КОМПОЗИТНЫЙ ЭНАНТИОСЕЛЕКТИВНЫЙ ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИЧЕСКИЙ СЕНСОР НА ОСНОВЕ ПАСТОВОГО ЭЛЕКТРОДА ИЗ СМЕСИ ГРАФИТИРОВАННОЙ ТЕРМИЧЕСКОЙ САЖИ CARBOBLACKC, УГЛЕРОДНЫХ НАНОТРУБОК И ГОМОХИРАЛЬНОГО ЦЕОЛИТА MFI ДЛЯ РАСПОЗНАВАНИЯ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭНАНТИОМЕРОВ ТРИПТОФАНА Российский патент 2024 года по МПК G01N27/327 G01N27/48 

Изобретение относится к области электрохимических методов анализа, а именно совершенствованию количественного определения энантиомеров оптически активной аминокислоты – триптофана (Трп) – методом вольтамперометрии в модельных растворах, биологических жидкостях, а также биологически активных добавках без предварительного его выделения из таблетированных форм.

Энантиомерная чистота Трп является важным показателем качества биологически активной добавки «Триптофан», поскольку из ее двух существующих оптических D- и L-изомеров, только последний изомер участвует в синтезе белков, пептидных антибиотиков, нативных иммунодепрессантов, формировании иммунного отклика и нормализации процессов центральной нервной системы (ЦНС). Влияние D-изомера изучено существенно меньше, однако его присутствие вызывает дополнительную нагрузку на биохимические процессы. Трп-содержащие препараты различных производителей активно используются в медицинской практике и широко представлены на рынке, поэтому экспрессный, высокоэффективный и недорогой контроль качества, способный определять энантиомерную чистоту содержащегося Трп, является востребованным. Единственным аналитическим методом способным обеспечить энантиоселективный анализ Trp при одновременном соблюдении всех вышеуказанных требований является вольтамперометрия в сочетании со специальными энантиоселективными сенсорами. Именно последние отвечают за определение энантиомерной чистоты содержащегося в препаратах триптофана, а также прочие параметры анализа: высокую чувствительность, селективность, точность. Несмотря на все успехи, создание энантиоселективного сенсора способного одновременно обеспечить доступность, простоту изготовления, высокий коэффициент энантиоселективности, низкий предел обнаружения, высокую точность, стабильность при хранении все еще остается нерешенной технической задачей.

1. Известны сенсоры для селективного распознавания и определения энантиомеров триптофана на основе пастового электрода с различными модификаторами, такими как 5AEBCNPE [S. Tajik, M.A. Taher, H. Beitollahi. First report for simultaneous determination of methyldopa and hydrochlorothiazide using a nanostructured based electrochemical sensor // J. Electroanal. Chem., 2013, vol. 704, pp. 137–144], 3-Neomenthylindene [L.R. Zagitova, V.N. Maistrenko, Y.A. Yarkaeva, V.V. Zagitov, R.A. Zilberg, P.V. Kovyazin and L.V. Parfenova, Novel chiral voltammetric sensor for tryptophan enantiomers based on 3-neomenthylindene as recognition element // J. Electroanal. Chem., 2021, vol. 880, pp. 114939–114949], p-APMCNTPE [A.A. Ensafi and H. Karimi-Maleh, A. Voltammetric Sensor Based on Modified Multiwall Carbon Nanotubes for Cysteamine Determination in the Presence of Tryptophan Using p-Aminophenol as a Mediator // Electroanalysis, 2010, vol. 22, pp. 2558 – 2568], SnO₂-Co₃O₄@rGO/IL [H. Zeinali, H. Bagheri, Z. Monsef-Khoshhesab, H. Khoshsafar and A. Hajian. Nanomolar simultaneous determination of tryptophan and melatonin by a new ionic liquid carbon paste electrode modified with SnO₂-Co₃O₄@rGO nanocomposite // Mater. Sci. Eng. C, 2017, vol. 71, pp. 386–394], GR [P. Deng, Z. Xu and Y. Feng. Acetylene black paste electrode modified with graphene as the voltammetric sensor for selective determination of tryptophan in the presence of high concentrations of tyrosine // Mater. Sci. Eng., 2014, vol. 35, pp. 54–60], SiO₂ nanoparticles [M. Xu, M. Ma and Y. Ma. Electrochemical determination of tryptophan based on silicon dioxide nanoparticles modified carbon paste electrode // Russ. J. Electrochem. 2012, vol. 48, pp. 489–494], MWCNT-LDH [O.J. D’Souza, R.J. Mascarenhas, T. Thomas, I.N.N. Namboothiri, M. Rajamathi, P. Martis and J. Dalhalle, Electrochemical determination of L-Tryptophan based on a multiwall carbon nanotube/Mg–Al layered double hydroxide modified carbon paste electrode as a sensor // J. Electroanal. Chem., 2013, vol. 704, pp. 220–226], BTPM [Y.A. Yarkaeva, E.N. Islamuratova, L.R. Zagitova, V.Y. Gus’kov, R.A. Zil’berg and V.N. Maistrenko A sensor for the recognition and determination of tryptophan enantiomers based on carbon-paste electrode modified by enantiomorphic crystals of bromotriphenylmethane // J. Anal. Chem. 2021, vol. 76, pp. 1345–1354], Fe₃O₄@Ag [A. Pourhabib and M. Arvand, Electrochemical Sensing of Tryptophan and Tyrosine in Chronic Kidney Disease Patients Using Magnetic Core/Ag Nanoparticles Shell Nanocomposite Modified Electrode // J. Anal. Chem., 2022, Vol. 77, pp. 235–245], Ni NPs/N-C [P. Deng, X. Nie, Y. Wu, Y. Tian, J. Li and Q. He, A cost-saving preparation of nickel nanoparticles/nitrogen-carbon nanohybrid as effective advanced electrode materials for highly sensitive tryptophan sensor // Microchem. J., 2021, vol. 160, pp. 105744], AuPdCu-rGO-MWCNTs [N. Mohammadi, M. Bahmaei, and A.M. Sharif, Electrochemical Determination of Dopamine, Acetaminophen and Tryptophan using AuPdCu-rGOMWCNTs Nanocomposite as the Sensing Layer // Anal. Bioanal. Electrochem., 2020, vol. 12, pp. 468-485], CPE/CNF [X. Tang, Y. Liu, H. Hou, T. You, Electrochemical determination of L-tryptophan, L-tyrosine and L-cysteine using electrospun carbon nanofibers modified electrode, Talanta, 2010, vol. 80, pp. 2182–2186], GO-NiO/n-H-3MIHF [M. Shabani-Nooshabadi, M. Roostaee and H. Karimi-Maleh, Incorporation of graphene oxide–NiO nanocomposite and n-hexyl-3-methylimidazolium hexafluoro phosphate into carbon paste electrode: application as an electrochemical sensor for simultaneous determination of benserazide, levodopa and tryptophan // J. Iran. Chem. Soc., 2017, vol. 14, pp. 955–961]. Срок хранения вышеперечисленных сенсоров представлен в табл. 1.

Ограничением применения представленных сенсоров является низкая стабильность и сложность изготовления.

2. Известны сенсоры для селективного распознавания и определения энантиомеров триптофана на основе следующих хиральных модификаторов: 3-neomenthylindene [L.R. Zagitova, V.N. Maistrenko, Y.A. Yarkaeva, V.V. Zagitov, R.A. Zilberg, P.V. Kovyazin and L.V. Parfenova, Novel chiral voltammetric sensor for tryptophan enantiomers based on 3-neomenthylindene as recognition element // J. Electroanal. Chem., 2021, vol. 880, pp. 114939–114949], GO-NiO/n-H-3MIHF [M. Shabani-Nooshabadi, M. Roostaee and H. Karimi-Maleh, Incorporation of graphene oxide–NiO nanocomposite and n-hexyl-3-methylimidazolium hexafluoro phosphate into carbon paste electrode: application as an electrochemical sensor for simultaneous determination of benserazide, levodopa and tryptophan // J. Iran. Chem. Soc., 2017, vol. 14, pp. 955–961], NH₂-GQDs/ β-CD [Q. Xiao, S. Lu, C. Huang, W. Su, S. Zhou, J. Sheng and S. Huang, An Electrochemical Chiral Sensor Based on AminoFunctionalized Graphene Quantum Dots/b-Cyclodextrin Modified Glassy Carbon Electrode for Enantioselective Detection of Tryptophan Isomers // J. Iran. Chem. Soc., 2017, vol. 14, pp. 1957–1970], Cu₂-β-CD/NH₂-CS-MWCNTs [P. Lei, Y. Zhou, G. Zhang, Y. Zhang, C. Zhang, S. Hong, Y. Yang, C. Dong and S. Shuang, A highly efficient chiral sensing platform for tryptophan isomers based on a coordination self-assembly // Talanta, 2019, vol. 195, pp. 306–312], NF/BPNSs-G₂-b-CD [J. Zou and J.-G. Yu, Nafion-Stabilized Black Phosphorus Nanosheets-Maltosyl-b-Cyclodextrin as a Chiral Sensor for Tryptophan Enantiomers // Mater. Sci. Eng. C Mater. Biol. Appl., 2020, vol. 112, pp. 110910], β-CD-PtNPs/GNs [Y.-X. Sun, D.-D. Zhang, Y. Sheng, D. Xu, R. Zhang and M. Bradley, Supramolecular assembly induced chiral interface for electrochemical recognition of tryptophan enantiomers // Anal. Methods, 2021, vol. 13, pp. 2011–2020], PLC/MWCNTs [D.M. Guo, Y.H. Huang, C. Chen, Y. Chen and Y.Z. Fu, A sensing interface for recognition of tryptophan enantiomers based on porous cluster-like nanocomposite films // New J. Chem., 2014, vol. 38, pp. 5880–5885], MWCNTs-HECS [J. Song, C. Yang, J. Ma, Q. Han, P. Ran and Y. Fu, Voltammetric chiral discrimination of tryptophan using a multilayer nanocomposite with implemented amino-modified beta-cyclodextrin as recognition element // Microchim. Acta, 2018, vol. 185, pp. 230], ПЭК-[Cu(L-Phe)₂] [Р.А. Зильберг, Л.Р. Загитова, И.В. Вакулин, Ю.А. Яркаева и Т.В. Берестова, Энантиоселективные вольтамперометрические сенсоры на основе аминокислотных комплексов Cu(II), Co(III), Zn(II) // Журн. Аналит. химии., 2021, т. 76, с. 1111-1122], GNP-CILE [A. Safavi and S. Momeni, Electrocatalytic oxidation of tryptophan at gold nanoparticle-modified carbon ionic liquid electrode // Electroanalysis, 2010, vol. 22, pp. 2848–2855], nanoAu-MWCNTs [M. Kooshki, H. Abdollahi, S. Bozorgzadeh and B. Haghighi, Second-order data obtained from differential pulse voltammetry: Determination of tryptophan at a gold nanoparticles decorated multiwalled carbon nanotube modified glassy carbon electrode // Electrochim. Acta, 2011, vol. 56, pp. 8618–8624], NH₂-β-CD/Au@Pt/PEI/MWCNTs [J. Xu, Q. Wang, C. Xuan, Q. Xia, X. Lin and Y. Fu, Chiral recognition of tryptophan enantiomers based on beta-cyclodextrin-platinum nanoparticles/graphene nanohybrids modified electrode // Electroanalysis, 2016, vol. 28, pp. 868–873], PAP/α-CD, PAP/β-CD, PAP/γ-CD [R. A. Zilberg, V.N. Maistrenko, Y.A. Yarkaeva and D.I. Dubrovsky, An Enantioselective Voltammetric Sensor System Based on Glassy Carbon Electrodes Modified by Polyarylenephthalide Composites with α-, β-, and γ-Cyclodextrins for Recognizing D- and L-Tryptophans // J. Anal. Chem., 2019, vol. 74, pp. 1245-1255], BTPM [Y.A. Yarkaeva, E.N. Islamuratova, L.R. Zagitova, V.Y. Gus’kov, R.A. Zil’berg and V.N. Maistrenko, A sensor for the recognition and determination of tryptophan enantiomers based on carbon-paste electrode modified by enantiomorphic crystals of bromotriphenylmethane // J. Anal. Chem., 2021, vol. 76, pp. 1345–1354]. Сравнение аналитических характеристик приведено в табл. 2.

Представленные сенсоры имеют следующие основные ограничения их применения: высокий предел обнаружения, узкий линейный диапазон концентраций, низкое значение разности потенциалов (ΔE_p), а также коэффициента энантиоселективности (i_p1/i_p2).

3. Известны сенсоры для селективного распознавания и определения энантиомеров триптофана на основе молекулярного импринтинга (МИП): Nafion-MIP-MWCNTs@IL [Y. Xia, F. Zhao and B. Zeng, A molecularly imprinted copolymer based electrochemical sensor for the highly sensitive detection of L-tryptophan // Talanta, 2020, vol. 206, pp. 120245], GE/molecularly imprinted Ppy [V. Ratautaite, E. Brazys, A. Ramanaviciene and A. Ramanavicius, Electrochemical sensors based on L-tryptophan molecularly imprinted polypyrrole and polyaniline // J. Electroanal. Chem., 2022, vol. 917, pp. 116389], MIP-MWCNTs [Y. Wu, P. Deng, Y. Tian, Z. Ding, G. Li, J. Liu, Z. Zuberi and Q. He, Rapid recognition and determination of tryptophan by carbon nanotubes and molecularly imprinted polymer-modified glassy carbon electrode // Bioelectrochemistry, 2020, vol. 131, pp. 107393], MIP/GCE [N. Mahdi, M. Roushani and Z.M. Karazan, Electrochemical sensor based on molecularly imprinted copolymer for selective and simultaneous determination of riboflavin, dopamine, and L-tryptophan // J. Mol. Recognit., 2023, vol. 36, pp. e3053], MIOPPy/MnO₂/CF [L. Dong, X. Liu, H. Xu, D. Wu, S. Gao, L. Zhong and Y. Kong, Improved chiral electrochemical recognition of tryptophan enantiomers based on three - dimensional molecularly imprinted overoxidized polypyrrole/MnO2/carbon felt composites // Chirality, 2019, vol. 31, pp. 917–922], MIP/ABPE [T. Deng, W. Ding, Li. Liu and He, A simple and efficient molecularly imprinted electrochemical sensor for the selective determination of tryptophan // Biomolecules, 2019, vol. 9, pp. 294], ABPE/GR [P. Deng, Z. Xu and Y. Feng, Acetylene black paste electrode modified with graphene as the voltammetric sensor for selective determination of tryptophan in the presence of high concentrations of tyrosine // Mater. Sci. Eng. C., 2014, vol. 35, pp. 54–60], [Y.-J. Li, L.-L. Yang, L. Ni, J.-M. Xiong, J.-Y. He, L.-D. Zhou, L. Luo, Q.-H. Zhang, C.-S. Yuan, Constructing electrochemical sensor using molecular-imprinted polysaccharide for rapid identification and determination of L-tryptophan in diet // Food Chem., 2023, vol. 425, pp. 136486], MIP/CNT-CPE [M. Akhoundiana, T. Alizadeha, M.R. Ganjalia and P. Norouzia, Ultra-trace detection of methamphetamine in biological samples using FFT square wave voltammetry and nano-sized imprinted polymer/MWCNTs-modified electrode // Talanta, 2019, vol. 200, pp. 115–123]. В табл. 3 представлены аналитические характеристики МИП сенсоров, описанных в литературе.

Основными ограничениями представленных МИП-сенсоров являются сложная методика изготовления и необходимость качественного удаления молекул темплатов для получения воспроизводимых результатов.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка экспрессного, недорогостоящего, стабильного и высокочувствительного энантиоселективного вольтамперометрического сенсора, обладающего возможностью определять энантиомерную чистоту биологически активной добавки «Триптофан» в модельных растворах, таблетированных формах и биологических жидкостях с помощью дифференциально-импульсной вольтамперометрии (ДИВ).

Техническим результатом изобретения является возможность определения содержания индивидуальных энантиомеров оптически активного действующего вещества биологически активной добавки «Триптофан» в модельных растворах, биологических жидкостях, а также таблетированных формах различных производителей с использованием вольтамперометрического метода.

Поставленная задача решается, а указанный технический результат достигается за счет применения энантиоселективного вольтамперометрического сенсора на основе пастового электрода из графитированной термической сажи Carboblack C с хиральным модификатором – углеродными нанотрубками УНТ и гомохиральным цеолитом MFI (MFI-УНТ), взятым в соотношении MFI@ГПЭ : УНТ 1 массовая часть MFI@ГПЭ на 1 массовую часть УНТ.

Предложенное техническое решение отличается тем, что в качестве хиральных селекторов использованы коммерчески доступные углеродные нанотрубки и гомохиральный цеолит MFI, преимуществом использования которых является стабильность на воздухе и в водных растворах, что обеспечивает более длительный срок хранения предложенного сенсора, по сравнению с другими, описанными в литературе (Табл. 4).

Предложенное техническое решение отличается тем, что хиральный модификатор MFI-УНТ обеспечивает более низкий предел обнаружения, широкий линейный диапазон концентраций, высокий коэффициент энантиоселективности (i_p1/i_p2), большую разность Red/Ox потенциалов (ΔE_p), а также имеет низкую себестоимость, по сравнению с другими хиральными модификаторами, описанными в литературе (Табл. 4).

Предложенное техническое решение отличается тем, что при сопоставимых значениях линейного диапазона определяемых концентраций, энантиоселективность обеспечивается простой процедурой механического перемешивания хирального модификатора MFI-УНТ с частицами графитированной термической сажи Carboblack C без задействования методики молекулярного импринтинга (Табл. 4).

Предложенный стабильный энантиоселективный вольтамперометрический сенсор состоит из не менее трех основных компонентов – тела сенсора, выполненного из цилиндрического политетрафторэтиленного корпуса и платиновой проволоки в качестве электрического коллектора, графитированной термической сажи Carboblack C и хиральных селекторов, придающих сенсору способность к детектированию аналитического сигнала L-2-амино-3-(1H-индол-3-ил)пропионовой кислоты – углеродных нанотрубок и гомохирального цеолита MFI с размером каналов порядка 5.6~7.6 Å на пересечении которых образуются «хиральные ячейки», обеспечивающие энантиочувствительность. Для связывания смеси хирального селектора MFI-УНТ с графитированной термической сажи Carboblack С и создания пастообразной массы используется сквалан.

Реализацию предложенного хирального сенсора иллюстрирует следующий пример:

Методика приготовления MFI-УНТ@ГПЭ

Для приготовления пастообразного электрода смешали 0.06 г цеолита MFI и 1 г графитированной термической сажи Carboblack C. Затем к полученной смеси добавили 1.06 г углеродных нанотрубок УНТ и энергично перемешали полученную массу. Для образования однородной пасты к модифицированному Carboblack C добавляли две капли сквалана с последующим перемешиванием.

В табл. 4 представлены аналитические характеристики предложенного сенсора для распознавания и определения L- и D-энантиомеров Трп (n=5, P=0.95).

Таблица 4.

Сенсор MFI-УНТ@ГПЭ Предел обнаружения, моль/л 3.25*10^-7 М для L-Трп,
5.00*10^-7 М для D-Трп Линейный диапазон определяемых концентраций, моль/л 5·10^-6 до 1·10^-3 i _p1/i_p2 1.53 ΔE_p, мВ 30 Относительное стандартное отклонение, % 0.3–2.9 в модельных растворах
1.0–4.1 в плазме крови
0.9–3.4 в моче
1.3–2.2 для L-Трп в желатине,
диоксиде титана (Производитель: Scitec Nutrition)
1.2–3.7 для L-Трп в желатине, диоксиде титана, пантотенате кальция, пиридоксине гидрохлориде (Производитель: Эвалар, партия 282028)
1.4–3.3 для L-Трп в желатине, диоксиде титана, пантотенате кальция, пиридоксина гидрохлориде (Производитель: Эвалар, партия 412019) Правильность, % 100.0–104.0 в модельных растворах
92.0–100.4 в плазме крови
92.0–100.3 в моче
96.0–99.8 для L-Трп в желатине,
диоксиде титана (Производитель: Scitec Nutrition)
92.0–99.8 для L-Трп в желатине, диоксиде титана, пантотенате кальция, пиридоксине гидрохлориде (Производитель: Эвалар, партия 282028)
92.0–99.9 для L-Трп в желатине, диоксиде титана, пантотенате кальция, пиридоксина гидрохлориде (Производитель: Эвалар, партия 412019) Срок хранения, дни 30

Из представленных в табл. 4 аналитических характеристик следует, что разработанный энантиоселективный вольтамперометрический сенсор обладает хорошей стабильностью, широким линейным диапазоном определяемых концентраций, высоким коэффициентом энантиоселективности (i_p1/i_p2), разностью потенциалов (ΔE_p), а также низким пределом обнаружения, что позволяет проводить высокоточное количественное определение энантиомеров триптофана в модельных растворах, биологических жидкостях и биологически активных добавках без предварительного выделения активного вещества из таблетированных форм. Разработанный сенсор характеризуется низкой стоимостью, простотой изготовления, коммерческой доступностью всех его составляющих, а также воспроизводимостью результатов анализа.

Изобретение относится к области электроаналитической химии. Энантиоселективный вольтамперометрический сенсор на основе пастового электрода из графитированной термической сажи Carboblack C с хиральным модификатором – углеродными нанотрубками УНТ и гомохиральным цеолитом MFI (MFI-УНТ), взятым в соотношении MFI@ГПЭ : УНТ 1 массовая часть MFI@ГПЭ на 1 массовую часть УНТ. Изобретение обеспечивает возможность создания экспрессного, недорогостоящего, стабильного и высокочувствительного энантиоселективного вольтамперометрического сенсора для определения энантиомерной чистоты биологически активной добавки «Триптофан» в модельных растворах, таблетированных формах и биологических жидкостях с помощью дифференциально-импульсной вольтамперометрии. 4 табл.

Энантиоселективный вольтамперометрический сенсор на основе пастового электрода из графитированной термической сажи Carboblack C с хиральным модификатором – углеродными нанотрубками УНТ и гомохиральным цеолитом MFI (MFI-УНТ), взятым в соотношении MFI@ГПЭ : УНТ 1 массовая часть MFI@ГПЭ на 1 массовую часть УНТ.