ТЕСТ-ШТАММ YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS ДЛЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ БАКТЕРИЙ YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ГРУППЫ I Российский патент 2012 года по МПК C12N1/20 C12Q1/02 C12R1/02 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и представляет собой оригинальный штамм возбудителя псевдотуберкулеза, содержащий хромосомный ген суперантигена Y.pseudotuberculosis YPMa/YPMc (ypmA/C), ген адгезивного «острова» патогенности иерсиний YAPI (pilPQ), плазмиды с мол. массой 82 МДа (pVM 82) и используемый как тест-штамм для дифференциации бактерий Y.pseudotuberculosis генетической группы I.

Псевдотуберкулез регистрируется в России практически повсеместно, при этом наиболее высокие показатели заболеваемости характерны для территорий с умеренным и холодным климатом (Сибирский, Дальневосточный, Северо-Западный ФО).

Известно, что псевдотуберкулез в различных географических регионах характеризуется определенными клиническими симптомами (Fukushima Н., Matsuda Y., Seki R., et al. Geographical Heterogeneity between Far Eastern and Western Countries in Prevalence of the Virulence Plasmid, the Superantigen Yersinia pseudotuberculosis-Denved Mitogen, and the High-Pathogenicity Island among Yersinia pseudotuberculosis Strains. J Clin Microbiol. 2001; 39 (10): 3541-3547): в Европе для этой инфекции характерны, главным образом, наличие лихорадки, гастроинтестинальных симптомов и мезентериального лимфаденита, тогда как в России - это системные проявления, такие как сыпь, узловатая эритема, артриты.

Такой полиморфизм клинических проявлений заболевания обусловлен наличием у возбудителя большого набора факторов патогенности хромосомной и плазмидной природы. Так, гены «острова» высокой патогенности HPI, расположенного на хромосоме, ответственны за биосинтез и регуляцию системы утилизации железа, необходимого для экспрессии высоковирулентного фенотипа энтеробактерий (Carniel E. The Yersinia high-pathogenicity island: an iron-uptake island. Microbes and Infection, 3, 2001, 561-569). Суперантигены YPMs в организме хозяина стимулируют поликлональную активацию Т-лимфоцитов (СД4+, СД8+). При этом во взаимодействие вовлекаются от 10 до 40% всех лимфоцитов. Это ведет к гиперпродукции цитокинов, таких как IL-2, TNF-α, IFN-γ, что может вызвать синдром токсического шока (Шурыгина И.А., 2003). Известны три группы суперантигенов - YPMa, YPMb, YPMc, кодируемых соответствующими генами ypmA, ypmB и ypmC (Carnoy С., Floquet S., Marceau M., et al. The superantigen gene ypm is located т an unstable chromosomal locus of Yersinia pseudotuberculosis. J Bacteriol. 2002, 184 (16): 4489-99). YAPI - адгезивный «остров» патогенности иерсиний, несет гены, кодирующие пили IV типа (филаментозные структуры, отходящие от поверхности бактериальной клетки, короче и многочисленнее жгутиков). Пили IV типа вовлечены в различные бактериальные функции, включая адгезию на клетках пейеровых бляшек, бактериофагальную адсорбцию, плазмидный перенос и флагеллин-независимую подвижность (Collyn F., Léty M.A., Nair S., et al. Yersinia pseudotuberculosis harbors a type IV pilus gene cluster that contributes to pathogenicity. Infect Immun., 2002, 70 (11): 6196-205). Плазмида с мол. массой 82 МДа (pVM82), присутствующая у некоторых штаммов Y.pseudotuberculosis, оказывает иммуносупрессорное и антифагоцитарное действие на иммунные структуры макроорганизма (Дубровина В.И., Голубинский Е.П., Борсук Г.И. и авт. Особенности фагоцитоза Yersinia pseudotuberculosis с разным набором плазмид. Мед. паразитол., 1999, 4:50-53). М.В. Чеснокова и соавт. (Чеснокова М.В., Климов В.Т., Марамович А.С. Генотипирование Yersinia pseudotuberculosis, выделенных в Сибири и на Дальнем Востоке. Журн. микробиол., 2006, 6, 20-25) показали, что штаммы Y.pseudotuberculosis, обладающие плазмидой pVM82, вызывают более тяжелое течение псевдотуберкулеза.

Ранее методом ПЦР штаммы Y.pseudotuberculosis были исследованы на наличие таких генов вирулентности, как гены суперантигенов (ypmA, ypmB и ypmC), гены «острова» высокой патогенности HPI, и по результатам работы разделены на генетические группы (Fukushima H., Matsuda Y., Seki R., et al. Geographical Heterogeneity between Far Eastern and Western Countries in Prevalence of the Virulence Plasmid, the Superantigen Yersinia pseudotuberculosis-Derived Mitogen, and the High-Pathogenicity Island among Yersinia pseudotuberculosis Strains. J Clin Microbiol. 2001; 39 (10): 3541-3547). Недостатком этого исследования является то, что не были учтены другие факторы патогенности - адгезивный «остров» патогенности иерсиний и плазмида pVM82.

В настоящее время для эпидемиологического расследования случаев спорадических и групповых заболеваний псевдотуберкулезом и проведения мониторинга за возбудителями на различных территориях исследуют содержание плазмид Y.pseudotuberculosis, которые выделяют по методу Т.Kieser в несколько этапов, а также методом ПЦР определяют наличие генов «острова» высокой патогенности HPI и суперантигена (Чеснокова М.В., Климов В.Т., Марамович А.С. Генотипирование Yersinia pseudotuberculosis, выделенных в Сибири и на Дальнем Востоке. Журн. микробиол., 2006, 6, 20-25). Штамм-аналог получить не удалось.

За прототип выбран штамм Y.pseudotuberculosis КМ-9/2160 (Мессорош В.Г. Биологические свойства Yersinia pseudotuberculosis и совершенствование лабораторной диагностики псевдотуберкулеза. Автореф. дисс.… канд. мед. наук, СПб, 1993, 18 с.), используемый в качестве эталона для определения вирулентности, депонированный в коллекции патогенных микроорганизмов РосНИПЧИ «Микроб». Степень вирулентности определяли при конъюнктивальном заражении морских свинок, энтеральном заражении белых мышей и морских свинок и инфицировании культур тканей линий НЕр-2, HeLa. Изучение наличия генов вирулентности не проводилось. Поэтому применение штамма для выполнения задач мониторинга за циркуляцией возбудителя псевдотуберкулеза и поиска источника инфекции нецелесообразно.

Изобретение направлено на получение тест-штамма Y.pseudotuberculosis генетической группы I.

Технический результат - дифференциация бактерий Yersinia pseudotuberculosis генетической группы I по содержанию генов вирулентности, что позволит устанавливать источник инфекции в очаге заболевания и идентифицировать факторы передачи, а также проводить мониторинг за циркуляцией штаммов на различных территориях.

Полученный штамм Y.pseudotuberculosis 413 депонирован в коллекции патогенных микроорганизмов РосНИПЧИ «Микроб» КМ 211. Особенностью штамма является содержание хромосомного гена суперантигена Y.pseudotuberculosis YPMa/YPMc (ypmA/C), гена адгезивного «острова» патогенности иерсиний YAPI (pilPQ) и плазмиды с мол. массой 82 МДа (pVM82).

Штамм семейства Enterobacteriaceae род Yersinia вид Y.pseudotuberculosis, выделен от больного псевдотуберкулезом генерализованной формы средней степени тяжести, г.Санкт-Петербург, 2000 г.

Морфологические и физиологические характеристики. Грамотрицательные аспорогенные бескапсульные палочковидные клетки 1-3 мкм, слабоподвижны при температуре ниже 30°С, при 37°С неподвижны. На жидких питательных средах в аэробных условиях при 28°С или при 37°С образуют равномерное помутнение. На агаре Хоттингера при 28°С через 48 ч образуют выпуклые прозрачные серовато-желтые блестящие колонии с относительно ровным краем и приподнятым центром размером до 1,2-1,8 мм. На среде с бромтимоловым синим при 28°С через 48 ч на сине-голубом фоне среды образуют мелкие (1-2 мм), голубовато-зеленые, с приподнятым центром, выпуклые, сухие, с матовым налетом колонии с фестончатым краем.

Биохимическая активность. Ферментирует с образованием кислоты: глюкозу, маннит, ксилозу, не ферментирует лактозу, сахарозу, сорбит. Пробы на индол и сероводород отрицательны. Продуцирует каталазу, не продуцирует оксидазу. Гидролизует мочевину, не ферментирует салицин. Не продуцирует орнитиндекарбоксилазу.

Антигенные свойства. Вступает в реакцию агглютинации с диагностической сывороткой к Y.pseudotuberculosis O:1.

Гентические особенности. Содержит хромосомный ген суперантигена YPMa/YPMc (ypmA/C), ген адгезивного «острова» патогенности иерсиний YAPI (pilPQ), плазмиду pVM82 (dotO); отсуствуют хромосомный ген «острова» высокой патогенности HPI (fyuA) и ген суперантигена иерсиний YPMb (ypmB).

По сравнению со штаммом-аналогом в настоящем изобретении изучают также наличие хромосомного фактора патогенности - YAPI. Преимуществом данного исследования является использование только метода ПНР для поиска всех генов вирулентности.

Сущность изобретения поясняется чертежами.

На ФИГ.1 представлены результаты ПЦР со штаммом Yersinia pseudotuberculosis №413 (группа I), где М - маркер молекулярного веса ДНК (10000 b.p.; Eurogentec); 1 - ypmA/С (422 b.p.); 2 - ypmB (268 b.p.); 3 - fyuA (149 b.p.); 4 - pilPQ (569 b.p.); 5 - dotO (2811 b.p.).

На ФИГ.2 - результаты ПЦР со штаммами Yersinia pseudotuberculosis №413 дорожки (1-5), №418 дорожки (6-10) и №435 дорожки (11-15), где М - маркер молекулярного веса ДНК (VI.; Eurogentec); 1, 6, 11 - ypmA/С (422 b.p.); 2, 7, 12 - ypmB (268 b.p.); 3, 8, 13 - fyuA (149 b.p.); 4, 9, 14 - pilPQ (569 b.p.); 5, 10, 15 - dotO (2811 b.p.).

Изобретение реализуется следующим образом.

Пример 1. Способ получения штамма.

Чистую культуру штамма выращивают на агаре Хоттингера при 28°С в течение 24 ч.

Готовят взвесь бактерий с концентрацией 10⁸ м.к./мл в стерильной дистиллированной воде, 100 мкл взвеси кипятят 5 мин, центрифугируют при 10 тыс.об./мин 1 мин, используют надосадок. Бактерии исследуют методом полимеразной цепной реакции с праймерами к участкам генов, кодирующим факторы патогенности Y.pseudotuberculosis производства ООО «Синтол» (Москва) (таблица 1)

Таблица 1 Ген Локализация гена Праймер последовательность (5'-3') Длина ПЦР продукта (п.н.) на хромосоме fyuA HPI Forward CTTTATCCTCTGGCCTTGGG 149 Reverse CTGACAACAGTAGACGAG pilPQ YAPI Forward TATGTTGCTGGAGGCTCAG 569 Reverse GCGAACTATCAGCTATACG ypmA/С Локус YPMa/YPMc Forward CACTTTTCTCTGGAGTAGCG 422 Reverse ACAGGACATTTCGTCA ypmB Локус YPMb Forward TTTCTGTCATTACTGACATTA 268 Reverse CCTCTTTCCATCCATCTCTTA на плазмиде dotO pVM82 Forward ATGATGGATGGTTCACTGGG 2811 Reverse ATTGATTGCTTGAGGTCTTGG

Реакционную смесь для проведения ПЦР готовят с использованием стандартных реагентов производства «Fermentas» согласно прилагаемой инструкции: 2,5 мкл 10х Taq буфера с (NH₄)₂SO₄, 2 мМ/мкл MgCl₂, 0,2 мМ/мкл каждого дНТФ, 0,4 мкМ/мкл прямого и обратного праймеров, 0,625 U Taq-ДНК-полимеразы, с добавлением 4 мкл исследуемого образца до конечного объема 25 мкл. ПЦР проводят по программе: 1 цикл 95°С - 5 мин; 25 циклов 94°С - 1 мин, 55°С - 1 мин, 72°С - 1 мин; 1 цикл 72°С - 7 мин. Для учета результатов ПЦР проводят электрофорез в 1,5% агарозном геле при постоянном напряжении 75 В в ТВЕ буфере (0,9 М Tris, 0,9 М борная кислота, 20 мМ EDTA·Na₂) с окрашиванием этидий бромидом.

На ФИГ.1 представлен результат электрофоретического разделения фрагментов ДНК, полученных после проведения ПЦР.

Видно, что у штамма 413 присуствуют три фрагмента ДНК, длиной 422 п.н., 569 п.н. и 2811 п.н. (дорожки 1, 4 и 5), что соответствует участкам генов ypmA/С, pilPQ и dotO. На дорожках 2 и 3 ампликонов нет.

Пример 2. Исследование ДНК штаммов Yersinia pseudotuberculosis.

Методом ПНР с использованием праймеров к хромосомным генам Yersinia (fyuA, pilPQ, ypmA/С, ypmB) и к плазмидному гену (dotO) были исследованы ДНК штаммов №418 и №435, которые были выделены в стационаре при лечении спорадических больных псевдотуберкулезом. В качестве контроля использован штамм Y.pseudotuberculosis KM 211.

Результаты исследования представлены на ФИГ.2.

Видно, что у всех исследованных штаммов Y.pseudotuberculosis присуствуют три фрагмента ДНК длиной 422 п.н. (дорожки 1, 6, 11), 569 п.н. (дорожки 4, 9, 14) и 2811 п.н. (дорожки 5, 10, 15), как и у полученного тест-штамма, и, соответственно, они могут быть отнесены к генетической группе I. Таким образом, установлен факт генетического сходства исследованных штаммов, что позволяет судить о циркуляции Y.pseudotuberculosis данной генетической группы на исследуемой территории.

Таким образом, заявленный штамм пригоден для дифференциации бактерий Yersinia pseudotuberculosis генетической группы I по содержанию генов вирулентности, что позволит устанавливать источник инфекции в очаге заболевания и идентифицировать факторы передачи, а также проводить мониторинг за циркуляцией штаммов на различных территориях.

Штамм бактерий Yersinia pseudotuberculosis 413 выделен от больного псевдотуберкулезом, депонирован в коллекции РосНИПЧИ «Микроб» под номером КМ 211 и предназначен в качестве тест-штамма для дифференциации бактерий Yersinia pseudotuberculosis генетической группы I. Особенностью штамма является содержание хромосомного гена суперантигена Y. pseudotuberculosis YPMa/YPMc (ypmA/C), гена адгезивного «острова» патогенности иерсиний YAPI (pilPQ), плазмиды pVM 82 с мол. массой 82 МДа, которые определяют методом ПЦР. Использование изобретения позволит проводить эпидемиологическое расследование спорадических и групповых заболеваний псевдотуберкулезом, установления источника инфекции в очаге заболевания и идентификации факторов передачи, а также мониторинг за циркуляцией штаммов на различных территориях. 2 ил., 1 табл.

Тест-штамм Yersinia pseudotuberculosis, РосНИПЧИ «Микроб» KM 211, для дифференциации бактерий Yersinia pseudotuberculosis генетической группы I.