ЭНАНТИОСЕЛЕКТИВНЫЙ КОМПОЗИТНЫЙ ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИЧЕСКИЙ СЕНСОР НА ОСНОВЕ КОМБИНАЦИИ АЛЮМОФОСФАТНОГО ЦЕОЛИТА AlPO4-11 И БЕТУЛИНОВОЙ КИСЛОТЫ Российский патент 2024 года по МПК G01N27/36 G01N27/327 

Изобретение относится к области электрохимии и может быть использовано для улучшения энантиоселективности распознавания и определения оптически активного действующего вещества лекарственного препарата «Напроксен» в модельных растворах, а также биологических жидкостях (моча, плазма крови).

Лекарственный препарат «Напроксен» представляет собой нестероидный противовоспалительный анальгетик, используемый для лечения ряда воспалительных заболеваний, например ревматоидный артрит, болезнь Бехтерева, первичная дисменорея и острая подагра. Поскольку на фармацевтическом рынке представлено большое количество вариантов лекарственных форм данного препарата, выпускаемых различными производителями, актуальной аналитической задачей является недорогой, высокочувствительный и экспрессный контроль его качества. Одним из важнейших показателей качества лекарственного препарата «Напроксен» является энантиочистота, так как только S-энантиомер действующего вещества оказывает лечебное действие. Фармацевтическая активность S-энантиомера в 28 раз сильнее, чем у R-энантиомера. Содержание R-энантиомера оказывает гепатотоксичное действие на организм, приводящее к серьезным осложнениям и увеличению метаболической нагрузки.

Решение указанной задачи возможно путем применения вольтамперометрии в различных вариантах (дифференциально- импульсной, циклической) с использованием энантиоселективных вольтамперометрических сенсоров.

Известны вольтамперометрические сенсоры, состоящие из различных полимерных связующих компонентов, нанесенных на рабочую поверхность стеклоуглеродного электрода (СУЭ):

СУЭ/поли(фен) [A. Kassa, A. Benor, G. T. Tiginehand A. Abebe, Characterization and Application of a Synthesized Novel Poly(chlorobis(1,10-phenanthroline)resorcinol cobalt(II) chloride)- Modified Glassy Carbon Electrode for Selective Voltammetric Determination of Cefadroxilin Pharmaceutical Formulations, Human Urine, and Blood Serum Samples // ACS Omega, 2023, vol. 8, pp. 15181-15192.];

- СУЭ/поли(L-Arg) [S. K. Anand, M. R. Mathew, J. Radecki, H. Radecka and K. G. Kumar, Individual and simultaneous voltammetric sensing of norepinephrine and tyramine based on poly(L-arginine)/reduced graphene oxide composite film modified glassy carbon electrode // J. Electroanal. Chem., 2020, vol. 878, pp. 114531.];

- СУЭ/PoAP [L. Zhang and L.-L. Wang, Electrochemical Synthesis of a Polyaniline Network on a Poly(o-aminophenol) Modified Glassy Carbon Electrode and Its Use for the Simultaneous Determination of Ascorbic Acid and Uric Acid // Anal. Sci., 2012, vol. 28, pp. 1001-1007; W. Wen, D.-M. Zhao, X.-H. Zhang, H.-Y. Xiong, S.-F.Wang, W. Chen and Y.-D. Zhao, One-step fabrication of poly(o-aminophenol)/multi-walled carbon nanotubes composite film modified electrode and its application for levofloxacin determination in pharmaceuticals // Sens. Actuators, B, 2012, vol. 174, pp. 202-209.].

Электрохимические характеристики - эффективная площадь поверхности (А) и сопротивление переносу заряда (R_et) данных композитных сенсоров представлены в таблице 1.

Таблица 1. Сенсор A, мм² R_et,Ом СУЭ/поли(фен) 2.8 4950 СУЭ/поли(L-Arg) 5.9 3156 СУЭ/PoAP 9.7 10000

Основными недостатками представленных выше вольтамперометрических сенсоров являются пониженная эффективная площадь поверхности и высокое сопротивление переносу заряда.

Для селективного распознавания и определения энантиомеров напроксена известны композитные вольтамперометрические сенсоры на основе различных хиральных модификаторов, нанесенных на рабочую поверхность стеклоуглеродного электрода:

СУЭ/ПЭК-[Cu(S-Ala)₂]-[Cu(S-Phe)₂] и СУЭ/ПЭК-[Zn(S-Ala)₂(H2O)]-[Zn(S-Phe)₂(H2O)] [R.A. Zilberg, T.V. Berestova, R.R. Gizatov, Y.B. Teres, M.N. Galimov, E.O. Bulysheva, Chiral Selectors in Voltammetric Sensors Based on Mixed Phenylalanine/Alanine Cu(II) and Zn(II) Complexes // Inorganics, 2022, vol. 10, pp. 117];

BSA/TBO@rGO [L. Guo, Y. Huang, Q. Zhang, C. Chen, D. Guo, Y. Chenand Y. Fu, Electrochemical Sensing for Naproxen Enantiomers Using Biofunctionalized Reduced Graphene Oxide Nanosheets // J. Electrochem. Soc., 2014, vol. 161, no. 4, pp. B70-B74.];

L-Cys/rGO [M. Jafari, J. Tashkhourian and G. Absalan, Electrochemical Sensor for Enantioselective Recognition of Naproxen Using L-Cysteine/Reduced Graphene Oxide Modified Glassy Carbon Electrode // Anal. Bioanal. Chem. Res., 2020, vol. 7, no. 1, pp. 1-15.];

L-Cys/AuNPs/Au [A. Afkhami, F. Kafrashi, M. Ahmadi and T. Madrakian, A new chiral electrochemical sensor for the enantioselective recognition of naproxen enantiomers using l-cysteine self-assembled over gold nanoparticles on a gold electrode // RSC Adv., 2015, vol. 5, pp. 58609-58615.];

rGO-TsPro-Cs [L. Zagitova, Y. Yarkaeva, V. Zagitov, M. Nazyrov, S. Gainanova and V. Maistrenko, Voltammetric chiral recognition of naproxen enantiomers by N-tosylproline functionalized chitosan and reduced graphene oxide based sensor // J. Electroanal. Chem., 2022, vol. 922, pp. 116744.];

СУЭ/β-CD/EG [S. Ebrahimi, A. Afkhami and T. Madrakian, Target -responsive host-guest binding driven dual-sensing readout for enhanced electrochemical chiral analysis // The Analyst, 2021, vol. 146, no. 15, pp. 4865-4872.].

Электрохимические параметры представленных выше композитных сенсоров, представлены в таблице 2, где i_p1/i_p2 - отношение токов пиков энантиомеров, ΔE_p - разница в потенциалах окисления энантиомеров.

Таблица 2. Сенсор Предел обнаружения, Мкмоль/л Линейный диапазон определяемых концентраций, моль/л i_p1/i_p2 ΔE_p, мВ СУЭ/ПЭК-[Cu(S-Ala)₂]-[Cu(S-Phe)₂] 0.30 для S- энантиомера
0.38 для R- энантиомера 2.5⋅10^-5-1.0⋅10^-3 1.27 30 СУЭ/ПЭК-[Zn(S-Ala)₂ (H₂O)]-[Zn(S-Phe)₂(H₂O)] 0.38 для S- энантиомера
0.42 для R- энантиомера 2.5⋅10^-5-1.0⋅10^-3 1.12 20 СУЭ/BSA/TBO@rGO 0.33 5.0⋅10^-4 - 5.0⋅10^-3 - - СУЭ/L-Cys/rGO 0.35 для S- энантиомера
2.5 для R- энантиомера 5.0⋅10^-6 - 1.3⋅10^-4 3.4 220 СУЭ/L-Cys/AuNPs/Au 0.67 2.0⋅10^-6 - 2.0⋅10^-7 5.4 110 СУЭ/rGO-TsPro-Cs 0.9 для S- энантиомера 0.4 для R- энантиомера 2.0⋅10^-5 - 5.0⋅10^-4 1.4 40 СУЭ/β -CD/EG 0.07 4⋅10^-7-6⋅10^-6 2.26 -

Основными недостатками представленных выше вольтамперометрческих сенсоров являются узкий линейный диапазон концентраций и высокое значение предела обнаружения.

Для селективного распознавания и определения энантиомеров напроксена известны композитные вольтамперометрические сенсоры на основе молекулярного импринтинга (МИП):

МИП/МУНТ/Fe₃O₄-CuO-ZnO [M. Vahidifar, Z. Es’haghi, N.M. Oghaz, A.A. Mohammadi and M.S. Kazemi, Multi-template molecularly imprinted polymer hybrid nanoparticles for selective analysis of nonsteroidal anti-infammatory drugs and analgesics in biological and pharmaceutical samples // Environ. Sci. Pollut. Res., 2022, vol. 29, pp. 47416-47435.];

МИП@CDs [K. Li, M. Zhang, X. Ye, Y. Zhang, G. Li, R. Fu and X. Chen, Highly sensitive and selective detection of naproxen via molecularly imprinted carbon dots as a fluorescent sensor // RSC Adv., 2021, vol. 11, pp. 29073-29079.].

Электрохимические параметры представленных выше хиральных МИП сенсоров представлены в таблице 3.

Таблица 3. Сенсор Предел обнаружения, Мкмоль/л Линейный диапазон определяемых концентраций, моль/л i_p1/i_p2 ΔE_p, мВ УПЭ/МИП/МУНТ/Fe₃O₄-CuO-ZnO 0.001 5.0⋅10^-9 -1.0⋅10^-4 - - МИП@CDs 0.03 5.0⋅10^-8 -4.0⋅10^-6 - -

Основными недостатками представленных выше МИП-сенсоров являются необходимость полного удаления молекул темплатов из МИП-сенсора для получения воспроизводимых результатов и сложная методика изготовления.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка доступного, простого в изготовлении и недорогого композитного вольтамперометрического сенсора с достаточной энантиоселективностью, позволяющего быстро определять энантиочистоту оптически активного действующего вещества лекарственного препарата «Напроксен» в модельных растворах, а также биологических жидкостях (моча, плазма крови) с помощью дифференциально-импульсной вольтамперометрии.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является возможность определения в широком линейном диапазоне дифференцированного по двум параметрам энантиоселективности (i_p1/i_p2, ΔE_p) сигнала энантиомеров напроксена за счет проявления синергетического эффекта бетулиновой кислоты с алюмофосфатным цеолитом AlPO4-11, нанесенных на поверхность сенсора.

Поставленная задача решается, а указанный технический результат достигается за счет применения энантиоселективного вольтамперометрического сенсора, выполненного из стеклоуглеродного электрода с нанесенным на рабочую поверхность композитным хиральным модификатором, состоящим из смеси полиэлектролитного комплекса хитозан-сукцинамид хитозана, бетулиновой кислоты и алюмофосфатного цеолита AlPO4-11, взятых в соотношении 1 мл смеси полиэлектролитного комплекса с бетулиновой кислотой к 4 мг алюмофосфатного цеолита.

Предложенный энантиоселективный вольтамперометрический сенсор представляет собой стеклоуглеродный электрод с нанесенной на рабочую поверхность комбинации из необходимых химических компонентов, которые придают сенсору способность детектировать аналитический сигнал натриевой соли (S)-6-метокси-α-метил-2-нафталинуксусной кислоты. Энантиоселективный композитный вольтамперометрический сенсор содержит не менее трех основных компонентов - тело сенсора, хиральный модификатор и связующее. Тело сенсора представляет собой запрессованный во фторопластовую трубку стержень с диаметром 2±0.5 мм, выполненный из стеклоуглерода, который характеризуется электропроводностью, инертностью, а также отсутствием хиральности и отсутствием пористой структуры поверхности. Способность к детектированию энантиомеров обеспечивается нанесением на рабочую поверхность тела сенсора хирального модификатора, представляющего собой бетулиновую кислоту. Для закрепления хирального модификатора на рабочей поверхности тела сенсора и увеличения эффективной площади поверхности сенсора, модификатор наносится в смеси со связующим компонентом и алюмофосфатным цеолитом AlPO4-11. В качестве связующего компонента используется токопроводящий полиэлектролитный комплекс хитозан-сукцинамид хитозана.

Преимуществом полиэлектролитного комплекса хитозан-сукцинамид хитозана являются более выраженные оптически активные свойства, биосовместимость, сниженное сопротивление переносу заряда, а также увеличенная эффективная площадь поверхности.

Введение в композит помимо бетулиновой кислоты частиц алюмофосфатного цеолита AlPO4-11 повышает эффективную площадь поверхности электрода и воспроизводимость измерений.

Представленный хиральный модификатор отличается от описанных в литературе сенсоров простотой получения, пониженным пределом обнаружения и широким линейным диапазоном концентраций, при сопоставимых значениях коэффициентов энантиоселективности (i_p1/i_p2 и разность Red/Ox потенциалов -ΔE_p).

Энантиоселективность обеспечивается простой процедурой нанесения хирального модификатора с AlPO4-11 в смеси с ПЭК без задействования методики молекулярного импринтинга при сопоставимых значениях линейного диапазона определяемых концентраций.

Реализацию предложенного хирального сенсора иллюстрируют следующие примеры.

Методика приготовления СУЭ/ПЭК-БК/ALPO4-11

Натриевая соль сукцинамида хитозана (молекулярная масса 200 кДа) получена из хитозана со степенью деацетилирования 82 % и степенью модификации по аминогруппам 75 %. Хитозан гидрохлорид брали в виде пленки, полученной из солянокислого раствора хитозана, который готовили растворением 0.25 г хитозана (молекулярная масса 30 кДа) со степенью деацетилирования 75 % в 50 мл 1 % раствора HCl. Пленки сушили на воздухе с последующей сушкой в вакууме до постоянной массы. Водные дисперсии ПЭК получали при температуре 25°С добавлением сукцината хитозана (0.005 %) к водным растворам гидрохлорида хитозана (0.005 %) по каплям при интенсивном перемешивании (500 об/мин) с интервалом между дозами 2 мин. При добавлении к полученному раствору новых порций раствора гидрохлорида хитозана происходило фазовое расслоение (образуется устойчивая опалесценция общей системы). Область существования дисперсий частиц ПЭК ограничивается мольным соотношением 1:10, выше которого в процессе смешения компонентов наблюдается осаждение ПЭК. Для изготовления сенсора 0.002 г хирального модификатора - бетулиновой кислоты добавляли к 10 мл ПЭК и помещали в ультразвуковую ванну на 15 мин. Далее к 1 мл смеси ПЭК-БК добавляли навеску цеолита AlPO4-11 (ALPO4-11 ) массой 0.004 г и перемешивали полученную смесь в течение 5 мин со скоростью 200 об/мин.

Методика приготовления СУЭ/ПЭК-БК

Натриевая соль сукцинамида хитозана (молекулярная масса 200 кДа) получена из хитозана со степенью деацетилирования 82 % и степенью модификации по аминогруппам 75 %. Хитозан гидрохлорид брали в виде пленки, полученной из солянокислого раствора хитозана, который готовили растворением 0.25 г хитозана (молекулярная масса 30 кДа) со степенью деацетилирования 75 % в 50 мл 1 % раствора HCl. Пленки сушили на воздухе с последующей сушкой в вакууме до постоянной массы. Водные дисперсии ПЭК получали при температуре 25°С добавлением сукцината хитозана (0.005 %) к водным растворам гидрохлорида хитозана (0.005 %) по каплям при интенсивном перемешивании (500 об/мин) с интервалом между дозами 2 мин. При добавлении к полученному раствору новых порций раствора гидрохлорида хитозана происходило фазовое расслоение (образуется устойчивая опалесценция общей системы). Область существования дисперсий частиц ПЭК ограничивается мольным соотношением 1:10, выше которого в процессе смешения компонентов наблюдается осаждение ПЭК.

Для изготовления сенсора 0.002 г хирального модификатора - бетулиновой кислоты добавляли к 10 мл ПЭК и помещали в ультразвуковую ванну на 15 мин.

Методика приготовления СУЭ/ПЭК- AlPO4-11

Натриевая соль сукцинамида хитозана (молекулярная масса 200 кДа) получена из хитозана со степенью деацетилирования 82 % и степенью модификации по аминогруппам 75 %. Хитозан гидрохлорид брали в виде пленки, полученной из солянокислого раствора хитозана, который готовили растворением 0.25 г хитозана (молекулярная масса 30 кДа) со степенью деацетилирования 75 % в 50 мл 1 % раствора HCl. Пленки сушили на воздухе с последующей сушкой в вакууме до постоянной массы. Водные дисперсии ПЭК получали при температуре 25°С добавлением сукцината хитозана (0.005 %) к водным растворам гидрохлорида хитозана (0.005 %) по каплям при интенсивном перемешивании (500 об/мин) с интервалом между дозами 2 мин. При добавлении к полученному раствору новых порций раствора гидрохлорида хитозана происходило фазовое расслоение (образуется устойчивая опалесценция общей системы). Область существования дисперсий частиц ПЭК ограничивается мольным соотношением 1:10, выше которого в процессе смешения компонентов наблюдается осаждение ПЭК. Для изготовления сенсора к 1 мл ПЭК добавляли навеску цеолита AlPO4-11 (ALPO4-11) массой 0.004 г и перемешивали полученную смесь в течение 5 мин со скоростью 200 об/мин.

Методика приготовления СУЭ/ПЭК

Натриевая соль сукцинамида хитозана (молекулярная масса 200 кДа) получена из хитозана со степенью деацетилирования 82 % и степенью модификации по аминогруппам 75 %. Хитозан гидрохлорид брали в виде пленки, полученной из солянокислого раствора хитозана, который готовили растворением 0.25 г хитозана (молекулярная масса 30 кДа) со степенью деацетилирования 75 % в 50 мл 1 % раствора HCl. Пленки сушили на воздухе с последующей сушкой в вакууме до постоянной массы. Водные дисперсии ПЭК получали при температуре 25°С добавлением сукцината хитозана (0.005 %) к водным растворам гидрохлорида хитозана (0.005 %) по каплям при интенсивном перемешивании (500 об/мин) с интервалом между дозами 2 мин. При добавлении к полученному раствору новых порций раствора гидрохлорида хитозана происходило фазовое расслоение (образуется устойчивая опалесценция общей системы). Область существования дисперсий частиц ПЭК ограничивается мольным соотношением 1:10, выше которого в процессе смешения компонентов наблюдается осаждение ПЭК.

Аналитические характеристики предложенных сенсоров по результатам дифференциально-импульсного вольтамперометрического определения S- и R- энантиомеров действующего вещества препарата «Напроксен» (n = 5, P = 0.95) представлены в таблице 4.

Таблица 4. Сенсор СУЭ/ПЭК-БК/ALPO4-11 СУЭ/ПЭК-БК СУЭ/ПЭК-ALPO4-11 СУЭ/ПЭК i_p1/i_p2 1.40 1.17 1.08 1.00 ΔE_p, мВ 60 60 50 40 A, мм² 9.8 8.2 11.3 10.33 R_et,Ом 649.9 867.9 251.4 250 Предел обнаружения, Мкмоль/л 0.15 для S-энантиомера
0.11 для R- энантиомера - - - Линейный диапазон определяемых концентраций, моль/л 2.5⋅10^-5-1.0⋅10^-3 - - - Относительное стандартное отклонение, % 1.4-2.1 в модельных р-рах
2.2-3.4 в плазме крови
2.3-3.3 в моче - - - Относительная погрешность, % 0.3-1.2 в модельных р-рах
0.8-3.0 в плазме крови
0.6-2.3 в моче - - - Оптимальный состав композита 1 мл ПЭК-БК к 4 мг ALPO4-11 - - -

Важность компонентов БК и ALPO4-11 в формировании энантиоселективности сенсора подтверждается представленными результатами. Так сенсор СУЭ/ПЭК не содержащий этих модификаторов характеризуется невысокой энантиоселективностью - отношение токов пиков энантиомеров i_p1/i_p2 =1, а разница в потенциалах окисления энантиомеров (ΔE_p) всего 40 мВ. Дополнительное введение в композицию ALPO4-11 или БК несколько увеличивает ΔE_p и i_p1/i_p2, что приводит к некоторому повышению энантиоселективности сенсора. Заметное увеличение энантиоселективности сенсора наблюдается только при совместном добавлении ALPO4-11 +БК в композицию (ΔE_p=60 мВ, i_p1/i_p2=1.40), что связано с проявлением синергетического эффекта модификаторов.

Таким образом, разработанный композитный энантиоселективный вольтамперометрический сенсор СУЭ/ПЭК-БК/ALPO4-11 для селективного распознавания и определения энантиомеров напроксена, характеризуется высокой энантиоселективностью и чувствительностью, точностью результатов измерений. Разработанные сенсоры успешно апробированы для определения энантиомеров напроксена в модельных растворах чистых энантиомеров и в биологических жидкостях. Данные сенсоры обладают широким линейным диапазоном определяемых концентраций, низкими пределами обнаружения, по значению коэффициента энантиоселективности (i_p1/i_p2) и ΔE_p данные сенсоры сопоставимы с ранее описанными в литературе. Основными преимуществами разработанных сенсоров являются доступность, простота изготовления, низкая стоимость и стабильность.

Изобретение относится к области электрохимии и может быть использовано для улучшения энантиоселективности распознавания и определения оптически активного действующего вещества лекарственного препарата «Напроксен» в модельных растворах, а также биологических жидкостях. Энантиоселективный композитный вольтамперометрический сенсор выполнен из стеклоуглеродного электрода с нанесенным на рабочую поверхность композитным хиральным модификатором, состоящим из смеси полиэлектролитного комплекса хитозан-сукцинамид хитозана, бетулиновой кислоты и алюмофосфатного цеолита AlPO4-11, взятых в соотношении 1 мл смеси полиэлектролитного комплекса с бетулиновой кислотой к 4 мг алюмофосфатного цеолита. Изобретение обеспечивает возможность определения в широком линейном диапазоне дифференцированного по двум параметрам энантиоселективности (i_p1/i_p2, ΔE_p) сигнала энантиомеров напроксена за счет проявления синергетического эффекта бетулиновой кислоты с алюмофосфатным цеолитом AlPO4-11, нанесенных на поверхность сенсора. 4 табл.

Энантиоселективный композитный вольтамперометрический сенсор, выполненный из стеклоуглеродного электрода с нанесенным на рабочую поверхность композитным хиральным модификатором, состоящим из смеси полиэлектролитного комплекса хитозан-сукцинамид хитозана, бетулиновой кислоты и алюмофосфатного цеолита AlPO4-11, взятых в соотношении 1 мл смеси полиэлектролитного комплекса с бетулиновой кислотой к 4 мг алюмофосфатного цеолита.