РЕФЕРЕНС-ШТАММ ДЛЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ БАКТЕРИЙ YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ГРУППЫ 1b Российский патент 2024 года по МПК C12N1/20 C12Q1/02 C12R1/01 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может найти применение в молекулярной эпидемиологии для установления источника инфекции и обнаружения факторов передачи в очаге заболевания, а также для проведения мониторинга циркуляции штаммов, выявления доминирующих и новых, нетипичных для территории наблюдения, геновариантов.

Известно, что псевдотуберкулез в различных географических регионах мира характеризуется определенными клиническими симптомами: в Европе для этой инфекции характерно, главным образом, наличие лихорадки, гастроинтестинальных симптомов и мезентериального лимфаденита, тогда как в России - это проявления системного инфекционного процесса, такие как сыпь, узловатая эритема, артриты.

Полиморфизм клинических проявлений заболевания обусловлен наличием у возбудителей определенного набора факторов патогенности хромосомной и плазмидной природы, в соответствии с которым штаммы Yersinia pseudotuberculosis относят к различным генетическим группам G и их подгруппам (Fukushima, Н. Geograhical heterogeneity between Far Eastern and Western Countries in Prevalence of the Virulence Plasmid, the Superantigen Yersinia pseudotuberculosis - Derived Mitogen, and the High-Pathogenicity Island among Yersinia pseudotuberculosis Strains / H. Fukushima, Y. Matsuda, R. Seki, M. Tsubokura, N. Takeda, F.N. Shubin, IK Paik, XB Zheng // J.of Clin. Microbiol. - 2001. - Vol. 39, №10, P. 3541-3547). Изучены следующие факторы патогенности. Гены «острова» высокой патогенности HPI, расположенного на хромосоме, ответственны за биосинтез и регуляцию системы утилизации железа, необходимого для экспрессии высоковирулентного фенотипа энтеробактерий. Суперантиген YPMa в организме хозяина стимулирует поликлональную активацию Т-лимфоцитов (СД4+, СД8+), при этом во взаимодействие вовлекаются от 10 до 40% всех лимфоцитов. Это ведет к гиперпродукции цитокинов, таких как IL-2, TNF-α, IFN-γ, что может вызвать синдром токсического шока. Известно три группы суперантигенов - YPMa, YPMb, YPMc, кодируемых соответствующими генами ypmA, ypmB и ypmC, являющимися аллелями гена ypm. У Yersinia pseudotuberculosis выявляют ген ypmA или ypmC. YAPI - адгезивный «остров» патогенности иерсиний, несет гены, кодирующие пили IV типа (филаментозные структуры, отходящие от поверхности бактериальной клетки, короче и многочисленнее жгутиков). Пили IV типа вовлечены в различные бактериальные функции, включая адгезию на клетках пейеровых бляшек, бактериофагальную адсорбцию, плазмидный перенос и флагеллин-независимую подвижность. Плазмида с молекулярной массой 82 МДа (pVM82), присутствующая у некоторых штаммов Yersinia pseudotuberculosis, детерминирует аппарат секреции IVB типа, оказывает иммуносупрессорное и антифагоцитарное действие на иммунные структуры макроорганизма, что ведет к развитию генерализованных форм заболевания. Было показано, что штаммы Yersinia pseudotuberculosis, обладающие плазмидой pVM82, вызывают более тяжелое течение псевдотуберкулеза.

Ранее методом ПЦР проведены исследования коллекции российских и зарубежных штаммов Y. pseudotuberculosis по выявлению генов, кодирующих основные факторы вирулентности (Кокорина Г.И. Генотипы штаммов Yersinia pseudotuberculosis и их клиническое и диагностическое значение: дис.…канд. мед; наук: защищена 28.05.13: утв. 21.10.13 / Кокорина Галина Ивановна. - СПб. - 144 с.). При этом, в генетической группе G1 выявлена одна подгруппа - 1а. Она характеризуется наличием генов «острова» высокой патогенности HPI и гена суперантигена YPMa при отсутствии других факторов патогенности.

Ближайшим к заявленному штамму выбранному в качестве прототипа является штамм Y. pseudotuberculosis 634, депонированный в Государственной коллекции патогенных бактерий ФКУН Российский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора под номером КМ 214 и используемый в качестве тест-штамма для дифференциации бактерий Y. pseudotuberculosis генетической группы I_A. Штамм содержит хромосомный ген суперантигена Y. pseudotuberculosis YPMa/YPMc (ypmA/C), ген адгезивного «острова» патогенности иерсиний YAPI (pilPQ) (патент RU 2465321, опубл. 27.10.2012). Штамм не содержит гены «острова» высокой патогенности HPI (irp2, fyuA), поэтому не может быть использован как тест-штамм для дифференциации бактерий Y. pseudotuberculosis генетической группы 1b.

Изобретение направлено на получение тест-штамма Y. pseudotuberculosis генетической группы 1b.

Технический результат - дифференциация бактерий Y. pseudotuberculosis генетической группы 1b по содержанию определенных генов вирулентности, что позволит устанавливать источник инфекции в очаге заболевания и идентифицировать факторы передачи, а также проводить мониторинг циркуляции штаммов на различных территориях.

Полученный штамм Y. pseudotuberculosis 1834 депонирован в Государственной коллекции патогенных бактерий ФКУН Российский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора под номером КМ 2156. Особенностью штамма является содержание хромосомного гена суперантигена Y. pseudotuberculosis YPMa (ypmA), гена адгезивного «острова» патогенности иерсиний YAPI (pilPQ) генов «острова» высокой патогенности HPI (irp2, fyuA). Штамм относится к порядку Enterobacteriales, семейству Yersiniaceae, роду Yersinia, виду Yersinia pseudotuberculosis, выделен от серой крысы в г. Хабаровске 1.03.1959 г.

Морфологические и физиологические характеристики. Грамотрицательные аспорогенные бескапсульные палочковидные клетки 1-3 мкм, слабоподвижны при температуре ниже 30°С, при 37°С неподвижны. На жидких питательных средах в аэробных условиях при 28°С или при 37°С образуют равномерное помутнение. На агаре Хоттингера при 28°С через 48 ч образуют выпуклые прозрачные серовато-желтые блестящие колонии с относительно ровным краем и приподнятым центром размером до 1,2-1,8 мм. На Иерсиния-агаре при 28°С через 48 ч на сине-голубом фоне среды образуют мелкие (1-2 мм), голубовато-зеленые, с приподнятым центром, выпуклые, сухие, с матовым налетом колонии с фестончатым краем.

Биохимическая активность. Штамм гидролизует мочевину, эскулин, ферментирует L-рамнозу, D-ксилозу, мальтозу, трегалозу; не ферментирует лактозу, сахарозу, D-сорбитол, раффинозу; не образует индол, не декарбоксилирует орнитин, не утилизирует цитрат на среде Симмонса. Образование ацетоина (реакция Фогеса-Проскауэра) отсутствует при температурах (26±2)°С и (37±1)°С.

Антигенные свойства. При проведении молекулярного серотипирования методом ПЦР (Bogdanovich, Т. Use of O-Antigen Gene Cluster-Specific PCRs for the Identification and O-Genotyping of Yersinia pseudotuberculosis and Yersinia pestis / T. Bogdanovich, E. Carniel, H. Fukushima, M. Skurnik // Clin.Microbiol. - 2003. - Vol. 41, №11, P. 5103-5112.) отнесен к серотипу O:2b.

Генетические особенности. Содержит хромосомный ген суперантигена YPMa (ypmA), ген адгезивного «острова» патогенности иерсиний YAPI (pilPQ), хромосомные гены «острова» высокой патогенности HPI (irp2, fyuA); отсутствует ген плазмиды pVM82 (dotO), ген адгезивного «острова» патогенности иерсиний YAPI (api74), хромосомный ген суперантигена YPMc (ypmC).

Сущность изобретения поясняется чертежом, где на ФИГ. 1 представлен результат электрофоретического разделения фрагментов ДНК, полученных после проведения ПЦР.

На дорожки 1 и 8 нанесен маркер молекулярного веса ДНК (30000 п.н.; SibEnzyme). На дорожку 2 нанесен продукт ПЦР с праймерами к участку гена ypm А/С (350 п.н.); 3 - irp2 (280 п.н.); 4 - fyuA (540 п.н.); 5 -pilPQ (569 п.н.); 6 - api74 (941 п.н.); 7 - dotO (2811 п.н.).

Видно, что у штамма 1834 присутствуют четыре фрагмента ДНК, длиной 350 п.н., 280 п.н., 540 п.н. и 569 п.н. (дорожки 2-5), что соответствует участкам генов ypmA/С, irp2, fyuA и pilPQ. На дорожках 6 и 7 ампликонов нет. При секвенировании по Сенгеру установлено, что данный штамм содержит ген ypmA.

Изобретение реализуется следующим образом.

Штамм высевают в пробирки с мясо-пептонным бульоном для культивирования микроорганизмов, рН (7,1±0,1), инкубируют в течение суток при температуре (26±2)°С. Затем высевают на агар Хоттингера выращивают при (26±2)°С в течение суток. Полученную культуру исследуют методом ПЦР, для этого:

1) Выделяют ДНК из бактериальных клеток согласно стандартной методике (Организация и проведение лабораторных исследований на иерсиниозы на территориальном, региональном и федеральном уровнях: методические указания МУК 4.2.3019-12 / Е.Б. Ежлова [и др.]. - М.: Изд-во ФГУЗ «ФЦГЭ Роспотребнадзора», 2012. - 61 с.).

2) Готовят реакционную смесь для амплификации с использованием стандартных реагентов: ScreenMix 1х, 0,4 мкМ/мкл прямого и обратного праймеров, 1 мкл исследуемого образца (100 нг), вода до 25 мкл конечного объема. ПЦР проводят по программе: 1 цикл 95°С - 5 мин; 25 циклов 94°С - 1 мин, 55°С - 1 мин, 72°С - 1 мин; 1 цикл 72°С - 7 мин. Для учета результатов ПЦР проводят электрофорез в 1,5% агарозном геле при постоянном напряжении 75 В в ТВЕ буфере (0,9 М Tris, 0,9 М борная кислота, 20 мМ EDTA⋅Na2) с окрашиванием этидий бромидом. Используют праймеры к хромосомным и плазмидным генам, кодирующим факторы вирулентности Y. pseudotuberculosis (таблица 1):

Последовательности генов, кодирующие суперантигены Y. pseudotuberculosis ypmA и ypmC, являются аллелями гена ypm и различаются на 1 нуклеотид, поэтому для их дифференциации проводили секвенирование по Сэнгеру. Для этого использовали праймеры (таблица 2).

При секвенировании установлено, что данный штамм содержит ген ypmA.

Таким образом, штамм Y. pseudotuberculosis 1834 содержит определенный набор генов вирулентности и относится к генетической группе G 1b. Штамм с таким набором генов выявлен впервые, аналогов не обнаружено. При обнаружении штаммов с таким же набором генов вирулентности, возможно достоверно проводить генетическое типирование штаммов - относить их к новой генетической группе 1b, что позволит проводить эпидемиологическое расследование случаев спорадических и групповых заболеваний псевдотуберкулезом, а также проводить мониторинг циркуляции b возбудителя псевдотуберкулеза на различных территориях.

Изобретение относится к медицинской микробиологии. Предложен штамм Y. pseudotuberculosis 1834, содержащий ген ypmA суперантигена YPMa, ген pilPQ адгезивного «острова» патогенности иерсиний YAPI, гены irp2, fyuA «острова» высокой патогенности HPI. Штамм депонирован в Государственной коллекции патогенных бактерий ФКУН Российский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора под номером Y. pseudotuberculosis КМ 2156. Штамм предназначен для использования в качестве референс-штамма генетической группы 1b. Изобретение обеспечивает дифференциацию бактерий Y. pseudotuberculosis генетической группы 1b по содержанию указанных генов вирулентности, что позволит устанавливать источник инфекции в очаге заболевания и идентифицировать факторы передачи, а также проводить мониторинг циркуляции штаммов на различных территориях. 1 ил., 2 табл.

Штамм Y. pseudotuberculosis 1834, содержащий ген ypmA суперантигена YPMa, ген pilPQ адгезивного «острова» патогенности иерсиний YAPI, гены irp2, fyuA «острова» высокой патогенности HPI, депонированный в Государственной коллекции патогенных бактерий ФКУН Российский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора под номером Y. pseudotuberculosis КМ 2156, в качестве референс-штамма генетической группы 1b.