ЛИОФИЛИЗИРОВАННЫЙ ПРОДУКТ И СУСПЕНЗИЯ НАПОЛНЕННЫХ ГАЗОМ МИКРОВЕЗИКУЛ Российский патент 2024 года по МПК A61K49/22 A61K9/10 A61K9/127 A61K9/19 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к новому способу получения суспензии наполненных газом микровезикул путем восстановления лиофилизированного продукта и к суспензии, полученной в соответствии с указанным способом.

Предпосылки создания изобретения

Быстрое развитие контрастных веществ в последние годы привело к появлению ряда различных композиций и составов, которые полезны для получения изображений с контрастным усилением органов и тканей тела человека или животных, а также для их терапевтического лечения.

Класс контрастных веществ, особенно полезных для ультразвуковых методов визуализации с контрастным усилением (визуализации “CEUS”), включает суспензии пузырьков газа нано- и/или микрометрического размера, диспергированных в водной среде. Газ обычно улавливается или инкапсулируется в пленочном слое, включающем, например, эмульгаторы, масла, загустители или сахара. Для названия этих стабилизированных пузырьков газа (диспергированных в подходящем физиологическом растворе) в данной области техники обычно используют различные термины, обычно в зависимости от стабилизирующего вещества, используемого для их получения; эти термины включают, например, “микросферы”, “микровезикулы”, “микрокапсулы” или “микрошарики”, которые в целом называются в настоящей заявке “наполненные газом микровезикулы” (или “микровезикулы”).

Контрастные вещества для ультразвуковых исследований (“USCA”) можно получить в соответствии с различными способами изготовления. Один из этих способов, см., например, WO94/09829, включает растворение амфифильного вещества (такого как фосфолипид и/или жирная кислота) и соединения, защищающего в процессе лиофилизации (например, полиэтиленгликоля), в органическом растворителе; полученную смесь затем подвергают лиофилизации, обычно после заполнения флаконов, для удаления растворителя и получения лиофилизированного продукта. Другой способ, см., например, WO2004/069284, включает получение микроэмульсии воды и не смешивающегося с водой органического растворителя, при этом указанная эмульсия включает амфифильное вещество и соединение, защищающее в процессе лиофилизации. Затем эмульсию подвергают (после распределения по флаконам) стадии лиофилизации для удаления воды и растворителя.

Свободный объем флаконов, содержащих на дне лиофилизированный твердый продукт в форме порошка, затем заполняют подходящим газом (например, фторированным газом) и в завершение герметично закрывают для хранения. Перед использованием водную суспензии микровезикул легко приготовить путем введения подходящей жидкости (например, физиологического раствора) в флакон, и осторожно встряхивая флакон для растворения лиофилизированного продукта.

Коммерчески доступным USCA, который может быть получен в соответствии с указанным выше способом, является SonoVue® (или Lumason^® в USA) от Bracco.

Заявитель обнаружил, что характеристики суспензии наполненных газом микровезикул (особенно микровезикул), восстановленной из лиофилизированного продукта, можно улучшить путем введения конечной контролируемой термической обработки (т.е. нагревания) в конце процесса изготовления лиофилизированного твердого продукта.

Сущность изобретения

В соответствии с одним аспектом, настоящее изобретение относится к способу изготовления лиофилизированной композиции, подходящей для получения суспензии стабилизированных наполненных газом микровезикул, при этом указанная композиция включает: (i) амфифильное вещество, способное стабилизировать указанные газовые микровезикулы; и (ii) защитный компонент для лиофилизации; который включает:

a. получение жидкой смеси, включающей указанное амфифильное вещество и указанный защитный компонент для лиофилизации в растворителе;

b. лиофилизацию жидкой смеси для удаления указанного растворителя и получения лиофилизированного продукта, включающего указанное амфифильное вещество и указанный защитный компонент для лиофилизации; и

c. нагревание указанного лиофилизированного продукта.

Предпочтительно указанная стадия нагревания включает нагревание указанного продукта при температуре выше 35°C, более предпочтительно по меньшей мере 38°C. Температура нагревания предпочтительно находится ниже 50°C, более предпочтительно ниже 48°C.

В некоторых вариантах осуществления стадию нагревания осуществляют при атмосферном давлении.

Предпочтительно стадия нагревания длится в течение по меньшей мере 8 часов, более предпочтительно в течение по меньшей мере 12 часов.

Согласно другому аспекту, настоящее изобретение относится к лиофилизированному продукту, полученному в соответствии с описанным выше способом изготовления.

Согласно другому аспекту, настоящее изобретение относится к суспензии наполненных газом микровезикул, полученной путем восстановления лиофилизированного продукта, полученного в соответствии с описанным выше способом изготовления, при этом указанную суспензию получают путем смешивания указанного продукта с фармацевтически приемлемым жидким носителем в присутствии физиологически приемлемого газа при осторожном перемешивании.

Согласно следующему аспекту, настоящее изобретение относится к способу изготовления суспензии наполненных газом микровезикул, стабилизированной амфифильным веществом, который включает:

a. получение лиофилизированного продукта в соответствии со способом изготовления, проиллюстрированным выше; и

b. восстановление указанного продукта путем смешивания его с фармацевтически приемлемым жидким носителем в присутствии физиологически приемлемого газа при осторожном перемешивании с получением суспензии наполненных газом микровезикул.

Подробное описание изобретения

Подходящий способ получения суспензий наполненных газом микровезикул для инъекций включает восстановление, в присутствии подходящего физиологически приемлемого газа, лиофилизированного продукта, включающего амфифильное вещество, способное стабилизировать указанные микровезикулы (например, путем образования стабилизирующего слоя на границе раздела жидкость-газ), с использованием водного носителя.

Лиофилизированный продукт обычно получают лиофилизацией жидкой смеси, включающей указанное амфифильное вещество и защитный компонент для лиофилизации в подходящем растворителе.

Жидкая смесь, которая подвергается процессу лиофилизации, может быть получена способами, известными в данной области техники, например, раскрытыми в WO94/09829 или WO2004/069284.

Получение жидкой смеси для лиофилизации

Например, в соответствии со способом, раскрытым в WO94/09829, амфифильное вещество диспергируют в органическом растворителе (например, третичном бутаноле, диоксане, циклогексаноле, тетрахлордифторэтилене или 2-метил-2-бутаноле) вместе с подходящим защитным компонентом для лиофилизации. Дисперсию, содержащую амфифильное вещество и защитный компонент для лиофилизации, затем подвергают лиофилизации для удаления органического растворителя, получая, таким образом, лиофилизированный продукт.

В соответствии с альтернативным способом, раскрытым в WO2004/069284, композиция, включающая амфифильное вещество, может быть диспергирована в эмульсии воды с не смешивающимся с водой органическим растворителем при перемешивании, предпочтительно в смеси с защитным компонентом для лиофилизации.

Подходящие не смешивающиеся с водой органические растворители включают, например, разветвленные или линейные алканы, алкены, циклоалканы, ароматические углеводороды, простые алкиловые эфиры, кетоны, галогенированные углеводороды, перфторированные углеводороды или их смеси.

Эмульсию можно получить, подвергая водную среду и растворитель, в присутствии амфифильного вещества, любому подходящему способу получения эмульсии, известному в данной области, такому как, например, обработка ультразвуком, встряхивание, гомогенизация под высоким давлением, микроперемешивание, мембранное эмульгирование, высокоскоростное перемешивание или перемешивание с большим усилием сдвига. Защитный компонент для лиофилизации может быть добавлен либо до, либо после образования эмульсии, например, в виде водного раствора, включающего такой защитный компонент для лиофилизации. Полученную таким образом микроэмульсию, которая содержит микрокапли растворителя, окруженные и стабилизированные амфифильным веществом, затем лиофилизируют в соответствии с обычными методами для получения лиофилизированного вещества, которое затем может быть использовано для получения суспензии наполненных газом микровезикул.

Амфифильное вещество

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления амфифильные вещества, полезные для получения вышеуказанных жидких смесей, включают фосфолипид. Фосфолипиды, как и другие амфифильные молекулы, обычно способны образовывать стабилизирующую пленку вещества (обычно в форме мономолекулярного слоя) на границе раздела газ-вода в конечной суспензии наполненных газом микровезикул, эти вещества также называют в данной области техники “пленкообразующими” веществами.

Фосфолипиды обычно содержат по меньшей мере одну фосфатную группу и по меньшей мере одну, предпочтительно две липофильные углеводородные группы с длинной цепью.

Примеры подходящих фосфолипидов включают сложные эфиры глицерина с одним или предпочтительно двумя (одинаковыми или разными) остатками жирных кислот и с фосфорной кислотой, где остаток фосфорной кислоты, в свою очередь, связан с гидрофильной группой, такой, например, как холин (фосфатидилхолины - PC), серин (фосфатидилсерины - PS), глицерин (фосфатидилглицерины - PG), этаноламин (фосфатидилэтаноламины - PE), инозитол (фосфатидилинозитол). Сложные эфиры фосфолипидов с только одним остатком жирной кислоты в данной области обычно называют “лизо” формами фосфолипида или “лизофосфолипидами”. Остатки жирных кислот, присутствующие в фосфолипидах, обычно представляют собой длинноцепочечные алифатические кислоты, обычно содержащие от 12 до 24 атомов углерода, предпочтительно от 14 до 22; алифатическая цепь может содержать одну или более ненасыщенностей или предпочтительно является полностью насыщенной. Примерами подходящих жирных кислот, включенных в фосфолипиды, являются, например, лауриновая кислота, миристиновая кислота, пальмитиновая кислота, стеариновая кислота, арахиновая кислота, бегеновая кислота, олеиновая кислота, линолевая кислота и линоленовая кислота. Предпочтительно используют насыщенные жирные кислоты, такие как миристиновая кислота, пальмитиновая кислота, стеариновая кислота и арахиновая кислота.

Другими примерами фосфолипидов являются фосфатидные кислоты, т.е. сложные диэфиры глицерин-фосфорной кислоты с жирными кислотами; сфинголипиды, такие как сфингомиелины, т.е. те аналоги фосфатидилхолина, в которых остаток сложного диэфира глицерина с жирными кислотами заменен церамидной цепью; кардиолипины, т.е. сложные эфиры 1,3-дифосфатидилглицерина с жирной кислотой; гликолипиды, такие как ганглиозиды GM1 (или GM2) или цереброзиды; глюколипиды; сульфатиды и гликосфинголипиды.

В контексте настоящей заявки термин “фосфолипид(фосфолипиды)” включает встречающиеся в природе, полусинтетические или синтетически полученные соединения, которые можно использовать либо по отдельности, либо в виде смесей.

Примерами встречающихся в природе фосфолипидов являются природные лецитины (производные фосфатидилхолина (PC)), обычно такие как лецитины соевых бобов или яичного желтка.

Примерами полусинтетических фосфолипидов являются частично или полностью гидрированные производные природных лецитинов. Предпочтительными фосфолипидами являются сложные диэфиры жирных кислот и фосфатидилхолина, этилфосфатидилхолина, фосфатидилглицерина, фосфатидной кислоты, фосфатидилэтаноламина, фосфатидилсерина, фосфатидилинозита или сфингомиелина.

Примерами предпочтительных фосфолипидов являются, например, дилауроил-фосфатидилхолин (DLPC), димиристоил-фосфатидилхолин (DMPC), дипальмитоил-фосфатидилхолин (DPPC), диарахидоил-фосфатидилхолин (DAPC), дистеароил-фосфатидилхолин (DSPC), диолеоил-фосфатидилхолин (DOPC), 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-этилфосфохолин (Этил-DSPC), дипентадеканоил-фосфатидилхолин (DPDPC), 1-миристоил-2-пальмитоил-фосфатидилхолин (MPPC), 1-пальмитоил-2-миристоил-фосфатидилхолин (PMPC), 1-пальмитоил-2-стеароил-фосфатидилхолин (PSPC), 1-стеароил-2-пальмитоил-фосфатидилхолин (SPPC), 1-пальмитоил-2-олеилфосфатидилхолин (POPC), 1-олеил-2-пальмитоил-фосфатидилхолин (OPPC), дилауроил-фосфатидилглицерин (DLPG) и его соли с щелочными металлами, диарахидоилфосфатидил-глицерин (DAPG) и его соли с щелочными металлами, димиристоилфосфатидилглицерин (DMPG) и его соли с щелочными металлами, дипальмитоилфосфатидилглицерин (DPPG) и его соли со щелочными металлами, дистеароилфосфатидилглицерин (DSPG) и его соли с щелочными металлами, диолеоил-фосфатидилглицерин (DOPG) и его соли с щелочными металлами, димиристоилфосфатидная кислота (DMPA) и ее соли с щелочными металлами, дипальмитоилфосфатидная кислота (DPPA) и ее соли с щелочными металлами, дистеароилфосфатидная кислота (DSPA), диарахидоилфосфатидная кислота (DAPA) и ее соли с щелочными металлами, димиристоил-фосфатидилэтаноламин (DMPE), дипальмитоилфосфатидилэтаноламин (DPPE), дистеароилфосфатидилэтаноламин (DSPE), диолеилфосфатидил-этаноламин (DOPE), диарахидоилфосфатидилэтаноламин (DAPE), дилинолеоилфосфатидилэтаноламин (DLPE), димиристоилфосфатидилсерин (DMPS), диарахидоилфосфатидилсерин (DAPS), дипальмитоилфосфатидилсерин (DPPS), дистеароилфосфатидилсерин (DSPS), диолеоилфосфатидилсерин (DOPS), дипальмитоилсфингомиелин (DPSP), и дистеароилсфингомиелин (DSSP), дилауроилфосфатидилинозит (DLPI), диарахидоилфосфатидилинозит (DAPI), димиристоилфосфатидилинозит (DMPI), дипальмитоилфосфатидилинозит (DPPI), дистеароилфосфатидилинозит (DSPI), диолеоил-фосфатидилинозит (DOPI).

Подходящие фосфолипиды также включают фосфолипиды, модифицированные присоединением к ним гидрофильного полимера, такого как полиэтиленгликоль (PEG) или полипропиленгликоль (PPG). Предпочтительные полимер-модифицированные фосфолипиды включают “пэгилированные фосфолипиды”, т.е. фосфолипиды, связанные с PEG полимером. Примерами пэгилированных фосфолипидов являются пэгилированные фосфатидилэтаноламины (вкратце “PE-PEG”), т.е. фосфатидилэтаноламины, в которых гидрофильный этаноламиновый фрагмент связан с молекулой PEG с различной молекулярной массой (например, от 300 до 20000 дальтон, предпочтительно от 500 до 5000 дальтон), такие как DPPE-PEG (или DSPE-PEG, DMPE-PEG, DAPE-PEG или DOPE-PEG). Например, DPPE-PEG5000 относится к DPPE, имеющему присоединенный к нему полимер PEG, имеющий среднюю молекулярную массу около 5000. Примером DPPE-PEG5000 является PEG производное с концевой метокси группой 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[метокси(полиэтиленгликоль)-5000].

В одном варианте осуществления фосфолипиды могут содержать реакционноспособную группу, которая затем может взаимодействовать с соответствующей реакционноспособной группой, содержащей подходящий активный компонент (например, нацеливающий лиганд), для связывания указанного активного компонента с микровезикулами. Примеры подходящих реакционноспособных групп включают, например, реакционноспособные группы, способные взаимодействовать с аминогруппой, связанной с активным компонентом, такие как изотиоцианатные группы (которые образуют тиомочевинную связь), реакционноспособные сложные эфиры (для образования амидной связи), альдегидные группы (для образования иминной связи, которая должна быть восстановлена до алкиламиновой связи); реакционноспособные группы, способные взаимодействовать с тиольной группой, связанной с активным компонентом, такие как галогенацетильные производные или малеимиды (для образования тиоэфирной связи); реакционноспособные группы, способные взаимодействовать с карбоксильной группой, связанной с активным компонентом, такие как амины или гидразиды (для образования амидных или алкиламидных связей). Предпочтительно амфифильное соединение, содержащее реакционноспособную группу, представляет собой липид, содержащий гидрофильный полимер, такой как приведенные выше, предпочтительно пэгилированный фосфолипид, например DPPE-PEG2000, такой как DPPE-PEG2000-малеимид.

Особенно предпочтительными фосфолипидами являются DAPC, DSPC, DPPC, DMPA, DPPA, DSPA, DMPG, DPPG, DSPG, DMPS, DPPS, DSPS и Этил-DSPC. Наиболее предпочтительными являются DPPG, DPPS и DSPC.

Также можно использовать смеси фосфолипидов, такие как, например, смеси DPPE и/или DSPE (включая пэгилированные производные), DPPC, DSPC и/или DAPC с DSPS, DPPS, DSPA, DPPA, DSPG, DPPG, Этил-DSPC и/или Этил-DPPC.

Фосфолипиды удобно использовать в смеси с любым другим соединением, предпочтительно амфифильным. Например, липиды, такие как холестерин, эргостерин, фитостерин, ситостерин, ланостерин, токоферол, пропилгаллат или аскорбилпальмитат, жирные кислоты, такие как миристиновая кислота, пальмитиновая кислота, стеариновая кислота, арахиновая кислота и их производные, или бутилированный гидрокситолуол и/или другие нефосфолипидные (амфифильные) соединения могут быть, необязательно, добавлены к одному или нескольким из вышеуказанных фосфолипидов, например в пропорциях предпочтительно менее 50% масс., более предпочтительно до 25% масс. или менее. Особенно предпочтительными дополнительными соединениями в смеси с фосфолипидами являются жирные кислоты. Жирные кислоты, полезные в композиции по настоящему изобретению, которые могут быть либо насыщенными, либо ненасыщенными, включают алифатическую цепь C₁₀-C₂₄ с концевой карбоновокислотной группой, предпочтительно C₁₄-C₂₂ и более предпочтительно алифатическую цепь C₁₆-C₂₀. Примеры подходящих насыщенных жирных кислот включают каприновую (н-декановую), лауриновую (н-додекановую), миристиновую (н-тетрадекановую), пальмитиновую (н-гексадекановую), стеариновую (н-октадекановую), арахиновую (н-эйкозановую), бегеновую (н-докозановую) и н-тетракозановую кислоту. Предпочтительными насыщенными жирными кислотами являются миристиновая, пальмитиновая, стеариновая и арахиновая кислоты, более предпочтительна пальмитиновая кислота. Примеры ненасыщенных жирных кислот включают миристолеиновую (цис-9-тетрадеценовую), пальмитолеиновую (цис-9-гексадеценовую), сапиеновую (цис-6-гексадеценовую), олеиновую (цис-9-октадеценовую), линолевую (цис-9,12-октадекадиеновую), линоленовую (цис-9,12,15-октадекатриеновую), гондоевую (цис-11-эйкозеновую), цис-11,14-эйкозадиеновую, цис-5,8,11-эйкозатриеновую, цис-8,11,14-эйкозатриеновую, цис-11,14,17- эйкозатриеновую, арахидоновую (цис-8,11,14,17-эйкозатетраеновую) и эруковую (цис-13-докозеновую) кислоту.

В соответствии с вариантом осуществления, смесь амфифильных веществ включает смесь DSPC, DPPG и пальмитиновой кислоты.

В соответствии с альтернативным вариантом осуществления, указанное амфифильное вещество включает смесь DSPC, DPPE-PEG5000 и пальмитиновой кислоты, необязательно дополнительно включающую нацеливающий лиганд.

Нацеливающие лиганды

Композиции и микровезикулы по настоящему изобретению необязательно могут включать нацеливающий лиганд.

Термин “нацеливающий лиганд” охватывает своим значением любое соединение, фрагмент или остаток, обладающий или способный стимулировать целевую активность (например, включая селективное связывание) микровезикул композиции по настоящему изобретению в отношении любого биологического или патологического участка в живом организме. Мишени, с которыми может связываться нацеливающий лиганд, включают ткани, такие как, например, ткань миокарда (включая клетки миокарда и кардиомиоциты), мембранные ткани (включая эндотелий и эпителий), пластинки, соединительную ткань (включая интерстициальную ткань) или опухоли; сгустки крови; и рецепторы, такие как, например, рецепторы клеточной поверхности для пептидных гормонов, нейротрансмиттеров, антигенов, фрагментов комплемента и иммуноглобулины, а также цитоплазматические рецепторы для стероидных гормонов.

Нацеливающий лиганд может быть синтетическим, полусинтетическим или природного происхождения. Материалы или вещества, которые могут служить в качестве нацеливающих лигандов, включают, например, но не ограничиваются этим, белки, включая антитела, фрагменты антител, рецепторные молекулы, рецептор-связывающие молекулы, гликопротеины и лектины; пептиды, включая олигопептиды и полипептиды; пептидомиметики; сахариды, включая моно- и полисахариды; витамины; стероиды, аналоги стероидов, гормоны, кофакторы, биоактивные вещества и генетический материал, включая нуклеозиды, нуклеотиды и полинуклеотиды.

Нацеливающий лиганд может представлять собой соединение per se, которое смешивается с другими компонентами микровезикулы, или может представлять собой соединение, которое связано с амфифильной молекулой (обычно фосфолипидом), используемым для образования микровезикулы.

В одном предпочтительном варианте осуществления нацеливающий лиганд может быть связан с амфифильной молекулой (например, фосфолипидом), образуя стабилизирующую оболочку микровезикулы посредством ковалентной связи. В таком случае конкретная реакционноспособная группа, которая должна присутствовать в амфифильной молекуле, будет зависеть от конкретного нацеливающего лиганда, который должен связываться с ней, как подробно проиллюстрировано выше. Для ковалентного связывания с желаемым нацеливающим лигандом по меньшей мере часть амфифильного соединения, образующего оболочку микровезикулы, должна, таким образом, содержать подходящую реакционноспособную группу, и связывание с ней нацеливающего лиганда, содержащего комплементарную функциональную группу, будут осуществлять в соответствии с известными методами, например, путем добавления его к дисперсии, содержащей амфифильные компоненты микровезикулы. Предпочтительно амфифильное соединение представляет собой липид, содержащий гидрофильный полимер, такой как те, которые приведены выше, предпочтительно пэгилированный фосфолипид (например, DSPE-PEG2000). В этом случае нацеливающий лиганд связывают с подходящей реакционноспособной группой на гидрофильном полимере (например, DSPE-PEG2000-NH₂), необязательно через линкер. Амфифильное соединение может быть объединено с желаемым нацеливающим лигандом перед получением микровезикулы, и полученная таким образом комбинация может быть использована для получения микровезикулы. Альтернативно, связывание нацеливающего лиганда с соответствующим амфифильным соединением можно осуществить во время получения микровезикулы (например, при получении промежуточной микроэмульсии способом, описанным в WO2004/069284). В качестве дополнительной альтернативы, связывание может происходить на сформированной микровезикуле, включающей амфифильное вещество, содержащее реакционноспособную группу.

В соответствии с альтернативным вариантом осуществления, нацеливающий лиганд также может подходящим образом связан с микровезикулой посредством физического и/или электростатического взаимодействия. В качестве примера, в амфифильную молекулу может быть введен функциональный фрагмент, обладающий высоким сродством и селективностью в отношении комплементарного фрагмента, в то время как комплементарный фрагмент будет связан с нацеливающим лигандом. Например, авидиновый (или стрептавидиновый) фрагмент (имеющий высокое сродство к биотину) может быть ковалентно связан с фосфолипидом (или с пэгилированным фосфолипидом), в то время как комплементарный биотиновый фрагмент может быть включен в подходящий нацеливающий лиганд, например, пептид или антитело. Таким образом, меченный биотином нацеливающий лиганд будет связан с меченным авидином фосфолипидом микровезикулы посредством системы связывания авидин-биотин. Альтернативно, как фосфолипид, так и нацеливающий лиганд оба могут включать биотиновый фрагмент и впоследствии могут быть связаны друг с другом при помощи авидина (который является бифункциональным компонентом, способным связывать два биотиновых фрагмента). Примеры биотин/авидинового связывания фосфолипидов и пептидов также раскрыты в цитированном выше патенте США 6139819. Альтернативно, ван-дер-ваальсевы взаимодействия, электростатические взаимодействия и другие процессы ассоциации могут использоваться для ассоциации или связывания нацеливающего лиганда с амфифильными молекулами.

Альтернативно, фосфолипид может быть модифицирован белком, подходящим для специфического связывания с Fc-доменом иммуноглубулина (Ig), таким как белок A, белок G, белок A/G или белок L. В соответствии с альтернативным вариантом осуществления, нацеливающий лиганд может представлять собой соединение, которое смешивают с компонентами, образующими микровезикулу, для включения в конечном итоге в структуру микровезикулы, такое как, например, липопептид, как описано, например, в международных патентных заявках WO 98/18501 или 99/55383.

Альтернативно, сначала может быть получена микровезикула, которая включает соединение (липид или модифицированный полимером липид), имеющее подходящую группу, способную взаимодействовать с соответствующим комплементарным фрагментом нацеливающего лиганда; после этого желаемый нацеливающий лиганд добавляют к суспензии микровезикул для связывания с соответствующим комплементарным фрагментом на микровезикуле.

Примерами подходящих конкретных мишеней, на которые могут быть направлены микровезикулы, являются, например, фибрин и GPIIbIIIa связывающий рецептор на активированных тромбоцитах. Фактически фибрин и тромбоциты обычно присутствуют в "тромбах", т.е. сгустках, которые могут образовываться в кровотоке и вызывать обструкцию сосудов. Подходящие связывающие пептиды раскрыты, например, в цитированном выше патенте США 6139819. Другие связывающие пептиды, специфические для нацеливания на фибрин, раскрыты, например, в международной патентной заявке WO 02/055544.

Другие примеры важных мишеней включают рецепторы в нестабильных бляшках и опухолеспецифические рецепторы, такие как область киназного домена (KDR) и комплекс VEGF (фактор роста эндотелия сосудов)/KDR. Связывающие пептиды, подходящие для KDR или комплекса VEGF/KDR, раскрыты, например, в международной патентной заявке WO 03/74005, WO 03/084574 и WO2007/067979. В одном варианте осуществления целевой пептид представляет собой димерный пептид-фосфолипидный конъюгат (липопептид), как описано в WO2007/067979.

Защитный компонент для лиофилизации

Как определено в настоящей заявке, защитный компонент для лиофилизации, представляет собой соединение с криопротекторным и/или лиопротекторным действием. Подходящие защитные компоненты для лиофилизации включают, например, углеводы, например моно-, ди- или полисахарид, такой как сахароза, мальтоза, трегалоза, глюкоза, лактоза, галактоза, рафиноза, циклодекстрин, декстран, хитозан и его производные (например, карбоксиметилхитозан, триметилхитозан); полиолы, например сахарные спирты, такие как сорбит, маннит или ксилит; или гидрофильные полимеры, например полиоксиалкиленгликоль, такой как полиэтиленгликоль (например, PEG2000, PEG4000 или PEG8000) или полипропиленгликоль. В соответствии с вариантом осуществления, указанный защитный компонент для лиофилизации представляет собой полиэтиленгликоль, предпочтительно PEG4000. PEG4000 в контексте настоящей заявки имеет свое обычное значение, известное в данной области, и означает полиэтиленгликоль, имеющий молекулярную массу около 4000 г/моль, как правило, с отклонением +/- 10% от указанного значения.

Процесс лиофилизации

Для процесса лиофилизации жидкую смесь, содержащую амфифильное вещество и защитный компонент для лиофилизации (полученную, например, в соответствии с любым из ранее проиллюстрированных способов изготовления), обычно распределяют в стеклянные флаконы (например, DIN8R или DIN20R), которые загружают в лиофилизатор.

Процесс лиофилизации, как правило, включает начальную стадию (первичную сушку), на которой флаконы подвергают быстрому глубокому охлаждению (например, при температурах от -35°C до -70°C) для замораживания жидкости(жидкостей) смеси, а затем подвергают условиям вакуума (например, 0,1-0,8 мбар); во время первичной сушки значительная часть замороженной жидкости(жидкостей) (например, воды и/или растворителей) удаляется путем сублимации, обычно до около 95% от общего количества жидкости, предпочтительно до около 99%. После первичной сушки остаточная жидкость (включая возможную промежуточную воду) может затем удаляться в процессе вторичной сушки, которую обычно осуществляют при температуре выше комнатной, под вакуумом (предпочтительно путем поддержания того же вакуума, что и во время первичной сушки). Температура во время вторичной сушки предпочтительно не превышает 35°C. Вторичную сушку можно остановить, когда остаточное содержание жидкости(жидкостей) достигнет желаемого минимального значения, например, менее 3% (предпочтительно менее 1%) по массе воды в расчете на общую массу остаточного лиофилизированного продукта, или, например, менее 0,01% по массе, предпочтительно менее 0,08% для остаточного(остаточных) растворителя(растворителей).

После завершения процесса лиофилизации (т.е. прекращения нагревания и удаления вакуума) лиофилизированный продукт может подвергаться дополнительной стадии термической обработки в соответствии с настоящим изобретением, при атмосферном давлении. В контексте настоящей заявки термин “атмосферное давление” относится к нормальному значению атмосферного давления (т.е. около 103,12 кПа на уровне моря, обычно между 95 и 104 кПа). Предпочтительно термическую обработку осуществляют на плотно закрытом флаконе, после насыщения свободного объема флаконов, содержащих лиофилизированный продукт, подходящим физиологически приемлемым газом, а затем закупоривания (например, резиновой пробкой, например, из бутилкаучука) и герметизации (например, с металлическим, например, алюминиевым, обжимным уплотнением) флаконов. В этом случае флаконы предпочтительно извлекают из лиофилизатора и помещают в подходящую печь для термообработки. Альтернативно, такую термообработку можно осуществлять на открытом флаконе (который предпочтительно хранится в лиофилизаторе), который затем насыщают газом, а затем закупоривают/запечатывают.

Примеры подходящих физиологически приемлемых газов включают, например, фторированные газы, такие как SF₆, C₃F₈, C₄F₁₀, необязательно в смеси с воздухом или азотом.

В одном варианте осуществления газ SF₆ используют в комбинации со смесью амфифильных веществ, включающей DSPC, DPPG и пальмитиновую кислоту, как определено выше.

В другом варианте осуществления газ C₄F₁₀, или смесь C₄F₁₀ с азотом, используют в комбинации со смесью амфифильных веществ, включающей DSPC, DPPE-PEG5000 и пальмитиновую кислоту, необязательно дополнительно включающую нацеливающий лиганд, как определено выше.

Другие компоненты

Другие компоненты, например, эксципиенты или добавки, могут либо присутствовать в сухой композиции для получения микровезикул, либо могут быть добавлены вместе с водным носителем, используемым для ее восстановления, необязательно участвуя (или только частично участвуя) в формировании стабилизирующей оболочки микровезикулы. К ним относятся, например, регуляторы pH, регуляторы осмоляльности, усилители вязкости, эмульгаторы, наполнители и т.д., и их можно использовать в обычных количествах.

Суспензии наполненных газом микровезикул

Затем можно получить суспензии наполненных газом микровезикул путем восстановления лиофилизированного продукта с использованием физиологически приемлемого (водного) носителя, при осторожном перемешивании. Подходящие физиологически приемлемые (водные) носители включают, например, воду для инъекций, физиологический раствор или раствор глюкозы, необязательно содержащие эксципиенты или добавки, проиллюстрированные выше.

Термическая обработка

В соответствии с настоящим изобретением, лиофилизированный продукт (содержащийся в соответствующих флаконах в конце процесса лиофилизации) преимущественно подвергают дополнительной заключительной стадии термической обработки (или тепловой обработки).

Как указано выше, термическую обработку предпочтительно выполняют на лиофилизированном продукте в запечатанных флаконах, уже содержащих физиологически приемлемый газ; альтернативно, ее можно осуществлять на лиофилизированном продукте в флаконах перед заполнением их газом и герметизацией. В первом случае термическую обработку можно осуществлять либо в лиофилизаторе, либо предпочтительно в отдельном нагревательном устройстве (например, в печи). Во втором случае стадию нагревания предпочтительно осуществляют в аппарате для лиофилизации; после этого атмосферу насыщают желаемым газом, и флаконы герметично закрывают.

Как замечено заявителем, указанная термообработка лиофилизированного продукта неожиданно приводит к улучшенным характеристикам суспензии наполненных газом микровезикул, полученной при восстановлении лиофилизированного продукта, по сравнению с суспензиями, полученными из лиофилизированных продуктов, которые не подвергали такой термообработке.

Заявитель, в частности, заметил, что такая обработка приводит к повышенной устойчивости полученных микровезикул к давлению.

Лиофилизированный продукт предпочтительно нагревают при температуре выше 35°C (например, 36°C), более предпочтительно при температуре 38°C или выше. Максимальная температура термообработки, как правило, зависит от веществ, содержащихся в лиофилизированном продукте. Например, такая температура должна быть ниже, чем температура плавления вещества, используемого в качестве добавки для лиофилизации, которое является компонентом, образующим бóльшую часть массы лиофилизированного продукта (обычно имеет массу в 50 до более чем 600 раз больше массы активных компонентов, образующих стабилизирующий слой микровезикул). Например, PEG4000 имеет температуру плавления 53-58°C. В соответствии с вариантом осуществления, температура нагрева предпочтительно составляет 50°C или ниже. Предпочтительные температуры для термообработки составляют от 38°C до 45°C.

Продолжительность термообработки обычно зависит от температуры обработки; как правило, чем выше температура, тем короче продолжительность нагрева. Поскольку вещества, образующие оболочку наполненных газом микровезикул (в частности, фосфолипиды), могут подвергаться реакции разложения, когда они подвергаются воздействию избыточных температур в течение слишком длительного периода времени (с возможными негативными последствиями для характеристик восстановленных микровезикул), длительность термической обработки не должна увеличиваться без необходимости. Хотя продолжительность обработки около 8 часов может быть достаточной (особенно в сочетании с температурами выше 45°C, например, 48°C), продолжительность термообработки предпочтительно составляет 12 часов, например, до 20 часов, более предпочтительно 14-18 часов. Хотя в конкретных случаях вполне может применяться более длительная термообработка (особенно в сочетании с температурами ниже 45°C, предпочтительно ниже 42°C), заявитель обнаружил, что это приводит лишь к незначительному, или вообще никакому, дальнейшему улучшению характеристик конечных наполненных газом микровезикул; такая увеличенная продолжительность, таким образом, в большинстве случаев не является необходимой и обычно неудобна с точки зрения экономии при производстве в промышленных масштабах.

В некоторых вариантах осуществления лиофилизированный продукт включает смесь фосфолипида и жирной кислоты, как определено выше, в смеси с защитным компонентом для лиофилизации. Было доказано, что термическая обработка по изобретению особенно эффективна для улучшения характеристик наполненных газом микровезикул, включающих такую смесь компонентов.

В соответствии с одним вариантом осуществления, лиофилизированный продукт включает DSPC, DPPG и пальмитиновую кислоту в комбинации с защитным компонентом для лиофилизации (например, полиэтиленгликолем, таким как PEG4000). Указанный лиофилизированный продукт предпочтительно нагревают при температуре от около 40°C до 48°C, в частности около 45°C (+/- 3°C), в течение по меньшей мере восьми часов, предпочтительно в течение около 18 часов (+/- 4 часа).

В соответствии с другим вариантом осуществления изобретения, лиофилизированный продукт включает DSPC, DPPE-PEG5000 и пальмитиновую кислоту в комбинации с защитным компонентом для лиофилизации (например, полиэтиленгликолем, таким как PEG4000). Указанный лиофилизированный продукт нагревают при температуре от около 36°C до 45°C, в частности около 39°C (+/- 3°C), в течение по меньшей мере восьми часов, предпочтительно в течение около 15 часов (+/- 5 часов).

В соответствии с еще одним вариантом осуществления, указанная смесь DSPC, DPPE-PEG5000 и пальмитиновой кислоты дополнительно включает нацеливающий липопептид, например, как описано в WO2007/067979.

Как указано выше, термообработка лиофилизированного продукта по настоящему изобретению приводит к повышенной устойчивости наполненных газом микровезикул к давлению. Предпочтительно микровезикулы с повышенной устойчивостью к давлению, как правило, демонстрируют повышенную продолжительность присутствия в кровотоке после инъекции.

Устойчивость к давлению наполненных газом микровезикул можно оценить путем определения эмпирического параметра “Pc50” или “критического давления”.

Как подробно объясняется в экспериментальной части, значение Pc50 суспензии наполненных газом микровезикул определяет значение приложенного избыточного давления (по отношению к атмосферному давлению), при котором поглощательная способность суспензии микровезикул падает до половины поглощательной способности суспензии, измеренной при атмосферном давлении, при этом указанное приложенное избыточное давление приводит к значительному уменьшению популяции микровезикул по сравнению с исходной (при атмосферном давлении). Фактически, снижение поглощательной способности суспензии микровезикул связано с уменьшением первоначальной популяции наполненных газом микровезикул, в результате чего изначально молочная суспензия (высокая концентрация микровезикул) становится все более и более прозрачной при увеличении давления (снижение концентрации из-за разрушения микровезикул). Чем выше значения Pc50, тем выше устойчивость микровезикул к давлению. Для применения в ультразвуковой диагностике минимальное значение Pc50, составляющее по меньшей мере 12 кПа, желательно для наполненных газом микровезикул, предпочтительно по меньшей мере 13 кПа (около 100 мм рт.ст.), более предпочтительно по меньшей мере 14 кПа (105 мм рт.ст.). Для ультразвуковых терапевтических применений, обычно требующих более длительного времени сохранения в кровотоке, желательно минимальное значение Pc50, составляющее по меньшей мере 55 кПа (около 412 мм рт.ст.), предпочтительно по меньшей мере 70 кПа (около 525 мм рт.ст.), более предпочтительно по меньшей мере 80 кПа (около 600 мм рт.ст.), тогда как более высокие значения Pc50 даже более предпочтительны.

Обычно, термическая обработка лиофилизированного продукта по настоящему изобретению позволяет увеличить Pc50 восстановленной суспензии микровезикул по меньшей мере на 5 кПа, предпочтительно по меньшей мере 8 кПа и более предпочтительно по меньшей мере 10 кПа по сравнению с Pc50 восстановленной суспензии, полученной из лиофилизированного продукта, который не подвергался такой термической обработке. Такое увеличение Pc50 может составлять до 15 кПа, а в некоторых вариантах осуществления до 25 кПа.

В соответствии с вариантом осуществления (например, когда лиофилизированный продукт включает DSPC, DPPG, пальмитиновую кислоту и PEG4000) суспензия микровезикул, восстановленная из лиофилизированного продукта, подвергнутого термообработке по настоящему изобретению, имеет значение Pc50 по меньшей мере 20 кПа, предпочтительно по меньшей мере 22 кПа и более предпочтительно по меньшей мере 25 кПа.

В соответствии с другим вариантом осуществления (например, когда лиофилизированный продукт включает DSPC, DPPE-PEG5000 и пальмитиновую кислоту в комбинации с защитным компонентом для лиофилизации, например, полиэтиленгликолем, таким как PEG4000) суспензия микровезикул, восстановленная из лиофилизированного продукта, подвергнутого термообработке по настоящему изобретению, имеет значение Pc50 по меньшей мере 75 кПа, предпочтительно по меньшей мере 80 кПа и более предпочтительно по меньшей мере 90 кПа.

Фармацевтический набор, введение и способы применения

Флаконы, содержащие лиофилизированный продукт, предпочтительно могут быть упакованы в виде двухкомпонентного диагностического и/или терапевтического набора, предпочтительно для введения путем инъекции. Набор предпочтительно включает флакон, содержащий лиофилизированный продукт, и и второй контейнер (например, цилиндр шприца), содержащий физиологически приемлемый водный носитель для восстановления.

Микровезикулы по настоящему изобретению можно использовать в различных диагностических и/или терапевтических методах, включая, в частности, ультразвук.

Таким образом, аспект изобретения относится к использованию в способе диагностики суспензии микровезикул, восстановленных из лиофилизированного продукта, подвергнутого термической обработке по настоящему изобретению.

Диагностические методы включают любой метод, в котором использование наполненных газом микровезикул позволяет улучшить визуализацию участка или части тела животного (включая человека), включая визуализацию для целей доклинических и клинических исследований. Для ультразвуковых применений можно использовать различные методы формирования изображений, например, включая формирование изображений в B-режиме на основной и гармонической частоте, формирование изображений с импульсной или фазовой инверсией, а также формирование изображений на основной и гармонической доплеровской частоте; при желании можно использовать методы трехмерной визуализации.

Микровезикулы по настоящему изобретению обычно можно вводить в концентрации от около 0,01 до около 1,0 мкл газа на кг пациента, в зависимости, например, от их соответствующей композиции, ткани или органа, изображения которых нужно получить, и/или выбранной техники визуализации. Этот общий диапазон концентраций, конечно, может варьироваться в зависимости от конкретных применений визуализации, например, когда сигналы могут наблюдаться при очень малых дозах, например, в цветном доплеровском режиме или инверсии импульса мощности.

В одном варианте осуществления указанный способ диагностики включает

(i) введение пациенту суспензии наполненных газом микровезикул, полученной путем восстановления лиофилизированного продукта, полученного в соответствии со способом по настоящему изобретению; и

(ii) обнаружение ультразвукового сигнала из интересующей области у указанного пациента.

В соответствии с вариантом осуществления, указанная суспензия наполненных газом микровезикул включает DSPC, DPPG, пальмитиновую кислоту и PEG4000,

Восстановление лиофилизированного продукта предпочтительно осуществляют путем его диспергирования в физиологически приемлемом водном носителе, например физиологическом растворе, в присутствии физиологически приемлемого газа, например SF₆, при осторожном перемешивании.

Указанная суспензия микровезикул предпочтительно имеет значение Pc50 по меньшей мере 20 кПа, более предпочтительно по меньшей мере 22 кПа и даже более предпочтительно по меньшей мере 25 кПа.

В одном варианте осуществления указанный способ диагностики включает ультразвуковую визуализацию сердца, в частности, для затемнения камеры левого желудочка и улучшения очертания эндокардиальной границы левого желудочка у взрослых пациентов с субоптимальными эхокардиограммами.

В другом варианте осуществления указанный способ диагностики включает ультразвуковую визуализацию печени, в частности, для характеристики очаговых поражений печени у взрослых и детей.

В другом варианте осуществления указанный способ диагностики включает ультразвуковую визуализацию мочевыводящих путей, в частности, для оценки подозреваемого или известного пузырно-мочеточникового рефлюкса у педиатрических пациентов.

В другом варианте осуществления указанного диагностического способа указанная суспензия наполненных газом микровезикул включает DSPC, DPPE-PEG5000, пальмитиновую кислоту, необязательно нацеливающий липопептид и PEG4000. Предпочтительно нацеливающий липопептид представляет собой нацеливающий липопептид VEGF/KDR, например, как описано в WO2007/067979.

Возможные другие диагностические применения визуализации включают сцинтиграфию, световую визуализацию и рентгеновскую визуализацию, в том числе рентгеновскую фазово-контрастную визуализацию.

Другой аспект изобретения относится к использованию в способе терапевтического лечения суспензии микровезикул, восстановленных из лиофилизированного продукта, подвергнутого термической обработке по настоящему изобретению.

Терапевтические методы включают любой способ лечения (как определено выше) пациента, который включает комбинированное использование ультразвуковых методов и наполненных газом микровезикул как таковых (например, в ультразвуковом тромболизисе, высокоинтенсивной фокусированной ультразвуковой абляции, пермеабилизации гематоэнцефалического барьера, иммуномодуляции, нейромудуляции, радиосенсибилизации) в комбинации с терапевтическим средством (т.е. опосредованная ультразвуком доставка, например, для доставки лекарственного средства или биологически активного соединения в выбранный участок или ткань, например, при лечении опухолей, генной терапии, терапии инфекционных заболеваний, терапии метаболических заболеваний, терапии хронических заболеваний, терапии дегенеративных заболеваний, терапии воспалительных заболеваний, терапии иммунологических или аутоиммунных заболеваний или при использовании в качестве вакцины), при этом присутствие наполненных газом микровезикул может само по себе обеспечивать терапевтический эффект или способно усилить терапевтические эффекты применяемых ультразвуковых методов, например, путем проявления ими, или когда они являются ответственными за проявление, биологического эффекта in vitro и/или in vivo, либо самостоятельно, либо при специфической активации различными физическими методами (включая, например, опосредованную ультразвуком доставку).

Микровезикулы по настоящему изобретению обычно можно вводить в терапевтических целях при концентрации от около 0,01 до около 5,0 мкл газа на кг пациента, в зависимости, например, от их соответствующей композиции, типа субъекта, подвергаемого лечению, ткани или органа, подлежащих лечению, и/или применяемого терапевтического метода.

В одном варианте осуществления указанный способ терапевтического лечения с применением ультразвука включает:

(i) введение пациенту суспензии наполненных газом микровезикул, полученной путем восстановления лиофилизированного продукта, полученного в соответствии со способом по настоящему изобретению;

(ii) идентификацию интересующей области у указанного пациента, подлежащего терапевтическому лечению, причем указанная представляющая интерес область включает указанную суспензию наполненных газом микровезикул; и

(iii) применение ультразвукового луча для терапевтического лечения указанной представляющей интерес области;

посредством чего указанное терапевтическое ультразвуковое лечение усиливается присутствием указанной суспензии наполненных газом микровезикул в указанной представляющей интерес области.

В одном варианте осуществления указанная суспензия наполненных газом микровезикул включает DSPC, DPPE-PEG5000, пальмитиновую кислоту, необязательно нацеливающий липопептид и PEG4000.

Восстановление лиофилизированного продукта предпочтительно осуществляют путем его диспергирования в физиологически приемлемом водном носителе, например, физиологическом растворе, в присутствии физиологически приемлемого газа, например смеси C₄F₁₀ и азота, при осторожном перемешивании.

Указанная суспензия микровезикул предпочтительно имеет значение Pc50 по меньшей мере 84 кПа, более предпочтительно по меньшей мере 88 кПа и даже более предпочтительно по меньшей мере 90 кПа, например до около 105 кПа.

В другом варианте осуществления суспензию наполненных газом микровезикул по изобретению можно успешно использовать в способе разделения клеток, обычно посредством плавучести (также известной как сортировка клеток с активацией плавучести “BACS”). Способ может быть полезным для отделения клеток желаемого типа от других клеток в физиологической жидкости (например, крови или плазме). В одном варианте осуществления способ разделения включает мечение желаемой клетки, которую нужно отделить, подходящим меченым антителом, способным связываться со специфическим (и селективным) рецептором на указанной клетке. Микровезикулы по изобретению затем добавляют к суспензии клеток, подлежащих разделению (включая те, которые несут меченое антитело); после смешивания с суспензией клеток микровезикулы связываются через лиганд с метящим остатком, связанным с конструкцией антитело/клетка, что позволяет разделить клетки при помощи плавучести (см., например, WO 2017/117349). Например, меченое антитело представляет собой биотинилированное антитело, где остаток биотина способен связываться с соответствующим фрагментом, таким как, например, остаток авидина, нейтравидина или стрептавидина, на заполненных газом микровезикулах. Повышенная устойчивость к давлению позволяет использовать микровезикулы по изобретению в самых разных методах разделения клеток.

Следующие ниже примеры помогут дополнительно проиллюстрировать изобретение.

ПРИМЕРЫ

Материалы

DSPC: 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфохолин

DPPG-Na: 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфо-(1'-rac-глицерин) (натриевая соль)

DPPE-PEG5000: 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[метокси(полиэтиленгликоль)-5000] (аммониевая соль)

PEG4000=полиэтиленгликоль (MW=4000 г/моль)

Измерение устойчивости к давлению (Pc50)

Устойчивость к давлению наполненных газом микровезикул оценивали при помощи нефелометра для давления собственной разработки. Вкратце, суспензию микровезикул вводили в ячейку для образца спектрофотометра (воздухонепроницаемую и связанную с системой повышения давления). Оптическая плотность (поглощение при 700 нм) суспензии непрерывно регистрируется при линейном увеличении давления, прикладываемого к образцу в ячейке, от атмосферного давления (760 мм рт.ст., 101,3 кПа,) до избыточного давления в два бара (2280 мм рт.ст., 303,9 кПа), со скоростью около 4 мм рт.ст./сек (533 Па/сек).

Параметр Pc50 (“критическое давление”), характеризующий каждую суспензию, определяет избыточное давление (по отношению к атмосферному давлению), при котором поглощательная способность суспензии микровезикул падает до половины своего исходного значения.

Пример 1

Получение лиофилизированного продукта (Партии 1a-1b)

Процедуру, проиллюстрированную в рабочих примерах WO 94/09829, использовали для получения двух разных партий (1a-1b), каждая из которых состояла из нескольких флаконов, содержащих лиофилизированный продукт.

Вкратце, DSPC, DPPG-Na и пальмитиновую кислоту в массовом соотношении 4,75/4,75/1 сначала растворяли в смеси гексан/этанол (8/2, об/об) при концентрации около 5 г/л и растворители выпаривали под вакуумом. К твердому остатку добавляли PEG4000 в массовом соотношении около 0,017:1, смесь растворяли в трет-бутаноле при температуре около 60°C и прозрачный раствор использовали для заполнения соответствующих флаконов DIN8R (с соответствующим объемом, содержащим около 25 мг смеси). Флаконы затем быстро охлаждали до -45°C и затем подвергали условиям вакуума для удаления замороженного растворителя сублимацией. Температуру затем повышали (выше комнатной, но не выше 35°C) и оставшийся растворитель выпаривали до конечного количества менее 0,5% масс. В конце процесса лиофилизации окружающую среду лиофилизатора насыщали SF₆ при атмосферном давлении, и флаконы (содержащие твердый лиофилизированный продукт, контактирующий с SF₆) закрывали пробкой и герметично закупоривали.

Эти две партии использовали для последующих экспериментов по термообработке.

Пример 2

Получение лиофилизированного продукта (2a-2h)

Процедуру, проиллюстрированную в рабочих примерах WO2004/069284, использовали для получения восьми разных партий (2a-2h), каждая из которых состояла из нескольких флаконов, содержащих лиофилизированный продукт.

Вкратце, получали эмульсию циклооктана и воды (около 1,5/100 об/об), содержащую около 90 мг/л DSPC, 7 мг/л пальмитиновой кислоты, 60 мг/л DPPE-PEG5000 и 100 г/л PEG4000 (Megatron MT3000, Kinematica; 10000 об/мин) и отбирали образцы в флаконы DIN8R (около 1 мл/флакон).

Флаконы охлаждали при -50°C под вакуумом и затем подвергали лиофилизации с последующей вторичной сушкой при температуре выше комнатной до полного удаления воды и растворителя (менее 0,5% по массе), как описано в примере 1. В конце процесса лиофилизации свободный объем флаконов насыщали смесью C₄F₁₀/N₂ в соотношении 35/65 и флаконы закрывали пробкой и герметично закупоривали.

Различные партии (1a - 1h) использовали для последующих экспериментов по термической обработке.

Пример 3

Эффект термообработки на партии, полученные в соответствии с примером 1

Флаконы с разными партиями, полученными в соответствии с примером 1, подвергали различным термическим обработкам и наблюдали эффект на характеристики восстановленных суспензий наполненных газом микровезикул.

Эксперимент 3.1

Флаконы партии 1a подвергали нагреванию при температуре 48°C в течение времени от 8 часов до одной недели (пять флаконов для каждой группы). Затем продукт в флаконе восстанавливали с использованием 5 мл физиологического раствора и измеряли характеристики микровезикул в суспензии. Результаты представлены в следующей таблице 1.

Таблица 1
Партия 1a Время нагрева
48°C Pc50 (кПа)
среднее значение Без нагревания 14,4 8 часов 24,8 16 часов 25,5 24 часов 28,7 48 часов 28,8 Одна неделя 32,0

Как следует из приведенных выше результатов, значительное увеличение устойчивости к давлению можно наблюдать после 8 часов термообработки, по сравнению с необработанными лиофилизированными образцами. Такая устойчивость к давлению немного увеличивается со временем, вплоть до максимума после недели обработки. Однако, как замечено заявителем, слишком продолжительное время нагрева (например, через 24 часа и особенно через 48 часов) может отрицательно повлиять на другие характеристики наполненных газом микровезикул, например, на их общее количество, общий объем газа и/или или их средний размер.

Эксперимент 3.2

Во втором эксперименте флаконы партии 1b нагревали при температурах 40°C, 45°C и 49°C в течение 12, 16 или 20 часов (по три флакона для каждой группы, всего 27 флаконов). Затем продукт в флаконе восстанавливали с использованием 5 мл физиологического раствора и измеряли характеристики микровезикул в суспензии. Результаты представлены в следующей таблице 2.

Таблица 2
Партия 1b Время нагрева T (°C) Pc50 (кПа)
среднее значение 12 часов 40 22,8 16 часов 40 23,6 20 часов 40 23,7 12 часов 45 25,5 16 часов 45 22,5 20 часов 45 22,4 12 часов 49 24,1 16 часов 49 24,4 20 часов 49 24,9

Как следует из приведенных выше данных, значительное увеличение устойчивости к давлению получают путем термической обработки лиофилизированных продуктов (по сравнению с начальным значением около 14 кПа). В то время как более высокое увеличение Pc50 обычно наблюдается при температуре обработки 49°C, обработка при этой температуре может, однако, отрицательно повлиять на другие характеристики восстановленных наполненных газом микровезикул, особенно на значения среднего размера.

Пример 4

Эффект термической обработки на партии, изготовленные в соответствии с примером 2

Флаконы с разными партиями (2a-2h), полученными в соответствии с примером 2, подвергали различным термическим обработкам и наблюдали эффект на характеристики восстановленных суспензий наполненных газом микровезикул.

Эксперимент 4.1

Флаконы партии 2a подвергали нагреванию при температуре 40°C или 45°C в течение 16 часов или не нагревали. Затем продукт в флаконе восстанавливали с использованием 5 мл физиологического раствора и измеряли характеристики микровезикул в суспензии. Результаты представлены в следующей таблице 3.

Таблица 3
Партия 1a T нагревания
в течение 16 часов Pc50 (кПа)
среднее значение Без нагревания 66,1 40°C 84,8 45°C 78,8

Как следует из приведенных выше данных, значительное увеличение устойчивости к давлению получают путем термообработки также для партий, полученных в соответствии с процедурой примера 2.

Эксперимент 4.2

Флаконы партии 2b подвергали нагреванию при температуре 40°C в течение времени от 16 до 88 часов, или не нагревали. Затем продукт в флаконе восстанавливали с использованием 5 мл физиологического раствора и измеряли характеристики микровезикул в суспензии. Результаты представлены в следующей таблице 4.

Таблица 4
Партия 2b Время нагрева
T=40°C Pc50 (кПа)
среднее значение Без нагревания 82,1 16 часов 99,0 40 часов 103,6 64 часов 98,6 88 часов 102,5

Как следует из приведенных выше данных, значительное увеличение устойчивости к давлению получают путем термообработки при 40°C. Продолжительность обработки в течение 16 часов обычно считается достаточной, также чтобы избежать возможных негативных эффектов, вызываемых более длительной термообработкой, на другие характеристики микровезикул (например, увеличение количества микровезикул большого размера в восстановленной суспензии).

Эксперимент 4.3

Флаконы партий 2c-2g подвергали нагреванию при температуре 40°C в течение 16 часов или не нагревали. Затем продукт в флаконе восстанавливали с использованием 5 мл физиологического раствора и измеряли характеристики микровезикул в суспензии. Результаты представлены в следующей таблице 5.

Таблица 5
Партии 2c-2g (40°C, 16 час.) № партии Термическая обработка Pc50 (кПа)
среднее значение 2c нет 70,6 2c да 93,7 2d нет 74,1 2d да 94,3 2e нет 69,6 2e да 94,2 2f нет 62,8 2f да 79,8 2g нет 55,4 2g да 81,3

Как видно из приведенной выше таблицы, для суспензий микровезикул, восстановленных из различных партий, повышение устойчивости к давлению более чем на 15 кПа или более, вплоть до около 25 кПа, получали после термической обработки лиофилизированных продуктов.

Эксперимент 4.4

Флаконы партии 2h подвергали термической обработке при 38°C в течение времени от двух до 24 часов. Затем продукт в флаконе восстанавливали с использованием 5 мл физиологического раствора и измеряли характеристики микровезикул в суспензии. Результаты представлены в следующей таблице 6.

Таблица 6
Партия 2h Время нагрева
(час) при 38°C Pc50 (кПа)
среднее значение 0 63,19 2 73,33 4 74,66 6 79,33 8 80,26 12 82,66 16 79,73 24 83,06

Как видно из приведенной выше таблицы, повышение устойчивости к давлению микровезикул в восстановленной суспензии достигалось при нагревании лиофилизированного вещества в течение увеличивающегося периода времени, до 8-12 часов, при 38°C. Дальнейшее нагревание вещества (16 или 24 часов) по существу не увеличивало устойчивость к давлению.

Группа изобретений относится к области получения и использования средств для ультразвуковых методов визуализации с контрастным усилением. Предлагается способ изготовления лиофилизированной композиции, содержащей (i) амфифильное вещество, включающее фосфолипид и жирную кислоту, и (ii) полиэтиленгликоль в качестве защитного компонента для лиофилизации, и подходящей для получения суспензии стабилизированных наполненных газом микровезикул, где способ включает: а) получение жидкой смеси, включающей указанное амфифильное вещество и указанный защитный компонент для лиофилизации в растворителе; b) лиофилизацию жидкой смеси для удаления указанного растворителя и получения лиофилизированного продукта; и c) нагревание указанного лиофилизированного продукта при атмосферном давлении при температуре выше 35°C и до 50°C в течение периода времени от 8 до 20 часов. Предлагаются также: способ изготовления суспензии наполненных газом микровезикул, который включает восстановление лиофилизированного продукта, полученного в соответствии с указанным выше способом, с использованием фармацевтически приемлемого жидкого носителя в присутствии физиологически приемлемого газа при осторожном перемешивании, и способ диагностики, который включает (i) введение пациенту суспензии наполненных газом микровезикул, полученных указанным выше способом; и (ii) обнаружение ультразвукового сигнала из интересующей области у указанного пациента. Использование группы изобретений обеспечивает улучшенные характеристики суспензии наполненных газом микровезикул, полученной при восстановлении лиофилизированного продукта, который подвергнут дополнительной термообработке, по сравнению с суспензиями, полученными из лиофилизированных продуктов, которые не подвергали такой термообработке. В частности, указанная выше термообработка лиофилизированного продукта приводит к повышенной устойчивости наполненных газом микровезикул к давлению, которые, как правило, демонстрируют повышенную продолжительность присутствия в кровотоке после инъекции. 3 н. и 16 з.п. ф-лы, 6 табл., 4 пр.

1. Способ изготовления лиофилизированной композиции, подходящей для получения суспензии стабилизированных наполненных газом микровезикул, при этом указанная композиция включает: (i) амфифильное вещество, включающее фосфолипид и жирную кислоту; и (ii) полиэтиленгликоль в качестве защитного компонента для лиофилизации; который включает:

a) получение жидкой смеси, включающей указанное амфифильное вещество и указанный защитный компонент для лиофилизации в растворителе;

b) лиофилизацию жидкой смеси для удаления указанного растворителя и получения лиофилизированного продукта; и

c) после завершения лиофилизации стадии b) нагревание указанного лиофилизированного продукта при атмосферном давлении при температуре выше 35°C и до 50°C в течение периода времени от восьми до двадцати часов.

2. Способ по п. 1, где указанная жидкая смесь включает указанное амфифильное вещество и указанный защитный компонент для лиофилизации, диспергированные в органическом растворителе.

3. Способ по п. 1, где указанная жидкая смесь включает указанное амфифильное вещество и указанный защитный компонент для лиофилизации, диспергированные в водной эмульсии не смешивающегося с водой растворителя и воды.

4. Способ по п. 1, где указанную стадию нагревания осуществляют при температуре 38°C или выше.

5. Способ по п. 1, где указанную стадию нагревания осуществляют при температуре 40°C или выше.

6. Способ по п. 1, где указанный фосфолипид включает дилауроил-фосфатидилхолин (DLPC), димиристоил-фосфатидилхолин (DMPC), дипальмитоил-фосфатидилхолин (DPPC), диарахидоил-фосфатидилхолин (DAPC), дистеароил-фосфатидилхолин (DSPC), диолеоил-фосфатидилхолин (DOPC), 1,2 Дистеароил-sn-глицеро-3-Этилфосфохолин (Этил-DSPC), дипентадеканоил-фосфатидилхолин (DPDPC), 1-миристоил-2-пальмитоил-фосфатидилхолин (MPPC), 1-пальмитоил-2-миристоил-фосфатидилхолин (PMPC), 1-пальмитоил-2-стеароил-фосфатидилхолин (PSPC), 1-стеароил-2-пальмитоил-фосфатидилхолин (SPPC), 1-пальмитоил-2-олеилфосфатидилхолин (POPC), 1-олеил-2-пальмитоил-фосфатидилхолин (OPPC), дилауроил-фосфатидилглицерин (DLPG) и его соли с щелочными металлами, диарахидоилфосфатидил-глицерин (DAPG) и его соли с щелочными металлами, димиристоилфосфатидилглицерин (DMPG) и его соли с щелочными металлами, дипальмитоилфосфатидилглицерин (DPPG) и его соли с щелочными металлами, дистеароилфосфатидилглицерин (DSPG) и его соли с щелочными металлами, диолеоил-фосфатидилглицерин (DOPG) и его соли с щелочными металлами, димиристоилфосфатидную кислоту (DMPA) и ее соли с щелочными металлами, дипальмитоилфосфатидную кислоту (DPPA) и ее соли с щелочными металлами, дистеароилфосфатидную кислоту (DSPA), диарахидоилфосфатидную кислоту (DAPA) и ее соли с щелочными металлами, димиристоил-фосфатидилэтаноламин (DMPE), дипальмитоилфосфатидилэтаноламин (DPPE), дистеароил фосфатидил-этаноламин (DSPE), диолеилфосфатидил-этаноламин (DOPE), диарахидоилфосфатидилэтаноламин (DAPE), дилинолеоилфосфатидилэтаноламин (DLPE), димиристоил фосфатидилсерин (DMPS), диарахидоилфосфатидилсерин (DAPS), дипальмитоилфосфатидилсерин (DPPS), дистеароилфосфатидилсерин (DSPS), диолеоилфосфатидилсерин (DOPS), дипальмитоилсфингомиелин (DPSP) и дистеароилсфингомиелин (DSSP), дилауроил-фосфатидилинозит (DLPI), диарахидоилфосфатидилинозит (DAPI), димиристоилфосфатидилинозит (DMPI), дипальмитоилфосфатидилинозит (DPPI), дистеароилфосфатидилинозит (DSPI) или диолеоил-фосфатидилинозит (DOPI).

7. Способ по п. 1, где указанная жирная кислота включает каприновую (н-декановую), лауриновую (н-додекановую), миристиновую (н-тетрадекановую), пальмитиновую (н-гексадекановую), стеариновую (н-октадекановую), арахидовую (н-эйкозановую), бегеновую (н-докозановую) или н-тетракозановую кислоту.

8. Способ по п. 1, где указанное амфифильное вещество включает DSPC, DPPG и пальмитиновую кислоту.

9. Способ по п. 1, где указанное амфифильное вещество включает DSPC, DPPE-PEG5000 и пальмитиновую кислоту.

10. Способ по п. 8, где указанную стадию нагревания осуществляют при температуре от 40°C до 48°C в течение по меньшей мере 8 часов.

11. Способ по п. 9, где указанную стадию нагревания осуществляют при температуре от 36°C до 45°C.

12. Способ по п. 1, где указанное нагревание на стадии с) осуществляют в течение по меньшей мере двенадцати часов.

13. Способ по любому из предшествующих пунктов, где указанную жидкую смесь собирают в стеклянные флаконы, которые загружают в лиофилизатор.

14. Способ по п. 13, который включает, по завершении стадии b), насыщение свободного объема флаконов, содержащих лиофилизированный продукт, физиологически приемлемым газом и затем закупоривание и герметизацию флаконов.

15. Способ изготовления суспензии наполненных газом микровезикул, который включает восстановление лиофилизированного продукта, полученного в соответствии со способом по любому из пп. 1-14, с использованием фармацевтически приемлемого жидкого носителя в присутствии физиологически приемлемого газа при осторожном перемешивании.

16. Способ диагностики, который включает

(i) введение пациенту суспензии наполненных газом микровезикул, полученных способом по п. 15; и

(ii) обнаружение ультразвукового сигнала из интересующей области у указанного пациента.

17. Способ по п. 16, который включает ультразвуковую визуализацию сердца.

18. Способ по п. 16, который включает ультразвуковую визуализацию печени.

19. Способ по п. 16, который включает ультразвуковую визуализацию мочевыводящих путей.