньшей мере одно активное вещество ковалентно связано с данным полимером. Более того, и как определено относительно магнитных наночастиц, данное активное вещество, имеющее противоопухолевую активность, может быть либо ковалентно, либо физически связано с внешней поверхностью данного оксида магнитного металла.

Согласно вышеприведенному определению, данное вещество, имеющее противоопухолевую активность, может представлять собой пептид, пептидомиметик, полипептид или малую молекулу.

В одном варианте осуществления данное вещество, имеющее противоопухолевую активность, представляет собой пептид или пептидомиметик, такой как пептид или пептидомиметик, содержащий cRGD, или пептид или пептидомиметик, содержащий ациклический RGD. В предпочтительном варианте осуществления данный cRGD-пептид представляет собой cRGD-пептид с последовательностью SEQ ID NO:1.

В следующем варианте осуществления данное вещество, имеющее противоопухолевую активность, представляет собой полипептид, такой как цитокин, например, TNF-α, TNF-β; цитокин, родственный TNF, или интерлейкин. Неограничивающие примеры цитокинов, родственных TNF, включают родственный TNF лиганд, индуцирующий апоптоз (TRAIL), TALL-1, TNF-подобный лиганд TL1A, лимфотоксин-бета (LT-β), лиганды CD30, лиганды CD27, лиганды CD40, лиганды OX40, лиганды 4-1BB, лиганды Apo-1, и лиганды Apo-3. В предпочтительном варианте осуществления данный цитокин представляет собой TRAIL, IL-12, IL-23 или IL-27, более предпочтителен TRAIL.

В еще одном варианте осуществления данное вещество, имеющее противоопухолевую активность, представляет собой малую молекулу. Неограничивающие примеры малых молекул включают химиотерапевтические вещества антрациклинового ряда и антифорлатные лекарственные средства, согласно вышеприведенному определению, предпочтительно доксорубицин и метотрексат, соответственно.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает наночастицы, имеющие противоопухолевое вещество, связанное исключительно с их внешней поверхностью, где вышеуказанный пептид или пептидомиметик представляет собой пептид или пептидомиметик, содержащий cRGD, предпочтительно cRGD-пептид с последовательностью SEQ ID NO:1, или пептид или пептидомиметик, содержащие ациклический RGD; вышеуказанный полипептид представляет собой цитокин, выбранный из TNF-α, TNF-β, цитокина, родственного TNF, отобранного из родственного TNF лиганда, индуцирующего апоптоз (TRAIL), TNF-α, TNF-β, TALL-1, TNF-подобного лиганда TL1A, лимфотоксина-бета (LT-β), лиганда CD30, лиганда CD27, лиганда CD40, лиганда OX40, лиганда 4-1BB, лиганда Apo-1, или лиганда Apo-3, предпочтительно TRAIL, интерлейкин (IL), предпочтительно IL-12, IL-23 или IL-27, или антитело, предпочтительно авастин; указанная малая молекулы представляет собой атифолатное лекарственное средство, выбранное из метотрексата или химиотерапевтическое вещество антрациклинового ряда, отобранное из даунорубицина, доксорубицина, эпирубицина, идарубицина и митоксантрона, предпочтителен доксорубицин; или их комбинация. В предпочтительном варианте осуществления вышеуказанный полимер представляет собой желатин, вышеуказанный оксид магнитного металла представляет собой оксид железа, и вышеуказанное по меньшей мере одно вещество, имеющее противоопухолевую активность, представляет собой TNF или цитокин, родственный TNF, химиотерапевтическое вещество антрациклинового ряда, антифолатное лекарственное средство или их кобинацию. В наиболее предпочтительном варианте осуществления указанное по меньшей мере одно вещество, имеющее противоопухолевую активность, представляет собой TRAIL.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, включающую наночастицы, имеющие противоопухолевое вещество, связанное исключительно с их внешней поверхностью, согласно вышеприведенному определению, и фармацевтически приемлемый носитель, применяемую для уменьшения или ингибирования роста опухоли.

В предпочтительном варианте осуществления эта фармацевтическая композиция включает наночастицы, имеющие противоопухолевое вещество, связанное исключительно с их внешней поверхностью, где по меньшей мере одно вещество, имеющее противоопухолевую активность, представляет собой TRAIL, cRGD-пептид с последовательностью SEQ ID NO:1, IL-12, доксорубицин, метотрексат или их комбинацию.

Наночастицы, имеющие противоопухолевое вещество, связанное исключительно с их внешней поверхностью, согласно вышеприведенному определению, можно использовать для уменьшения или ингибирования роста опухоли или для уменьшения или ингибирования роста опухолевых клеток, оставшихся в организме пациента после удаления опухоли хирургическим путем. Настоящее изобретение, таким образом, дополнительно относится к способу уменьшения или ингибирования роста опухоли или для уменьшения или ингибирования роста опухолевых клеток, оставшихся в организме пациента после удаления опухоли хирургическим путем, включающему введение в организм указанного пациента вышеуказанной фармацевтической композиции. Согласно вышеприведенному определению эти наночастицы можно использовать в комбинации с радиотерапией. Таким образом, этот способ можно осуществлять в сочетании с радиотерапией.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу оценки чувствительности опухолевых клеток к обработке кандидатным соединением, который заключается в обеспечении контакта клеток биоптата, полученного из опухоли, с наночастицами, имеющими противоопухолевое вещество, связанное исключительно с их внешней поверхностью, согласно вышеприведенному определению, предпочтительно с композитными наночастицами желатин/оксид железа, имеющими противоопухолевое вещество, связанное исключительно с их внешней поверхностью, и контроле выживаемости опухолевых клеток, где данное противоопухолевое вещество, связанное с внешней поверхностью оксида магнитного металла в данных наночастицах, представляет собой оцениваемое кандидатное соединение.

Фармацевтическую копозицию, обеспеченную настоящим изобретением, можно приготовить, используя стандартные технологические приемы, например, как описано в Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Ed., 1995. Данная композиция может быть в твердой, полутвердой или жидкой форме и может дополнительно включать фармацевтически приемлемые наполнители, носители, или разбавители, или другие инертные ингредиенты и среды для лекарства. Более того, данная фармацевтическая композиция может быть создана для замедленного высвобождения данных наночастиц. Данную композицию можно принимать посредством любого пути введения, например, внутривенно, перорально, парентерально, ректально, чрескожно или местно. Дозировка зависит от состояния пациента и будет определена лечащим врачом.

Путь введения может представлять собой любой путь, посредством которого данное действующее соединение будет эффективно доставлено в соответствующее или желательное место приложения действия, предпочтителен внутривенный путь введения. Если твердый носитель используется для перорального применения, данная композиция может быть таблетированной, помещенной в твердую желатиновую капсулу в виде порошка или гранул, или она может быть в виде пастилки. Если используется жидкий носитель, данная композиция может быть в виде сиропа, эмульсии или мягкой желатиновой капсулы. Для перорально применения особенно целесообразными являются таблетки, драже или капсулы, имеющие тальковый и/или углеводный носитель или связующее вещество. Предпочтительные носители для таблеток, драже или капсул, включают лактозу, кукурузный крахмал и/или картофельный крахмал.

Согласно вышеприведенному определению, злокачественные глиомы являются наиболее распространенными первичными внутричерепными опухолями у пациентов. Прогноз этих опухолей неблагоприятен, поскольку они плохо реагируют на радиационную или химиотерапию. Трудности дифференциации опухолевой и нормальной мозговой тканей и исключительная способность глиом инфильтровывать мозг создают серьезную проблему в лечении глиомы и постановке диагноза.

TRAIL представляет собой трансмембранный белок, первично экспрессируемый на клеточной мембране, и впоследствии получаемый в результате протеолитического процессинга. Растворимый TRAIL (sTRAIL) может индуцировать апоптоз в опухолевых клетках различного происхождения, не затрагивая большинство нормальных клеток. Однако, несмотря на то, что большинство предыдущих исследований было проведено на клеточных культурах, доставка и эффективность sTRAIL in vivo в значительной степени менее разработана и успешна. Главным препятствием для лечения с помощь sTRAIL in vivo является его короткое время полужизни вследствие протеолитического расщепления, что соответственно требует избыточных количеств sTRAIL. Применение sTRAIL in vivo в частности является неэффективным для лечения глиомы из-за трудности введения TRAIL в мозг, и из-за относительной нечувствительности глиом к TRAIL in vivo.

Далее в примерах 6-8 подробно описаны различные in vitro и in vivo эксперименты, проведенные с магнитными композитными наночастицами желатин/оксид металла по настоящему изобретению, и в случае, когда по меньшей мере одно активное вещество ковалентно связано с полимером внутри наночастицы, и, при желании, это же или другое активное вещество было связано с внешней поверхностью оксида магнитного металла; а также, когда ни одно активное вещество не было ковалентно связано с данным полимером.

Как показано в этих примерах, конъюгирование TRAIL и с флуоресцентными, и с нефлуоресцентными композитными наночастицами желатин/оксид железа, значительно стабилизирует sTRAIL, доводя до минимума ферментативное расщепление данного sTRAIL, и, таким образом, уменьшая количество sTRAIL, необходимое для апоптоза опухолевых клеток. Этот подход делает возможной избирательную доставку sTRAIL в опухолевые клетки для эффективного апоптоза. Кроме того, конъюгированные с sTRAIL наночастицы селективно сопровождают клетки инфильтрирующей опухоли, оказывая цитотоксические действия in vivo, и значительно повышая выживаемость животных, имеющих опухоль. Опухолевые клетки, которые были невосприимчивы к цитотоксическому действию наночастиц, конъюгированных с sTRAIL, были сенсибилизированы, используя комбинированное лечение с помощью низкорадиоактивного γ-облучения с последующей обработкой наночастицами, конъюгированными с sTRAIL. Альтернативно, эти клетки были эффективно обработаны наночастицами, которые были конъюгированы более чем с одним активным веществом. Активными веществами, используемыми для этой цели, были sTRAIL, и другое противораковое лекарственное средство (средства), такие как cRGD-пептид, IL-12, cRGD-пептид и адриамицин. Эти вещества, в различных сочетаниях, были связаны либо с поверхностью оксида магнитного металла, с полимером внутри наночастицы, либо и с тем, и с другим.

В дополнение к лечебному применению эти наночастицы, конъюгированные с sTRAIL, служат в качестве маркера для визуализации опухоли посредством МРТ и/или флуоресценции. Используя эти методы визуализации в экспериментальных моделях на животных с имплантированными глиомными опухолями человека, было показано, что наночастицы, конъюгированные с sTRAIL, мигрируют в область опухолей и аккумулируются вокруг и внутри опухолей, в то время, как наночастицы без связи с sTRAIL мигрируют медленнее и аккумулируются только на периферии опухолевых клеток. Наночастицы, с которыми был конъюгирован sTRAIL, используют в качестве носителя для стабилизации sTRAIL, диагностики данной опухоли и содействия нацеливания на опухоль для индукции апоптоза. Используя наночастицы, в которых флуоресцентный краситель был связан с данным полимером, было дополнительно показано, что наночастицы, конъюгированные с sTRAIL, распознают и выявляют клетки инфильтрирующих опухолей. Способность наночастиц, конъюгированных с sTRAIL, специфически разпознавать клетки глиомы также можно использовать для определения границы опухолей в мозге и для различения рецидивирующих глиом и некроза, индуцированного радиацией. Дополнительно была продемонстрирована эффективность наночастиц, конъюгированных с sTRAIL, при распознавании и индуцировании апоптоза опухолевых клеток, отличных от глиом, например, карциномы, рака молочной железы и рака легких.

Настоящее изобретение далее будет проиллюстрировано следующими неограничивающими примерами.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Синтез и определение характеристик магнитных композитных наночастиц желатин/оксид железа

Магнитные композитные наночастицы желатин/оксид железа, размером приблизительно от 5 нм до 100 нм с узким распределением по размерам, были получены посредством образования активных центров, с последующим контролируемым наращиванием тонких слоев оксида магнитного металла на ядра желатин/оксид железа, как подробно описано в WO 99/062079. Данный этап образования активных центров основан на комплексообразовании ионов Fe²⁺ на хелатообразующих участках желатина, с последующим частичным окислением (приблизительно до 50%) хелатированного Fe²⁺ до Fe³⁺, с тем, чтобы растворимый в воде желатин содержал как хелатированные Fe²⁺, так и Fe³⁺ ионы. Ядра желатин/оксид железа затем были сформированы посредством добавления NaOH или, альтернативно, водного раствора аммиака, приблизительно до значения pH 9,5. Наращивание магнитных слоев на желатиновые ядра выполнялось посредством повторения несколько раз этапа образования активных центров.

Вкратце, наночастицы со средним сухим диаметром 15 нм были получены посредством добавления раствора FeCl₂ (10 ммоль/5 мл H₂O) к 80 мл водного раствора, содержащего 200 мг желатина (Sigma), с последующим добавлением раствора NaNO₂ (7 ммоль/5 мл H₂O). После 10 мин времени взаимодействия добавляли водный раствор NaOH (1 н.) до значения pH 9,5. Этот процесс повторяли четыре раза или более, если требовались более крупные наночастицы. Сформированные магнитные наночастицы затем отмывали с избытком реагентов, используя колонки с градиентом магнитного поля. Анализ поверхности выявил наличие желатина и внутри, и на поверхности данной наночастицы. Поверхностный желатин обеспечивает дополнительную стабилизацию против аггломерации наночастиц и функциональные групп, таких как карбоксилаты и первичные амины, посредством чего соответствующие лиганды могут быть ковалентно связаны. На фиг.1A-1D представлены изображения, полученные посредством трансмиссионной электронной микроскопии (ТЕМ) магнитных наночастиц с увеличенным средним диаметром, сформированных посредством повторения процесса нанесения магнитных слоев на этапе наращивания, от 4 до 7 раз, соответственно. На фиг.2 показано, что магнитные наночастицы с сухим средним диаметром 15 нм, полученные как описано в настоящем описании ранее, и диспергированные в воде, представляют собой одну тесную популяцию со средним гидродинамическим диаметром приблизительно 100 нм. На фиг.3A-3B представлены изображения, полученные посредством трансмиссионной электронной микроскопии с высоким разрешением (HTEM) (3A), демонстрирующие кристаллическую структуру с распределением в пространстве 0,479 нм, и изображение, полученное посредством структурной электронографии (ED) (3B), представляющее собой четкие кольца, отражающие кристаллический характер данных магнитных наночастиц. На фиг.4 представлена дифракционная рентгенограмма (XRD) магнитных композитных наночастиц желатин/оксид железа, указывающая на то, что кристаллические центры этих наночастиц состоят практически полностью из оксимагнетита (γ-Fe₂O₃). По распространению линии рентгеновского спектра получен средний диаметр данных магнитных центров, равный 15 нм. На фиг.5 изображен моссбауэровский спектр магнитных композитных наночастиц желатин/оксид железа, дополнительно показывающий, что эти наночастицы состоят из оксимагнетита. Считается, что магнетитовые (Fe₃O₄) наночастицы были изначально получены в результате этих процессов образования активного ядра и наращивания, а затем были окислены до более термодинамически стабильного оксида железа, оксимагнетита. На фиг.6 представлена петля магнитного гистерезиса оксимагнетитовых наночастиц с сухим диаметром 15 нм при комнатной температуре, показывающая, что кривая М(Н) этих наночастиц не проявляет никакой коэрцитивности и не насыщена при 10000 Ое, в то время, как магнитный момент, достигнутый при 10000 Ое, составляет приблизительно 41 ЭМЕ г^-1. Оба признака являются типичными для суперпарамагнитного поведения.

Однотипные магнитные композитные наночастицы желатин/оксид железа, с различными размерами и свойствами, были получены посредством изменения условий получения, например, окислительных реагентов, типа соли железа, рН и температуры, как ранее описано в WO 99/062079. Однотипные наночастицы с размером сухого диаметра менее 15 нм были получены посредством поэтапного растворения поверхности 15 нм наночастиц с использованием кислот, например HCl при значении рН приблизительно 1,0, или лигандов, хелатирующих железо, например ЭДТА и щавелевая кислота. После достижения требуемого диаметра данные магнитные наночастицы отмывали в дистиллированной воде.

Пример 2. Синтез магнитных композитных наночастиц желатин/оксид железа, меченных флуоресцентной меткой

Магнитные композитные наночастицы желатин/оксид железа, меченные флуоресцентной меткой, в которых данный флуоресцентный краситель, главным образом, находится внутри данных магнитных композитных наночастиц, были получены, как описано в примере 1, с заменой желатина на желатин, ковалентно связанный с флуоресцентной меткой, как показано на фиг.7. Например, меченные родамином наночастицы были получены посредством медленного добавления 0,5 мл диметилсульфоксида (ДМСО), содержащего 5 мг родаминизотиоцианата (RITC), к 20 мл водного раствора, содержащего 200 мг желатина. Значение pH данного водного раствора повышали до 9,5, добавляя водный раствор NaOH (1 н.), и данный раствор перемешивали встряхиванием в течение 1 ч при 60°C. Этот процесс включает ковалентное связывание, посредством тиомочевинных и/или тиоуретанных связей, между участком гидроксильной и аминной групп желатина и изотиоцианатом из RITC. Избыток RITC затем удаляли из желатина, конъюгированного с родаминовыми звеньями, посредством экстенсивного диализа (величина отсечки: 12-14000) вышеупомянутого раствора при 60°C против H₂O, или посредством отмывания через магнитную колонку. Объем данного раствора доводили до 80 мл и синтез затем продолжали, как описано в примере 1.

Схожие процессы осуществляли с другими подходящими красителями, например, с флуоресцеином.

Пример 3. Синтез магнитных композитных наночастиц желатин/оксид железа, содержащих лекарственное средство (средства)

Магнитные композитные наночастицы желатин/оксид железа, содержащие лекарственное средство, были получены, как описано в примере 1, с заменой желатина на желатин, ковалентно связанный с лекарственным средством. Например, адриамицин (Aldrich) был ковалентно связан с желатином посредством карбодиимидного метода активации, как описано у Melamed и Margel (2001). Вкратце, 123 мг NHS (N-гидроксисукцинимид, Sigma) и 82 мг CDC (1-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил) карбодиимид мето-п-толуолсульфонат, Sigma) добавляли к 20 мл буфера MES (0,01 м при значении pH 5,0, Sigma), содержащего 200 мг желатина и 5 мг адриамицина, и данный раствор затем перемешивали встряхиванием в течение 2 ч при 60°C. Данный раствор отмывали от излишка реагентов посредством диализа (величина отсечки: 12-14000) против воды. Объем данного раствора доводили до 80 мл и синтез продолжали, как описано в примере 1.

В аналогичном процессе были получены магнитные композитные наночастицы желатин/оксид железа, в которых метотрексат и/или sTRAIL, по отдельности или в комбинации, был/были ковалентно связаны с желатином.

Пример 4. Функционализация магнитных композитных наночастиц желатин/оксид железа

Различные способы образования функциональных групп на поверхности магнитных композитных наночастиц желатин/оксид железа, полученных как описано в примерах 1-3, были разработаны, на основе различных принципов действия, таких как (i) высокая аффинность покрывающего полимера, например, декстрана, к поверхности наночастицы; (ii) ковалентное связывание между функциональными группами на поверхности наночастиц и требуемым функциональным лигандом, например, аминолиганды, такие как белки с активированными двойными связями на поверхности наночастиц, посредством реакции Майкла, или с карбоксильными группами (относящихся к желатиновому слою) посредством карбодиимидного метода активации, как описано у Melamed и Margel (2001); и (iii) преципитация покрывающего полимера, например, желатина или альбумина, на поверхности наночастицы. Данные функциональные группы на поверхности наночастиц затем использовали для ковалентной или физической связи различных лекарственных средств, например, TRAIL и cRGD-пептида, посредством различных активационных методов.

4(i) Функционализация с активированными двойными связями

Дивинилсульфон (DVS) был добавлен к магнитным композитным наночастицам желатин/оксид железа, полученным, как описано в примерах 1-3, где изначально массовое соотношение [DVS]/[наночастицы] было 4/1, и затем был добавлен триэтиламин, чтобы достичь значение рН 10,5, с последующим инкубированием при 60°C в течение ночи. Образовавшиеся функционализированные наночастицы желатин/оксид железа-DVS, или наночастицы желатин/оксид железа-DVS, меченные флуоресцентным красителем, затем отмывали с помощью 0,1 М бикарбонатного буфера (pH 8,3) через колонки с градиентом магнитного поля, и хранили при 4°C.

4(ii) Функционализация со сшитым декстрановым покрытием, содержащим активированные двойные связи

2% (мас./об.) декстран (MW 48000, Sigma) добавляли в водную дисперсию магнитных композитных наночастиц желатин/оксид железа, полученную как описано в примерах 1-3, и после растворения декстрана, данную водную дисперсию перемешивали встряхиванием в течение 3 ч при 85°C. Наночастицы с декстрановым покрытием отмывали от избытка декстрана водой посредством магнитных колонок. Образование поперечных связей в декстране было осуществлено с помощью DVS, как описано выше в 4(i), для предотвращения утечки физически абсорбированного декстрана в водную диспергирующую среду и для образования поверхностных активированных двойных связей.

4(iii) Функционализация желатинового или альбуминового покрытия в отсутствии или присутствии активированных двойных связей

0,2% (мас./об.) желатин добавляли в водную дисперсию магнитных композитных наночастиц желатин/оксид железа, полученную как описано в примерах 1-3, и данную водную дисперсию затем перемешивали встряхиванием в течение 3 ч при 85°C. Данную водную дисперсию остужали при комнатной температуре, и затем наночастицы с желатиновым покрытием отмывали посредством магнитных колонок. Получение производных DVS было осуществлено, при необходимости, как описано выше в 4(i).

Альбуминовое покрытие наночастиц было осуществлено аналогичным образом с заменой желатина на бычий или человеческий сывороточный альбумин.

Пример 5. Иммобилизация лекарственных средств на функциональных магнитных композитных наночастицах желатин/оксид железа

5(i) Иммобилизация человеческого TRAIL или IL12 на магнитных композитных наночастицах желатин/оксид железа-DVS

20 мкг TRAIL человека (hTRAIL, CytoLab Ltd., Israel) добавляли к 1 мл дисперсии бикарбонатного буфера (0,1 M, pH 8,3), содержащего 1 мг магнитных композитных наночастиц желатин/оксид железа, полученных, как описано в примере 4, и данную дисперсию затем перемешивали при комнатной температуре в течение 60 мин. Этот процесс включает связывание, посредством реакции Майкла, остаточных двойных связей данных наночастиц и первичных аминогрупп данного TRAIL. Затем проводили блокирование остаточных активированных двойных связей с использованием глицина, посредством добавления глицина (1% мас./об.) и продолжительного перемешивания данной дисперсии в течение дополнительных 60 мин при комнатной температуре. Избыток несвязавшегося hTRAIL и глицина удаляли с помощью PBS (pH 7,4) посредством колонок с градиентом магнитного поля. Концентрация связанного hTRAIL, определенная посредством набора ELISA Development Kit (900-K141 lot no. 11041410, CytoLab Ltd., Israel), составляла приблизительно 2000 нг/мг наночастиц.

IL12 был связан с магнитными композитными наночастицами желатин/оксид железа-DVS аналогичным образом, с заменой hTRAIL на IL12.

5(ii) Иммобилизация cRGD-пептида на магнитных композитных наночастицах желатин/оксид железа-DVS

Эксперимент, описанный выше в 5(i) был повторен с заменой 20 мкг hTRAIL на 3 мг cRGD-пептида с последовательностью цикло(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys) (SEQ ID NO:1) (Peptides International, Louisville, KY 40224 USA). Для отрицательного контроля был осуществлен схожий процесс с заменой cRGD-пептида на cRAD-пептид с последовательностью цикло(Arg-Ala-Asp-D-Phe-Lys) (Peptides International).

5(iii) Иммобилизация hTRAIL и cRGD-пептида на магнитных композитных наночастицах желатин/оксид железа-DVS

Эксперимент, описанный выше в 5(i), был повторен с заменой глицина на 3 мг cRGD-пептида, и вследствие этого, оставшиеся остаточные активированные двойные связи в DVS были конъюгированы с cRGD-пептидом.

5(iv) Иммобилизация биоактивных реагентов, например, hTRAIL и/или cRGD-пептида, на композитных частицах желатин/оксид железа

Человеческий TRAIL и/или cRGD-пептид были ковалентно связаны с композитными наночастицами желатин/оксид железа, полученными в соответствии с примерами 1-3 и примером 4(iii), посредством карбодиимидного активационного метода, как описано у Melamed и Margel (2001). Вкратце, 123 мг NHS и 82 мг CDC были добавлены к 20 мл буфера MES (0,01 M при pH 5,0, Sigma), содержащего 200 мг наночастиц, и эту дисперсию наночастиц затем перемешивали встряхиванием при комнатной температуре в течение 3 ч. Данные активированные наночастицы тщательно отмывали с PBS посредством колонок с градиентом магнитного поля, и затем добавляли 5 мл раствора PBS, содержащего 8 мг hTRAIL или 50 мг cRGD-пептида, к 20 мл дисперсии отмытых активированных наночастиц. Данную суспензию перемешивали встряхиванием при комнатной температуре в течение приблизительно 8 ч, и блокирование остаточных активированных групп затем выполняли либо с помощью глицина (200 мг), либо cRGD-пептида (50 мг), как описано в 5(i) или 5(iii), соответственно.

5(v) Иммобилизация Авастина или Ремикада на магнитных композитных наночастицах желатин/оксид железа-DVS

20 мкг моноклональных антител Авастин (Bevacizumab, Genentech) или Ремикад (Infliximab) добавляли к 1 мл дисперсии бикарбонатного буфера (0,1 M, pH 8,3), содержащей 1 мг магнитных композитных наночастиц желатин/оксид железа, полученных как описано в примере 4, и данную дисперсию затем перемешивали встряхиванием при комнатной температуре в течение 60 мин. Этот процесс включает связывание, посредством реакции Майкла, остаточных двойных связей данных наночастиц и первичных аминогрупп Авастина или Ремикада. Блокирование остаточных активированных двойных связей затем осуществляли с помощью глицина, добавляя глицин (1% мас./об.) и продолжая перемешивание данной дисперсии при комнатной температуре в течение дополнительных 60 мин. Избыток несвязавшегося Авастина или Ремикада был удален с помощью PBS (pH 7,4) посредством колонок с градиентом магнитного поля.

5(vi) Физическая иммобилизация биоактивных реагентов, например, hTRAIL, на магнитных композитных наночастицах желатин/оксид железа

20 мкг человеческого TRAIL (hTRAIL, CytoLab Ltd., Israel) добавляли к 1 мл дисперсии бикарбонатного или PBS буфера (0,1 M, pH 8,3), содержащего 1 мг нефункционализированных магнитных композитных наночастиц желатин/оксид железа, полученных как описано в примере 3, или магнитных композитных наночастиц желатин/оксид железа с альбуминовым покрытием, полученных как описано в примере 4(iii). Данную дисперсию затем перемешивали при комнатной температуре в течение 120 мин, и вследствие этого данный hTRAIL был нековалентно связан с наночастицами без покрытия, или наночастицами с альбуминовым покрытием. Это физическое связывание основано на нековалентных взаимодействиях, например, гидрофобных связях, межионных взаимодействиях и водородных связях, между данным TRAIL и данными наночаститцами. Избыток несвязавшегося hTRAIL удаляли с использованием PBS (pH 7,4), посредством колонок с градиентом магнитного поля.

5(vii) Иммобилизация человеческого TRAIL на магнитных композитных наночастицах желатин/оксид железа

Человеческий sTRAIL был связан непосредственно с наночастицами желатин/оксид железа, посредством карбодиимидного активационного метода, как описано у Melamed и Margel (2001). В стандартном эксперименте, 123 мг NHS и 82 мг CDC добавляли к 15 мл буфера MES (0,1 M при pH 5,0), содержащего 10 мг наночастиц. Эту смесь наночастиц затем перемешивали встряхиванием при комнатной температуре в течение приблизительно 3 ч. Данные активированные наночастицы отмывали посредством колонок с градиентом магнитного поля. Раствор PBS (2 мл), содержащий 0,5 мг sTRAIL, затем добавляли к 8 мл дисперсии PBS с отмытыми активированными наночастицами. Данную дисперсию затем перемешивали встряхиванием при комнатной температуре приблизительно в течение 2 ч. Блокирование остаточных активированных двойных связей затем осуществляли с глицином или первичным амино полиэтиленгликолем, добавляя глицин (1% мас./об.) (или первичный аминополиэтиленгликоль, 5 мг), и продолжая перемешивание данной дисперсии в течение дополнительных 60 мин при комнатной температуре. Избыток несвязавшегося hTRAIL и глицина (или аминополиэтиленгликоля) удаляли с помощью PBS (pH 7,4) посредством колонок с градиентом магнитного поля.

Концентрации связанных биоактивных реагентов, описанных в пунктах с 5(i) по 5(vi), контролировали посредством изменения параметров связывания, например, концентрации hTRAIL.

Пример 6. Исследования in vitro: выявление, визуализация и апоптоз клеток глиомы

Материалы и методы

Клеточные линии. Все клетки, использованные в следующих экспериментах, были получены из Американской коллекции типовых культур (ATCC), или из Центра опухолей мозга Hermelin (Henry Ford Hospital, Detroit, MI). Все клетки были культивированы в среде DMEM, дополненной 10% FBS (Hyclone, Logan, UT), 2 мМ L-глютамина и 100 мкг/мл стрептомицин-пенициллина (Invitrogen), при 37°C в условиях 5% CO₂.

Оценка клеточного апоптоза. Клеточный апоптоз оценивали, используя окрашивание пропидиум йодидом (PI) и анализируя посредством проточной цитометрии, как описано у Riccardi и Nicoletti (2006), а также посредством ELISA (набор Cell Death Detection ELISA Kit), используя антитела к гистонам, как описано у Blass et al. (2002). Клетки (10⁶/мл) наносили на шестилуночные планшеты при 37°C и подвергали обработке указанными способами (добавление 10 мкл или менее забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS), или PBS, содержащего пептид, например, TRAIL, или наночастицы, несвязанные, или связанные с пептидом) в течение 24 ч. Отслоившиеся и трипсинизированные прилипающие клетки объединяли, фиксировали в 70% этаноле в течение 1 ч на льду, отмывали с использованием PBS и обрабатывали в течение 15 мин с помощью RNase (50 мкМ) при комнатной температуре. Затем клетки окрашивали PI (5 мкг/мл) и анализировали посредством клеточного сортера Becton-Dickinson.

Жизнеспособность клеток дополнительно определяли количественно, посредством измерения высвобождения цитоплазматического фермента лактатдегидрогеназы (LDH) из погибших клеток в среду (набор приобретен у фирмы Sigma). Для этой цели супернатанты собирали из контрольных и обработанных клеток и, после центрифугирования (10 мин 1400×g), супернатанты переносили в 96-луночные планшеты и LDH измеряли, согласно инструкциям фирмы-изготовителя.

6(i) Стабилизация TRAIL посредством конъюгирования с магнитными композитными наночастицами желатин/оксид железа

Для изучения стабильности несвязанного и конъюгированного TRAIL против деградации, 1 мл PBS, содержащего либо несвязанный TRAIL (100 нг), либо конъюгированные с TRAIL магнитные композитные наночастицы желатин/оксид железа (NP-TRAIL, 100 нг TRAIL), инкубировали при 10°C, и концентрацию TRAIL измеряли в течение 35 дней. На фиг.8 показано, что конъюгирование TRAIL с наночастицами стабилизировало TRAIL, таким образом, изначальная концентрация TRAIL поддерживалась до 35 дней при 10°C. В отличие от этого несвязанный TRAIL значительно деградировал в этих условиях.

6(ii) Конъюгированные с TRAIL магнитные композитные наночастицы желатин/оксид железа индуцируют апоптоз в клетках глиомы человека и в глиомных сфероидах, развившихся из первичных опухолей

Клетки глиомы человека A172 инкубировали либо с TRAIL (100 нг/мл), либо с NP-TRAIL (10 нг TRAIL/мл) в течение 5 часов. Клеточный апоптоз определяли с помощью окрашивания пропидиумом йодидом и анализа и посредством проточной цитометрии (FACS), и по морфологическим признакам данных клеток. На фиг.9 показано, что несвязанный TRAIL индуцировал апоптоз приблизительно 48% клеток, в то время как NP-TRIAL индуцировали апоптоз в 57% клеток и наночастицы по отдельности не индуцировали значительного апоптоза клеток. Другими словами, апоптотическая активность, индуцированная конъюгированным TRAIL была по меньшей мере в 10 раз выше, чем индуцированная несвязанным.

Апоптотический эффект несвязанного TRAIL (100 нг/мл) и NP-TRAIL (10 нг TRAIL/мл) был дополнительно протестирован, используя глиомные сфероиды, происходящие из трех различных опухолей, а именно: HF2020, HF1254 и HF1308. Эти культуры более напоминают исходные опухоли, поскольку они поддерживают свои трехмерные структуры и клеточно-клеточные взаимодействие. Как обнаружено, глиомные сфероиды, происходящие из HF2020, показаны на фиг.9В, и HF1308, подвержены апоптозу в ответ на TRAIL или NP-TRAIL, в то время как HF1254 испытывает только низкую степень апоптоза клеток. В частности, как показано на фиг.9В и фиг.10, и TRAIL, и NP-TRAIL значительно повышают уровень LDH в глиомных сфероидах HF2020 и HF1308.

6(iii) Цитотоксический эффект несвязанного TRAIL и конъюгированных с TRAIL магнитных композитных наночастиц желатин/оксид железа, в различных клеточных линиях глиомы и первичных культурах глиом

Глиомные клетки U87, A172 и U251, а также первичные культуры клеток глиомы HF1308, HF1254 и HF1316 инкубировали с TRAIL (100 нг/мл), NP-TRAIL (10 нг TRAIL/мл) или только с магнитными композитными наночастицами желатин/оксид железа в течение 24 ч. Затем эти клетки собирали, окрашивали пропидиумом йодидом и анализировали на предмет суб-G₀ популяции (апоптотические клетки), посредством анализа FACS. На фиг.11 показано, что во всех случаях цитотоксический эффект NP в чистом виде не отличается от эффекта, оказываемого PBS, и что NP-TRAIL проявляют значительно более сильную цитотоксическую активность, чем свободный TRAIL.

6(iv) Цитотоксическое действие конъюгированных с TRAIL нефлуоресцентных и флуоресцентно меченных магнитных композитных наночастиц желатин/оксид железа на различные глиомные клетки

Глиомные клетки человека A172 инкубировали в течение 5 ч. с нефлуоресцентными наночастицами (NP-Контроль), NP-TRAIL (10 нг TRAIL/мл), меченными родамином магнитными композитными наночастицами желатин/оксид железа (NPR) и с конъюгированными с TRAIL меченными родамином магнитными композитными наночастицами желатин/оксид железа (NPR-TRAIL, 10 нг TRAIL/мл). Апоптоз определяли, используя окрашивание пропидиумом йодидом и анализ FACS. Как показано на фиг.12, апоптоз, индуцированный посредством NPR-TRAIL (51%) был схож с тем, который был индуцирован посредством NP-TRAIL (45%). Подобные результаты наблюдали также для других глиомных клеток, например U251 и U87. Эти результаты показывают, что конъюгированные с TRAIL флуоресцентно меченные наночастицы индуцируют апоптоз глиомных клеток схожим с их нефлуоресцентными аналогами образом и приблизительно в 10 раз сильнее, чем несвязанный TRAIL.

6(v) Специфическая интернализация флуоресцентно меченных конъюгированных с TRAIL магнитных композитных наночастиц желатин/оксид железа, глиомными клетками

Специфичность NP-TRAIL для глиомных клеток по сравнению с нормальными астроцитами была исследована с помощью NPR-TRAIL. В частности, глиомные клетки человека A172 и нормальные астроциты человека инкубировали с NPR-TRAIL (10 нг TRAIL/мл) в течение 30 мин, и эти клетки были изучены и получены их изображения посредством конфокальной микроскопии. Как показано на фиг.13, NPR-TRAIL проникал в клетки A172 за 30 мин обработки, и накапливался в области ЭР/комплекс Гольджи, в то время как в нормальных клетках наблюдали очень слабую флуоресценцию. Аналогично, NPR, которые не были конъюгированы с TRAIL, не проникали в клетки обоих клеточных типов (данные не показаны). Эти результаты свидетельствуют о том, что NPR-TRAIL, возможно, проникает в глиомные клетки посредством интернализации с последующим связыванием с рецепторами TRAIL, и они могут иметь важное значение для способности конъюгированных с TRAIL наночастиц доставлять лекарственные средства внутрь данных клеток.

6(vi) Синергетическое действие γ-облучения и конъюгированных с TRAIL магнитных композитных наночастиц желатин/оксид железа

Несмотря на то, что NP-TRAIL индуцировали апоптоз во многих клеточных линиях глиомы, существуют некоторые глиомные клетки, которые являются невосприимчивыми к этой обработке. Таким образом, поскольку сообщалось, что γ-облучение повышает чувствительность опухолевых клеток к TRAIL, увеличивая экспрессию рецепторов к TRAIL, был изучен эффект комбинированной обработки с использованием NP-TRAIL и γ-облучения на апоптоз глиомных клеток. В частности, использовали клетки A172 и U251, которые были чувствительны к TRAIL, а также клетки U87, которые проявляют слабую реакцию на TRAIL и клетки LN-18, которые устойчивы к обработке TRAIL, и применяли субоптимальные концентрации NP-TRAIL (5 нг TRAIL/мл) и γ-облучение (10 Гр). Клетки обрабатывали только NP, NP-TRAIL (5 нг TRAIL/мл), γ-облучением (10 Гр) или комбинацией NP-TRAIL (5 нг TRAIL/мл) и γ-облучения (10 Гр). Для данной комбинированной обработки клетки сначала облучали, а затем через 2 часа обрабатывали NP в чистом виде или NP-TRAIL. Клеточный апоптоз определяли через 24 часа. На фиг.14 показано, что апоптоз, индуцированный в результате данной комбинированной обработки, был значительно повышен, и что добавление низких доз γ-облучения преодолевает устойчивость некоторых глиомных клеток к NP-TRAIL.

6(vii) Конъюгированные с cRGD-пептидом магнитные композитные наночастицы желатин/оксид железа индуцируют аутофагию в глиомных клетках

Другой тип клеточной гибели, индуцированный в клетках глиомы, представляет собой клеточную гибель II типа, или аутофагию, как описано у Gozuacik и Kimchi (2004). Для описания аутофагии клетки трансфецировали плазмидой LC3-GFP и исследовали накопление аутофагической вакуолизации. Как обнаружено, в то время, как в контрольных клетках LC3-GFP обнаруживали в клетках везде, в аутофагических клетках наблюдали неравномерное окрашивание. Принимая это во внимание, был исследован характер LC3-GFP в контрольных клетках, обработанных NP в чистом виде, и клетках, обработанных конъюгированными с cRGD-пептидом магнитными композитными наночастицами желатин/оксид железа (NP-cRGD). Для этой цели клетки U251 трансфецировали с LC3-GFP в течение 24 ч, и данные клетки обрабатывали cRGD-пептидом (10 мкг/мл), NP в чистом виде или NP-cRGD (приблизительно 4 мкг cRGD/мл) в течение дополнительных 24 часов, а затем подсчитывали процентное содержание клеток с неравномерным окрашиванием GFP. Как показано на фиг.15, приблизительно 24 ч, приблизительно 30% клеток, обработанных cRGD и приблизительно 18% клеток, обработанных с NP-cRGD, проявляли неравномерный характер LC3-GFP. В противоположность этому только 2-3% контрольных или обработанных NP в чистом виде клеток проявляли неравномерное окрашивание.

6(viii) Синергетическое действие TRAIL и конъюгированных с cRGD-пептидом магнитных композитных наночастиц желатин/оксид железа

В этом эксперименте клетки LN-18, которые были невосприимчивы к обработке TRAIL, инкубировали в течение 24 ч с NP-TRAIL, TRAIL и конъюгированными с cRGD-пептидом наночастицами (полученными, как описано в примере 5(iii)) или TRAIL, содержащим адриамицин, и наночастицами, конъюгированными с cRGD-пептидом (полученными, как описано в примерах 3 и 5(iii)). Синергетическое действие дополнительных лекарственных средств (cRGD-пептида и адриамицина) было продемонстрировано значительным увеличением процента апоптоза, который составлял около 8% для NP-TRAIL, около 25% для TRAIL и конъюгированных с cRGD пептидом наночастиц, и 45% для TRAIL, содержащего адриамицин, и наночастиц, конъюгированных с cRGD-пептидом.

6(ix) Действие конъюгированных с TRAIL магнитных композитных наночастиц желатин/оксид железа на апоптоз различных опухолевых клеток

В этом эксперименте действие NP-TRAIL на опухолевые клетки, отличные от глиомы, было исследовано с использованием клеточной линии карциномы шейки матки HeLa, клеточной линии рака молочной железы MCF-7 и клеток рака легких A549. На фиг.16 представлено апоптотическое действие TRAIL (100 нг/мл), NP-TRAIL (50 нг TRAIL/мл), NP в чистом виде или PBS (контроль), после инкубирования в течение 5 ч. Как показано, в то время как оба PBS и NP имели незначительное апоптотическое действие, NP-TRAIL индуцировали значительный апоптоз, который по меньшей мере в два раза превышал таковой, индуцированный посредством TRAIL, свидетельствуя о том, что конъюгирование TRAIL с наночастицами поддерживает его апоптотический эффект и даже повышает его по отношению к различным раковым клеткам. Клеточный апоптоз измеряли посредством окрашивания пропидиумом йодидом (PI) и анализа проточной цитофлуметрией.

6(x) Синергетическое действие γ-облучения и конъюгированных с TRAIL магнитных композитных наночастиц желатин/оксид железа на сфероиды глиомы стволовых клеток человека

Глиомы стволовых клеток были образованы из опухолевых образцов 2355 и 2303, их выращивали в виде сфероидов и поддерживали в культуре в течение двух месяцев. Данные глиомы стволовых клеток проявляли самообновление и дифференцировку на поли-L-лизине в астроциты, нейроны и олигодендроциты. Для исследования действия NP и NP-TRAIL на эти клетки, сфероиды были помещены в 6-луночный планшет и обработаны с TRAIL (100 нг/мл), NP в чистом виде или NP-TRAIL (50 нг TRAIL/мл) в течение 24 ч. Затем собирали супернатанты и проводили анализ LDH.

Для оценки комбинированного эффекта γ-облучения и TRAIL, эти клетки сначала облучали дозой радиации 5 Гр, а через 4 часа обрабатывали либо TRAIL, либо NP-TRAIL в течение дополнительных 24 ч. Клеточную гибель определяли, используя уровни LDH в культуральных супернатантах. Апоптотический эффект, индуцированный в результате различных обработок, был схожим в обеих линиях глиомы стволовых клеток, и представлен на фиг.17А-17В. Незначительный апопототический эффект наблюдали при обработке NP в чистом виде, только γ-облучением или несвязанным TRAIL. NP-TRAIL индуцировали умеренный апоптотический эффект; однако и NP-TRAIL, и несвязанный TRAIL, вместе с γ-облучением, индуцировали значительный апоптоз.

6(xi) Конъюгированные с IL-12 магнитные композитные наночастицы желатин/оксид железа индуцируют апоптоз в клетках рака яичников человека

Клетки рака яичников обрабатывали только средой, IL-12 (50 нг/мл), NP (50 мкг/мл) или конъюгированными с IL-12 магнитными композитными наночастицами желатин/оксид железа (NP-IL-12, 50 нг IL-12/мл), инкубировали в течение 24 ч и затем проводили анализ клеточной гибели, используя анализ LDH. Как показано на фиг.18, и IL-12, и NP-IL-12 индуцировали клеточную гибель в культивированных клетках, что дополнительно отражено на клеточной морфологии.

Пример 7. Исследования in vivo: выявление, визуализация и апоптоз глиомных клеток

Материалы и методы

Клеточные линии и животные. Клетки U251 были получены из ATCC (Manassas, Va.), или из Центра Опухолей Мозга Hermelin (Hemy Ford Hospital, Detroit, MI). Все клетки были культивированы в среде DMEM, дополненной 10% FBS (Hyclone, Logan, UT), 2 мМ L-глютамином, и 100 мкг/мл стрептомицин-пенициллином (Invitrogen), при 37°C в условиях 5% CO₂. Самки крыс Nu/Nu были получены от NCI Fredericks (Fort Detricks, MD). Все крысы были в возрасте 6-8 недель в момент имплантации опухоли.

Имплантация опухоли и применение наночастиц. Перед использованием крысы проходили акклиматизацию в течение недели после поступления. Перед имплантацией опухолевых клеток, животным проводили анестезию и подготавливали к стерильной хирургической операции. На скальпе делали разрез длинной 1 см и использовали иглу размера 26, для осторожного прокалывания посредством вращения, и получения отверстия в скальпе размером 2 мм справа и 2 мм дорсальнее от срединной линии. Затем животное помещали в стереотоксическое устройство (Kopf, Tujunga, CA), оборудованное и микроманипулятором, и держателем для шприца. Иглу продвигали на 3 мм ниже в предварительно проделанном отверстии, поднимали на 0,5 мм, и объем опухоли (5 мкл) медленно вводили в течение 2,5 мин. Иглу оставляли на месте в течение 1 мин, а затем медленно вынимали в течение 1 мин. Животное удаляли из стереотоксического устройства, отверстие плотно запечатывали с помощью воска для кости, скальп зашивали и наблюдали за восстановлением животного. На 4, 7 или 10 день после имплантации опухоли, PBS (10 мкл) с или без контрольных наночастиц (0,05 мг), конъюгированные с TRAIL наночастицы (100 нг конъюгированного TRAIL на 0,05 мг наночастиц) или несвязанный TRAIL (100, 200 или 800 нг), были имплантированы таким же образом в ипсилатеральное или контрлатеральное полушарие. Либо в определенные моменты времени, либо при признаках заболеваемости, осуществляли стандартную перфузию физиологическим раствором с 10% формалина. Извлекали головной мозг и помещали в 10% нейтральный буференный формалин на ночь для дальнейшей обработки. Для визуализации флуоресцентно меченных опухолей и наночастиц, в выбранные моменты времени осуществляли стандартную перфузию физиологическим раствором. Мозг удаляли и моментально замораживали для изготовления срезов, используя криостат, для дальнейшей визуализации.

Гистохимия, иммуногистохимия, визуализация наночастиц и выявление апоптоза. Зафиксированные формалином ткани вдавливали с фиксацией в парафин, делали срезы (5 мкм) и окрашивали гематотоксилином и эозином (H&E) для гистоморфологической оценки. Гематоксилин окрашивает в голубой цвет ядра, кислотные участки цитоплазмы и хрящевую основу. Эозин окрашивает в розовый цвет щелочные области цитоплазмы и коллагеновые волокна (Gartner and Hiatt, 2001). Срезы толщиной 5 мкм высушивали в печи при 60°C в течение 1 ч, и стандартным образом проводили депарафинизацию с ddH₂O. Для выявления клеток человека, срезы инкубировали с митохондриальными антитела человека в разведении 1:250 (Chemicon, cat#H10060). Иммуногистохимический анализ осуществляли, используя краситель Biocare Medical Nemesis 7200 (Concord, CA) и реагенты. Срезы были блокированы с использованием реагента Biocare Sniper в течение 7 минут, и инкубированы с первичными антителами и разбавителем Biocare в течение 60 мин. После ополаскивания буфером эти среды были блокированы с использованием авидина биотина в течение 15 мин. После прополаскивания, антигены определяли используя универсальное сочленение, с последующим HP (Biocare) и Betazoid DAB. После ополаскивания буфером проводили ополаскивание dH₂O и докрашивание с помощью CAT Гематоксилин в течение 10 секунд. Контрольные срезы обрабатывали без первичных антител.

Реакцию окрашивания по Гомори с железом (Sheehan and Hrapchak, 1980) для визуализации наночастиц (голубой цвет), проводили с использованием 5 мкм срезов формалинзафиксированной вдавленной в парафин ткани. Срезы размером 5 мкм высушивали в печи при 60°C в течение 1 ч, и стандартным образом проводили депарафинизацию с ddH₂O. На всех оставшихся этапах использовали изделия из стекла, очищенные кислотой. Предметные стекла помещали в равные части 20% HCl и 10% водного гексациано-железо-кислого натрия на 10-20 минут. Стекла затем хорошо ополаскивали в ddH₂O и контрастно докрашивали с ядерным прочным красным в течение 2 минут, с последующим обезвоживанием, очищением и затем покрывали покровным стеклом. Срезы селезенки использовали в качестве положительных контролей для каждого окрашивания.

Окрашивание апоптотических клеток проводили с использованием окрашивания TUNEL (коричневое окрашивание), которое специфически выявляет апоптотические клетки (Shah et al, 2003). Вкратце, окрашивание формалин-фиксированной вдавленной в парафин ткани осуществляли с использованием набора для детекции Apoptag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit (Chemicon, Temecula, CA), следуя инструкциям фирмы-производителя. Вкратце, срезы 5 мкм формалин-фиксированной вдавленной в парафин ткани высушивали в печи при температуре 60°C в течение 1 ч, а затем проводили депарафинизацию стандартным способом. Затем ткань обрабатывали протеиназой К (20 мкг/мл) в течение 15 минут при комнатной температуре. Предметные стекла отмывали два раза в ddH₂O и эндогенную пероксидазу резко подавляли в 3,0% перекиси водорода в PBS в течение 5 минут при комнатной температуре. Предметные стекла отмывали два раза в PBS и 75 мкл/5 см² уравновешивающего буфера наносили на каждое стекло, как минимум, на 10 секунд. Избыток жидкости промокали и добавляли 55 мкл/5см² фермента TdT. Предметные стекла инкубировали в течение 1 часа и затем отмывали стоп/отмывочном буфере в течение 15 секунд с перемешиванием, затем оставляли на 10 минут при комнатной температуре. На следующем этапе предметные стекла отмывали 3 раза PBS, по 1 минуте каждый раз, с последующей инкубацией с 65 мкл/5 см² конъюгата анти-дигоксигненина в течение 30 мин. После 4 смен PBS по 2 мин каждый раз, стекла инкубировали в течение 3-6 мин при комнатной температуре с 75 мкл/5 см² пероксидазного субстрата. Стекла отмывали в 3 окончательных сменах ddH₂O по 1 мин каждый раз, инкубировали в ddH₂O в течение 5 мин, а затем контрастно окрашивали с помощью метилового зеленого в течение 10 минут при комнатной температуре, отмывали с помощью ddH₂O, очищали с помощью 100% н-бутанола, обезвоживали с помощью ксилена и накрывали покровным стеклом, насаженным на пермаунт.

Визуализация. Иммуногистологические и гистохимические изображения были получены при комнатной температуре с использованием микроскопа Nikon Eclipse E800M с объективами X10, X20 и X40, подключенного к цифровому фотоаппарату Nikon DXM1200C, и были оцифрованы с использованием программного обеспечения ACT-1C на компьютере Dell Optiplex GX620. Изображения в формате Tiff были импортированы в программу Adobe Photoshop для получения композиции. Вставки представляют собой увеличения, полученные с использованием Photoshop.

Флуоресцентные изображения были получены при комнатной температуре с использованием конфокального микроскопа Nikon C1 с объективами X4, X10 и X20, соединенного с цифровым фотоаппаратом. Растровые изображения были импортированы в программу Adobe Photoshop для получения композиции.

Исследование МР-визуализации in vivo: Используя галотан получали адекватную степень анестезии (3% для индукции, от 0,7% до 1,5% для поддержания в смеси N₂:O₂ в соотношении 2:1). Анестезированных крыс помещали в сверхпроводящий электромагнит с внутренним диаметром 20 см и магнитной индукцией 7 Тесла (Magnex Scientific, Abingdon, England), соединенный с пультом управления BRUKER (Bellerica, MA). Использовали 12 см самоэкранируемый градиентный прибор с максимальным градиентом 45 гаусс/см. Высокочастотные (RF) импульсы излучались посредством гребенчатого спирального излучателя диаметром 7,5 см с активной развязкой по схеме TTL от поверхностного спирального приемника диаметром 3,2 см, расположенного на центральной линии относительно черепа животного. Использовали стереотоксические ушные вкладыши для минимизации движения во время процедуры визуализации. Ректальную температуру поддерживали на уровне 37±0,5°C, используя управляемую при обратной связи водяную баню. Использовали модифицированную последовательность быстрой покадровой визуализации под малым углом (FLASH) для воспроизводимого позиционирования животного в магните в каждый сеанс МРТ. МР-исследования проводили, используя T1-, T2- и T2*-утяжеленные МРТ изображения. Для выявления клеток, меченных оксидом железа, обычно используются сканы T2*W градиентных отраженных сигналов. Среднее время исследования для T1-, T2- и T2*-нагруженных МРТ сканов составляло приблизительно 9, 13 и 13 минут, соответственно, для исследования опухолей мозга in vivo. Для проведения МРТ применяли следующие параметры: T1-нагруженная многослойная последовательность (TR/TE=500/10 мс, 128х128 матрикс, 13-15 срезов, толщина 1 мм, зона обзора 32 мм (FOV), число излучений (NEX)=4). T2 нагруженные изображения получали, используя многослойную (13-15) мульти-отраженную (6 отраженных сигналов) МРТ со стандартным двухмерным преобразованием Фурье (2DTF). Комплекты шести наборов изображения (13-15 срезов для каждого набора) получали, используя TE по 10, 20, 30, 40, 50 и 60 мс, и TR 3000 мс. Эти изображения получали, используя FOV 32 мм, толщина среза 1 мм, матрикс 128·128, и NEX=2. T2* нагруженные изображения получали, используя стандартную многослойную (13-15 срезов) мульти-отраженную (6 отраженных сигналов) МРТ. Комплекты шести наборов изображения (13-15 срезов для каждого набора) получали, используя TE по 5, 10, 15, 20, 25 и 30 мс, TR 3000 мс. Эти изображения были получены, используя FOV 32 мм, толщину среза 1 мм, матрикс 128·128 и NEX=2. И T2, и T2* изображения использовали для определения карт T2 и T2*. Трехмерные (3D) с градиентным отраженным сигналом МР-изображения были получены, используя TR=100 мс, TE=6 мс, угол переворота 10° (FA), FOV 32Ч32Ч16 мм³, матрикс 256·192·64, и NEX=1. Общее время всей последовательности составляло приблизительно 20 минут. Для поддержания температуры тела использовали грелку-подушку. Ректальный датчик использовали для контроля температуры тела. Для сравнения качества снимком между МР-системами 3 тесла и 7 тесла, выбранным случайным образом животным проводили МРТ, используя 3 тесла. Для визуализации с использованием МРТ 3 тесла, адекватную анастезию получали посредством инъекции кетамин хлорида и ксилазина. Крыс надлежащим образом укрывали согревающей тканью для поддержания температуры тела.

7(i) Создание экспериментальной модели глиомы на животном

Для изучения эффекта конъюгированных с TRAIL магнитных композитных наночастиц желатин/оксид железа (NP-TRAIL) in vivo, были созданы две экспериментальные модели глиомы на животных. В первой модели клетки человека U87 или U251 были интракраниально имплантированы мышам линии nude. Во второй модели авторы изобретения использовали клетки глиомы человека из образцов свежеизвлеченных опухолей, которые имплантировали крысам линии nude, что породило опухоли, сохраняющие оригинальные свойства исходных опухолей, тем самым обеспечивая систему, с помощью которой можно прогнозировать реакцию этих опухолей на различные противораковые обработки.

7(ii) Конъюгированные с TRAIL магнитные композитные наночастицы желатин/оксид железа индуцируют клеточный апоптоз в глиоме

Для исследования эффекта NP-TRAIL in vivo, клетки глиомы человека U251 использовали в качестве ксенотрансплантатов. Опухоли оставляли развиваться в течение 7 дней, после чего в область опухоли интракраниально инъецировали NP-TRAIL, магнитные композитные наночастицы желатин/оксид железа (NP) в чистом виде, или PBS. Степень клеточного апоптоза анализировали после 7 дней обработки. Клеточный апоптоз определяли, используя окрашивание TUNEL (коричневое окрашивание), которое специфически выявляет апоптотические клетки. На фиг.19 представлены срезы опухоли от крыс, обработанных либо только NP, либо NP-TRAIL. Как показано, NP в чистом виде не индуцировали клеточный апоптоз в значительной степени; однако, NP-TRAIL индуцировали большую степень клеточного апоптоза, как определено посредством TUNEL (коричневое окрашивание)-позитивных клеток. У крыс, обработанных PBS, также не наблюдали значимой степени клеточного апоптоза (данные не представлены).

7(iii) Конъюгированные с TRAIL магнитные композитные наночастицы продлевают срок дожития при глиоме

Для того, чтобы установить может ли NP-TRAIL (100 нг TRAIL) обеспечить благоприятное действия на дожитие, PBS, NP в чистом виде или NP-TRAIL доставляли внутриопухолево непосредственно в ксеногенные человеческие опухоли U251 в мозгу крыс линии nude. За животными затем наблюдали на предмет выявления признаков заболеваемости, и умерщвляли при появлении любого признака, или на 85 день после имплантации опухоли. Как показано на фиг.20, обработка с помощь NP-TRAIL значительно увеличивала срок дожития, по сравнения с обработкой NP в чистом виде (p=0,0248) или PBS (p=0,0288). Микрофотографические снимки опухолей в момент заболевания представлены на фиг.21А-21С. Большие опухоли проявлялись у животных, умерщвленных по причине распространения опухоли, но никакие опухоли не проявлялись у подвергнутых обработке животных. Однако у этих животных наблюдали наличия некоторых рубцов (стрелки). Каждая серия получена от одного и того же животного и из разрезов на расстоянии 2 мм. Аналогичный эксперимент провели с sTRAIL, заменяя инъекцию 10 мкл PBS, содержащего NP-TRAIL (100 нг TRAIL), на 100, 200 и 800 нг sTRAIL. В результате этих экспериментов выявили аналогичные результаты выживаемости, как те, которые наблюдали с PBS. Однако в эксперименте с более высокой концентрацикй sTRAIL выявили некоторое повреждающее действие для олигодендроцитов.

7(iv) Конъюгированные с TRAIL магнитные композитные наночастицы желатин/оксид железа уменьшают объем опухоли при глиоме

Для выявления эффекта NP-TRAIL на опухолевую нагрузку, PBS, NP в чистом виде или NP-TRAIL доставляли внутриопухолево непосредственно в ксеногенные человеческие опухоли U251 в мозгу крыс линии nude. На 21 день после имплантации опухоли животных безболезненно умерщвляли и и извлекали головной мозг для изготовления срезов и окрашивания гематоксилин-эозином. Мозг нарезали на блоки размером 2 мм, обрабатывали, и блоки, в которых выявили опухоль, нарезали на секции размером 5 мкм, каждый 15-й срез оставляли и окрашивали гематоксилин-эозином, и определяли объем опухоли в этом срезе. Измеряли максимальную ширину и высоту опухоли в каждом 15-м срезе, и общую опухолевую нагрузку определяли путем умножения максимальной ШЧВХ (5·15) для каждого среза в котором обнаружена опухоль, и сложения этих чисел. Статистическая значимость была определена с помощью пакета Statview, используя критерий PLSD Фишера (уровень значимости 5%). Как показано на фиг.22, применение NP-TRAIL значительно снижает опухолевую нагрузку, по сравнению с применением NP в чистом виде, или PBS. Не наблюдали достоверной разницы между применением NP в чистом виде и PBS.

7(v) Способность следовать за опухолью

Способность NP перемещаться из участка имплантации в область опухолевого роста представляет собой эффективный терапевтический потенциал NP, в частности для лечения опухоли мозга. Таким образом, с целью выявления этой способности, клетки опухоли U251 имплантировали в левые полушария головного мозга крыс линии nude в день 0 и через 7 дней аналогично имплантации опухоли, но в противоположное полушарие, вводили меченные родамином магнитные композитные наночастицы желатин/оксид железа (NPR). На 11 день (4 день после введения NPR), животных безболезненно умерщвляли и проводили перфузию физиологическим раствором, головной мозг удаляли и моментально замораживали для изготовления срезов из замороженных тканей, и проводили анализ с помощью конфокального микроскопа. Как показано на фиг.23, NPR легко прослеживаются вдоль мозолистого тела. Несмотря на то, что некоторые NPR мигрировали далеко от опухолевой массы, большинство NPR наблюдали мигрирующими к опухолевой массе в левом полушарии. Аналогичное поведение наблюдали для меченных родамином конъюгированных с TRAIL магнитных композитных наночастиц желатин/оксид железа (NPR-TRAIL).

7(vi) Деструкция опухоли

В этом эксперименте выявили способность NP-TRAIL разрушать опухоль. В частности, крысам линии nude имплантировали опухоли U251n в день 0. В день 7 внутрь новообразования вводили NP-TRAIL, NP в чистом виде или PBS, на 14 день животных безболезненно умерщвляли и собирали ткани. Как показано на фиг.24, применение NP-TRAIL привело к развитию больших областей деструкции опухоли в нижней части опухолевой массы, которые не наблюдали у животных, получавших NP в чистом виде, или PBS. После введения NP-TRAIL в этих областях наблюдали много некротических и апоптотических клеток (правые панели); однако их не наблюдали после введения NP или PBS. На фиг.25 изображено большое увеличение областей деструкции опухоли после обработки.

7(vii) конъюгированные с TRAIL магнитные композитные наночастицы желатин/оксид железы достигают границы и проникают внутрь ксенотрансплантатов глиомы человека, имплантированных крысам линии nude, что показано посредством МРТ

Клетки глиомы человека U251n имплантировали крысам линии nude и через 11 дней в противоположную опухоли сторону интракраниально вводили NP или NP-TRAIL. МР-изображения получали через 8 дней. Как показано на фиг.26А-26В, NP-TRAIL (26B) индуцировали более низкую интенсивность сигнала как на границе, так и внутри опухоли, по сравнению с применением только NP (26A). Более низкая интенсивность означает присутствие наночастиц.

7(viii) Поглощение in vivo конъюгированных с TRAIL магнитных композитных наночастиц желатин/оксид железа опухолевыми клетками

Только NPR или NPR-TRAIL имплантировали непосредственно в опухолевую массу через 7 дней после имплантации опухолевых клеток GFP-U251. Через четыре дня животных безболезненно умерщвляли, головной мозг удаляли и мгновенно замораживали для получения срезов и визуализации (красное окрашивание и зеленое окрашивание означает присутствие NPR и опухолевых клеток GFP-U251, соответственно). Как показано на фиг.27, в то время как в чистом виде NPR были обнаружены в областях вокруг опухолевых клеток, но не были колокализованы с опухолевыми клетками (панели D, E, F), NPR-TRAIL были обнаружены колокализованными с опухолевыми клетками в областях деструкции опухоли (панели G, H, I). Это дополнительно показывает, что опухоль, видимая у животных, обработанных NPR-TRAIL, деградирована по сравнению с опухолью у животных, обработанных или PBS, или NPR, лишь с очень незначительным количеством жизнеспособных опухолевых клеток в этом участке. Этот эксперимент свидетельствует о том, что TRAIL приводит к поглощению NP опухолевыми клетками, как показано in vitro в примере 6(v).

7(ix) Миграция конъюгированных с cRGD пептидом меченных родамином магнитных композитных наночастиц желатин/оксид железа к глиоме

Конъюгированные с cRGD-пептидом меченные родамином магнитные композитные наночастицы желатин/оксид железа (NPR-cRGD, 10 мкл, содержащие 0,05 мг наночастиц, конъюгированных приблизительно с 2 мкг cRGD-пептида) через 7 дней после имплантации опухолевых клеток GFP-U251, были инъецированы в противоположную область головного мозга. Через четыре дня животных безболезненно умерщвляли, головной мозг удаляли и мгновенно замораживали для получения срезов и визуализации (красное окрашивание и зеленое окрашивание означает присутсвие NPR и опухолевых клеток GFP-U251, соответственно). На фиг.28 показано, что NPR-cRGD мигрировали в область опухоли.

7(x) Миграция конъюгированных с cRGD пептидом- и с TRAIL меченных родамином магнитных композитных наночастиц желатин/оксид железа по направлению к участку повреждения

Повреждение наносили посредством инъекции PBS с помощью иглы в левую часть головного мозга. Последующие 4 дня в противоположную часть мозга инъецировали 5 мкл (25 мкг) NPR в чистом виде, NPR-TRAIL (50 нг TRAIL) и NPR-cRGD. Через 4 дня, животных безболезненно умерщвляли и с помощью флуоресцентного микроскопа визуализировали флуоресценцию NPR. Как показано на фиг.29, несколько NPR присутствовало в другой части головного мозга, но их распределение было обширным. NPR-TRAIL были локализованы, главным образом, вдоль участка повреждения. В отличие от этого, NPR-cRGD были распределены по всему участку повреждения головного мозга и также вдоль мозолистого тела. Эти результаты указывают на то, что данные наночастицы обладают некоторой способностью сопрягаться с участком повреждения и что NPR-TRAIL показывают селективное накопление в области повреждения. NPR-cRGD имеют способность сопряжения, но их распределение не ограничено участком повреждения и они могут связывать клетки воспалительного инфильтрата, которые также накапливаются там. Эти результаты имеют важное значение для использования системы NP для доставки лекарственных средств при повреждении мозга, нарушении мозгового кровообращения и воспалительных заболеваниях головного мозга.

Пример 8. Цитотоксические действия конъюгированных с TRAIL магнитных композитных наночастиц желатин/оксид железа на клетки карциномы мочевого пузыря, клетки рака молочной железы и нормальные клетки молочной железы

В этих экспериментах были определены цитотоксические эффекты конъюгированных с TRAIL магнитных композитных наночастиц желатин/оксид железа (NP-TRAIL) на различные раковые клетки, отличные от клеток глиомы. Линии раковых клеток, в частности, использованные, представляли собой клетки карциномы мочевого пузыря TSU-PR1 и клетки рака молочной железы MDA-MB, и в качестве контроля использовали нормальные клетки молочной железы MCF10A. Кроме того, было изучено действие на эти клетки посредством NP-TRAIL в комбинации с ингибитором протеасом (PS), мультикаталитического протеазного комплекса, ответственного за большую часть внутриклеточного разрушения белка. Фармакологические ингибиторы протеасом обладают противоопухолевой активностью in vitro и in vivo. Преклинические исследования показали, что ингибиторы протеасом усиливают действие других противораковых лекарственных средств, таких как TRAIL, частично посредством даунрегуляции путей резистентности к химическому воздействию.

Клетки (1·10⁵/лунка) обрабатывали различными концентрациями TRAIL (10-100 нг/мл), NP или NP-TRAIL (10-40 нг TRAIL/мл), в присутствии или отсутствии PS (5 мМ). Клеточную гибель определяли через 24 ч, используя анализ LDH. 100% клеточную гибель выявили в клетках, обработанных посредством Triton X-100, и результаты были стандартизированы.

Как показано на фиг.30А-30В, нормальные клетки молочной железы MCF10A не реагировали на все виды обработки, описанные выше, что свидетельствует о том, что эти виды обработки не являются токсичными для нормальных клеток. Как дополнительно показано, активность NP-TRAIL была потенциирована после обработки с помощью PS. Эта находка может иметь большое значение, в частности, при планировании эффективных стратегий лечения.

ЛИТЕРАТУРА

Ashkenazi A., Pai R.C., Fong S., Leung S., Lawrence D.A., Marsters SA., Blacki C, Chang L., McMurtrey A.E., Hebert A., DeForge L., Koumenis I.L., Lewis D., Harris L., Bussiere J., Koeppen H., Shahokh Z., Schwall R.H., J. Clin. Invest, 1999, 104, 155-162.

Blass M., Kronfeld L, Kazimirsky G., Blumberg P.M., Brodie C., Mol Cell. Biol., 2002, 22, 182-195.

Bockstaller M., Lapetnikov Y., Margel S., Thomas E.L., J.A.C.S., 2003, 125, 5276.

Bunker B.C., Rieke P.C, Tarasevich B.J., Campbell A.A., Fryxell G.E., Graff G.L., Song L., Liu J., Virden J.W., McVay G.L., Science, 1994, 264, 48.

Carlo-Stella C, Lavezza C, Locatelli A., Vigano L., Gianni A.M., Gianni L., Clin Cancer Res., 2007, 13, 2313-2317.

Denicourt C, Dowdy S.F., Science, 2004, 305, 1411.

Desjardins A., Rich J.N., Quinn J.A., Vredenburgh J., Gururangan S., Sathornsumetee S., Reardon D.A., Friedman A.H., Bigner D.D., Friedman H.S., Front. Biosci, 2005, 10, 2645-2668.

Galperin A., Margel D., Baniel J., Dank G., Biton H., Margel S., Biomaterials, 2007, 28, 4461-4468.

Gartner L.P., Hiatt J.L., Color textbook of histology, 2^nd Edition, 2001, 2-3.

Giese A., Bjerkvig R, Berens M.E., Westphal M., J Clin Oncol, 2003, 21, 1624-1636.

Gozuacik D., Kimchi A., Oncogene, 2004, 23, 2891-2906.

Green-Sadan T., Kuttner T., Lublin T., Kinor N., Boguslavsky Y., Margel S., Yadid G., Experimental Neurology, 2005, 194, 97.

Hergt R., Hiergeist R., Hilger I., Kaiser W.A., Margel S., Richter U., J. of Magnetism & Magnetic Materials, 2004, 270, 345-357.

Lacoste J., Vaillant D., Carlsson D.J., J. Palm. Sci, Part A: Polym. Chem., 1993, 31, 715.

Leemputten E.V., Horisberger M., Biotech. And Bioeng., 1974, 16, 997.

Margel S. et al. Microspheres, Microcapsules & Liposomes, Ed. R. Arshady, Citus Ltd, London, 1999, 2, 11-42.

Melamed O., and Margel S., J.of Colloid & Interface Sci., 2001, 241, 357-365.

Riccardi C, Nicoletti I., Nature Protocols, 2006, 1, 1458-1461.

Sanson M., Thillet J., Hoang-Xuan K., Curr Opin Oncol, 2004, 16, 607-613.

Shah K., Tang Y., Breakefield X., Weissleder R., Oncogene, 2003, 22, 6865-6872.

Shankar S., Strivastava R.K., Drug Resistance Updates, 2004, 7, 139-156.

Sheehan D.C., Hrapchak B.B., Theory and Practice of Histotechnology, 2^nd Edition, The C.V. Mosby Company, 1980.

Shir A., Levitzki A., Cell Mol Neurobiol, 2001, 21, 645.

Smyth M.J., Takeda K., Hayakawa Y., Peschon J.J., Van Den Brink M.R.M., Yagita H., Immunity, 2003, 18, 1-6.

Szymonifka M.J., Chapman K.T., Tetrahedron Letters, 1995, 36, 1597.

Van Meir E.G., Bellail A., Phuphanich S., Semin Oncol, 2004, 31, 38.

Wang S., El-Deiry W,F., Oncogene, 2003, 22, 8628-8633.

Wei Lu, Qing Sun, Jin Wan, Xin-Guo Jiang, Cancer Res., 2006, 66, 11878-11887.

Zhang Y., Lee H.J., Boado R.J., Pardridge W.M., The J. Of Gene Medicine, 2002, 4, 183-194.

Изобретение относится к наночастицам для доставки лекарственного вещества, причем наночастицы состоят из хелатирующего металл полимера, и активного агента, представляющего собой родственный TNF лиганд, индуцирующий апоптоз (TRAIL), где активный агент ковалентно связан с полимером. Изобретение также относится к фармацевтической композиции для индуцирования апоптоза в раковой клетке, уменьшения роста опухоли и/или ингибирования роста опухоли, которая включает указанные наночастицы и фармацевтически приемлемый носитель. Заявлен также способ приготовления наночастицы, который включает смешивание водного раствора хелатирующего металл полимера с растворимой солью металла, оксидирование ионов металла и образование наночастицы путем доведения pH до основного. Далее повторяют стадии добавления металла, оксидирования и доведения раствора до основного pH. Затем проводят функционализацию наночастицы и ее контактирование с TRAIL с последующим блокированием остающихся активных сайтов на поверхности наночастицы. Изобретение обеспечивает достижение эффективного апоптоза за счет стабилизации TRAIL, предотвращение его расщепления и уменьшения необходимого для апоптоза количества TRAIL. 3 н. и 24 з.п. ф-лы, 40 ил., 8 пр.

1. Наночастица для доставки лекарственного средства, состоящая из полимера, хелатирующего металл, покрытия из оксида магнитного металла и по меньшей мере одного активного агента, ковалентно связанного с полимером, где по меньшей мере один активный агент представляет собой родственный TNF лиганд, индуцирующий апоптоз (TRAIL).

2. Наночастица по п.1, где указанный полимер содержит функциональные группы, способные связывать ионы металла, где указанный полимер включает желатин, полиметиленимин, хитозан или полилизин.

3. Наночастица по п.1, где указанный оксид магнитного металла представляет собой оксид железа или феррит, происходящий из оксида железа, где указанный оксид железа представляет собой магнетит, оксимагнетит или их смеси, и указанный феррит представляет собой оксид формулы (Fe,M)₃O₄, где M представляет собой ион переходного металла.

4. Наночастица по п.1, где указанный TRAIL связан напрямую или опосредованно с оксидом магнитного металла.

5. Наночастица по п.1, дополнительно содержащая, по меньшей мере, одно дополнительное средство.

6. Наночастица по п.5, где указанное, по меньшей мере, одно дополнительное средство представляет собой пептид или пептидомиметик cRGD.

7. Наночастица по п.1, где указанный полимер представляет собой желатин, а указанный оксид магнитного металла представляет собой оксид железа.

8. Наночастица по любому из пп.1-7 для применения в индуцировании апоптоза, аутофагии или обоих в раковой клетке.

9. Наночастица по п.8, где указанная клетка дополнительно подвергается γ-облучению.

10. Наночастица по п.8, где указанная раковая клетка представляет собой глиомную клетку, раковую стволовую клетку, клетку карциномы, клетку рака молочной железы или клетку рака легкого.

11. Наночастица по п.8, где указанное индуцирование апоптоза, аутофагии или обоих в раковой клетке представляет собой лечение пациента, страдающего раком.

12. Наночастица по п.11, где указанный пациент страдает глиомой, карциномой, раком молочной железы или раком легкого.

13. Наночастица по п.8, где указанная клетка дополнительно приводится в контакт с ингибитором протеосомы.

14. Наночастица по любому из пп.1-7, где указанная наночастица является нетоксичной для нераковой клетки.

15. Наночастица по п.1, дополнительно содержащая лекарственное средство, метку-краситель, контрастное средство или любую их комбинацию.

16. Наночастица по п.15, где указанная метка-краситель представляет собой флуоресцентный краситель.

17. Наночастица по п.1, где указанный TRAIL связан напрямую или опосредованно с полимером, хелатирующим металл.

18. Фармацевтическая композиция для индуцирования апоптоза в раковой клетке, уменьшения роста опухоли и/или ингибирования роста опухоли, включающая наночастицы по любому из пп.1-7, и фармацевтически приемлемый носитель.

19. Способ приготовления наночастицы по п.1, включающий следующие последовательные стадии:
a) смешивание водного раствора, содержащего растворимый полимер, хелатирующий металл, с, по меньшей мере, одной растворимой солью металла;
b) оксидирование ионов металла, образующихся в указанном растворе;
c) образование указанной наночастицы в указанном растворе путем доведения кислотности указанного раствора до основного pH;
d) добавление дополнительной порции соли металла в указанный раствор;
e) оксидирование ионов металла, образующихся в указанном растворе;
f) доведение кислотности указанного раствора до основного pH;
g) повторение стадий d)-f), по меньшей мере, один раз;
h) функционализация указанной наночастицы;
i) приведение указанной функционализованной наночастицы в контакт, по меньшей мере, с TRAIL; и
j) блокирование остающихся активных сайтов на поверхности указанной наночастицы.

20. Способ по п.19, где указанное полимерное хелатирующее металл средство содержит функциональные группы, где указанные функциональные группы содержат амино-, гидроксильную, карбоксилатную, -SH, эфирную, имминную, фосфатную и сульфидную группы, и где указанное полимерное хелатирующее металл средство содержит желатин, полиметиленимин, декстран, хитозан, полилизин, поливинилпирролидон или их комбинацию.

21. Способ по п.19, где указанная функционализация указанной наночастицы включает приведение указанной наночастицы в контакт с акрилоилхлоридом, дивинилсульфоном (DVS), дикарбонилимидазолом, этиленгликоль-бис(сульфосукцинимидилсукцинатом), N-гидроксисульфосукцинимидным эфиром m-малеимидобензойной кислоты или любой их комбинацией.

22. Способ по п.21, где указанная функционализация дополнительно включает покрывание указанной наночастицы покрывающим полимером.

23. Способ по п.22, где указанная функционализация дополнительно включает сшивание указанного покрывающего полимера с акрилоилхлоридом, дивинилсульфоном (DVS), дикарбонилимидазолом, этиленгликоль-бис(сульфосукцинимидилсукцинатом), N-гидроксисульфосукцинимидным эфиром m-малеимидобензойной кислоты или любой их комбинацией.

24. Способ по п.19, где указанный водный раствор включает: лекарственное средство, метку-краситель, контрастное средство или любую их комбинацию.

25. Способ по п.19, где указанный растворимый хелатирующий металл полимер связан с лекарственным средством, меткой-красителем, контрастным средством или любой их комбинацией.

26. Способ по п.24 или 25, где указанное лекарственное средство представляет собой TRAIL.

27. Способ по п.24 или 25, где указанная метка-краситель представляет собой флуоресцентный краситель.