МОНОКЛОНАЛЬНЫЙ ИММУНОГЛОБУЛИН ЧЕЛОВЕКА КЛАССА IGGI ПРОТИВ АНТИГЕНА D СИСТЕМЫ РЕЗУС Российский патент 1997 года по МПК C12P21/08 A61K39/395 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для предотвращения сенсибилизации резус-отрицательных женщин резус-положительными эритроцитами плода во время беременности и после родов, т.е. для профилактики гемолитической болезни новорожденных (ГБН). В основе препарата лежат высокоочищенные моноклональные человеческие антитела класса IgGl, продуцируемые бессмертной гетерогибридомой. Антитела при введении их внутримышечно или внутривенно резус-отрицательной женщине в течение 24-72 ч после родов вызывают быстрый клиренс резус-положительных эритроцитов ребенка, которые в количестве 0,2 5 мл попадают в кровь матери при отделении плаценты и могут вызвать образование иммунных антител. Тот же препарат используется и у резус-отрицательных пациентов при переливании им тромбоцитов от резус-положительного донора, поскольку обязательная примесь резус-положительных эритроцитов донора в тромбомассе может вызвать сенсибилизацию больного.

В настоящее время для профилактики ГБН во всем мире используются препараты, изготавливаемые из сывороток резус-отрицательных людей, иммунных против D антигена системы резус. Производство таких препаратов снижается из-за уменьшения общего числа иммунных доноров и из-за постоянной выбраковки пулов сывороток, в которых обнаруживаются вирусы гепатитов или СПИДа. Проблемой является также вероятность внесения с препаратом патогенных вирусов человека. Идея использования моноклональных анти-резус антител для создания препарата для профилактики ГБН возникла сразу после получения первых клеточных линий-продуцентов моноклональных анти-D антител (Hughes-Jones N.C. 1988). В текстах in vitro и in vivo (Kumpel B.M. et al. 1989; Thompson A. et al. 1990) было показано, что анти-D антитела класса IgGl наиболее эффективно стимулируют механизм антителозависимого клеточного цитолиза в сравнении с антителами класса IgG3 (анти-D антитела практически всегда принадлежат к этим классам).

За рубежом получены клеточные линии, продуцирующие моноклональные анти-D антитела классов IgGl и 3, проведены выделение и очистка моноклональных антител, и на шимпанзе и донорах-добровольцах испытан моноклональный препарат (Blancher A. et al. 1992; Kumpel B.M. et al. 1995). Однако в работах были использованы трансформированные вирусом Эпштейн-Барра (EBV) лимфобластоидные клеточные линии. По нашим данным, даже после аффинного выделения иммуноглобулина из супернатантов таких линий не удается избавиться от вирусной ДНК. Поэтому для создания препарата была получена гетерогибридома HG-92, которая в процессе клонирований и культивирования утратила геном EBV, что показано методом полимеразной цепной реакции (Оловникова Н.И. 1994). Препарат на основе моноклональных анти-D антител класса IgGl, продуцируемых линий HG-92, прошел необходимые доклинические испытания. Испытана доза препарата, равная 150 мкг или 750 ME, что теоретически достаточно для лизиса 8 мл резус-положительных эритроцитов. Изучены его свойства в тестах in vitro (специфичность, титр, способность стимулировать антителозависимую цитотоксичность) и in vivo (клиренс эритроцитов). Показано, что характеристики препарата не изменяются при хранении в течение 3 лет при 2-8^oC, что свидетельствует о его высокой стабильности. После получения разрешения на клинические испытания препарат был введен 20-ти резус-отрицательным женщинам после рождения резус-положительного ребенка, совместимого с матерью по системе АВО. Показано, что препарат не вызывает никаких побочных реакций. Наблюдение за каждой пациенткой проводилось в течение двух месяцев, и ни у одной из них в этот срок не были обнаружены анти-D антитела, что подтверждает эффективность препарата для предотвращения сенсибилизации. В настоящее время предлагаемый препарат не имеет аналогов ни в России, ни за рубежом. Крупномасштабное культивирование линии-продуцента антител позволяет нарабатывать практически неограниченное количество антител, что актуально в связи с сокращением заготовок иммунных сывороток и почти полным прекращением снабжения родильных домов поликлональными препаратами для профилактики ГБН.

1. Получение бессмертной гетерогибридомной линии HG-92, секретирующей моноклональные анти-D антитела класса IgGl.

а) Лимфоциты для трансформации получены от резус-отрицательного донора, иммунного против D антигена системы резус. Донор здоров и в течение 3 лет после взятия крови для выделения мононуклеаров продолжал сдавать кровь, которая регулярно тестировалась на вирусы гепатитов, СПИДа с отрицательным результатом. Это является дополнительной гарантией того, что лимфоциты не были контаминированы патогенными вирусами человека, несмотря на отрицательные результаты анализов. Мононуклеары выделяли в градиенте плотности и трансформировали вирусом Эпштейна-Барр. В качестве источника вируса была использована линия B-95.8. Клетки культивировали в среде, содержащий вирус, в течение 2 ч и затем рассаживали в 96-ячеечные платы по 30000 на ячейку в присутствии Циклоспорина А 0,75 мкг/мл.

б) Через 3 нед была проведена селекция линий, секретирующих IgG анти-D антитела с помощью непрямого антиглобулинового метода (непрямой пробы Кумбса), и их клонирование на фидерном слое облученных гомотипических клеток (мононуклеары или клетки лимфобластоидной линии, не секретирующей антитела).

в) Клонированные линии наращивали и сливали с миеломой мыши P3-X63-Ag. 8.653 в присутствии полиэтиленгликоля м. в. 3000-3700. Селекцию гибридов проводили в среде с НАТ и уабаином.

г) Гетерогибридомы, секретирующие IgG анти-D антитела, клонировали методом лимитирующих разведений на макрофагах мыши. Линия HG-92 была получена в результате 5 последовательных клонирований со 100%-ным выходом антителопродуцирующих гибридов в двух последних.

д) Максимальное время непрерывного культивирования в роллерных флаконах объемом 2 л 6 мес без снижения титра антител в культуральной среде. Штамм HG-92 хранится в коллекции перевиваемых клеточных культур под номером ВСКК/П/631Д и имеет следующие признаки.

Культуральные признаки. Суспензионная культура в жидкой среде, пассирование 1:2 1:3 через 2-4 сут. Среда для культивирования: RPMI 1640,5% эмбриональной телячьей сыворотки, 10 мМ HEPES-буфера, 4 мМ L-глутамина, 2 мМ пирувата натрия, 5•10^-5 М 2-меркаптоэтанола, антибиотики. Оптимальной системой для культивирования является роллерная установка типа Bellco.

Криоконсервирование клеток. Клетки суспедируют в полной питательной среде и добавляют равный объем эмбриональной сыворотки с 20% диметилсульфоксида. Клетки в криоампулах помещают в холодильник 70^oC, через сутки переносят в жидкий азот.

Цитогенетические признаки. Модальное число хромосом 87 (37%), 6-8 хромосом человека.

Сведения о контаминации линии. Контаминации бактериями, грибами, микоплазмами, вирусами гепатита В, СПИДа, Эпштейна-Барр не обнаружено, другие вирусы не тестированы.

Характеристики моноклональных антител, продуцируемых штаммом. Антитела принадлежат а классу IgGl человека и специфично выявляют D антиген системы резус, не дают перекрестных реакций с другими эритроцитарными антигенами. Титр антител в культуральной жидкости составляет 1:1024 1:2048 в непрямом антиглобулиновом методе.

2. Разработка моноклонального препарата для профилактики гемолитической болезни новорожденных.

1. Выделение антител из супернатанта клеточной культуры. 3-4-дневную культуру клеток HG-92 центрифугируют при 1000 об/мин для отделения клеток, которые суспендируют в свежей среде (состав см. выше). Супернатант центрифугируют повторно при 5000 об/мин и затем концентрируют в 10 раз. Концентрированный супернатант фильтруют через стерилизующий фильтр с диаметром пор 0,22 мкм и пропускают через колонку с Протеин А Сефарозой (20 г) со скоростью около 100 мл/ч. После нанесения колонку промывают 0,1 М фосфатным буфером pH 7,0, затем 0,1 М фосфатно-цитратным буфером pH 5,4. Элюцию антител проводят 0,1 М фосфатно-цитратном буфером при pH 3,0. К фракции 3,0 по каплям прибавляют 1 М раствор NaOH при перемешивании до pH 6,8-7,0. Затем добавляют сухой глицин до концентрации 1% растворяют его и немедленно фильтруют раствор через фильтр с диаметром пор 0,22. Этот раствор иммуноглобулина в дальнейшем именуется концентрат.

2. Определение степени чистоты препарата. Проводят электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS) после кипячения пробы с 2-Меркаптоэтанолом. Препарат дает в электрофорезе 2 полосы, соответствующие легким и тяжелым цепям IgGl человека, что подтверждено иммуноблотингом с моноспецифичными антителами против цепей иммуноглобулинов человека.

3. Определение концентрации моноклонального иммуноглобулина. Концентрацию оценивают двумя способами: измеряют абсолютное значение концентрации по методу Бредфорда и сравнивают титр препарата с титром стандартного образца, содержащего известное число международных единиц активности (1 мкг равен 5-ти единицам). В качестве стандартов используются поликлональные анти-D иммуноглобулины производства Франции и Германии, которые сертифицируются международной референс-лабораторией в Лондоне.

4. Приготовление препарата. Готовый препарат получают путем разведения концентрата (пункт 1) забуференным физиологическим раствором pH 7,0 с 1% глицина. Перед разведением концентрат тестируют по следующей схеме:
определяют специфичность и титр анти-D антител непрямым антиглобулиновым методом со стандартными резус-положительными и резус-отрицательными эритроцитами;
определяют концентрацию белка по методу Бредфорда;
определяют pH;
проводят электрофоретическое исследование чистоты препарата;
проводят тестирование на пирогенность и стерильность согласно требованиям Фармакопеи. Готовый препарат должен содержать 150 мкг (750 ME) иммуноглобулина анти-D в одной дозе.

3. Пример приготовления серии моноклонального анти-D иммуноглобулина.

Все этапы приготовления препарата осуществляются в стерильных условиях с использованием стерильного апирогенного оборудования и посуды.

1. Размораживаем ампулу с 10⁸ криоконсервированных клеток гетерогибридомы HG-92 и культивируем в роллерном флаконе в объеме 300-350 мл в полной питательной среде (см. выше).

2. Через 3-4 сут считаем клетки и рассаживаем до плотности 0,25•10⁸/мл в свежей питательной среде, собирая при этом супернатант. Супернатант центрифугируем при 5000 об/мин и храним при 2-8^o. Через 5-6 пассажей объем супернатанта составляет 20 л.

3. Концентрируем 20 л супернатанта на установке Minetan до 2 л. Сразу после процедуры концентрирования фильтруем через мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм.

4. Пропускаем 2 л концентрированного супернатанта через колонку с Протеин А Сефарозой в течение 20 ч, после чего колонку промываем 500 мл фосфатного буфера pH 7,0, 200 мл фосфатно-цитратного буфера pH 5,4 и проводим элюцию связавшихся антител фосфатно-цитратным буфером pH 3,0, прослеживая за концентрацией белка в элюате с помощью увикорда. Объем фракции составляет около 200 мл.

5. Немедленно доводим pH до 6,8-7,0, добавляя по каплям 1 М раствор NaOH и мягко перемешивая. Для нейтрализации требуется добавить объем щелочи, составляющий 15% объема фракции 3,0, т.е. на 200 мл раствора антител необходимо 30 мл 1 М раствора NaOH. В пробе измеряем pH. Затем добавляем 1% (вес/объем), т.е. 2,3 г сухого глицина и фильтруем после полного растворения глицина через апирогенный фильтр с размером пор 0,22 мкм.

6. Берем пробу и готовим серию 2-кратных разведений в 96-луночном планшете на 24 ячейки (2 ряда) по 50 мкл/ячейку. Аналогично разводим стандарт (см. выше) и супернатант, прошедший через колонку (проскок), чтобы оценить процент несвязавшихся антител. В проскоке количество антител, оцененное по титру, не должно превышать 5% от общего количества иммуноглобулина. В каждую лунку вносим по 50 мкл 2% суспензии в физиологическом растворе трижды отмытых эритроцитов, тщательно перемешиваем и инкубируем при 37^oC. Через 45-60 мин эритроциты трижды отмываем физиологическим раствором и прибавляем в каждую лунку по 50 мкл антиглобулинового реагента. Результаты реакции учитываем визуально через 45-60 мин инкубации при комнатной температуре по форме осадка: при положительном результате осадок выстилает лунку или имеет неровные, загнутые края, при отрицательном результате осадок собирается на дне лунки в точку. Сравнивая титр в пробе и в стандарте, оцениваем содержание иммуноглобулина. Например, титр в стандарте 1:32000 и известно, что концентрация анти-D иммуноглобулина составляет 100 мкг/мл (500 ME), титр в исследуемом образце 1:256000. Это означает, что содержание специфического иммуноглобулина 800 мкг/мл (4000 ME). Одновременно измеряем концентрацию по методу Бредфорда. Расхождение не должно составлять более 20% Основным показателем концентрации специфического иммуноглобулина считается тот, который рассчитывается исходя по титру.

7. Пробу тестируем на пирогенность и стерильность согласно требованиям Фармакопеи.

8. Пробу концентрата анализируем на однородность в электрофорезе в 7,5% полиакриламидном геле с SDS после кипячения в течение 5 мин в присутствии 5% 2-меркаптоэтанола.

9. Если препарат специфичный, стерильный, апирогенный дает в электрофорезе 2 полосы, соответствующие тяжелым и легким цепям IgGl человека, то разводим его до концентрации 150 мкг/мл (750 ME/мл) с тем расчетом, чтобы в 1 мл содержалась 1 доза иммуноглобулина. Для разведения используется стерильный физиологический раствор или физиологический раствор, забуференный фосфатным буфером (PBS) с 1% глицина.

10. Стерильно разливаем в ампулы или флаконы.

Литература:
Оловникова Н. И. Белкина Е.В. Берковский А.Л. и др. Гематол и трансфузиол. 1994, т. 39, N 4, с. 3-6.

Blancher A. Socha W.W. Ruffie J. Vox Sang. 1992, V 63, pp 112-118.

Hughes-Jones N.S. Br.J.Haematol. 1988, V 70, N 3, pp 263-265.

Kumpel B. M. Leader K.A. Merry A.H. et al. Eur.J.Immunol, 1989, V 19, N 12, pp 2283-2288.

Kumpel B.M. Goodrick M.J. Pamphilon D.H. et al. Blood, 1995, V 86, N 5, pp 1701-1709.

Thomson A. Contreras M. Gorick B. et al. Lancet, 1990, V 336, N 8724, pp 1147-1150.

Использование: медицинская биотехнология, разработка препаратов для предотвращения гемолитической болезни новорожденных. Сущность изобретения: получение моноклонального иммуноглобулина человека к антигену D системы резус. Иммуноглобулин получают при использовании стабильной гетерогибридомы HG-92 типа человек - мышь. Доза геммуноглобулина, равная 150 мкг, достаточна для лизиса 8 мл резус - положительных эритроцитов.

Моноклональный иммуноглобулин человека класса JgGI против антигена D системы резус, продуцируемый гетерогибридомой HG-92 и используемый для предотвращения сенсибилизации резусотрицательных женщин и профилактики гемолитической болезни новорожденных.