СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СМЕСИ НАСЫЩЕННЫХ УГЛЕВОДОРОДОВ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИМ ПУТЕМ Российский патент 2012 года по МПК C12P5/02 C12N1/14 

Предлагаемое изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к способам получения насыщенных тяжелых углеводородов (парафинов) на основе микроорганизмов. Парафины могут быть использованы в легкой промышленности, в медицине, а также в качестве углеводородного сырья для получения биотоплива.

Известны способы получения жидких углеводородов химическими методами из органических продуктов с использованием СО₂ и Н₂ (патент №4670472 и №1401814 кл. С07С 1/04). Недостатком известных способов является использование дорогостоящих металлоксидных катализаторов, проведение реакций при высоких температурах и давлении.

Возможны способы получения газообразного топлива путём метанового сбраживания органических веществ в присутствии стимуляторов метаногенеза, в качестве которых могут выступать соединение ацетата никеля (II) с этилендиамином или соединение никеля (II) с глицерином. Известно, что водород оказывает стимулирующее действие на процесс метаногенеза. Также метан можно получать путем термофильного метанового брожения ацетонобутиловой барды в присутствии стимуляторов метаногенеза, в качестве которых используют метанол, хлористый кобальт, уксусную кислоту. В качестве сырья для получения метана также можно использовать обычный бытовой мусор. Путем сбраживания в течение 8-10 дней при 55°С в герметичной емкости образуется биогаз. Помимо мусора, метан можно получать путем воздействия на уголь метаногенным консорциумом микроорганизмов непрерывным прокачиванием культуральной среды через скважины и емкость, в которую помещен метаногенный консорциум микроорганизмов с культуральной средой. Результатом переработки угля данным способом являются биогаз и водоугольное топливо (Самуилов В.Д., Олескин А.В. Технологическая биоэнергетика. М., 1994, С.154-159).

Микроорганизмы - это не единственный способ получения метана, с успехом для этих целей можно использовать растения. В пресных водах тропиков и субтропиков широко распространено многолетнее растение водный гиацинт (Eichhornia crassipes), способный к быстрому вегетативному размножению. В этих и даже более умеренных широтах (например, во Франции) налаживают культивирование водного гиацинта для последующей его переработки в биогаз (Холл Д., Кумбс Дж., Хиггинс И. Энергия и биотехнология Биотехнология. Принципы и применение. М., 1988. С.35-90).

Известны способы получения небольших количеств углеводородов из клеток отдельных видов растений и микроорганизмов (Санадзе Г.А. Выделение растениями летучих органических веществ. Изд-во АН СССР, М., 1957; Максимова Г.Н., Воробьева Г.И. и др. Ж. «Микробиологический синтез, 1967, №5, С.10-11). Одноклеточные фототрофные организмы характеризуются высокими скоростями роста и являются перспективным сырьем для получения углеводородов из газовой смеси СО₂ и Н₂ и органического субстрата (Волова Т.Г. и др. Исследование физиолого-биохимических свойств зеленой водоросли Botriococcus braunii. Доклады РАН, 1998, т.361, №2, С.256-259).

Известен способ получения нефтяных углеводородов из твердых горючих ископаемых при обработке их бактериями рода Thiobacillus или Thiospaera в присутствии доноров водорода и в широком диапазоне температур и рН среды (Курашов В.М., Сахно Т.В. Микробиологический способ получения углеводородов нефти и отдельных углеводородных фракций из твердых горючих ископаемых. Патент РФ №2180919, кл. С12Р 5/00, C12R 1/01).

Известен способ получения внеклеточных жидких углеводородов С₁₄-С₂₅ с использованием сульфатредуцирующих бактерий с использованием газовой смеси СO₂ и H₂ и органического субстрата в виде лактата кальция и дрожжевого экстракта.

Наиболее близким по технической сущности и ожидаемому результату является способ получения смеси углеводородов состава С 15-C₂₂. из биомассы дрожжей рода Candida при выращивании на сложных органических средах и на минеральных средах с глюкозой. Культуру С. tropicalis К-17 выращивают на разных субстратах: 1 - на глюкозе; 2 - на октане (C₈); 3 - на декане (С₁₀). Посевным материалом во всех опытах служила суспензия клеток, выращенных в течение трех суток на минеральной среде с 1% равнообъемной смеси химически чистых н-алканов C₈-С₁₀. В данных опытах культивирование дрожжей на средах с углеводородами и глюкозой проводили в герметически закрытых сосудах. Биомассу для анализа отбирали в стационарной фазе роста. Из отмытых водой клеток углеводороды с липидами экстрагировали смесью органических растворителей (гексан-этиловый спирт) и разделяли на колонке с силикагелем марки АСК. Определение состава остаточных углеводородов проводили на газовом хроматографе «Цвет-4» при 250°. Применяли колонку (100×0,3 см) с хромосорбом W, неподвижная фаза - 15%-ный «Апиезон L». Газ-носитель - Не, давление на входе - 0,5 атм, на выходе - атмосферное. Идентификацию углеводородов выполняли путем сравнения полученных хроматограмм с хроматограммами искусственной калибровочной смеси и по графикам зависимости логарифмов удерживаемых объемов от числа углеродных атомов. Суммарное содержание углеводородов в клетках дрожжей С. tropicalis К-17, культивируемых на различных субстратах, различается между собой. Количество углеводородов в клетках, выращенных в одинаковых условиях на н-алканах, выше (0,240-0.400 % к сухой биомассе), чем на глюкозе (0,165%). Качественный состав внутриклеточных углеводородов во всех опытах оказался довольно однородным и включал н-алканы от C₁₅ до С₂₂. На всех исследованных субстратах в клетках дрожжей в максимальном количестве накапливаются н-алканы C₁₇-С₁₈. Количество синтезируемых клеткой н-алканов с большим числом углеродных атомов в молекуле (С₂₀-С₂₂) закономерно уменьшается.

Синтез отдельных углеводородов при выращивании на глюкозе и легких углеводородов идет несколько иначе. При культивировании на н-алканах (C₈ и С₁₀) он сдвинут в сторону преимущественного синтеза С₁₆-C₁₈; на глюкозе же в большом количестве образуются н-алканы С₁₇-С₂₀.

Таким образом, клетки дрожжей при выращивании на легких н-алканах - октане (C₈) и декане (С₁₀) обладают способностью при недостаточном количестве кислорода синтезировать тяжелые углеводороды от С₁₅ до C₂₂ (Квасников Е.И., Соломко Э.Ф., Мельник Я.В. Синтез тяжелых углеводородов при выращивании дрожжей на низкомолекулярных н-алканах. // Микробиология, 1972. Т. XLI, вып.3. С.560-561).

Недостатком способа является недостаточный выход целевых продуктов и их однородный качественный состав, использование дорогостоящих компонентов питательной среды культивирования - глюкозы и/или низкомолекулярных н-алканов.

Техническим результатом изобретения является удешевление способа получения целевых углеводородов, увеличение их выхода и более разнообразный состав.

Поставленная цель достигается тем, что в качестве штамма-продуцента углеводородов используется микроскопический гриб Hypomyces rosellus ВКПМ F-242. Продуцент культивируют на питательных средах состава (в %): отходы зерноперерабатывающей промышленности - 2-20: NaNO₃ - 0,1-0,5; КН₂РО₄ - 0,05-0,1; MgSO₄ - 0,05-0,1; FeSO₄ - 0,0001-0,001; остальное - вода. показатель рН исходной питательной среды поддерживают в пределах 6,0-6,2. Выращивание гриба проводят при температуре 20-25°С в течение 4-6 суток; экстракцию смеси насыщенных углеводородов ведут липидной фракции, выделенной из культуральной жидкости гриба Hypomyces rosellus ВКПМ F-242 неполярными органическими растворителями. Полученные экстракты упаривают.

В качестве неполярного органического растворителя используют гексан, петролейный эфир, бензол и хлороформ.

Анализ компонентного состава полученной смеси насыщенных углеводородов проводят с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ), газожидкостной хроматографии и методом хромато-масс-пектроскопии. Выделение углеводородов из липидной фракции проводят на силуфоловых пластинках в системе растворителей петролейный эфир - диэтиловый эфир - уксусная кислота (80:20:1). Выявляют пятна с Rf=0,22 - (1,3 диглицериды) - следы; Rf=0,4 - (жирные кислоты) - следы; Rf=0,96 - (углеводороды) - около 90%. В результате проведения колоночной хроматографии на силикагеле получают фракции липидов, которые далее анализируют на газожидкостном хроматографе, а также методом хромато-масс-пектроскопии.

Существенные отличия предлагаемого способа.

В предлагаемом способе в качестве компонентов питательной среды для культивирования продуцента насыщенных углеводородов используются целлюлозосодержащие отходы зерноперерабатывающей промышленности, а в известном способе дорогостоящие компоненты, такие как глюкоза и низкомолекулярные алканы.

Преимущества предлагаемого способа

Способ позволяет получать из культуры микофильного гриба Hypomyces rosellus насыщенные углеводороды состава C₁₃-С₃₅, получение которых ранее в литературе не описано. Описанным ранее способом получают только углеводороды состава С₁₅-С₂₂.

Способ поясняется примерами.

Пример 1. Штамм Hypomyces rosellus ВКПМ F-242 выращивают в колбах Эрленмеера емкостью 500 мл, содержащих 100 мл питательной среды, где в качестве единственного источника углерода используют отруби пшеничные. Питательную среду состава (в %):

отруби пшеничные (или ржаные) 3-10;

NaNO₃ - 0,1-0,5;

КН₂РO₄ - 0,05-0,1;

MgSO₄ - 0,05-0,1;

FeSO₄ - 0,0001-0,001;

Вода - остальное;

показатель рН исходной питательной среды - 6,0-6,2; засевают посевным материалом, выращенным на сусле 4° по Баллингу в количестве 3-5 объемных %. Выращивание гриба ведут в глубинных условиях в колбах на круговых качалках (200-220 об/мин) при температуре 20-25°С в течение 2, 4 и 6 суток. Липидные фракции выделяют из культуральной жидкости неполярным органическим растворителем - гексаном, взятым в объеме 200 мл. Объемное соотношение культуральная жидкость:растворитель = 1:2. Экстракт упаривают на роторном испарителе. Выход углеводородов составляет 30-36% в расчете на сухую биомассу. Целевой продукт представляет собой смесь насыщенных углеводородов фракции С₁₃-С₃₅.

Пример 2. Штамм Hypomyces rosellus ВКПМ F-242 выращивают в колбах Эрленмеера емкостью 500 мл, содержащих 100 мл питательной среды, где в качестве единственного источника углерода используют овсяную шелуху.

Питательную среду состава (в %):

Овсяная шелуха - 10-20;

NaNO₃ - 0,5;

КН₂РO₄ - 0,1;

MgSO₄ - 0,05;

FeSO₄ - 0,0001-0,001;

Вода остальное;

показатель рН исходной питательной среды - 6,0-6,2; засевают посевным материалом, выращенным на сусле 4° по Баллингу в количестве 3-5 объемных %. Выращивание гриба ведут в глубинных условиях в колбах на круговых качалках (200-220 об/мин) при температуре 20-25°С в течение 2, 4 и 6 суток. Липидные фракции выделяют из культуральной жидкости петролейным эфиром, взятым в объеме 200 мл. Объемное соотношение культуральная жидкость:растворитель = 1:2. Экстракт упаривают на роторном испарителе. Выход углеводородов составляет 18-22% в расчете на сухую биомассу. Целевой продукт представляет собой смесь насыщенных углеводородов фракции С₁₃-С₃₅.

Пример 3. Штамм Hypomyces rosellus ВКПМ F-242 выращивают в колбах Эрленмеера емкостью 500 мл, содержащих 100 мл питательной среды, где в качестве единственного источника углерода используют солому злаковых культур.

Питательную среду состава (в %):

Солома - 10-20;

NaNO₃ - 0,5;

КН₂РO₄ - 0,1;

MgSO₄ - 0,05;

FeSO₄ - 0,0001-0,001;

Вода остальное;

показатель рН исходной питательной среды - 6,0-6,2; засевают посевным материалом, выращенным на сусле 4° по Баллингу в количестве 3-5 объемных %. Выращивание гриба ведут в глубинных условиях в колбах на круговых качалках (200-220 об/мин) при температуре 20-25°С в течение 2, 4 и 6 суток. Липидные фракции выделяют из культуральной жидкости бензолом, взятым в объеме 200 мл.. Объемное соотношение культуральная жидкость:растворитель = 1:2. Экстракт упаривают на роторном испарителе. Выход углеводородов равен 28-30% в расчете на сухую биомассу. Целевой продукт представляет собой смесь насыщенных углеводородов фракции С₁₃-С₃₅.

Пример 4. Штамм Hypomyces rosellus ВКПМ F-242 выращивают в колбах Эрленмеера емкостью 500 мл, содержащих 100 мл питательной среды, где в качестве единственного источника углерода используют сахарозу.

Питательную среду состава (в %):

Сахароза - 2-4;

NaNO₃ - 0,3;

КН₂РO₄ - 0,1;

MgSO₄ - 0,05;

FeSO₄ - 0,0001-0,001;

Вода - остальное;

показатель рН исходной питательной среды - 6,0-6,2; засевают посевным материалом, выращенным на сусле 4° по Баллингу в количестве 3-5 объемных %. Выращивание гриба ведут в глубинных условиях в колбах на круговых качалках (200-220 об/мин) при температуре 20-25°С в течение 2, 4 и 6 суток. Липидные фракции выделяют из культуральной жидкости хлороформом, взятым в объеме 200 мл. Объемное соотношение культуральная жидкость: растворитель =1:2. Экстракт упаривают на роторном испарителе. Общий выход углеводородов незначителен и на 6 сутки не превышает 10% в расчете на сухую биомассу. Целевой продукт представляет собой смесь насыщенных углеводородов фракции С₁₇-С₃₆.

Примеры   Показатели Выход в расчете на сухую биомассу, % Качественный состав углеводородов Источник углерода в составе питательной среды Продуцент углеводородов Прототип на н-алканах - 0,240-0,400; на глюкозе - 0,165 С₁₅-С₂₂ Глюкоза, октан, декан Candida tropicalis штамм К-17 Пример 1 30-36 С₁₃-С₃₅ Отруби пшеничные или ржаные Hypomyces rosellus штамм ВКПМ F-242 Пример 2 18-22 С₁₃-С₃₅ Овсяная шелуха -«- Пример 3 28-30 C₁₃-С₃₅ Солома -«- Пример 4 (сравнительный) 10 С₁₇-С₃₆ Сахароза -«-

Способ получения смеси насыщенных углеводородов предусматривает выращивание штамма гриба Hypomyces rosellus ВКПМ F-242 на питательной среде, содержащей минеральные соли и органический источник углерода с последующей экстракцией углеводородов органическими растворителями. Используют питательную среду состава (в %): отходы зерноперерабатывающей промышленности - 2-20; NaNO₃ - 0,1-0,5; КН₂РO₄ - 0,05-0,1; MgSO₄ - 0,05-0,1; FeSO₄ - 0,0001-0,001; остальное - вода. Показатель рН исходной питательной среды поддерживают в пределах 6,0-6,2. Выращивание гриба осуществляют при температуре 20-25°С в течение 4-6 суток. Экстракцию смеси насыщенных углеводородов фракции С₁₃-С₃₅ ведут из липидной фракции, выделенной из культуральной жидкости гриба неполярными органическими растворителями. Способ позволяет получить смесь насыщенных углеводородов фракции С₁₃-С₃₅ с высоким выходом. Выход целевых продуктов составляет 18-36% в расчете на сухую биомассу. 1 табл.

Способ получения смеси насыщенных углеводородов, предусматривающий выращивание микроскопического гриба на питательной среде, содержащей минеральные соли и органический источник углерода с последующей экстракцией углеводородов органическими растворителями, отличающийся тем, что в качестве гриба используют щтамм Hypomyces rosellus ВКПМ F-242, в качестве питательной среды используют состав, %: отходы зерноперерабатывающей промышленности - 2-20; NaNO₃ - 0,1-0,5; КН₂РO₄ - 0,05-0,1; MgSO₄ - 0,05-0,1; FeSO₄ - 0,0001-0,001; остальное - вода, показатель рН исходной питательной среды поддерживают в пределах 6,0-6,2; выращивание гриба проводят при температуре 20-25°С в течение 4-6 суток, а экстракцию смеси насыщенных углеводородов фракции С₁₃-С₃₅ ведут из липидной фракции, выделенной из культуральной жидкости гриба Hypomyces rosellus ВКПМ F-242 неполярными органическими растворителями.