ХИРАЛЬНЫЙ КОМПОЗИТНЫЙ ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИЧЕСКИЙ СЕНСОР ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭНАНТИОМЕРОВ НАПРОКСЕНА Российский патент 2023 года по МПК G01N27/26 G01N33/68 

Изобретение относится к области электроаналитической химии, а именно совершенствованию определения в водных растворах, моче и плазме крови оптически активного действующего вещества лекарственного препарата «Напроксен».

Энантиомерная чистота является важным показателем качества препарата «Напроксен», т.к. лечебный эффект оказывает только S-энантиомер действующего вещества. Присутствие R-энантиомера приводит к повышению дозы препарата, увеличению метаболической нагрузки на организм и возникновению нежелательных побочных эффектов. Кроме того, данный препарат выпускается большим количеством производителей, поэтому востребованным является доступный, недорогой и экспрессный контроль качества, совмещенный с определением энантиомерной чистоты препарата «Напроксен» и отслеживание особенностей метаболизма действующего вещества у индивидуальных пациентов при стационарном и амбулаторном лечении.

1. Известны сенсоры на основе стеклоуглеродного электрода (СУЭ), в которых в качестве связующего компонента использованы: поли(фен) [A. Kassa, A. Benor, G. T. Tigineh and A. Abebe, Characterization and Application of a Synthesized Novel Poly(chlorobis(1,10-phenanthroline)resorcinolcobalt(II) chloride)- Modified Glassy Carbon Electrode for Selective Voltammetric Determination of Cefadroxil in Pharmaceutical Formulations, Human Urine, and Blood Serum Samples // ACS Omega, 2023, vol. 8, pp. 15181−15192.], поли(L-Cys) [E. Sohoulia, M. Ghalkhani, M. Rostami, M. Rahimi-Nasrabadi and F. Ahmadi, A noble electrochemical sensor based on TiO2@CuO-N-rGO and poly (Lcysteine) nanocomposite applicable for trace analysis of flunitrazepam // Mater. Sci. Eng., 2020, no. 117, pp. 111300.], поли(L-Arg) [S. K. Anand, M. R. Mathew, J. Radecki, H. Radecka and K. G. Kumar, Individual and simultaneous voltammetric sensing of norepinephrine and tyramine based on poly(L-arginine)/reduced graphene oxide composite film modified glassy carbon electrode // J. Electroanal. Chem., 2020, vol. 878, pp. 114531.], PoAP [L. Zhang and L.-L. Wang, Electrochemical Synthesis of a Polyaniline Network on a Poly(o-aminophenol) Modified Glassy Carbon Electrode and Its Use for the Simultaneous Determination of Ascorbic Acid and Uric Acid // Anal. Sci., 2012, vol. 28, pp. 1001-1007; W. Wen, D.-M. Zhao, X.-H. Zhang, H.-Y. Xiong, S.-F.Wang, W. Chen and Y.-D. Zhao, One-step fabrication of poly(o-aminophenol)/multi-walled carbon nanotubes composite film modified electrode and its application for levofloxacin determination in pharmaceuticals // Sens. Actuators, B, 2012, vol. 174, pp. 202–209.]. Эффективная площадь поверхности (А) и сопротивление переносу заряда (R_et) известных композитных сенсоров представлены в таблице 1.

Таблица 1.

Сенсор A, мм² R _et,Ом СУЭ/поли(фен) 2.8 4950 СУЭ/поли(L-Cys) 4.7 435 СУЭ/поли(L-Arg) 5.9 3156 СУЭ/PoAP 9.7 10000

Недостатками данных сенсоров являются низкая эффективная площадь поверхности и высокое сопротивление переносу заряда.

2. Известны сенсоры для определения энантиомеров напроксена, в которых в качестве хирального модификатора использованы BSA/TBO@rGO [L. Guo, Y. Huang, Q. Zhang, C. Chen, D. Guo, Y. Chen and Y. Fu, Electrochemical Sensing for Naproxen Enantiomers Using Biofunctionalized Reduced Graphene Oxide Nanosheets // J. Electrochem. Soc., 2014, vol. 161, no. 4, pp. B70-B74.], L-Cys/rGO [M. Jafari, J. Tashkhourian and G. Absalan, Electrochemical Sensor for Enantioselective Recognition of Naproxen Using L-Cysteine/Reduced Graphene Oxide Modified Glassy Carbon Electrode // Anal. Bioanal. Chem. Res., 2020, vol. 7, no. 1, pp. 1-15.], L-Cys/AuNPs/Au [A. Afkhami, F. Kafrashi, M. Ahmadi and T. Madrakian, A new chiral electrochemical sensor for the enantioselective recognition of naproxen enantiomers using l-cysteine self-assembled over gold nanoparticles on a gold electrode // RSC Adv., 2015, vol. 5, pp. 58609-58615.], rGO-TsPro-Cs [L. Zagitova, Y. Yarkaeva, V. Zagitov, M. Nazyrov, S. Gainanova and V. Maistrenko, Voltammetric chiral recognition of naproxen enantiomers by N-tosylproline functionalized chitosan and reduced graphene oxide based sensor // J. Electroanal. Chem., 2022, vol. 922, pp. 116744.]. В таблице 2 представлены аналитические характеристики некоторых модификаторов, описанных в литературе.

Таблица 2.

Сенсор Предел обнаружения, Мкмоль/л Линейный диапазон определяемых концентраций, моль/л i _p1/i_p2 ΔE_p, мВ СУЭ/BSA/TBO@rGO 0.33 5.0·10^-4 – 5.0·10^-3 - - СУЭ/L-Cys/rGO 0.35 для S- энантиомера
2.5 для R- энантиомера 5.0·10^-6 – 1.3·10^-4 3.4 220 СУЭ/L-Cys/AuNPs/Au 0.67 2.0·10^-6 – 2.0·10^-7 5.4 110 СУЭ/rGO-TsPro-Cs 0.9 для S- энантиомера 0.4 для R- энантиомера 2.0·10^-5 – 5.0·10^-4 - -

Недостатками данных сенсоров являются высокое значение предела обнаружения и узкий линейный диапазон концентраций.

3. Известны сенсоры для определения энантиомеров напроксена на основе молекулярного импринтинга (МИП): МИП/МУНТ/Fe₃O₄-CuO-ZnO [M. Vahidifar, Z. Es’haghi, N. M. Oghaz, A. A. Mohammadi and M. S. Kazemi, Multi-template molecularly imprinted polymer hybrid nanoparticles for selective analysis of nonsteroidal anti-infammatory drugs and analgesics in biological and pharmaceutical samples // Environ. Sci. Pollut. Res., 2022, vol. 29, pp. 47416-47435.], МИП@CDs [K. Li, M. Zhang, X. Ye, Y. Zhang, G. Li, R. Fu and X. Chen, Highly sensitive and selective detection of naproxen via molecularly imprinted carbon dots as a fluorescent sensor // RSC Adv., 2021, vol. 11, pp. 29073–29079.]. В таблице 3 представлены аналитические характеристики МИП сенсоров, описанных в литературе.

Таблица 3.

Сенсор Предел обнаружения, Мкмоль/л Линейный диапазон определяемых концентраций, моль/л i _p1/i_p2 ΔE_p, мВ УПЭ/МИП/МУНТ/Fe₃O₄-CuO-ZnO 0.001 5.0·10^-9 – 1.0·10^-4 - - МИП@CDs 0.03 5.0·10^-8 – 4.0·10^-6 - -

Недостатком МИП-сенсоров является использование сложной методики изготовления и необходимость качественного удаления молекул темплатов для получения воспроизводимых результатов.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка доступного, недорого вольтамперометрического сенсора, который позволяет экспрессно определять энантиочистоту препарата «Напроксен» в водных растворах, моче и плазме крови с помощью дифференциально-импульсной вольтамперометрии (ДИВ).

Техническим результатом изобретения является создание возможности определения содержания в водных растворах, моче и плазме крови индивидуальных энантиомеров оптически активного действующего вещества лекарственного препарата «Напроксен» электроаналитическим методом.

Поставленная задача решается, а указанный технический результат достигается за счет применения хирального вольтамперометрического сенсора для селективного распознавания и определения энантиомеров напроксена, выполненного из стеклоуглерода с нанесенным композитным модификатором, состоящим из смеси полиэлектролитного комплекса хитозан-сукцинамид хитозана и хелатных комплексов общей структуры [Me(Ln)_x(Ln’)_y] или [Me(Ln)_x(Ln’)_y(H2O)_z], где Me ион Cu(II) или Zn(II); Ln и Ln' энантиомеры α-аминокислот, неэлектроактивных в доступной области потенциалов; взятых в соотношении 0.002 - 0.02 г хелатного комплекса на 2мл 0.005% раствора полиэлектролитного комплекса хитозан-сукцинамид хитозана.

Предложенное техническое решение отличается тем, что в качестве связующего компонента использован полиэлектролитный комплекс хитозан-сукцинамид хитозана (ПЭК), преимуществом которого являются более выраженные оптически активные свойства, биосовместимость, а также снижение сопротивления переносу заряда и увеличение эффективной площади поверхности (Табл. 4).

Предложенное техническое решение отличается тем, что в качестве хирального модификатора использованы хелатные комплексы общей структуры [Me(Ln)_x(Ln’)_y] или [Me(Ln)_x(Ln’)_y(H2O)_z], где Me ион Cu(II) или Zn(II); Ln и Ln' энантиомеры α-аминокислот, неэлектроактивные в доступной области потенциалов, преимуществами которых являются дешевизна модификатора, простота получения, более низкий предел обнаружения и широкий линейный диапазон концентраций, при сопоставимых значениях коэффициентов энантиоселективности (i_p1/i_p2 и разность Red/Ox потенциалов –ΔE_p) (Табл. 4).

Предложенное техническое решение отличается тем, что при сопоставимых значениях линейного диапазона определяемых концентраций энантиоселективность обеспечивается простой процедурой нанесения хирального модификатора в смеси с ПЭК без задействования методики молекулярного импринтинга. (Табл. 4)

Предложенный хиральный сенсор представляет собой стеклоуглеродный электрод в сочетании с необходимыми химическими компонентами, которые придают сенсору способность детектировать аналитический сигнал натриевой соли (S)-6-метокси-α-метил-2-нафталинуксусной кислоты. Хиральный композитный вольтамперометрический сенсор содержит не менее трех основных компонентов – тело сенсора, хиральный модификатор и связующее. Тело сенсора представляет собой запрессованный во фторопластовую трубку стержень с диаметром 2±0.5 мм, выполненный из стеклоуглерода, который характеризуется электропроводностью, инертностью, а также отсутствием хиральности и отсутствием пористой структуры поверхности. Способность к детектированию энантиомеров обеспечивается нанесением на рабочую поверхность тела сенсора хирального модификатора, представляющего собой хелатные комплексы общей структуры [Me(Ln)_x(Ln’)_y] или [Me(Ln)_x(Ln’)_y(H2O)_z], где Me ион Cu(II) или Zn(II); Ln и Ln' энантиомеры α-аминокислот, неэлектроактивных в доступной области потенциалов. Число лигандов (х+y) варьируется от 2 до 3, число молекул воды во внутренней координационной сфере (z) от 0 до 1.  Для нивелирования диэлектрических свойств хирального модификатора, его закрепления на рабочей поверхности тела сенсора и увеличения эффективной площади поверхности сенсора, модификатор наносится в смеси со связующим компонентом. В качестве связующего компонента используется токопроводящий полиэлектролитный комплекс хитозан-сукцинамид хитозана.

Реализацию предложенного хирального сенсора иллюстрируют следующие примеры:

1) Методика приготовления СУЭ/ПЭК–[Cu(S-Ala)₂]–[Cu(S-Phe)₂]

Натриевая соль сукцинамида хитозана (молекулярная масса 200 кДа) получена из хитозана со степенью деацетилирования 82 % и степенью модификации по аминогруппам 75 %. Хитозан гидрохлорид брали в виде пленки, полученной из солянокислого раствора хитозана, который готовили растворением 0.25 г хитозана (молекулярная масса 30 кДа) со степенью деацетилирования 75 % в 50 мл 1 % раствора HCl. Пленки сушили на воздухе с последующей сушкой в вакууме до постоянной массы. Водные дисперсии ПЭК получали при температуре 25°С добавлением сукцината хитозана (0.005 %) к водным растворам гидрохлорида хитозана (0.005 %) по каплям при интенсивном перемешивании (500 об/мин) с интервалом между дозами 2 мин. При добавлении к полученному раствору новых порций раствора гидрохлорида хитозана происходило фазовое расслоение (образуется устойчивая опалесценция общей системы). Область существования дисперсий частиц ПЭК этих полисахаридов ограничена молярным соотношением, равным 0.1, выше которого уже в процессе смешения компонентов наблюдается осаждение комплекса. Для получения композита взвешенную порцию 0.002 г смеси [Cu(S-Ala)₂] и [Cu(S-Phe)₂] (1:1 масс.) растворяли в 2 мл ПЭК и выдерживали в течение 6 мин в ультразвуковой ванне с последующей фильтрацией на белом ленточном фильтре.

2) Методика приготовления СУЭ/ПЭК–[Zn(S-Ala)₂(H₂O)]–[Zn(S-Phe)₂(H₂O)]

Натриевая соль сукцинамида хитозана (молекулярная масса 200 кДа) получена из хитозана со степенью деацетилирования 82 % и степенью модификации по аминогруппам 75 %. Хитозан гидрохлорид брали в виде пленки, полученной из солянокислого раствора хитозана, который готовили растворением 0.25 г хитозана (молекулярная масса 30 кДа) со степенью деацетилирования 75 % в 50 мл 1 % раствора HCl. Пленки сушили на воздухе с последующей сушкой в вакууме до постоянной массы. Водные дисперсии ПЭК получали при температуре 25°С добавлением сукцината хитозана (0.005 %) к водным растворам гидрохлорида хитозана (0.005 %) по каплям при интенсивном перемешивании (500 об/мин) с интервалом между дозами 2 мин. При добавлении к полученному раствору новых порций раствора гидрохлорида хитозана происходило фазовое расслоение (образуется устойчивая опалесценция общей системы). Область существования дисперсий частиц ПЭК этих полисахаридов ограничена молярным соотношением, равным 0.1, выше которого уже в процессе смешения компонентов наблюдается осаждение комплекса. Для получения композита взвешенную порцию 0.002 г смеси [Zn(S-Ala)₂(H₂O)] и [Zn(S-Phe)₂(H₂O)] (1:1 масс.) растворяли в 2 мл ПЭК и выдерживали в течение 6 мин в ультразвуковой ванне с последующей фильтрацией на белом ленточном фильтре. Аналитические характеристики предложенных сенсоров по результатам дифференциально-импульсного вольтамепреометрического определения S- и R-энантиомеров действующего вещества препарата «Напроксен» (n = 5, P = 0.95) представлены в таблице 4.

Таблица 4.

Сенсор СУЭ/ПЭК–[Cu(S-Ala)₂]–[Cu(S-Phe)₂] СУЭ/ПЭК–[Zn(S-Ala)₂(H₂O)]–[Zn(S-Phe)₂(H₂O)] Предел обнаружения, Мкмоль/л 0.30 для S-энантиомера
0.38 для R- энантиомера 0.38 для S- энантиомера
0.42 для R- энантиомера Линейный диапазон определяемых концентраций, моль/л 2.5·10^-5–1.0·10^-3 5.0·10^-5– 1.0·10^-3 i _p1/i_p2 1.27 1.12 ΔE_p, мВ 30 20 Sr, % 0.9–2.2 в модельных р-рах
2.4–3.8 в плазме крови
2.5–3.8 в моче 0.9–1.9 в модельных р-рах
2.2–4.7 в плазме крови
2.0–3.1 в моче Правильность, % 98.7–100.3 в модельных р-рах
96.0–99.9 в плазме крови
97.3–100.1 в моче 98.7–100.4 в модельных р-рах
96.0–99.6 в плазме крови
96.0–99.9 в моче A, мм² 11.51 10.33 R _et,Ом 245 250

Из представленных в таблице аналитических характеристик следует, что разработанные композитные вольтамперометрические сенсоры для селективного распознавания и определения энантиомеров напроксена, характеризуются высокой чувствительностью и точностью результатов измерений. Разработанные сенсоры успешно апробированы для определения энантиомеров напроксена в модельных растворах чистых энантиомеров и в биологических жидкостях. Данные сенсоры обладают широким линейным диапазоном определяемых концентраций, низкими пределами обнаружения, по значению коэффициента энантиоселективности (i_p1/i_p2) и ΔE_p данные сенсоры сопоставимы с ранее описанными в литературе. Основными преимуществами разработанных сенсоров являются доступность, простота изготовления, низкая стоимость и стабильность.

Изобретение относится к области электроаналитической химии, а именно к хиральному вольтамперометрическому сенсору для селективного распознавания и определения энантиомеров напроксена, выполненному из стеклоуглерода с нанесенным композитным модификатором, состоящим из смеси полиэлектролитного комплекса хитозан-сукцинамид хитозана и хелатных комплексов общей структуры [Me(Ln)_x(Ln’)_y] или [Me(Ln)_x(Ln’)_y(H2O)_z], где Me - ион Cu(II) или Zn(II); Ln и Ln' - энантиомеры α-аминокислот, неэлектроактивных в доступной области потенциалов, взятых в соотношении 0.002-0.02 г хелатного комплекса на 2 мл 0.005% раствора полиэлектролитного комплекса хитозан-сукцинамид хитозана. Техническим результатом изобретения является возможность определения содержания в водных растворах, моче и плазме крови индивидуальных энантиомеров оптически активного действующего вещества лекарственного препарата «Напроксен» электроаналитическим методом. 4 табл.

Хиральный вольтамперометрический сенсор для селективного распознавания и определения энантиомеров напроксена, выполненный из стеклоуглерода с нанесенным композитным модификатором, состоящим из смеси полиэлектролитного комплекса хитозан-сукцинамид хитозана и хелатных комплексов общей структуры [Me(Ln)_x(Ln’)_y] или [Me(Ln)_x(Ln’)_y(H2O)_z], где Me - ион Cu(II) или Zn(II); Ln и Ln' - энантиомеры α-аминокислот, неэлектроактивных в доступной области потенциалов, взятых в соотношении 0.002-0.02 г хелатного комплекса на 2 мл 0.005% раствора полиэлектролитного комплекса хитозан-сукцинамид хитозана.