Вакцина против вируса африканской чумы свиней Российский патент 2024 года по МПК A61K39/12 C12N15/82 C07K19/00 

Область изобретения: данное изобретение относится к области вирусов, более конкретно - к области вируса африканской чумы свиней (ВАЧС, англ. «ASFV»). Данное изобретение относится к способам создания вакцины, которая защищает от инфицирования вирусом АЧС, и к применению такой вакцины для профилактики или ослабления инфекции и (или) распространения у свиней вируса африканской чумы свиней.

Уровень техники

Африканская чума свиней (АЧС) представляет собой вирусное заболевание, которому подвержены только домашние и дикие свиньи. После первоначального заражения симптомы могут проявиться через 2-10 суток. В зависимости от патогенности вируса умирают от 30% до 100% зараженных животных. Общие симптомы включают в себя: потерю аппетита, слабость, покраснение кожи, воспаление слизистых оболочек глаз, рвоту, кровавый понос и лихорадку. В дополнение к этому, кожа может посинеть, участки кожи - отмирать (черные пятна) и могут возникать кровотечения. Более того, данное заболевание может вызывать самопроизвольные выкидыши у беременных свиноматок. Также может наступить внезапная смерть без каких-либо предшествующих заметных симптомов. Симптомы АЧС напоминают симптомы классической чумы свиней.

Свиньи могут пережить острую фазу и, по-видимому, выздороветь, только чтобы стать долгосрочными носителями вируса (от нескольких месяцев до всей продолжительности жизни) и, таким образом, снова выделять вирус и заражать других животных.

Данный вирус распространяется напрямую - от животного к животному, и непрямым образом - посредством зараженных материалов, таких как фекалии, свинина и другие продукты из свинины, кусающие мухи и клещи, особенно посредством разновидности мягкого клеща Ornithodoros moubata, в котором данный вирус размножается. Пищевые отходы или субпродукты от инфицированных свиней также могут содержать АЧС, что способствует распространению вируса. Предпринимаются такие попытки, как международные меры и поддержание бдительности на свинофермах, чтобы предотвратить дальнейшее распространение данного заболевания. С 2007 г. произошло несколько вспышек АЧС в Восточной Европе, Китае и России. АЧС недавно была диагностирована у популяции дикого кабана в Бельгии.

АЧС вызывается большим вирусом с двухцепочечной ДНК, относящимся к семейству Asfaruiridae. Его ДНК-геном имеет значительные вариации в длине - от 160 до 210 т.п.о., в зависимости от изолята. Данный геном включает в себя от 150 до 167 открытых рамок считывания, определяющих 54 структурных белка частицы вируса АЧС и более 100 инфекционных белков [Dixon et al., 2013. Virus Res 173: 3 - 14]. К настоящему времени идентифицировано восемь серологических групп, названных серогруппами 1-8, но, по всей вероятности, будет выявлено еще больше серогрупп. Сложность и изменчивость вируса усложнили создание вакцины, защищающей от инфекций АЧС. Было использовано несколько различных подходов, включая и активированные вакцины, субъединичные вакцины, аттенуированные живые вакцины и рекомбинантные живые аттенуированные вакцины [Arias et al., 2017. Vaccines 5, 35; doi: 10.3390/vaccines5040035].

Было обнаружено, что инактивированные вакцины не обеспечивают защиту даже в присутствии адъювантов [Stone et al., 1967. Am J Vet Res 28: 475-481; Blome et al., 2014. Vaccine 32: 3879-3882].

Субъединичные вакцины не обеспечивают защиту или обеспечивают лишь частичную защиту. В некоторой степени это может быть связано с большим количеством кодируемых белков (~160) и сложностью выбора соответствующих белков. Кроме того, последовательность большого количества белков ВАЧС не похожа на известные белки [Dunigan et al., 2006. Virus Research 117: 119-132], что затрудняет прогнозирование функции этих белков.

Живые аттенуированные вакцины получают либо из вирулентных штаммов, либо из естественно низковирулентных штаммов, таких как OURT88/3 [Boinas et al., 2004. J Gen Virol 85: 2177-2187] и NH/68 [Gil et al., 2008. Arch Virol 153: 1845-1854]. Эти живые аттенуированные вакцины часто обеспечивают до 100% защиты от гомологичных штаммов, но только частичную перекрестную защиту от гетерологичных штаммов. В дополнение к этому, они часто вызывают неприемлемые побочные эффекты, такие как пневмония, двигательные нарушения, очаги некроза, выкидыши и даже смерть et al., 2018. Vet J 233: 41-48; Arias et al., 2017. Vaccines 5, 35; doi: 10.3390/vaccines5040035].

Наиболее многообещающие результаты были недавно получены с рекомбинантными живыми аттенуированными вакцинами, в которые были введены делеции генов или комбинации делеций генов для достижения приемлемых уровней безопасности и эффективности. Наблюдалась защита от определенных изолятов, хотя и в сочетании с различными уровнями остаточной вирулентности, что, по всей видимости, зависит от конкретного использованного штамма [Sanchez-Cordon et al., 2018. Vet J 233: 41-48; Arias et al., 2017. Vaccines 5, 35; doi: 10.3390/vaccines5040035]. Долгосрочная генетическая стабильность этих делеционных мутантов неизвестна, как и результаты более крупного испытания в полевых условиях.

Таким образом, существует потребность в вакцине, которая была бы эффективной и безопасной, и обеспечивала бы защиту от инфицирования большим количеством различных штаммов вируса АЧС.

2 Краткое описание сущности изобретения

В данном изобретении, таким образом, представлена рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты, предпочтительно - рекомбинантная молекула ДНК, содержащая экспрессионную кассету, кодирующую полиэпитоп, содержащий Т-клеточные антигены из белков вируса африканской чумы свиней, при этом указанные Т-клеточные антигены разделены спейсерами, предпочтительно - спейсерами из 1-10 аминокислотных остатков, которые содержат сигналы для протеасомного расщепления. Указанный полиэпитоп предпочтительно содержит 2-50 пептидов в качестве Т-клеточных антигенов. Указанный полиэпитоп предпочтительно содержит 2-50 нонапептидов в качестве Т-клеточных антигенов, предпочтительно - нонапептиды 1-13 и 15-20, как показано в Таблице 1, которые разделены спейсерами из около 1-5 аминокислотных остатков, предпочтительно - спейсерными последовательностями 1-11, как показано в Таблице 2.

Рекомбинантная молекула согласно данному изобретению может дополнительно кодировать универсальный Т-клеточный эпитоп. Указанная рекомбинантная молекула согласно данному изобретению может дополнительно содержать нуклеотидную последовательность убиквитина, предпочтительно - на 5'-конце полиэпитопа.

Данное изобретение также относится к вирусной частице, содержащей рекомбинантную молекулу согласно данному изобретению. Указанная вирусная частица может дополнительно содержать маркерный белок.

В данном изобретении также представлен способ стимуляции иммунного ответа у свиньи, включающий в себя введение рекомбинантной молекулы согласно данному изобретению и (или) вирусной частицы согласно данному изобретению. Указанное введение предпочтительно осуществляется в комбинации с вирусной частицей, содержащей В-клеточные антигены вируса африканской чумы свиней, предпочтительно - выбранные из белков р30, р54, р72, EP402R, A104R и (или) B602L из вируса африканской чумы свиней, свинье в количестве, эффективном для индукции иммунного ответа. Указанная рекомбинантная молекула предпочтительно вводится парентерально, предпочтительно - внутримышечно и (или) внутрикожно, предпочтительно - путем иммуноэлектроперации. Указанная рекомбинантная молекула и (или) вирусная частица предпочтительно вводится 2-4 раза, предпочтительно с интервалами около 2 недель. Предпочтительно, чтобы по меньшей мере одно из введений рекомбинантной молекулы нуклеиновой кислоты и (или) вирусной частицы сочеталось с введением синтетических Т-клеточных антигенов из белков вируса африканской чумы свиней. По меньшей мере одно из повторных введений рекомбинантной молекулы и (или) вирусной частицы комбинируется с введением вирусной частицы, содержащей В-клеточные антигены вируса африканской чумы свиней, предпочтительно - выбранные из белков р30, р54, р72, EP402R, A104R и (или) B602L из вируса африканской чумы свиней.

В данном изобретении также представлена композиция, содержащая рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты согласно данному изобретению и (или) вирусную частицу согласно данному изобретению, и ветеринарно приемлемый эксципиент.

В данном изобретении также представлена вакцина, содержащая эффективное иммунизирующее количество композиции, содержащей рекомбинантную молекулу согласно данному изобретению и (или) вирусную частицу согласно данному изобретению, и ветеринарно приемлемый эксципиент.

В данном изобретении также представлен способ профилактики или ослабления инфекции и (или) распространения у свиней вируса африканской чумы свиней, включающий в себя введение рекомбинантной молекулы согласно данному изобретению и (или) вирусной частицы согласно данному изобретению по меньшей мере одной свинье. Указанное введение рекомбинантной молекулы и (или) вирусной частицы предпочтительно комбинируется с введением вирусной частицы, содержащей В-клеточные антигены вируса африканской чумы свиней, предпочтительно - выбранные из белков р30, р54, р72, EP402R, A104R и (или) B602L из вируса африканской чумы свиней.

В данном изобретении также представлена вирусная частица, содержащая В-клеточные антигены вируса африканской чумы свиней, предпочтительно - выбранные из белков р30, р54, р72, EP402R, A104R и (или) B602L из вируса африканской чумы свиней.

В данном изобретении также представлен набор вирусных частиц и набор компонентов, содержащих В-клеточные антигены вируса африканской чумы свиней, предпочтительно выбранные из белков р30, р54, р72, EP402R, A104R и (или) B602L из вируса африканской чумы свиней.

В данном изобретении также представлен набор вирусных частиц, включающий в себя вирусную частицу, содержащую рекомбинантную молекулу по любому из пп. 1-5, и одну или несколько вирусных частиц, содержащих В-клеточные антигены вируса африканской чумы свиней, предпочтительно - выбранные из белков р30, р54, р72, EP402R, A104R и (или) B602L из вируса африканской чумы свиней.

В данном изобретении также представлен набор компонентов, включающий в себя вирусную частицу, содержащую рекомбинантную молекулу согласно данному изобретению и одну или несколько вирусных частиц, содержащих В-клеточные антигены вируса африканской чумы свиней, предпочтительно - выбранные из белков р30, р54, р72, EP402R, A104R и (или) B602L из вируса африканской чумы свиней.

В данном изобретении также представлен набор компонентов, включающий в себя вирусную частицу, содержащую рекомбинантную молекулу согласно данному изобретению и синтетические Т-клеточные антигены из белков вируса африканской чумы свиней.

В данном изобретении также представлена вирусная частица, содержащая В-клеточные антигены вируса африканской чумы свиней, или набор вирусных частиц, содержащих В-клеточные антигены вируса африканской чумы свиней, для применения в способе защиты свиньи от последующего инфицирования вирусом африканской чумы свиней.

3 Краткое описание графических материалов

Фиг. 1. Последовательности

IA. Вставка рекомбинантной молекулы нуклеиновой кислоты с указанием убиквитина и Т-клеточных эпитопов.

IB. Вставка ASFDVAC2. Жирным шрифтом выделены аминокислотная последовательность убиквитина и Т-клеточные антигены 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 19, 20, 11 и 18, как указано в Таблице 1. Курсивом обозначены аминокислотная последовательность PADRE и нуклеотидная последовательность CpG.

IC. Нуклеотидная последовательность MVA-p30+B602L (3106 п.о.). В направлении от 5'-конца указаны сайт SwaI - заглавными буквами, левый фланг ТК, промотор MVA 13.5L - жирным и подчеркнутым шрифтом, последовательность Козака, жирным шрифтом - кодирующая последовательность гена р30 из штамма Е75, подчеркнутым шрифтом - последовательность метки FLAG, стоп-кодон - курсивом, заглавными буквами - терминирующая последовательность из mH5, ранняя/ поздняя промоторыая последовательность mH5 - жирным и подчеркнутым шрифтом, последовательность Козака, кодирующая последовательность для BA71V-B602L (9RL) - жирным шрифтом, последовательность тройной метки FLAG - подчеркнутым шрифтом, стоп-кодон - курсивом, заглавными буквами - терминирующая последовательность из CT1R, правый фланг ТК, и сайт SwaI - заглавными буквами.

ID. Нуклеотидная последовательность MVA-p54+EP402R+K205R (3309 п.о.). В направлении от 5'-конца указаны сайт SwaI - заглавными буквами, левый фланг ТК, промотор MVA 13.5L - жирным и подчеркнутым шрифтом, последовательность Козака, жирным шрифтом - кодирующая последовательность гена р54, подчеркнутым шрифтом - последовательность метки FLAG, стоп-кодон - курсивом, заглавными буквами - терминирующая последовательность из mH5, ранняя/ поздняя промоторная последовательность mH5, кодирующая последовательность для BA71V-B602L (9RL) - жирным шрифтом, последовательность тройной метки FLAG - подчеркнутым шрифтом, стоп-кодон - курсивом, заглавными буквами - терминирующая последовательность из CT1R, промоторная последовательность LEO - жирным и подчеркнутым шрифтом, последовательность Козака, жирным шрифтом - кодирующая последовательность гена BA71V-K205R, подчеркнутым шрифтом - последовательность метки FLAG, стоп-кодон - курсивом, заглавными буквами - терминирующая последовательность из M2L, правый фланг ТК, и сайт SwaI - заглавными буквами.

IE. Нуклеотидная последовательность MVA-p72+A104R (2992 п.о.). В направлении от 5'-конца указаны сайт SwaI - заглавными буквами, левый фланг ТК, промотор MVA 13.5L - жирным и подчеркнутым шрифтом, последовательность Козака, жирным шрифтом - кодирующая последовательность гена р72, подчеркнутым шрифтом - последовательность метки FLAG, стоп-кодон - курсивом, заглавными буквами - терминирующая последовательность из mH5, ранняя/ поздняя промоторная последовательность mH5 - жирным и подчеркнутым шрифтом, последовательность Козака, кодирующая последовательность для BA71V-A140R - жирным шрифтом, подчеркнутым шрифтом - последовательность метки FLAG, стоп-кодон - курсивом, заглавными буквами - терминирующая последовательность из C11R, правый фланг ТК, и сайт SwaI - заглавными буквами.

Фиг. 2. Результаты вакцинации рекомбинантной конструкцией нуклеиновой кислоты

2А. Кривые выживания. 2В. Клинические показатели для каждой группы в указанные сутки после заражения (СПЗ). Белые столбцы обозначают умерших животных. 2С. Результаты анализа ELISPOT мононуклеарных клеток периферической крови, которые были выделены из свиней в указанные СПЗ. Клетки стимулировали средой, вирусом и пептидами (вакциной), как указано.

Фиг. 3. Результаты вакцинации вирусными конструкциями

3А. Кривые выживания. 3В. Средние показатели тяжести заболевания свиней в разных группах. 3С. Клеточно-опосредованный иммунный ответ в трех группах лечения. Мононуклеарные клетки периферической крови выделяли из свиней в указанные сутки после заражения (ось X: СПЗ). Ось Y: продукция гамма-интерферона, определенная с помощью ELISPOT. Клетки стимулировали средой (отрицательный контроль), вирусом (ПВБ) и пептидами, как указано.

4 Подробное описание сущности изобретения

4.1 Определения

При употреблении в данном документе термин «Т-клеточный эпитоп» или «Т-клеточный антиген» относится к эпитопу, который может распознаваться иммунной системой после внутриклеточного процессинга антигена. После процессинга Т-клеточный эпитоп связывается с по меньшей мере одной молекулой ГКГ и экспрессируется на поверхности антигенпрезентирующей клетки в виде комплекса ГКГ - пептид. Т-клеточные эпитопы, презентируемые молекулами ГКГ класса I, обычно имеют длину от 8 до 11 аминокислот, тогда как молекулы ГКГ класса II могут презентировать пептиды длиной около 12-25 аминокислот, предпочтительно - около 13-17 аминокислот. Доступны компьютерные программы, которые могут прогнозировать потенциальные Т-клеточные эпитопы в белках на основе, например, профилей амфипатичности белков, мотивов последовательностей, количественных матриц, искусственных нейронных сетей, машин опорных векторов, количественной взаимосвязи структуры и активности, и моделирований молекулярной стыковки [Desai and Kulkarni-Kale, 2014. Methods Mol Biol 1184: 333-64]. Эти программы включают в себя IEDB Analysis Resource, ELISpot (PepScan, Лелистад, Нидерланды), RANKPEP [Reche et al., 2004. Immunogenetics 56: 405 - 19], nHLAPred [Bhasin and Raghava, 2007. J Biosci 32: 31 42] и NetMHC [Lundegaard et al., 2008. Nucleic Acids Res 36: W509-12].

Предпочтительный Т-клеточный эпитоп или Т-клеточный антиген, как этот термин используется в данной заявке, представляет собой эпитоп ГКГ класса I, также называемый цитотоксическим Т-клеточным эпитопом, содержащий 8-11 аминокислотных остатков, предпочтительно - около 9 аминокислотных остатков.

При употреблении в данном документе термин «полиэпитоп» относится к биомолекуле, предпочтительно - пептиду или белку, которая имеет множество эпитопов, таких как Т-клеточные эпитопы, предпочтительно - эпитопы ГКГ класса I.

Указанные отдельные эпитопы предпочтительно разделены линкерными последовательностями. Указанные линкерные последовательности обеспечивают гибкость и могут участвовать в процессинге полиэпитопа в отдельные эпитопы.

При употреблении в данном документе термин «экспресснойная кассета» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая обеспечивает экспрессию одной или нескольких открытых рамок считывания, присутствующих в указанной кассете. Экспрессионная кассета предпочтительно содержит промоторную последовательность, по меньшей мере одну открытую рамку считывания и З'-нетранслируемую область, которая предпочтительно содержит сигнал полиаденилирования. Экспрессионная кассета может дополнительно содержать энхансерные последовательности, один или несколько посттранскрипционных регуляторных элементов и (или) одну или несколько интронных последовательностей. Для экспрессии в эукариотических клетках указанные посттранскрипционные регуляторные элементы и (или) одна или несколько интронных последовательностей могут усиливать транспорт из ядра клетки продуктов транскрипции, то есть матричной РНК, экспрессионной кассеты, чтобы обеспечить трансляцию РНК в цитоплазме клетки. Указанная экспрессионная кассета предпочтительно оптимизирована для экспрессии у свиней.

При употреблении в данном документе термин «пептид» относится к белковой молекуле, которая содержит 2-50 аминокислотных остатков. Пептид может присутствовать в более крупном белке до процессинга этого белка в отдельные пептиды.

При употреблении в данном документе термин «белок» относится к белковой молекуле, которая содержит более 50 аминокислотных остатков.

При употреблении в данном документе термин «нонапептид» относится к пептиду, который содержит девять аминокислотных остатков.

При употреблении в данном документе термин «спейсер» относится к небольшим пептидам, предпочтительно из 1-10 аминокислотных остатков, более предпочтительно - из 1-5 аминокислотных остатков, которые присутствуют между отдельными эпитопами полиэпитопа и обеспечивают гибкость и процессинг эпитопов протеасомой, и представление отдельных эпитопов посредством ГКГ. Аминокислотные последовательности подходящих спейсеров представлены, например, в US 20130011424 и в Toes et al., 2001. J Exp Med 194: 1-12, которые включены в данный документ посредством ссылки.

При употреблении в данном документе термин «универсальный Т-клеточный эпитоп» относится к пептидной последовательности, которая связывается и представляется многими различными молекулами ГКГ, и поэтому предполагается, что она активирует иммунную систему многих особей. Указанный универсальный Т-клеточный эпитоп предпочтительно представляет собой эпитоп ГКГ класса II, также называемый Т-хелперным клеточным эпитопом.

При употреблении в данном документе термин «нуклеотидная последовательность убиквитина» относится к нуклеотидной молекуле, которая кодирует убиквитин. Убиквитин представляет собой белок из 76 аминокислот, последовательность которого высоко консервативно сохраняется на протяжении всей эволюции от беспозвоночных до млекопитающих. Убиквитин участвует в АТФ-зависимом нелизосомном протеолизе. Указанная нуклеотидная последовательность предпочтительно экспрессирует аминокислотную последовательность N-

При употреблении в данном документе термин «вирусная частица» относится к инфекционной частице вируса или вирусоподобной частице, которая аттенуирована и не способна к автономному распространению. Геном вирусной частицы предпочтительно содержит делеции в генах, которые важны для отделения указанной частицы от инфицированной клетки. Делеция указанных генов обеспечивает пространство для вставки чужеродных генов, кодирующих, например, рекомбинантную молекулу ДНК, которая содержит экспрессионную кассету, кодирующую В-клеточные эпитопы и (или) Т-клеточные эпитопы согласно данному изобретению.

При употреблении в данном документе термин «свинья» относится к животному из семейства парнокопытных животных Suidae. Термин «свинья» включает в себя домашнюю свинью и ее предка - обыкновенного евразийского дикого кабана (Sus scrofa), палаванскую бородатую свинью, борнейскую бородатую свинью, свинью Хьюда или вьетнамскую бородавчатую свинью, висайскую бородавчатую свинью, Целебесскую бородавчатую свинью, флоресскую бородавчатую свинью, миндорскую бородавчатую свинью, филиппинскую бородавчатую свинью, яванскую бородавчатую свинью, бабируссу и бородавочника.

При употреблении в данном документе термин «эффективное количество» относится к значению количества рекомбинантной молекулы согласно данному изобретению и (или) к значению количества одной или нескольких вирусных частиц согласно данному изобретению, которое оказывает влияние на последующее инфицирование свиньи вирусом африканской чумы свиней.

4.2 Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты

В данном изобретении представлена рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты, содержащей экспресснойную кассету, которая кодирует полиэпитоп, содержащий Т-клеточные антигены из белков вируса африканской чумы свиней, при этом указанные Т-клеточные антигены разделены спейсерами, предпочтительно - спейсерами из 1-10 аминокислотных остатков, которые содержат сигналы протеасомного расщепления.

Указанную молекулу нуклеиновой кислоты, предпочтительно - РНК или ДНК, предпочтительно получают с помощью рекомбинантных технологий, включая использование полимераз, рестрикционных ферментов и лигаз, как известно специалисту в данной области. В качестве альтернативы, указанная нуклеиновая кислота получается с помощью синтеза искусственных генов, например, с помощью синтеза частично или полностью перекрывающихся олигонуклеотидов, или сочетанием органической химии и рекомбинантных технологий, как известно специалисту в данной области. Указанная нуклеиновая кислота предпочтительно является кодон-оптимизированной для усиления экспрессии экспрессионной кассеты, кодирующей полиэпитоп, у вакцинированной свиньи. Дальнейшая оптимизация может включать в себя удаление скрытых сайтов сплайсинга, удаление скрытых поли(А)-хвостов и (или) удаление последовательностей, которые приводят к неблагоприятному фолдингу мРНК. Присутствие нитрона, фланкированного сайтами сплайсинга, может стимулировать экспорт из ядра инфицированных клеток.

В одном варианте реализации данного изобретения указанная молекула нуклеиновой кислоты представляет собой РНК, включая немодифицированную РНК, модифицированную РНК и, предпочтительно, самореплицирующуюся РНК. Указанная самореплицирующаяся РНК может быть основана на вирусных системах для амплификации молекулы РНК, например, полученных из альфавирусов, флавивирусов, рабдовирусов, вирусов кори и (или) флавивирусов. Указанная РНК может образовывать комплекс или конденсироваться с молекулами, такими как наночастицы, полиэтиленимин, катионные липиды, включая синтетические катионные липиды, такие как N-[1-(2,3-диолеилокси)пропил]-N,N,N-триметиламмоний хлорид (DOTMA), липофектамин и SAINT®, и (или) хитозаны.

Экспрессионная кассета предпочтительно содержит средства для обеспечения высоких уровней экспрессии, такие как сильные промоторы, например, вирусного происхождения (например, цитомегаловирус человека) или промоторы, полученные из генов, которые экспрессируются на высоком уровне в клетке, такой как клетка свиньи (Running Deer and Allison, 2004. Biotechnol Prog 20: 880-889; Патент США №5888809).

Кроме того, представлена клетка-хозяин, которая содержит рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую экспрессионную кассету в соответствии с данным изобретением. Указанная клетка-хозяин может быть выращена или сохранена для получения в будущем молекулы рекомбинантной нуклеиновой кислоты в соответствии с данным изобретением. Указанная клетка предпочтительно представляет собой бактериальную клетку, например, клетку Escherichia coli.

Нуклеиновая кислота предпочтительно солюбилизируется, например, в буферном растворе, таком как ФСБ, перед введением свинье. Вводимое количество предпочтительно содержит от 1 мкг до 1 мг нуклеиновой кислоты в целом на одно животное.

Указанная рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты, которая содержит экспрессионную кассету, кодирующую полиэпитоп, экспрессирует от 2 до 50 Т-клеточных антигенов, предпочтительно - от 5 до 30 Т-клеточных антигенов, более предпочтительно - около 20 Т-клеточных антигенов, например, 18 Т-клеточных антигенов, 19 Т-клеточных антигенов, 20 Т-клеточных антигенов и 21 Т-клеточный антиген, из белков вируса африканской чумы свиней. Подходящие Т-клеточные антигены предпочтительно предсказывают с помощью доступных компьютерных программ. Предпочтительные Т-клеточные антигены обладают аффинностью связывания с главным комплексом гистосовместимости (ГКГ) класса I. Предпочтительная компьютерная программа, которая включается в анализ подходящих Т-клеточных антигенов, имеет название NetMHC [Andreatta and Nielsen, 2016. Bioinformatics 32: 511-7], и основана на искусственных нейронных сетях, которые допускают вставки и делеции при выравнивании. Данная программа может узнать профиль длины различных молекул ГКГ. Предпочтительно, чтобы аутологичные пептиды не выбирались в качестве подходящих Т-клеточных антигенов, поскольку они могут вызывать аутоиммунное заболевание.

Указанные 2-50 Т-клеточных антигенов представляют собой пептиды из 6-15 аминокислотных остатков, предпочтительно - от 8 до 11 аминокислотных остатков, более предпочтительно - около 9 аминокислотных остатков, которые разделены спейсерами, предпочтительно - спейсерами из 1-10 аминокислотных остатков, которые содержат сигналы для протеасомного расщепления. Предпочтительные Т-клеточные антигены получены из белков вируса африканской чумы свиней MGF_505-7R, NP1450L, G1340L, B385R, G1211R, E423R, NP1450L, MGF_5059R, E301R, C717R, EP424R, F778R, CP530R, R298L, CP2475L, 0174L, MGF_360-2L, NP1450L, M1249L и (или) MGF_360-11.

Предпочтительные Т-клеточные антигены выбраны из пептидов, указанных в Таблице 1.

Предпочтительная рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая экспрессионную кассету согласно данному изобретению, предпочтительно кодирует пептиды 1- 20 из Таблицы 1, более предпочтительно - пептиды 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, более предпочтительно, в направлении от N-конца, в этом порядке, пептиды 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 19, 20, 11, 18.

Указанные спейсеры предпочтительно представляют собой примерно 1-5 аминокислотных остатков, включая 2 аминокислотных остатка, 3 аминокислотных остатка и 4 аминокислотных остатка. Предпочтительные спейсеры включают в себя пептиды, указанные в Таблице 2.

Предпочтительная рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая экспрессионную кассету согласно данному изобретению, предпочтительно кодирует универсальный Т-клеточный эпитоп. Указанный универсальный Т-клеточный эпитоп предпочтительно расположен перед Т-клеточными эпитопами вируса африканской чумы свиней, следовательно, с N-конца по отношению к этим Т-клеточным эпитопам. Примеры таких универсальных Т-клеточных эпитопов представлены в Khatun et al., 2017. Chemistry 23: 4233 - 4254. Предпочтительный универсальный Т-клеточный эпитоп обеспечивается не встречающимся в природе эпитопом пан-DR, называемым PADRE, имеющим аминокислотную последовательность AKXVAAWTLKAAAZC, где X обозначает L-циклогексилаланин, a Z обозначает аминокапроновую кислоту ((Alexander et al., 2000. J Immunol 164: 1625-1633). Для целей экспрессии предпочтительно используется производное, имеющее последовательность AKFVAAWTLKAAAARY.

Предпочтительная рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая экспрессионную кассету согласно данному изобретению, предпочтительно дополнительно содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую убиквитин, предпочтительно - на 5'-конце полиэпитопа. Слияние убиквитина с полиэпитопом, содержащим Т-клеточные антигены, усиливает нацеливание на протеасомы, что приводит к улучшенному процессингу полиэпитопа и усилению Т-клеточных ответов.

Предпочтительная рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, представленную на Фиг. 1В.

4.3 Вирусные частицы

В данном изобретении также представлена вирусная частица, которая содержит рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую экспрессионную кассету, кодирующую полиэпитоп, который содержит Т-клеточные антигены из белков вируса африканской чумы свиней согласно данному изобретению.

В данном изобретении также представлена вирусная частица, содержащая рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, которая экспрессирует В-клеточные антигены вируса африканской чумы свиней. Указанные В-клеточные антигены предпочтительно выбраны из белков р30, р54, р72, EP402R (pEP402R), A104R (pA104R) и (или) B602L (pB602L) из вируса африканской чумы свиней. Специалист в данной области понимает, что термин «белок EP402R» относится к pEP402R; термин «белок A104R» относится к pA104R; и термин «белок B602L» относится к pB602L. Указанные В-клеточные антигены предпочтительно содержат аминокислотную последовательность белков р30, р54, р72, EP402R, A104R и (или) B602L из вируса африканской чумы свиней, предпочтительно содержат по существу полные аминокислотные последовательности белков р30, р54, р72, EP402R, A104R и (или) B602L из вируса африканской чумы свиней. Примеры таких аминокислотных последовательностей предоставлены под номером доступа UniProt Р34204 (P30_ASFB7) для фосфопротеина р30 из штамма Badajoz 1971; под номером доступа UniProt Q65194 для белка оболочки р54 из штамма Badajoz 1971; под номером доступа UniProt Р22776 для основного капсидного белка р70 из штамма Badajoz 1971; под номером доступа UniProt Q89501 для СП2-гомолога EP402R из штамма Badajoz 1971; под номером доступа UniProt Р68742 для вирусного гистоноподобного белка A104R из штамма Badajoz 1971; и под номером доступа UniProt Q65169 для белка B602L из штамма Badajoz 1971.

Указанные В-клеточные антигены предпочтительно экспрессируются с использованием тандемных экспрессионных кассет, например, для экспрессии р30 и B602L; р72 и A104R) и (или) р54 и EP402R, или тройных экспрессионных кассет, например, для экспрессии экспрессионных кассет р54 и EP402R, и K205R). Конструкции ДНК, кодирующие В-клеточные антигены, могут быть получены синтетическим способом, например, получены из GenScript, как известно специалисту в данной области. Области, кодирующие В-клеточные антигены, предпочтительно клонируются с различными промоторами MVA и последовательностями терминации транскрипции для управления экспрессией данных генов. Кроме того, указанные В-клеточные антигены предпочтительно снабжены последовательностью метки, позволяющей обнаруживать экспрессию белка. Подходящие метки включают в себя метку 6xHis, домен c-myc (EQKLISEEDL), гемагглютининовую метку (YPYDVPDYA), мальтозосвязывающий белок, глутатион-D-трансферазу, мальтозосвязывающий белок, пептидную метку FLAG, пептид-акцептор биотина, стрептавидин-связывающий пептид и кальмодулин-связывающий пептид, как представлено в Chatterjee, 2006. Cur Opin Biotech 17, 353 - 358. Метка FLAG представляет собой предпочтительную метку. Указанная метка предпочтительно присутствует на С-конце В-клеточного антигена.

Вирусные частицы, которые могут быть использованы в качестве векторов для переноса указанных рекомбинантных молекул нуклеиновой кислоты, предпочтительно - молекул ДНК, включают в себя частицы на основе аденоассоциированного вируса, лентивируса, например, вектор на основе ретровируса, такой как вектор на основе вируса мышиного лейкоза Молони, вируса некроза селезенки SFFV, вируса миелопролиферативной саркомы, вируса стволовых клеток мыши или гаммаретровируса SFG (Riviere et al., 1995. PNAS 92: 6733 - 6737), аденовируса, вируса простого герпеса, поксвируса, такого как модифицированный вирус осповакцины Анкара (MVA; Mackowiak et al., 1999. Adv Vet Med 41: 571-583; Cottingham et al., 2008. PLoS One 20: el638) или поксвируса канареек, аренавируса, вируса кори, вируса болезни Ньюкасла [Kortekaas et al., 2010. Vaccine 28: 2271-2276) и (или) буньявируса, такого как вирус лихорадки Рифт-Валли (Wichgers Schreur et al., 2014. J Virol 88: 10883 - 10893).

Предпочтительная вирусная частица основана на поксвирусе. Указанная вирусная частица предпочтительно представляет собой частицу на основе модифицированного вируса осповакцины Анкара (MVA), такую как описано в Cottingham et al., 2008. PLoS One 20: e1638). Предпочтительная экспрессионная кассета в MVA содержит последовательность промотора MVA 13.5, как описано, например, в US20150299267. Экспрессионная кассета предпочтительно вставлена в ген ТК вакцинного вектора MVA (аттенуированная натуральная оспа) с помощью рекомбинации с искусственной бактериальной хромосомой (ИБХ, англ. «ВАС») в соответствии с процедурами, известными специалисту в данной области.

Указанная вирусная частица предпочтительно продуцируется в эукариотической клетке. Указанная эукариотическая клетка предпочтительно представляет собой клетку, которую можно легко инфицировать и (или) трансфицировать с использованием стандартных способов, известных специалисту в данной области, такие как, например, клетки дрожжей и клетки фибробластов курицы. Указанная эукариотическая клетка предпочтительно представляет собой клетку насекомого или клетку млекопитающего. Подходящие клетки насекомых включают в себя, например, клетки яичников Spodoptera frugiperda, такие как Sf9 и Sr21, клетки Drosophila Schneider 2 и клетки Aedes albopictus С6/36. Подходящие клетки млекопитающих включают в себя, например, клетки почки новорожденного хомяка, клетки эмбриональной почки человека, такие как НЕК293 и клетки FreeStyle HEK293F™ (ThermoFisher Scientific), клетки Vero, клетки MDCK, клетки СНО, клетки HeLa и клетки PER.C6 (Fallaux, F. J. et al. 1998. Hum Gene Ther 9: 1909 - 1917). Предпочтительные клетки представляют собой клетки эмбриональной почки человека, такие как клетки НЕК293 и клетки FreeStyle HEK293F™.

В одном варианте реализации данного изобретения указанная вирусная частица дополнительно содержит маркерный белок. Указанный маркерный белок позволяет идентифицировать свиней, которые получили вирусную частицу в соответствии с данным изобретением. Указанный маркерный белок позволяет отличить вакцинированную свинью от свиньи, инфицированной вирусом АЧС дикого типа. Указанный маркерный белок предпочтительно представляет собой флуоресцентный белок, бета-глюкуронидазу, бета-галактозидазу, люциферазу гауссии, люциферазу рениллы и (или) секретируемую щелочную фосфатазу. Специалисту в данной области будет понятно, что кодирующая последовательность для указанного маркерного белка присутствует в геноме вирусной частицы согласно данному изобретению, таким образом, что маркерный белок экспрессируется в клетке, которая получила вирусную частицу согласно данному изобретению.

В данном изобретении также представлен набор вирусных частиц, содержащих В-клеточные антигены вируса африканской чумы свиней.

В данном изобретении также представлен набор вирусных частиц, включающий в себя вирусную частицу, содержащую рекомбинантную молекулу по любому из пп. 1-5, и одну или несколько вирусных частиц, содержащих В-клеточные антигены вируса африканской чумы свиней, предпочтительно - выбранные из белков р30, р54, р72, EP402R, A104R и (или) B602L из вируса африканской чумы свиней.

В данном изобретении также представлен набор компонентов, включающий в себя вирусные частицы, содержащие В-клеточные антигены вируса африканской чумы свиней.

Указанные В-клеточные антигены предпочтительно выбраны из белков р30, р54, р72, EP402R, A104R и (или) B602L из вируса африканской чумы свиней. Указанные В-клеточные антигены предпочтительно содержат аминокислотную последовательность белков р30, р54, р72, EP402R, A104R и (или) B602L из вируса африканской чумы свиней, предпочтительно содержат по существу полные аминокислотные последовательности белков р30, р54, р72, EP402R, A104R и (или) B602L из вируса африканской чумы свиней. Примеры таких аминокислотных последовательностей предоставлены под номером доступа UniProt Р34204 (P30_ASFB7) для фосфопротеина р30 из штамма Badajoz 1971; под номером доступа UniProt Q65194 для белка оболочки р54 из штамма Badajoz 1971; под номером доступа UniProt Р22776 для основного капсидного белка р70 из штамма Badajoz 1971; под номером доступа UniProt Q89501 для СП2-гомолога EP402R из штамма Badajoz 1971; под номером доступа UniProt Р68742 для вирусного гистоноподобного белка A104R из штамма Badajoz 1971; и под номером доступа UniProt Q65169 для белка B602L из штамма Badajoz 1971.

В данном изобретении также представлен набор компонентов, включающий в себя вирусную частицу, которая содержит рекомбинантную молекулу, содержащую экспрессионную кассету, которая кодирует полиэпитоп, содержащий Т-клеточные антигены из белков вируса африканской чумы свиней согласно данному изобретению, и одну или несколько вирусных частиц, содержащих В-клеточные антигены вируса африканской чумы свиней, предпочтительно - выбранные из белков р30, р54, р72, EP402R, A104R и (или) B602L из вируса африканской чумы свиней согласно данному изобретению.

В данном изобретении также представлен набор компонентов, включающий в себя вирусную частицу, которая содержит рекомбинантную молекулу, содержащую экспрессионную кассету, которая кодирует полиэпитоп, содержащий Т-клеточные антигены из белков вируса африканской чумы свиней согласно данному изобретению и синтетические Т-клеточные антигены из белков вируса африканской чумы свиней.

4.4 Способы стимуляции иммунного ответа у свиньи

В данном изобретении представлен способ стимуляции иммунного ответа у свиньи, включающий в себя введение рекомбинантной молекулы согласно данному изобретению и (или) вирусной частицы согласно данному изобретению свинье в количестве, эффективном для индукции иммунного ответа.

В данном изобретении представлен способ стимуляции иммунного ответа у свиньи, включающий в себя введение рекомбинантной молекулы по любому из пп. 1-5 и (или) вирусной частицы по п. 6 или п. 7 в комбинации с вирусной частицей, содержащей В-клеточные антигены вируса африканской чумы свиней, предпочтительно - выбранные из белков р30, р54, р72, EP402R, A104R и (или) B602L из вируса африканской чумы свиней, свинье в количестве, эффективном для индукции иммунного ответа.

Рекомбинантная молекула согласно данному изобретению и (или) вирусная частица согласно данному изобретению предпочтительно содержатся в композиции, предпочтительно - в фармацевтической композиции.

Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты и (или) вирусная частица могут быть введены свинье любым способом, известным специалисту в данной области, включая инъекцию, пластыри для местной пассивной диффузии или ионтофореза, электропорацию, термическую микропорацию, назальные распылители, аэрозольную верхне-респираторную и легочную ингаляцию, сонопорацию, химические вещества и механическую абразию, а также кинетическую/ баллистическую доставку [Weniger et al., 2018. Vaccine 36: 427-437].

Предпочтительно, рекомбинантную молекула нуклеиновой кислоты и (или) вирусная частицу вводится/ вводятся парентерально, например, путем инъекции. Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты и (или) вирусная частица согласно данному изобретению предпочтительно формулируются с обычными нетоксичными фармацевтически приемлемыми переносчиками, адъювантами или носителями. Термин «парентерально», при употреблении в контексте данного документа, включает в себя подкожные, внутрикожные или интрадермальные, внутривенные, внутримышечные, интраартикулярные, интрасиновиальные, внутригрудинные, интратекальные, внутриочаговые и внутричерепные инъекции или методики инфузии.

Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты согласно данному изобретению более предпочтительно вводится свиньям путем электропорации, более предпочтительно - путем внутримышечной/ внутрикожной электропорации. Электропорация может быть выполнена с использованием, например, набора электродов, состоящего из набора позолоченных троакарных игл диаметром 0,43 мм с расстоянием 1,5 мм между ними (Inovio Pharmaceuticals, Плимут Митинг, Пенсильвания, США), который прижимается к кожному пузырьку, образованному по методу Манту путем введения 50 мкл плазмидного состава, с воздействием импульсами по 25 В длительностью по 100 мс; портативного генератора импульсов (CUY21 EDIT; Nepa Gene, Итикава, Япония) и пинцетных электродов (6 импульсов по 10 мс с выходным током 300-600 мА); генератора импульсов ВТХ ЕСМ 830 с безыгольным микропатчевым круглым электродом, установленным на ручке (модель MP 35) (Genetronics, Сан-Диего, Калифорния, США), и с воздействием шестью прямоугольными импульсами в 60, 70 или 80 В, соответственно, с длительность импульса в 60 мс, интервалом между импульсами в 200 мс и обращением полярности после трех импульсов.

В другом предпочтительном способе используется внутримышечное введение в правое бедро в два участка на расстоянии примерно трех сантиметров друг от друга в объеме 0,25 мл на одно место инъекции. Сразу после инъекции может быть применена процедура электропорации in vivo с использованием клинипоратора (IGEA) с линейными/ гексагональными игольчатыми электродами в месте инъекции. Расстояние между иглами предпочтительно составляет около 2 см, а электропоратор предпочтительно установлен на 100 В. Электрический ток в 50 В/см используется для поддержания средней силы тока в 0,6 А. Производят воздействие импульсами, применяя от двух до двадцати импульсов, предпочтительно - от пяти до десяти импульсов, предпочтительно - около восьми импульсов, длительностью около 5-50 миллисекунд, предпочтительно - около 20 миллисекунд, с интервалами в 50-500 миллисекунд, предпочтительно - около 200 миллисекунд.

Указанное введение предпочтительно повторяют, предпочтительно 1-3 раза, таким образом, чтобы рекомбинантная молекула и (или) вирусная частица вводилась в общей сложности 2-4 раза. Повторное введение предпочтительно проводить с интервалами около 2 недель.

Защитный иммунный ответ может потребовать как клеточного, так и серологического иммунитета. Следовательно, в предпочтительном способе стимуляции иммунного ответа у свиньи по меньшей мере одно из введений рекомбинантной молекулы и (или) вирусной частицы комбинируется с введением синтетических пептидов, содержащих Т-клеточные антигены из белков вируса африканской чумы свиней, предпочтительно - 2-50 пептидов, более предпочтительно - около 10-30 пептидов, например, около 20 пептидов, например, 18 пептидов, 19 пептидов, 20 пептидов и 21 пептид.

Указанные пептиды, содержащие Т-клеточные антигены, предпочтительно представляют собой пептиды из 6-15 аминокислотных остатков, предпочтительно - из 8-11 аминокислотных остатков, более предпочтительно - из около 9 аминокислотных остатков. Предпочтительные пептиды выбраны из пептидов, представленных в Таблице 1.

Указанные пептиды предпочтительно вводят парентерально, например, путем инъекции, более предпочтительно - путем внутримышечной инъекции.

В предпочтительном способе стимуляции иммунного ответа у свиньи по меньшей мере одно из введений рекомбинантной молекулы и (или) вирусной частицы комбинируется с введением вирусной частицы, содержащей В-клеточные антигены вируса африканской чумы свиней, предпочтительно - выбранные из белков р30, р54, р72, EP402R, A104R и (или) B602L из вируса африканской чумы свиней.

Количество вирусной частицы согласно данному изобретению, которое вводится свинье, обычно находится в диапазоне от 1000 до 1000000000 инфекционных вирусных частиц на одно животное. Количество инфекционных частиц может быть определено с использованием стандартных методик, известных специалисту в данной области, таких как, например, кривая доза - эффект.

В данном изобретении также представлена композиция, предпочтительно - ветеринарно приемлемая композиция, содержащая рекомбинантную молекулу и (или) вирусную частицу согласно данному изобретению, и ветеринарно приемлемый эксципиент.

Указанная композиция предпочтительно представляет собой водную или масляную суспензию. Эта суспензия может быть составлена в соответствии с методиками, известными в данной области, с использованием подходящих диспергирующих или смачивающих агентов (таких как, например, Tween 80) и суспендирующих агентов. Среди приемлемых носителей и растворителей, которые могут быть использованы, следует указать маннит, воду, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. Кроме того, стерильные нелетучие масла традиционно используются в качестве растворителя или суспендирующей среды. Для этой цели можно использовать любое мягкое нелетучее масло, включая синтетические моно- или диглицериды. Жирные кислоты, такие как олеиновая кислота и ее глицеридные производные, являются полезными для приготовления подходящей композиции, так же как и натуральные фармацевтически приемлемые масла, такие как оливковое масло или касторовое масло, особенно в их полиоксиэтилированных формах. Эти масляные растворы или суспензии могут также содержать длинноцепочечный спирт в качестве разбавителя или диспергатора, или аналогичный спирт, как описано в Pharmacopoea Helvetica.

В данном изобретении также представлена вакцина, содержащая эффективное иммунизирующее количество композиции, содержащей рекомбинантную молекулу и (или) вирусную частицу согласно данному изобретению, и ветеринарно приемлемый эксципиент. Указанная вакцина предпочтительно дополнительно содержит вирусную частицу, содержащую В-клеточные антигены вируса африканской чумы свиней, предпочтительно - выбранные из белков р30, р54, р72, EP402R, A104R и (или) B602L из вируса африканской чумы свиней.

Композиция, содержащая вирусную частицу согласно данному изобретению, предпочтительно дополнительно содержит адъюванты, включая цитокины, такие как интерферон-гамма, иммуностимулирующие последовательности нуклеиновых кислот, такие как олигонуклеотиды CpG, липосомы, вирусоподобные частицы, поверхностно-активные вещества, такие как гексадециламин, полианионы, такие как пиран и сульфат декстрана.

Предпочтительный адъювант представляет собой ISCOM, как описано в международной заявке на патент WO2002026255A1. Технология ISCOM имеет ряд преимуществ перед другими адъювантами. ISCOM стимулируют как гуморальный, так и клеточно-опосредованный иммунный ответ.ISCOM представляет собой высокоэффективный адъювант, позволяющий дополнительно снизить количества и и активированного компонента или его части в соответствии с данным изобретением. Предпочтительный ISCOM представляет собой ISCOM Matrix-M.

Другой предпочтительный адъювант представляет собой BLP. BLP представляют собой самоадъювантные носители для доставки вакцины, полученные из инактивированных бактерий Lactococcus lactis. L. lactis - это безопасная бактерия, обычно используемая в пищевой промышленности, например, для производства сыра и пробиотических напитков. BLP производятся простой обработкой горячей кислотой, в результате чего получается прочный матрикс клеточной формы, который преимущественно состоит из пептидогликановой поверхности. Указанный пептидогликан предпочтительно содержит С-концевой пептидогликан-связывающий домен LysM гидролазы АстА из клеточной стенки Lactococcus lactis, как описано в WO 2010/033031. Данная поверхность вызывает длительный иммунитет, необходимый для защиты от болезнетворных патогенов. Неживая природа частиц BLP обеспечивает их точную дозировку без риска распространения.

BLP также обеспечивают безопасную и универсальную основу, которая может быть эффективно загружена конкретными выбранными антигенами, например, одной или несколькими вирусными частицами согласно данному изобретению, содержащими Т-клеточные антигены и (или) В-клеточные антигены вируса африканской чумы свиней. Полная загрузка BLP антигенами достигается с помощью технологии нековалентного связывания, как описано в WO 2010/033031. Данная технология позволяет просто смешивать слитый антиген с BLP, что приводит к надежному и немедленному связыванию антигена с поверхностью этих частиц. Полученные в результате BLP, покрытые антигеном, предпочтительно доставляют свинье через слои слизистой оболочки носа (спрей) или рта (капсула) без необходимости инъекции.

В данном изобретении также представлен способ профилактики или ослабления инфекции и (или) распространения у свиней вируса африканской чумы свиней, включающий в себя введение рекомбинантной молекулы, содержащей экспрессионную кассету, кодирующую полиэпитоп, который содержит Т-клеточные антигены из белков вируса африканской чумы свиней, и (или) вирусной частицы, содержащей указанную рекомбинантную молекулу, по меньшей мере, одной свинье. Указанное введение рекомбинантной молекулы и (или) вирусной частицы предпочтительно комбинируется с введением вирусной частицы, содержащей В-клеточные антигены вируса африканской чумы свиней, предпочтительно - выбранные из белков р30, р54, р72, EP402R, A104R и (или) B602L из вируса африканской чумы свиней.

Указанный способ обеспечивает защиту от последующего инфицирования вирулентным вирусом дикого типа африканской чумы свиней. Защита определяется как выживание и отсутствие клинических проявлений заболевания, а также сокращение дальнейшего распространения вируса дикого типа любым путем, включая горизонтальное и вертикальное распространение. Время до наступления защиты и длительная защита являются частью эффективности вакцины. Кроме того, широкая защита от различных видов или серотипов вируса также является частью эффективности вакцины в соответствии с данным изобретением.

В данном изобретении также представлена вирусная частица, содержащая Т-клеточные антигены, предпочтительно содержащая экспрессионную кассету, которая кодирует полиэпитоп, содержащий Т-клеточные антигены из белков вируса африканской чумы свиней, или В-клеточные антигены вируса африканской чумы свиней, или набор вирусных частиц, содержащих Т-клеточные антигены и В-клеточные антигены вируса африканской чумы свиней, для применения в способе защиты свиньи от последующего инфицирования вирусом африканской чумы свиней.

В данном изобретении также представлен набор компонентов, включающий в себя вирусные частицы, содержащие Т-клеточные антигены, предпочтительно содержащие экспрессионную кассету, которая кодирует полиэпитоп, содержащий Т-клеточные антигены из белков вируса африканской чумы свиней, и В-клеточные антигены вируса африканской чумы свиней, для применения в способе защиты свиньи от последующего заражения вирусом африканской чумы свиней.

В целях ясности и для краткого описания отличительные признаки данного изобретения описаны в данном документе как часть тех же или отдельных вариантов его реализации, однако следует понимать, что объем данного изобретения может включать в себя варианты реализации, имеющие комбинации всех или некоторых описанных признаков.

5 Примеры

Пример 1: ДНК-вакцинация на основе экспрессии Т-клеточных эпитопов ВАЧС

Способ:

На основе полных последовательностей геномов известных изолятов АЧС и последовательности генома свиньи использовалась программа прогнозирования эпитопов NetMHCpan для получения списка Т-клеточных эпитопов, которые не зависят от штамма вируса или породы свиньи (см. Таблицу 1). Девятнадцать Т-клеточных эпитопов наивысшего уровня использовались для создания полиэпитопной синтетической ДНК-вакцины. Последовательность ДНК кодировала 19 нонапептидных эпитопов, разделенных спейсерами длиной от 3 до 5 аминокислот, которые содержат сигналы для протеасомного расщепления и дальнейшего процессинга (см. Фиг. 1А). Эпитоп 14 не использовался, поскольку он, вероятно, помешал бы правильному процессингу. Также для этой цели была включена последовательность универсального Т-клеточного эпитопа под названием PADRE (см. Фиг. 1 В). Для усиления протеасомной деградации была добавлена нуклеотидная последовательность убиквитина на 5'-конце синтетического гена. Это приводит к более эффективной деградации протеасомой и улучшенному представлению эпитопов Т-клеткам-хозяевам. Наконец, была добавлена адъювантная последовательность CpG к 3''-НТО синтетического гена. Кодон-оптимизированная версия синтетического гена была химически синтезирована GenScript Corporation и клонирована за промотором CMVb плазмиде pCVI (производное pCI-neo [Promega], полученное путем удаления фрагмента рестрикции ClaIl) с использованием сайтов рестрикции NheI и NotI. Полученная плазмида была названа pCVI-ASFDVAC2.

Для испытания контрольной вакцины использовали три группы свиней по 6 особей в каждой. Животных из группы 1 трижды вакцинировали pCVI-ASFDVAC2. Животных из группы 2 также вакцинировали трижды, но одновременно с 3-ей ДНК-вакцинацией они также получали бустер смесью синтетических нонапептидов, соответствующих Т-клеточным эпитопам синтетического гена. Животных из контрольной группы (группа 3) трижды вакцинировали пустой плазмидой pCVI. Свиней вакцинировали с интервалами в 2 недели. Вакцину вводили внутримышечно/ внутрикожно с помощью иммуноэлектроперации с использованием клинипораторного устройства (IGEA Clinical Biophysics, Карпи, Италия). Электрические импульсы, генерируемые устройством электропорации, улучшают поглощение ДНК окружающей тканью. Пептиды применялись путем внутримышечной вакцинации. Через две недели после последней вакцинации свиней заражали штаммом ВАЧС Netherlands '86 (Wageningen Bioveterinary Research, Нидерланды; см. Terpstra and Wensvoort, 1986. Tijdschrift voor diergeneeskunde 111: 389-392). Данный штамм выращивали в альвеолярных макрофагах свиньи. За инфицированными свиньями наблюдали более 2 недель на предмет выявления клинических симптомов. Уровни вируса в крови определяли с помощью ПЦР. Гуморальные иммунные ответы исследовали с помощью твердофазного ИФА с использованием целого вируса в качестве антигена. Уровни клеток, секретирующих ИФН-γ, определяли с помощью ELISPOT после стимуляции in vitro вирусом или смесью из двадцати нонапептидов. Результаты:

Контрольное заражение невакцинированной контрольной группы (группа 3) привела к 40% выживаемости. Вакцинация привела к выживаемости около 83% в группах 1 и 2 (см. Фиг. 2А). Свиньи в группе 2 имели значительно более низкие общие клинические показатели, чем свиньи в других группах (Фиг. 2В). Свиньи в этой группе также имели значительный ответ клеток, секретирующих ИФН-γ, против смеси из нонапептидов с 42-х суток после первой вакцинации (п.в.) (0-е сутки после контрольного заражения [п.з.]) до конца данного эксперимента (см. Фиг. 2С). Свиньи в группе 2 имели значительный ответ клеток, секретирующих ИФН-γ, против смеси из нонапептидов с 49-х суток п. в. (7-е сутки п. з.). В контрольной группе не наблюдалось ответа клеток, секретирующих ИФН-γ, на смесь из нонапептидов. Все группы продемонстрировали значительный ответ клеток, секретирующих ИФН-γ, против вируса на 56-е сутки п. в. (14-е сутки п.з.). Значительных различий в уровнях вирусной ДНК в крови между группами выявлено не было. Значительных различий в процентных показателях блокирования антител к АЧС в твердофазном ИФА не наблюдалось.

Пример 2: Вакцинация с использованием векторов MVA, экспрессирующих Т- и В-клеточные эпитопы ВАЧС

Способ:

Основываясь на многообещающих результатах испытания вакцины на основе полиэпитопной ДНК, синтетический ген ASFDVAC2 был снабжен промоторной последовательностью MVA 13.5 и вставлен в ген ТК вакцинного вектора MVA (аттенуированная натуральная оспа) посредством ИБХ-рекомбинирования в соответствии с опубликованными процедурами (Cottingham, 2012. Methods Mol Biol 890: 37-57). Полученный вирус был назван MVA-VAC2. Вставка MVA-VAC2 включает в себя, в направлении от 5'-конца, левый фланг ТК, промотор MVA 13.5L, последовательность Козака, синтетический ген ASFDVAC2, терминирующие последовательности из mH5 и правый фланг ТК.

Кроме того, ИБХ-рекомбинирование использовалось для вставки генов, кодирующих шесть хорошо известных основных В-клеточных антигенов вируса АЧС (р30, р54, р72, EP402R, A104R и B602L), в вектор MVA с использованием тандемной (р30+B602L; р72+A104R) или тройной кассеты экспрессии (р54+EP402R+K205R) гена (MVA-p30/B602L, MVA-p72/A104R и MVA-p54/EP402R/K205R, соответственно). С этой целью были созданы синтетические конструкции ДНК (GenScript), и области, кодирующие белки, были снабжены различными промоторами MVA и последовательностями терминации транскрипции для управления экспрессией этих генов. Кроме того, чтобы способствовать обнаружению экспрессии белка, каждая из областей, кодирующих белок, была снабжена С-концевой последовательностью метки FLAG.

Для эксперимента с контрольной вакцинацией использовали три группы свиней по 10 особей в каждой. Животных из группы 1 вакцинировали дважды внутримышечно с использованием 10⁸ TCID50 MVA-VAC2. Животных из группы 2 дважды вакцинировали комбинацией всех 4-х MVA-рекомбинантов, экспрессирующих Т-клеточные эпитопы и В-клеточные эпитопы (10⁸ TCID50 каждого). Невакцинированные животные из группы 3 служили контролем. Через две недели после второй вакцинации животных заражали штаммом ВАЧС Netherlands '86.

Результаты:

Контрольное заражение невакцинированных животных (группа 3) привело к 0% выживаемости (см. Фиг. 3А). Примечательно, что 9 из 10 свиней, вакцинированных комбинацией всех 4-х MVA-рекомбинантов (группа 2), выжили и демонстрировали лишь низкую тяжесть заболевания на протяжении всего нескольких суток. В группе 1 из животных, вакцинированных только MVA-VAC2, выжили 4 свиньи. Животные из этой группы демонстрировали более высокую тяжесть заболевания и на протяжении более длительного периода времени по сравнению с животными из группы 2 (см. Фиг. 3В). Эти результаты хорошо соответствуют клеточно-опосредованному иммунитету (КОИ), измеренному на основании ответа клеток, секретирующих ИФН-γ, против смеси из Т-клеточных нонапептидных эпитопов или целого антигена ВАЧС (Фиг. 3С).

Вывод

В данном исследовании были получены многообещающие результаты для разработки вакцины против ВАЧС с использованием комбинированной вакцины, состоящей из векторных вирусов MVA, которые экспрессируют Т-клеточные, а также В-клеточные, эпитопы ВАЧС. Комбинированная вакцина обеспечивала защиту от смертности и клинического проявления заболевания после заражения.

Изобретение относится к биотехнологии. Описана вакцина, подходящая для выявления иммунологического ответа в отношении вируса африканской чумы свиней (ASFV). Вакцина содержит эффективное иммунизирующее количество рекомбинантной молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей экспрессионную кассету, кодирующую полиэпитоп, содержащий Т-клеточные антигены из белков вируса африканской чумы свиней, при этом указанные Т-клеточные антигены разделены спейсерами, которые содержат сигналы для протеасомного расщепления, и/или вирусную частицу, содержащую указанную рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, причем указанная вакцина дополнительно содержит вирусную частицу, содержащую В-клеточные антигены вируса африканской чумы свиней и ветеринарно приемлемое вспомогательное вещество. Раскрыт способ стимуляции иммунного ответа у свиньи, включающий введение свинье вакцины, в количестве, эффективном для индукции иммунного ответа. Описан способ предотвращения или ослабления проявлений инфекции и/или распространения у свиней вируса африканской чумы свиней, включающий введение вакцины. Представлен набор вирусных частиц, содержащий вирусную частицу, содержащую рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую экспрессионную кассету, кодирующую полиэпитоп, содержащий Т-клеточные антигены из белков вируса африканской чумы свиней, при этом указанные Т-клеточные антигены разделены спейсерами, которые содержат сигналы для протеасомного расщепления; и одну или более вирусных частиц, содержащих В-клеточные антигены вируса африканской чумы свиней, для применения в способе защиты свиней от инфекции, вызванной вирусом африканской чумы свиней. Описан набор компонентов, содержащий указанную вакцину для применения в способе защиты свиней от инфекции, вызванной вирусом африканской чумы свиней. Изобретение расширяет арсенал средств для защиты свиней от инфекции, вызванной вирусом африканской чумы свиней. 5 н. и 15 з.п. ф-лы, 3 ил., 2 пр., 2 табл.

1. Вакцина, подходящая для выявления иммунологического ответа в отношении вируса африканской чумы свиней (ASFV), содержащая эффективное иммунизирующее количество рекомбинантной молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей экспрессионную кассету, кодирующую полиэпитоп, содержащий Т-клеточные антигены из белков вируса африканской чумы свиней, при этом указанные Т-клеточные антигены разделены спейсерами, которые содержат сигналы для протеасомного расщепления, и/или вирусную частицу, содержащую указанную рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, причем указанная вакцина дополнительно содержит вирусную частицу, содержащую В-клеточные антигены вируса африканской чумы свиней, и ветеринарно приемлемое вспомогательное вещество.

2. Вакцина по п. 1, отличающаяся тем, что указанная рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты представляет собой рекомбинантную молекулу ДНК.

3. Вакцина по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что спейсеры состоят из 1-10 аминокислотных остатков.

4. Вакцина по любому из пп. 1-3, отличающаяся тем, что указанный кодируемый полиэпитоп содержит 2-50 пептидов в качестве Т-клеточных антигенов.

5. Вакцина по любому из пп. 1-4, отличающаяся тем, что указанный кодируемый полиэпитоп содержит 2-50 нонапептидов в качестве Т-клеточных антигенов, предпочтительно нонапептидов 1-13 и 15-20 из Таблицы 1, которые разделены спейсерами из около 1-5 аминокислотных остатков.

6. Вакцина по п. 5, отличающаяся тем, что спейсерные последовательности выбраны из ARY, AQW, NQF, ADRRY, ADRRF, ADNQF, ADAQW, ADRIW, RRW, ADARY и ADARW из Таблицы 2.

7. Вакцина по любому из пп. 1-6, отличающаяся тем, что рекомбинантная молекула дополнительно кодирует универсальный Т-клеточный эпитоп.

8. Вакцина по любому из пп. 1-7, отличающаяся тем, что рекомбинантная молекула дополнительно содержит нуклеотидную последовательность убиквитина.

9. Вакцина по п. 8, отличающаяся тем, что нуклеотидная последовательность убиквитина расположена на 5'-конце полиэпитопа.

10. Вакцина по п. 8 или 9, отличающаяся тем, что нуклеотидная последовательность убиквитина содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1.

11. Вакцина по любому из пп. 1-10, отличающаяся тем, что указанные B-клеточные антигены выбраны из белков p30, p54, p72, EP402R, A104R и/или B602L вируса африканской чумы свиней.

12. Вакцина по любому из пп. 1-11, отличающаяся тем, что указанная вирусная частица, содержащая рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, дополнительно содержит маркерный белок.

13. Способ стимуляции иммунного ответа у свиньи, включающий введение свинье вакцины по любому из пп. 1-12, в количестве, эффективном для индукции иммунного ответа.

14. Способ по п. 13, отличающийся тем, что указанную вакцину вводят парентерально.

15. Способ по п. 13 или 14, отличающийся тем, что указанную вакцину вводят 2-4 раза.

16. Способ по любому из пп. 13-15, отличающийся тем, что вакцину вводят 2-4 раза с интервалом 2 недели.

17. Способ по любому из пп. 13-16, отличающийся тем, что по меньшей мере один раз указанную рекомбинантную молекулу и/или указанную вирусную частицу, содержащую указанную рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, вводят в сочетании с синтетическими Т-клеточными антигенами из белков вируса африканской чумы свиней.

18. Способ предотвращения или ослабления проявлений инфекции и/или распространения у свиней вируса африканской чумы свиней, включающий введение вакцины по любому из пп. 1-12.

19. Набор вирусных частиц, содержащий вирусную частицу, содержащую рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую экспрессионную кассету, кодирующую полиэпитоп, содержащий Т-клеточные антигены из белков вируса африканской чумы свиней, при этом указанные Т-клеточные антигены разделены спейсерами, которые содержат сигналы для протеасомного расщепления; и одну или более вирусных частиц, содержащих В-клеточные антигены вируса африканской чумы свиней, для применения в способе защиты свиней от инфекции, вызванной вирусом африканской чумы свиней.

20. Набор компонентов, содержащий вакцину по любому из пп. 1-12, для применения в способе защиты свиней от инфекции, вызванной вирусом африканской чумы свиней.