Способ определения уровня посттрансплантационного химеризма путем оценки экспрессии антигенов системы Резус и Келл в гелевых картах Российский патент 2021 года по МПК C12Q1/68 C12N15/00 

Изобретение относится к области медицины, конкретно к способу оценки количества циркулирующих в крови реципиента донорских эритроцитов путем исследования резус-фенотипа пациента, а именно антигенов D, С, с, Е, е, а также K, после аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (алло-ТГСК). Способ включает в себя исследование резус-фенотипа в гелевых картах методом гемагглютинации моноклональными антителами в геле с последующей процентной оценкой популяций эритроцитов, несущих антиген донора либо реципиента, в соответствии с разработанной шкалой. Способ обеспечивает раннюю и точную диагностику динамики появления донорского кроветворения после алло-ТГСК, а также собственного кроветворения реципиента при рецидиве заболевания.

Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторной диагностике, основанной на разделении популяций эритроцитов методом гемагглютинации в геле с помощью моноклональных антител, в зависимости от присутствия антигена на поверхности исследуемых эритроцитов.

Цель изобретения - разработать способ оценки донорского эритроцитарного химеризма у реципиента после алло-ТГСК при помощи исследования антигенов системы Резус: D, С, с, Е, е, а также антигена K системы Келл.

Алло-ТГСК является важным методом лечения многих онкогематологических заболеваний и других болезней, поражающих кроветворную и иммунную системы [1]. По данным Европейского общества по трансплантации костного мозга (ЕВМТ) большинство алло-ТГСК выполняется при острых лейкозах и миелодиспластическом синдроме [2]. Несмотря на быстрое развитие альтернативных методов лечения, таких как таргетная терапия, клеточные технологии и иммуномодулирующие препараты, за последние 20 лет в мире отмечается увеличение количества алло-ТГСК [3].

В отличие от трансплантации солидных органов и трансфузий крови, при которых совместимость донора и реципиента по антигенам эритроцитарных систем АВО и Резус обязательна, при алло-ТГСК указанная совместимость оказалась не важна. Таким образом, антигенные различия эритроцитов позволяют использовать их для оценки посттрансплантационного статуса реципиента [4].

Известно, что у реципиентов с несовместимостью по системам Резус и Келл, без имеющихся аллоантител, риск развития иммунологических осложнений ниже, чем при АВО-несовместимости. АВО-несовместимость, вследствие действия естественных анти-А, анти-В-антител, ведет к отсроченному приживлению донорских эритрокариоцитов с редукцией эритроидного ростка вплоть до его аплазии [5].

Известен способ оценки эритроцитарного химеризма количественным методом дифференциальной агглютинации по Эшби в модификации лаборатории иммуногематологии ГНЦ РАМН. Учет эритроцитов с донорским фенотипом производится с помощью микроскопии, с определением количества агглютинированных, либо неагглютинированных клеток на плоскости. Недостатком способа является трудоемкость метода, сложность его применения в рутинной практике и невозможность автоматизации исследования и документирования результата [5].

Известен способ определения эритроцитарного химеризма с использованием флюоресцентных микросфер. Исследуемые эритроциты инкубируются с антителами IgG к определенным эритроцитарным антигенам (А, В, С, с, Е, D, K, Fya, Fyb, Jka, Jkb, M, N, S и s), после чего подвергаются нескольким отмывкам. Далее к обработанным эритроцитам добавляются флюоресцентные микросферы, покрытые иммуноглобулинами к человеческим антителам IgG, с последующим центрифугированием. Подсчет позитивных клеток проводится с помощью флюоресцентной микроскопии. Однако использование этого метода трудоемко и требует организации специальных условий для микроскопирования [6].

В настоящее время применяются цитогенетические и молекулярно-биологические методы оценки донорского химеризма, в качестве мишеней при которых используются различные ДНК-маркеры (повторы ДНК, либо варианты уникальных генов). Среди них выделяют метод флуоресцентной in situ гибридизации - FISH (fluorescence in situ hybridization), метод амплификации и анализа продуктов мультиплексной полимеразной цепной реакции коротких тандемных повторов (STR, short tandem repeat) и ПЦР в реальном времени (например, полиморфизмов инсерция/делеция (InDel). Эти методы отличаются высокой чувствительностью и специфичностью, однако они не отражают состояние эритроидного ростка кроветворения у реципиента, перенесшего аллоТГСК [7].

Анализ резус-фенотипа методом гемагглютинации в геле с моноклональными антителами с процентной оценкой количества эритроцитов донора и реципиента, в соответствии с разработанной шкалой, позволяет быстро и точно оценить восстановление эритроидного ростка кроветворения, а возможность документирования результата исследования - отслеживать изменения в динамике.

Техническим результатом заявляемого изобретения является создание способа исследования донорского химеризма путем исследования резус-фенотипа реципиента после алло-ТГСК в гелевых картах методом гемагглютинации в геле с моноклональными антителами с последующей процентной оценкой популяций эритроцитов, несущих антиген донора либо реципиента (рис. 1), в соответствии с разработанной шкалой, что необходимо для назначения пациенту адекватной сопроводительной терапии и прогнозирования восстановления кроветворения.

Для достижения указанного результата в соответствии с прототипом исследуют наличие антигенов D, С, с, Е, е, K на эритроцитах периферической крови донора ГСК и реципиента до проведения алло-ТГСК с последующим заключением о выявленных различиях. В отличие от аналогов, в которых применяются технически сложные и требующие специального оборудования методики, в данном способе применяется рутинный для большинства лабораторий метод гемагглютинации в геле с дальнейшей визуальной оценкой процента донорских эритроцитов в соответствии с разработанной калибровочной шкалой. Возможно документирование результата с помощью автоматического иммуногематологического анализатора и фотографирования карт.

В процессе проведения патентно-информационного поиска не выявлено источников, порочащих новизну предполагаемого изобретения.

Заявляемое изобретение разработано в лаборатории иммуногематологии ФГБУН КНИИГиПК ФМБА России в соответствии с планом научно-исследовательской работы.

Способ предусматривает следующую последовательность исследований:

Этап 1. Создание калибровочной шкалы. Путем исследования методом агглютинации в геле смеси двух популяций эритроцитов (с определяемым антигеном и без такового) с заданными процентными соотношениями популяций: 3%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%; создается эталонная шкала (рис. 2, 3, 4, 5, 6, 7).

Этап 2. Исследование резус-фенотипа и антигена K у донора ГСК и реципиента до проведения аллоТГСК с последующим анализом различий эритроцитарных антигенов. Взятие, пробоподготовку, хранение материала проводят в соответствии с инструкцией к используемому комплекту для исследований.

Этап 3. После проведения аллоТГСК проводят исследование отличающихся эритроцитарных антигенов методом агглютинации в геле. Визуально сравнивая получившийся результат со шкалой, делают заключение о проценте циркулирующих донорских эритроцитов в крови реципиента.

Проанализированы результаты исследования эритроцитарного донорского химеризма у 82 реципиентов аллоТГСК, получавших лечение в ФГБУН КНИИГиПК ФМБА России в 2013-2020 гг. Установлены различия по антигенам систем Резус и Келл в 61 паре донор - реципиент (73,2%). Наиболее часто встречался химеризм по эритроцитарному антигену С (28,1%). В качестве метки можно было использовать антигены E и с в 22,0% и 20,7% соответственно. По наличию антигена D донор с реципиентом отличались в 17,1% случаев алло-ТГСК. Реже встречались различия по K (9,8%).

У 26,8% пар донор - реципиент были выявлены различия по 2 и более антигенам, что повышало точность результатов исследования эритроцитарного химеризма.

Таким образом, предлагаемый способ удобен для клинического использования и может быть применим в большинстве случаев алло-ТГСК.

Список литературы

1. Выполнение трансплантаций аллогенных гемопоэтических стволовых клеток от неродственных доноров из Российского и зарубежного регистров в одном трансплантационном центре / Васильева В.А., Кузьмина Л.А., Паровичникова Е.Н. [и др.]. // Гематология и трансфузиология. - 2020. - №65(3). - С. 299-311.

2. Hematopoietic SCT in Europe 2013: recent trends in the use of alternative donors showing more haploidentical donors but fewer cord blood transplants / Passweg J.R., Baldomero H., Bader P. [et al.]. // Bone Marrow Transplant. - 2015. - №50(4). - P. 476-482.

3. Use of haploidentical stem cell transplantation continues to increase: the 2015 European Society for Blood and Marrow Transplant activity survey report / Passweg J.R., Baldomero H., Bader P. [et al.]. // Bone Marrow Transplant. - 2017. - №52(6). - P. 811-817.

4. Порешина Л.П. Эритроцитарный химеризм при близкородственной аллогенной трансплантации костного мозга (особенности проявления, классификация): Автореф… дис. докт. биол. наук - М.: 2004. - 40 с.

5. Бурцев А.А. Особенности трансплантации аллогенного костного мозга от доноров, отличающихся по антигенам системы АВО и резус: Автореф… дис. кан. мед. Наук - М.: 2006. - 29 с.

6. Red blood cell phenotyping is a sensitive technique for monitoring chronic myeloid leukaemia patients after T-cell-depleted bone marrow transplantation and after donor leucocyte infusion / Schaap N., Schattenberg A., Bar B. [et al.]. // Br J Haematol. - 2000. - №108(1). - P. 116-125.

7. Количественный анализ химеризма после аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток молекулярно-генетическими методами / Лавриненко В.А., Савицкая Т.В., Волочник Е.В. [и др.]. // Онкогематология. - 2014. - №2. - С. 29-36.

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к способу оценки количества циркулирующих в крови реципиента донорских эритроцитов путем исследования резус-фенотипа пациента, а именно антигенов D, С, с, Е, е, а также K, после аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (алло-ТГСК). Способ обеспечивает раннюю и точную диагностику динамики появления донорского кроветворения после алло-ТГСК, а также собственного кроветворения реципиента при рецидиве заболевания. 7 ил., 1 пр.

Способ оценки уровня посттрансплантационного химеризма путем оценки экспрессии эритроцитарных антигенов системы Резус и Келл в гелевых картах, включающий в себя определение экспрессии антигенов D, С, с, Е, е, K методом агглютинации в геле, отличающийся тем, что процент донорского химеризма определяют визуально в соответствии с заранее созданной шкалой.