Способ получения экстракта из плаценты человека Российский патент 2024 года по МПК A61K35/50 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для получения экстракта из плаценты человека после родов на 38-40 неделе гестации, который может быть использован, в частности, для лечения лимфедемы и хронической венозной недостаточности.

Известен способ [RU 2237486, C1, А61К 35/50, 10.10.2004], который заключается в том, что плаценту отмывают, фрагментируют, подвергают замораживанию парами жидкого азота до температуры (-80)-(-120)°С, проводят измельчение в криомельнице при охлаждении парами жидкого азота до температуры (-80)-(-120)°С до размера частиц 20-30 мкм, полученный порошок лиофилизируют при температуре (-10)-(-20)°С до размера частиц 20-30 мкм и при давлении не выше 0,1 мм рт.ст. липофильную фракцию экстрагируют с помощью хладоновых растворителей под давлением 6-8 атм и температуре 30-35°С, а гидрофильную фракцию получают экстрагированием с помощью изотонического водного раствора хлорида натрия при температуре 25-30°С в течение 3-4 часов.

Недостатком этого технического решения является относительно узкая область применения, поскольку он используется для плаценты животного происхождения.

Наиболее близким по технической сущности с предложенному является способ получения экстракта [RU 2246308, C2, А61К 35/50, 20.02.2005], содержащего липопротеидный комплекс, обогащенный водорастворимыми витаминами группы В и жирорастворимыми витаминами A, D, Е, F, К, Q₁₀ и твердый остаток, содержащий гликолипопротеидный комплекс, включающий белковую, полисахаридную, нуклеопротеидную и липидную составляющие, и заключающийся в том, что получен путем обработки гидрофильным органическим растворителем интактной плаценты, при М=5-30, температуре 0-25°С, в течение 3-8 ч.

Недостатком наиболее близкого технического решения является относительно узкая область применения, поскольку в результате его использования формируется вещество (липопротеидный комплекс) со сложно-композиционным составом и наличием твёрдого остатка, которые сложно стандартизовать для клинического применения. Кроме того, твердый остаток усложняет возможность парентерального введения, а высокомолекулярные соединения повышают иммуногенность и пирогенность полученного вещества. В результате, известный способ может быть использован только для получения вещества с относительно низкой терапевтической эффективностью.

Задачей изобретения является создание способа получения экстракта плаценты с более высокой терапевтической эффективностью, который прост, относительно недорог в исполнении в условиях медико-биологической лаборатории и стандартизован.

Требуемый технический результат заключается расширении области применения и получении экстракта плаценты человека, применимого для медицинских целей, обладающего стерильностью, апирогенностью, нетоксичностью и более высокой терапевтической эффективностью, обеспечивающего расширение арсенала технических средств для получения веществ, используемых, в частности, для лечения лимфедемы и хронической венозной недостаточности.

Поставленная задача решается, а требуемый технический результат достигается тем, что в способе, заключающемся в обработке плаценты, согласно изобретению, проводят забор плаценты сразу после родов и помещают в стерильный герметичный контейнер, который помещают на лед в сумку-холодильник и транспортируют в ламинарный шкаф и отделяют пуповину и амнион, нарезают хорион на куски, берут аликвоту ткани плаценты, измельчают, промывают от крови в проточной воде, после чего полученные навески ткани дважды обезжиривают ацетоном, промывают от остатков ацетона в проточной воде, переносят в воду для инъекций, проводят кислотный гидролиз материала в течение 1 ч при 90°С с 0,1 М соляной кислотой, проводят ферментативный гидролиз, для чего добавляют пепсин в объеме 50 мг на 5 г ткани плаценты и проводят инкубацию в течение 12 ч при 37°С, после чего соляную кислоту нейтрализуют 0,1 М гидроксидом натрия и затем полученный образец центрифугируют на оборотах не менее 400 g и полученный супернатант морозят аликвотами по 10 мл.

Предложенный способ получения экстракта из плаценты человека реализуется с выполнением следующих этапов.

А. Забор плаценты сразу после родов.

Б. Помещают плаценту в стерильный герметичный контейнер, который помещаю на лед в сумку-холодильник (температура +2°С - +8°С).

В. Транспортируют, при необходимости, плаценту в течение до трех суток при условии соблюдения герметичности, стерильности и температурного режима.

Г. При транспортировке плаценты прилагают пакет документов - анамнез донора (матери) плаценты, результаты диагностики крови донора (матери) плаценты на вирусы (в соответствии с приказным списком).

Полученную плаценту помещают в стерильный ламинарный шкаф и обрабатывают следующим образом:

- отделяют пуповину;

- отделяют амнион;

- нарезают хорион на небольшие куски;

- куски плаценты либо отправляют в переработку, либо замораживают;

- замороженные образцы хранят при -20°С;

- берут аликвоту ткани плаценты (либо размораживают);

- измельчают блендером;

- тщательно промывают от крови в проточной воде;

- дважды обезжириваются полученные навески ткани ацетоном;

- промываются от ацетона в проточной воде;

- переносятся в воду для инъекций;

- проводят кислотный гидролиз материала в течение 1 ч при 90°С с 0,1 М соляной кислоты;

- проводят ферментативный гидролиз - к образцу добавляют пепсин 50 мг на 5 г ткани плаценты и проводят инкубацию в течение 12 ч при 37°С;

- нейтрализуют соляную кислоту 0,1 м гидроксидом натрия;

- полученный образец центрифугируют на высоких оборотах (не менее 400 g);

- супернатант морозят аликвотами по 10 мл.

Очистка и концентрирование супернатанта.

Очистка и концентрирование супернатанта производилась при помощи центрифужных концентраторов объёма от 2 до 15 мл с мембраной Hydrosart из регенерированной целлюлозы, и предназначенной для установки в роторы, которые подходят для пробирок Falcon 50 мл с коническим дном. Мембрана из регенерированной целлюлозы идеально соответствует нашим условиям, когда требуются особенно высокие коэффициенты извлечения при наиболее низкой степени адсорбции: для обессоливания, концентрирования фракций пептидов и фильтрации от пептидов большей величины, чем 30 kDa.

Для этого:

- после подготовки центрифужного концентратора, согласно инструкции производителя, выполняют концентрирование с помощью центрифуги (объём наносимой на концентратор пробы составляет 10-15 мл);

- образцы центрифугируют при 3000 g;

- после концентрирования образцы из концентратора собирают согласно протоколу производителя;

- аликвоты образца замораживают при -20°C;

- все манипуляции проводятся в стерильных условиях.

Пример реализации способа.

Сразу после родов, плацента упаковывается в стерильный герметичный контейнер, который помещается на лед в сумку-холодильник (температура +2° - +8 °С). Транспортировка плаценты может осуществляться до трех суток при условии соблюдения герметичности, стерильности и температурного режима. К транспортируемой плаценте прилагается пакет документов - анамнез донора (матери) плаценты, результаты диагностики крови донора (матери) плаценты на вирусы (в соответствии с приказным списком). Далее, в стерильном ламинарном шкафу плацента обрабатывается следующим образом: отделяется пуповина, амнион, а хорион нарезается на 2-3 куска, в зависимости от размера плаценты. Ткань хориона, полученная с соблюдением этого протокола, измельчается бытовым блендером и промывается в проточной воде комнатной температуры на сите, 20-30 минут до видимого избавления от крови. После этого, полученная масса заливается ацетоном 1:1 по объёму, и обезжиривается в течение 20 минут при постоянном перемешивании. Затем, этот ацетон сливается, и заливается свежий. Процедура повторяется. После обезжиривания, полученная масса промывается от ацетона в проточной воде комнатной температуры, удаляется избыток воды отжиманием на сите, и взвешивается. Масса разделяется на навески по 5 г. Навеску помещается в 100 мл 0,1М соляной кислоты на 1 ч при 90°С. Затем к образцу добавляется50 мг пепсина и проводится инкубация 12 ч при 37°С. Для нейтрализации соляной кислоты в образце добавляется равный объём 0,1М раствора гидроксида натрия, до pH=7,4. Далее, полученный образец центрифугируется с ускорением 400 g, а надосадочная жидкость переносится по 10мл в центрифужные коцентраторы с мембраной Hydrosart, и центрифугируется с ускорением 3000g. Профильтрованный таким образом образец экстракта плаценты человека готов к применению. Полученный экстракт замораживают и хранят при -20°С.

Предложенный способ получения экстракта из плаценты человека для стимуляции ангио- и лимфогенеза позволяет получить биологически активное вещество простым, относительно недорогим и доступным в исполнении в условиях медико-биологической лаборатории путём, что выгодно отличает его от предложенных ранее способов. Кроме того, полученный таким способом экстракт плаценты человека стандартизован и может вводиться в организм парентерально, что делает его более биодоступным и терапевтически эффективным, чем экстракты, полученные известными способами, поскольку в результате их применения формируется вещество (липопротеидный комплекс) со сложно-композиционным составом и наличием твёрдого остатка, которые сложно стандартизовать для клинического применения, а твердый остаток усложняет возможность парентерального введения, причем высокомолекулярные соединения повышают иммуногенность и пирогенность полученного вещества.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для получения экстракта из плаценты человека после родов на 38-40 неделе гестации, который может быть использован, в частности, для лечения лимфедемы и хронической венозной недостаточности. Требуемый технический результат, заключающийся в повышении терапевтической эффективности получаемого экстракта, достигается тем, что в плаценте отделяют пуповину и амнион, нарезают хорион на куски, берут аликвоту ткани плаценты, измельчают, промывают от крови в проточной воде, полученные навески ткани дважды обезжиривают ацетоном, промываются от остатков ацетона в проточной воде,  переносят в воду для инъекций, проводят кислотный гидролиз материала в течение 1 ч при 90°С с 0,1 М соляной кислотой, проводят ферментативный гидролиз, для чего добавляют пепсин в объеме 50 мг на 5 г ткани плаценты и проводят инкубацию в течение 12 ч при 37°С, после чего соляную кислоту нейтрализуют 0,1 м гидроксидом натрия и затем полученный образец центрифугируют на оборотах не менее 400 g и полученный супернатант морозят аликвотами по 10 мл. 1 пр.

Способ получения экстракта из плаценты человека, заключающийся в обработке плаценты, отличающийся тем, что проводят забор плаценты сразу после родов и помещают в стерильный герметичный контейнер, который помещают на лед в сумку-холодильник и транспортируют в ламинарный шкаф и отделяют пуповину и амнион, нарезают хорион на куски, берут аликвоту ткани плаценты, измельчают, промывают от крови в проточной воде, полученные навески ткани дважды обезжиривают ацетоном, промываются от остатков ацетона в проточной воде, переносят в воду для инъекций, проводят кислотный гидролиз материала в течение 1 ч при 90°С с 0,1 М соляной кислотой, проводят ферментативный гидролиз, для чего добавляют пепсин в объеме 50 мг на 5 г ткани плаценты и проводят инкубацию в течение 12 ч при 37°С, после чего соляную кислоту нейтрализуют 0,1 м гидроксидом натрия и затем полученный образец центрифугируют на оборотах не менее 400 g и после фильтрации полученный супернатант замораживают.