ВАКЦИНА ПРОТИВ АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ Российский патент 2024 года по МПК A61K39/12 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к вакцине для лечения и/или профилактики африканской чумы свиней.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Африканская чума свиней (АЧС) является разрушительным геморрагическим заболеванием среди домашних свиней, вызываемым двухцепочечным ДНК-вирусом, вирусом африканской чумы свиней (ВАЧС, ASFV). ВАЧС является единственным представителем семейства Asfarviridae, который реплицируется преимущественно в цитоплазме клеток. Вирулентные штаммы ВАЧС могут убить домашних свиней примерно через 5-14 дней после заражения, при этом смертность приближается к 100%.

В настоящее время не существует лечения ВАЧС. В странах за пределами Африки предпринимались попытки профилактики на национальном уровне путем введения ограничений на ввоз свиней и продуктов из свинины, обязательного кипячения лицензированных отходов животноводства перед кормлением свиней и применения политики убоя при диагностировании болезни. Предотвращение распространения от диких животных в Африке основано на мерах, направленных на то, чтобы бородавочники и материалы, зараженные бородавочниками, не попадали в стадо. Распространение среди популяций домашних свиней определяется эффективными мерами по биобезопасности и проведении карантина и убоя свиней на пораженных фермах.

На сегодняшний день не разработано эффективных аттенуированных или инактивированных вирусных вакцин (см. http://www.thepigsite.com/pighealth/article/441/african-swine-fever-asf).

Использование низковирулентного штамма ВАЧС OURT88/3, полученного от мягкого клеща, позволяет обеспечить экспериментальную защиту от летального заражения. OURT88/3 является непатогенным изолятом ВАЧС из Португалии. Было показано, что заранее проведенное инфицирование вирусом АЧС OURT88/3 обеспечивает защиту от заражения родственными вирулентными вирусами (Boinas et al. (2004) J Gen Virol 85:2177-2187; Oura et al. (2005) J. Gen. Virol. 86:2445-2450). Кроме того, некоторые вирусы с удаленным геном также являются эффективными в обеспечении защиты от заражения (например, BeninΔMGF и BeninΔDP148R).

Хотя было показано, что эти вирусы индуцируют защитный иммунный ответ у некоторых животных, этот эффект не является универсальным. Иммунизация, по-видимому, является неэффективной для защиты некоторых свиней от последующего заражения. Она также может быть связана с индукцией неблагоприятных клинических реакций у некоторых свиней, таких как лихорадка или отек суставов.

Также была исследована способность композиций на основе субъединиц, содержащих полипептиды ВАЧС, индуцировать защиту от ВАЧС. Однако эти исследования показали, что способность полипептида ВАЧС индуцировать иммуногенный ответ не обязательно позволяет предсказать его способность индуцировать защиту от заражения ВАЧС (см. Neilan et al.; Virology; 319(2); 337-342; 2004). Кроме того, полипептиды ВАЧС могут индуцировать защиту только при использовании в определенных комбинациях. Например, Neilan et al. (см. выше) сообщили, что комбинация p30, p54, p72 и p22 является недостаточной для индуцирования защиты. Напротив, согласно Argilaguet et al. (Antiviral Res; 98(1); 61-65; 2013), комбинация p30, p54 и EP402R обеспечивала частичную защиту от ВАЧС в экспериментах по вакцинации ДНК.

Таким образом, существует потребность в альтернативных мерах по борьбе с инфекцией, вызываемой ВАЧС, и предотвращению распространения болезни.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы настоящего изобретения определили минимальную комбинацию из трех полипептидов ВАЧС, которая способна индуцировать воспроизводимую защиту от ВАЧС при ее введении до заражения ВАЧС. Авторы изобретения определили, что при отсутствии любого из трех полипептидов ВАЧС защита не индуцируется. Кроме того, авторы изобретения продемонстрировали, что эта минимальная комбинация из трех полипептидов ВАЧС может быть объединена с дополнительными полипептидами ВАЧС для получения улучшенных вакцинных композиций, способных обеспечить надежную защиту от заражения ВАЧС и лечение и/или профилактику от заражения ВАЧС.

Таким образом, в первом аспекте настоящее изобретение относится к вакцине на основе субъединиц вируса АЧС, содержащей: (i) один или более рекомбинантных полинуклеотидов, кодирующих полипептиды, приведенные в SEQ ID NO: 1, 2 и 3, или их иммуногенные фрагменты; или вариант, на по меньшей мере 70% идентичный одной из последовательностей SEQ ID NO: 1, 2 или 3, или его иммуногенный фрагмент; при этом общее количество разных полипептидов вируса АЧС (ВАЧС), кодируемых одним или более рекомбинантными полинуклеотидами, составляет 10 или менее; или (ii) рекомбинантные полипептиды, приведенные в SEQ ID NO: 1, 2 и 3, или их иммуногенные фрагменты; или вариант, на по меньшей мере 70% идентичный одной из последовательностей SEQ ID NO: 1, 2 и 3, или его иммуногенный фрагмент; при этом вакцина содержит 10 или менее разных полипептидов ВАЧС.

В контексте настоящего описания термин вакцина на основе субъединиц означает вакцину, которая содержит отдельные полипептиды или полинуклеотиды, кодирующие указанные полипептиды; в отличие от вакцин, которые содержат целые вирусные частицы (такие как живой, аттенуированный вирус и мертвый вирус).

Количество разных полипептидов ВАЧС, кодируемых одним или более рекомбинантными полинуклеотидами, может составлять 9 или менее, 8 или менее, 7 или менее или 6 или менее полипептидов ВАЧС; или вакцина может содержать 9 или менее, 8 или менее, 7 или менее, или 6 или менее полипептидов.

Вакцина может содержать: (i) один или более дополнительных полинуклеотидов, кодирующих полипептид ВАЧС, выбранный из SEQ ID NO: 4-8, или их иммуногенные фрагменты, или вариант, на по меньшей мере 70% идентичный одной из последовательностей SEQ ID NO: 4-8, или его иммуногенный фрагмент; или (ii) один или более дополнительных полипептидов, выбранных из SEQ ID NO: 4-8, или их иммуногенные фрагменты; или вариант, на по меньшей мере 70% идентичный одной из последовательностей SEQ ID NO: 4-8, или его иммуногенный фрагмент.

Вакцина может содержать: а) рекомбинантные полинуклеотиды, которые кодируют полипептиды, содержащие SEQ ID NO: 1-8, или их иммуногенные фрагменты, или вариант, на по меньшей мере 70% идентичный последовательности SEQ ID NO: 1-8, или его иммуногенный фрагмент; или рекомбинантные полипептиды, содержащие SEQ ID NO: 1-8, или их иммуногенные фрагменты, или варианты, на по меньшей мере 70% идентичные последовательностям SEQ ID NO: 1-8, или их иммуногенные фрагменты; (b) рекомбинантные полинуклеотиды, кодирующие полипептиды, содержащие SEQ ID NO: 1-3 и 6-8, или их иммуногенные фрагменты, или варианты, на по меньшей мере 70% идентичные последовательностям SEQ ID NO: 1-3 и 6-8, или их иммуногенные фрагменты; или рекомбинантные полипептиды, содержащие SEQ ID NO: 1-3 и 6-8, или их иммуногенные фрагменты, или варианты, на по меньшей мере 70% идентичные последовательностям SEQ ID NO: 1-3 и 6-8, или их иммуногенные фрагменты; или (c) рекомбинантные полинуклеотиды, кодирующие полипептиды, содержащие SEQ ID NO: 1-5, или их иммуногенные фрагменты, или варианты, на по меньшей мере 70% идентичные последовательностям SEQ ID NO: 1-5, или их иммуногенные фрагменты; или рекомбинантные полипептиды, содержащие SEQ ID NO: 1-5, или их иммуногенные фрагменты, или варианты, на по меньшей мере 70% идентичные последовательностям SEQ ID NO: 1-5, или их иммуногенные фрагменты.

Рекомбинантные полинуклеотиды могут содержать SEQ ID NO: 9, 10 и 11 или их варианты, идентичные на по меньшей мере 70%.

Дополнительные полинуклеотиды могут содержать одну или более последовательностей SEQ ID NO: 12-16 или их варианты, идентичные на по меньшей мере 70%.

Полинуклеотид может присутствовать в векторе. Вектор может быть выбран из аденовируса, вектора модифицированного вируса осповакцины Анкра (Ankara) и вектора вируса псевдобешенства.

Каждый из рекомбинантных полинуклеотидов может быть представлен в одном и том же векторе.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к вакцине согласно первому аспекту изобретения для применения в лечении и/или профилактике африканской чумы свиней у субъекта.

Настоящее изобретение также относится к способу лечения и/или профилактики африканской чумы свиней у субъекта, который включает введение субъекту терапевтически эффективного количества вакцины по изобретению.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению рекомбинантного полинуклеотида, вектора или рекомбинантного полипептида, как определено в первом аспекте изобретения, в получении лекарственного средства для лечения и/или профилактики африканской чумы свиней у субъекта.

Субъектом может быть свинья. Соответственно, субъектом может быть домашняя свинья.

Вакцину можно вводить в соответствии с процедурой первичной бустерной вакцинации. Например, примирующая композиция может содержать один или более аденовирусных векторов, и бустерная композиция может содержать один или более векторов модифицированного вируса осповакцины Анкара.

Вакцину можно вводить перорально, внутривенно, внутримышечно, подкожно, интраназально или внутрикожно.

ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг. 1 - схема протокола прайм/буст вакцинации комбинацией аденовирус-MVA.

Фиг. 2 - репрезентативные аминокислотные последовательности полипептидов ВАЧС для использования в настоящем изобретении (SEQ ID NO: 1-8 и 17).

Фиг. 3 - репрезентативные последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие полипептиды ВАЧС, для использования в настоящем изобретении (SEQ ID NO: 9-16).

Фиг. 4 - таблица 1.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ВИРУС АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ (ВАЧС)

Авторы настоящего изобретения определили минимальную комбинацию трех полипептидов ВАЧС, которая способна индуцировать воспроизводимую защиту от ВАЧС.

Вирус африканской чумы свиней (ВАЧС) является возбудителем африканской чумы свиней (АЧС). Вирус вызывает геморрагическую лихорадку с высокой смертностью у свиней, но заражение естественных хозяев, бородавочников, кустарниковых свиней, приводит к развитию персистентной инфекции без проявления признаков болезни. Этот вирус также заражает мягких клещей рода Ornithodoros, которые, как полагают, используются в качестве переносчиков.

ВАЧС реплицируется в цитоплазме инфицированных клеток и является единственным представителем семейства Asfarviridae, обладающим такой способностью. ВАЧС является эндемичным для стран Африки к югу от Сахары и существует в дикой природе благодаря циклу заражения между клещами и дикими свиньями, кустарниковыми свиньями и бородавочниками. ВАЧС был впервые описан после того, как европейские поселенцы завезли свиней в районы, эндемичные по ВАЧС, и, как таковой, является примером «острой инфекции».

ВАЧС является крупным икосаэдрическим вирусом с двухцепочечной ДНК с линейным геномом, содержащим не менее 150 генов. Количество генов незначительно различается между разными изолятами вируса. ВАЧС имеет сходство с другими крупными ДНК-вирусами, например, поксвирусом, иридовирусом и мимивирусом. Как и при других вирусных геморрагических лихорадках, основными клетками-мишенями для репликации являются клетки моноцитарного и макрофагального происхождения.

На основании изменчивости последовательности в С-концевой области гена B646L, кодирующего главный капсидный белок р72, было идентифицировано 24 генотипа ВАЧС (I-XXIX). Все генотипы р72 ВАЧС циркулируют в восточной и южной частях Африки. Генотип I циркулирует на Сардинии и в Западной Африке. Генотип II циркулирует в Европе, Китае, Вьетнаме и Камбодже. Генотип VIII ограничен четырьмя странами Восточной Африки.

Примеры штаммов некоторых генотипов приведены ниже. Штаммы, выделенные жирным шрифтом, использовались в анализе идентичности, показанном в таблице 2.

Генотип I: OURT88/3; Brazil/79; Lisbon/60; BA715; ASFV-Pret; Benin 97/1; IC/1/96; IC/576; CAM/82; Madrid/62; Malta/78; ZAR85; Katange63; Togo; Dakar59; OURT88/1; BEN/1/97; Dom_Rep; VAL/76; IC/2/96; Awoshie/99; NIG/1/99; NIG/1/98; ANG/70; BEL/85; SPEC120; Lisbon/57; ASFV-Warm; GHA/1/00; GAM/1/00; Ghana; HOL/86; NAM/1/80; NUR/90/1; CAM/4/85; ASFV-Teng; Tengani; ASFV-E75.

Генотип II: Georgia 2007/1, Belgium 2018/1, China/2018/AnhuiXCGQ.

Генотип III: BOT 1/99.

Генотип IV: ASFV-Warthog; RSA/1/99/W

Генотип VI: MOZ 94/1.

Генотип VII: VICT/90/1; ASFV-Mku; RSA/1/98.

Генотип VIII: NDA/1/90; KAL88/1; ZAM/2/84; JON89/13; KAV89/1; DEZda; Malawi LIL 20/1.

Генотип IX: UGA/1/95; Ken06.Bus.

Генотип X: BUR/1/84; BUR/2/84; BUR/90/1; UGA/3/95; TAN/Kwh12; HindeII; ASFV-Ken; Virulent Uganda 65; Ken05/Tk1.

Авторы настоящего изобретения определили, что композиция, содержащая минимальную комбинацию полипептидов ВАЧС SEQ ID NO: 1-3, способна индуцировать защиту от заражения ВАЧС.

Таблица 2 Название гена Альтернативное название гена Аминокислотная SEQ ID NO: кДНК SEQ ID NO: B602L ASFV шаперон 1 9 E183L p54/j13L 2 10 EP153R ASFV лектин 3 11 B646L p72 4 12 CP204L CP196L/p30 5 13 E199L 6 14 F317L 7 15 MGF505-5R 8 16

Репрезентативные аминокислотные последовательности полипептидов, представленные в таблице 2, показаны на фиг. 2 (SEQ ID NO: 1-8 и 17).

Репрезентативные последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие полипептиды, перечисленные в таблице 2, приведены в SEQ ID NO: 9-16 на фиг. 3.

ПОЛИПЕПТИД

Термин «полипептид» используется в обычном смысле для обозначения ряда остатков, обычно L-аминокислот, соединенных друг с другом, как правило, пептидными связями между α-амино- и карбоксильными группами соседних аминокислот. Термин является синонимом слова «белок».

Термин «рекомбинантный полипептид» используется для обозначения полипептида, выделенного из своего природного окружения, например, экстрагированного из ВАЧС или полученного вне его. В частности, рекомбинантный полипептид не представлен в контексте ВАЧС и экспрессируется из рекомбинантной нуклеиновой кислоты, т. е. ДНК или РНК, созданной искусственно.

Вакцина по настоящему изобретению может содержать комбинацию полипептидов ВАЧС, определенных в настоящем описании.

Вакцина по настоящему изобретению может содержать рекомбинантные полипептиды, приведенные в SEQ ID NO: 1, 2 и 3, или их иммуногенные фрагменты; или вариант, на по меньшей мере 70% идентичный одной из последовательностей SEQ ID NO: 1, 2 и 3, или его иммуногенный фрагмент.

В любом варианте осуществления настоящего изобретения полипептид SEQ ID NO: 3 или его иммуногенный фрагмент; или вариант, на по меньшей мере 70% идентичный последовательности SEQ ID NO: 3, или его иммуногенный фрагмент может быть заменен SEQ ID NO: 17 или ее иммуногенным фрагментом; или вариантом, на по меньшей мере 70% идентичным последовательности SEQ ID NO: 17, или его иммуногенным фрагментом.

SEQ ID NO: 17 представляет собой репрезентативную последовательность EP153R из штамма Genotype II.

Соответственно вариант может содержать аминокислотную последовательность, на по меньшей мере 70, 80, 85, 90, 95, 98 или 99% идентичную одной из SEQ ID NO: 1, 2 или 3; или ее иммуногенный фрагмент.

Соответственно вариант может содержать аминокислотную последовательность, на по меньшей мере 70, 80, 85, 90, 95, 98 или 99% идентичную SEQ ID NO: 1, или ее иммуногенный фрагмент.

Соответственно вариант может содержать аминокислотную последовательность, на по меньшей мере 70, 80, 85, 90, 95, 98 или 99% идентичную SEQ ID NO: 2, или ее иммуногенный фрагмент.

Соответственно вариант может содержать аминокислотную последовательность, на по меньшей мере на 70, 80, 85, 90, 95, 98 или 99% идентичную SEQ ID NO: 3, или ее иммуногенный фрагмент.

Настоящая вакцина может содержать рекомбинантные полипептиды, приведенные в SEQ ID NO: 1, 2 и 3; или вариант, на по меньшей мере 70% идентичный одной из последовательностей SEQ ID NO: 1, 2 и/или 3. В одном из вариантов осуществления вакцина может состоять из рекомбинантных полипептидов, приведенных в SEQ ID NO: 1, 2 и 3; или варианта, на по меньшей мере 70% идентичного одной из последовательностей SEQ ID NO: 1, 2 и/или 3.

В одном из вариантов осуществления рекомбинантные полипептиды могут состоять из аминокислотных последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 1, 2 и 3, или их варианта, идентичного на по меньшей мере 70%.

Вакцина может дополнительно содержать один или более полипептидов, выбранных из SEQ ID NO: 4-8, или их иммуногенные фрагменты; или вариант, на по меньшей мере 70% идентичный одной из последовательностей SEQ ID NO: 4-8, или его иммуногенный фрагмент.

Соответственно вариант может содержать аминокислотную последовательность, на по меньшей мере на 70, 80, 85, 90, 95, 98 или 99% идентичную одной из SEQ ID NO: 4-8; или его иммуногенный фрагмент.

Соответственно вариант может содержать аминокислотную последовательность, на по меньшей мере на 70, 80, 85, 90, 95, 98 или 99% идентичную SEQ ID NO: 4, или ее иммуногенный фрагмент.

Соответственно вариант может содержать аминокислотную последовательность, на по меньшей мере на 70, 80, 85, 90, 95, 98 или 99% идентичную SEQ ID NO: 5, или ее иммуногенный фрагмент.

Соответственно вариант может содержать аминокислотную последовательность, на по меньшей мере на 70, 80, 85, 90, 95, 98 или 99% идентичную SEQ ID NO: 6, или ее иммуногенный фрагмент.

Соответственно вариант может содержать аминокислотную последовательность, на по меньшей мере на 70, 80, 85, 90, 95, 98 или 99% идентичную SEQ ID NO: 7, или ее иммуногенный фрагмент.

Соответственно вариант может содержать аминокислотную последовательность, на по меньшей мере на 70, 80, 85, 90, 95, 98 или 99% идентичную SEQ ID NO: 8, или ее иммуногенный фрагмент.

Вакцина может дополнительно содержать один или более полипептидов, выбранных из SEQ ID NO: 4-8, или вариант, на по меньшей мере 70% идентичный одной из SEQ ID NO: 4-8.

Вакцина может содержать по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4 или по меньшей мере 5 полипептидов, выбранных из SEQ ID NO: 4-8, или их иммуногенные фрагменты; или вариант, на по меньшей мере 70% идентичный одной из последовательностей SEQ ID NO: 4-8.

Вакцина может содержать 2, 3, 4 или 5 полипептидов, выбранных из SEQ ID NO: 4-8, или их иммуногенные фрагменты; или вариант, на по меньшей мере 70% идентичный одной из последовательностей SEQ ID NO: 4-8, или его иммуногенный фрагмент.

Соответственно, вакцина может содержать рекомбинантные полипептиды, содержащие SEQ ID NO: 1-8 или их иммуногенные фрагменты; или варианты, на по меньшей мере 70% идентичные последовательностям SEQ ID NO: 1-8, или их иммуногенные фрагменты.

Соответственно, вакцина может содержать рекомбинантные полипептиды, содержащие SEQ ID NO: 1-3 и 6-8, или их иммуногенные фрагменты; или варианты, на по меньшей мере 70% идентичные последовательностям SEQ ID NO: 1-3 и 6-8, или их иммуногенные фрагменты.

Соответственно, вакцина может содержать рекомбинантные полипептиды, содержащие SEQ ID NO: 1-5, или их иммуногенные фрагменты; или варианты, на по меньшей мере 70% идентичные последовательностям SEQ ID NO: 1-5, или их иммуногенные фрагменты.

ВАРИАНТ

Хотя вариант можно рассматривать с точки зрения сходства (т. е. аминокислотных остатков, имеющих сходные химические свойства/функции), в контексте настоящего изобретения предпочтительно выражать вариант с точки зрения идентичности последовательности.

Сравнение последовательностей можно осуществлять на глаз или, чаще, с помощью легкодоступных программ сравнения последовательностей. Эти общедоступные и коммерчески доступные компьютерные программы могут вычислять идентичность последовательностей между двумя или более последовательностями.

Идентичность последовательности может быть вычислена для непрерывных последовательностей, т. е. одну последовательность выравнивают относительно другой последовательности, и каждую аминокислоту в одной последовательности сравнивают непосредственно с соответствующей аминокислотой в другой последовательности по одному остатку за раз. Это называется выравниванием без пропусков. Как правило, такое выравнивание без пропусков выполняют только по относительно небольшому количеству остатков (например, менее 50 непрерывных аминокислот).

Хотя это очень простой и последовательный метод, в нем не учитывается тот факт, что, например, в идентичной в остальном паре последовательностей одна вставка или делеция может вызвать смещение следующих аминокислотных остатков, что может привести к сильному снижению % гомологии при глобальном выравнивании. Следовательно, большинство методов сравнения последовательностей предназначены для получения оптимального выравнивания, при котором учитываются возможные вставки и делеции без чрезмерного снижения общей оценки гомологии. Это достигается путем вставки «пробелов» (гэпов) при выравнивании последовательностей в попытке достижения максимальной локальной гомологии.

Однако в этих более сложных методах для каждого пробела, который встречается при выравнивании, назначаются «штрафы за пробелы», так что при одинаковом количестве идентичных аминокислот выравнивание последовательности с минимально возможным количеством пробелов, что отражает более высокое родство между двумя сравниваемыми последовательностями, получит более высокий балл, чем выравнивание с большим количеством пробелов. Обычно используется «цена пробела (гэпа) в последующих итерациях», которая имеет относительно высокую стоимость за открытие пробела и меньший штраф за каждый последующий остаток в пробеле. Это наиболее часто используемая система оценки пробелов. Высокие штрафы за пробелы, конечно, приведут к оптимизированному выравниванию с меньшим количеством пробелов. Большинство программ выравнивания позволяют изменять штрафы за пробелы. Однако при использовании такого программного обеспечения для сравнения последовательностей предпочтительно использовать значения по умолчанию. Например, при использовании пакета GCG Wisconsin Bestfit (см. ниже) штраф за пробел по умолчанию для аминокислотных последовательностей составляет -12 для открытия пробела и -4 для каждого удлинения.

Таким образом, для расчета максимального % идентичности последовательностей прежде всего необходимо получение оптимального выравнивания с учетом штрафов за пробелы. Подходящей компьютерной программой для проведения такого выравнивания является пакет GCG Wisconsin Bestfit (Университет Висконсина, США; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12:387). Примеры другого программного обеспечения, которое может выполнять сравнение последовательностей, включают, помимо прочего, пакет BLAST (см. Ausubel et al., 1999, там же - глава 18), FASTA (Atschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 403-410) и набор инструментов сравнения GENEWORKS. BLAST и FASTA доступны для автономного и онлайн-поиска (см. Ausubel et al., 1999 там же, стр. с 7-58 по 7-60). Однако предпочтительнее использовать программу GCG Bestfit.

В одном из вариантов осуществления идентичность последовательности определяют по всей последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1-8 или SEQ ID NO: 9-16. В одном из вариантов осуществления идентичность последовательности определяют по всей последовательности-кандидате, которую сравнивают с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 1-8 или SEQ ID NO: 9-16.

Хотя конечную идентичность последовательности можно измерить в терминах идентичности, сам процесс выравнивания обычно не основан на парном сравнении по принципу «все или ничего». Вместо этого обычно используется масштабированная матрица оценки сходства, в которой присваивают оценки каждому попарному сравнению на основании химического сходства или эволюционного расстояния. Примером такой обычно используемой матрицы является матрица BLOSUM62 - матрица по умолчанию для набора программ BLAST. В программах GCG Wisconsin обычно используют общедоступные значения по умолчанию или пользовательскую таблицу сравнения символов, если таковая имеется (дополнительную информацию см. в руководстве пользователя). Для пакета GCG предпочтительно использовать общедоступные значения по умолчанию или, в случае другого программного обеспечения, матрицу по умолчанию, такую как BLOSUM62.

После выполнения оптимального выравнивания с помощью программного обеспечения можно рассчитать % идентичности последовательности. Программное обеспечение обычно выполняет это как часть сравнения последовательностей и генерирует числовой результат.

В контексте настоящего описания термин «вариант» включает любое замещение, изменение, модификацию, замену, делецию или добавление одной (или более) аминокислот в последовательность, при условии, что полученная в результате аминокислотная последовательность по существу сохраняет ту же активность, что и немодифицированная последовательность.

Могут быть сделаны консервативные замены, например, в соответствии с приведенной ниже таблицей. Аминокислоты в одном блоке во втором столбце и предпочтительно в одной строке в третьем столбце могут быть заменены друг другом:

Алифатические Неполярные G A P I L V Полярные - незаряженные C S T M N Q Полярные - заряженные D E K R Ароматические H F W Y

Что касается функции, вариант должен быть способен индуцировать иммунный ответ. Например, индукция иммунного ответа может быть определена путем демонстрации ответного отклика в периферических иммунных клетках или спленоцитах, полученных от субъекта, ранее иммунизированного полипептидом или его иммуногенным фрагментом. Например, о воспроизводимости ответа может свидетельствовать продуцирование интерферонов (например, IFNγ) и/или пролиферативный ответ после заражения in vitro антигеном или полипептидом, ранее использовавшимся для иммунизации субъекта. Предпочтительно вариант должен быть способным индуцировать защитный иммунный ответ у субъекта против последующего заражения вирусом АЧС при введении в комбинации с полипептидом, выбранным из SEQ ID NO: 1-3, или его вариантом или иммуногенным фрагментом, как описано в настоящем документе.

Полипептид может содержать иммуногенный фрагмент аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1-8, или его вариант, идентичный на по меньшей мере 70%.

Иммуногенный фрагмент означает участок или часть SEQ ID NO: 1-8, которая способна индуцировать иммунный ответ. Предпочтительно иммуногенный фрагмент должен быть способным индуцировать защитный иммунный ответ у субъекта против последующего заражения ВАЧС при введении в комбинации с полипептидом, выбранным из SEQ ID NO: 1-3, или его вариантом или иммуногенным фрагментом, как раскрыто в настоящем описании.

Иммуногенные фрагменты SEQ ID NO: 1-8 или их варианты могут, например, содержать от 8 до 200 аминокислот, например, от 8 до 150 аминокислот, от 8 до 100 аминокислот, от 8 до 75 аминокислот, от 8 до 50 аминокислот, от 8 до 25 аминокислот, от 8 до 20 аминокислот, от 8 до 15 аминокислот или от 8 до 12 аминокислот. В одном из вариантов осуществления иммуногенный фрагмент SEQ ID NO: 1-8 или его вариант может иметь 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50 аминокислот в длину.

ПОЛИНУКЛЕТИД

Полинуклеотид может представлять собой полинуклеотид любого подходящего типа, такой как синтетическая последовательность РНК/ДНК, последовательность кДНК или частичная последовательность геномной ДНК.

В контексте настоящего описания термины «последовательность нуклеиновой кислоты» и «полинуклеотид» используются синонимично. «Полинуклеотид» обычно относится к любому полирибонуклеотиду или полидезоксирибонуклеотиду, который может представлять собой немодифицированную РНК или ДНК или модифицированную РНК или ДНК. «Полинуклеотиды» включают, без ограничения, одноцепочечную и двухцепочечную ДНК, ДНК, представляющую собой смесь одноцепочечных и двухцепочечных участков, одноцепочечную и двухцепочечную РНК и РНК, представляющую собой смесь одноцепочечных и двухцепочечных участков, гибридные молекулы, содержащие ДНК и РНК, которые могут быть одноцепочечными или, что более типично, двухцепочечными или смесью одноцепочечных и двухцепочечных участков. Кроме того, «полинуклеотид» относится к трехцепочечным областям, содержащим РНК или ДНК, или и РНК, и ДНК. Термин «полинуклеотид» также включает ДНК или РНК, содержащие одно или несколько модифицированных оснований, и ДНК или РНК с остовами, модифицированными для обеспечения стабильности или по другим причинам. «Модифицированные» основания включают, например, тритилированные основания и необычные основания, такие как инозин. В ДНК и РНК происходят различные модификации; таким образом, «полинуклеотид» включает химически, ферментативно или метаболически модифицированные формы полинуклеотидов, которые обычно встречаются в природе, а также химические формы ДНК и РНК, характерные для вирусов и клеток. «Полинуклеотид» также включает относительно короткие полинуклеотиды, часто называемые олигонуклеотидами.

Термин «рекомбинантный полинуклеотид» используется для обозначения полинуклеотида, выделенного из его природного окружения, например, экстрагированного из ВАЧС или полученного вне его. В частности, рекомбинантный полинуклеотид не представлен в контексте ВАЧС и получен в виде полинуклеотида, т. е. ДНК или РНК, созданной искусственно.

Специалисту в данной области очевидно, что из-за вырожденности генетического кода несколько разных полинуклеотидов могут кодировать один и тот же полипептид. Кроме того, следует понимать, что специалисты в данной области техники, используя стандартные методы, могут производить замены нуклеотидов, не оказывающие влияние на последовательность полипептидов, кодируемых представленными в настоящем описании полинуклеотидами, чтобы отразить использование кодонов любым конкретным организмом-хозяином, в котором должны экспрессироваться эти полипептиды.

Термин «вариант» используется для обозначения встречающейся в природе последовательности нуклеиновой кислоты, которая отличается от исследуемой последовательности. Вариант может быть идентичным рассматриваемой последовательности на по меньшей мере 70% или иметь до 20 мутаций включительно.

Вакцина по изобретению может содержать один или более полинуклеотидов, которые кодируют комбинацию рекомбинантных полипептидов в соответствии с вакциной по настоящему изобретению.

Иллюстративные полинуклеотиды, кодирующие каждый из полипептидов SEQ ID NO: 1-8, показаны в таблице 2.

Вакцина по настоящему изобретению может содержать один или более полинуклеотидов, которые кодируют рекомбинантные полипептиды, приведенные в SEQ ID NO: 1, 2 и 3, или их иммуногенные фрагменты; или вариант, на по меньшей мере 70% идентичный одной из последовательностей SEQ ID NO: 1, 2 и 3, или его иммуногенный фрагмент.

Вакцина по изобретению может содержать один или более полинуклеотидов, которые кодируют рекомбинантные полипептиды, приведенные в SEQ ID NO: 1, 2 и 3; или вариант, на по меньшей мере 70% идентичный одной из последовательностей SEQ ID NO: 1, 2 и/или 3. В одном из вариантов осуществления вакцина может состоять из одного или более полинуклеотидов, которые кодируют рекомбинантные полипептиды, приведенные в SEQ ID NO: 1, 2 и 3; или вариант, на по меньшей мере 70% идентичный одной из последовательностей SEQ ID NO: 1, 2 и/или 3.

Вакцина может дополнительно содержать один или более полинуклеотидов, кодирующих один или более полипептидов, выбранных из SEQ ID NO: 4-8, или их иммуногенные фрагменты; или вариант, на по меньшей мере 70% идентичный одной из последовательностей SEQ ID NO: 4-8, или его иммуногенный фрагмент.

Вакцина может дополнительно содержать один или более полинуклеотидов, которые кодируют один или более полипептидов, выбранных из SEQ ID NO: 4-8, или вариант, на по меньшей мере 70% идентичный одной из последовательностей SEQ ID NO: 4-8.

Вакцина может содержать один или более полинуклеотидов, кодирующих по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4 или по меньшей мере 5 полипептидов, выбранных из SEQ ID NO: 4-8, или их иммуногенные фрагменты; или вариант, на по меньшей мере 70% идентичный одной из последовательностей SEQ ID NO: 4-8.

Вакцина может содержать один или более полинуклеотидов, кодирующих 2, 3, 4 или 5 полипептидов, выбранных из SEQ ID NO: 4-8, или их иммуногенные фрагменты; или вариант, на по меньшей мере 70% идентичный одной из последовательностей SEQ ID NO: 4-8, или его иммуногенный фрагмент.

Соответственно, вакцина может содержать один или более полинуклеотидов, кодирующих рекомбинантные полипептиды, содержащие SEQ ID NO: 1-8, или их иммуногенные фрагменты; или варианты, на по меньшей мере 70% идентичные последовательностям SEQ ID NO: 1-8, или их иммуногенные фрагменты.

Соответственно, вакцина может содержать один или более полинуклеотидов, которые кодируют рекомбинантные полипептиды, содержащие SEQ ID NO: 1-3 и 6-8, или их иммуногенные фрагменты; или варианты, на по меньшей мере 70% идентичные последовательностям SEQ ID NO: 1-3 и 6-8, или их иммуногенные фрагменты.

Соответственно, вакцина может содержать один или более полинуклеотидов, которые кодируют рекомбинантные полипептиды, содержащие SEQ ID NO: 1-5, или их иммуногенные фрагменты; или варианты, на по меньшей мере 70% идентичные последовательностям SEQ ID NO: 1-5, или их иммуногенные фрагменты.

Полинуклеотид, кодирующий полипептид, приведенный в SEQ ID NO: 1-3, или его вариант может содержать SEQ ID NO: 9-11 соответственно; или ее вариант, на по меньшей мере 70% идентичный одной из последовательностей SEQ ID NO: 9-11.

Полинуклеотид, кодирующий полипептид, приведенный в SEQ ID NO: 1, или его вариант может содержать SEQ ID NO: 9; или ее вариант, на по меньшей мере 70, 80, 85, 90, 95, 98 или 99% идентичный SEQ ID NO: 9.

Полинуклеотид, кодирующий полипептид, приведенный в SEQ ID NO: 2, или его вариант может содержать SEQ ID NO: 10; или ее вариант, на по меньшей мере на 70, 80, 85, 90, 95, 98 или 99% идентичный SEQ ID NO: 10.

Полинуклеотид, кодирующий полипептид, приведенный в SEQ ID NO: 3, или его вариант может содержать SEQ ID NO: 11; или ее вариант, на по меньшей мере 70, 80, 85, 90, 95, 98 или 99% идентичный SEQ ID NO: 11.

Полинуклеотид, кодирующий полипептид, приведенный в SEQ ID NO: 4-8, или его вариант может содержать SEQ ID NO: 12-16 соответственно; или вариант, на по меньшей мере 70% идентичный одной из последовательностей SEQ ID NO: 12-16.

Полинуклеотид, кодирующий полипептид, приведенный в SEQ ID NO: 4, или его вариант может содержать SEQ ID NO: 12; или ее вариант, на по меньшей мере 70, 80, 85, 90, 95, 98 или 99% идентичный SEQ ID NO: 12.

Полинуклеотид, кодирующий полипептид, приведенный в SEQ ID NO: 5, или его вариант может содержать SEQ ID NO: 13; или ее вариант, на по меньшей мере 70, 80, 85, 90, 95, 98 или 99% идентичный SEQ ID NO: 13.

Полинуклеотид, кодирующий полипептид, приведенный в SEQ ID NO: 6, или его вариант может содержать SEQ ID NO: 14; или ее вариант, на по меньшей мере 70, 80, 85, 90, 95, 98 или 99% идентичный SEQ ID NO: 14.

Полинуклеотид, кодирующий полипептид, приведенный в SEQ ID NO: 7, или его вариант может содержать SEQ ID NO: 15; или ее вариант, на по меньшей мере 70, 80, 85, 90, 95, 98 или 99% идентичный SEQ ID NO: 15.

Полинуклеотид, кодирующий полипептид, приведенный в SEQ ID NO: 8, или его вариант может содержать SEQ ID NO: 16; или ее вариант, на по меньшей мере 70, 80, 85, 90, 95, 98 или 99% идентичный SEQ ID NO: 16.

Вакцина может дополнительно содержать один или более полипептидов, выбранных из SEQ ID NO: 4-8, или вариант, на по меньшей мере 70% идентичный одной из последовательностей SEQ ID NO: 4-8.

Соответственно, вакцина может содержать один или более полинуклеотидов, содержащих SEQ ID NO: 9-16, или варианты, на по меньшей мере 70% идентичные последовательностям SEQ ID NO: 9-16.

Соответственно, вакцина может содержать один или более полинуклеотидов, содержащих SEQ ID NO: 9-11 и 14-16; или варианты, на по меньшей мере 70% идентичные последовательностям SEQ ID NO: 9-11 и 14-16.

Соответственно, вакцина может содержать один или более полинуклеотидов, содержащих SEQ ID NO: 9-13; или варианты, на по меньшей мере 70% идентичные последовательностям SEQ ID NO: 9-13, или их иммуногенные фрагменты.

КОМБИНАЦИЯ

Настоящее изобретение основано, по меньшей мере частично, на определении авторами изобретения минимальной комбинации полипептидов или их иммуногенных фрагментов, которая способна индуцировать защиту от ВАЧС.

Следует понимать, что ссылки на полипептиды или комбинации полипептидов, представленные в настоящем описании, в равной степени относятся к соответствующим полинуклеотидам или комбинациям полинуклеотидов, которые кодируют указанные полипептиды.

Общее количество различных полипептидов ВАЧС (кодируемых либо одним, либо несколькими рекомбинантными полинуклеотидами) в вакцине по изобретению составляет 10 или менее.

Соответственно количество разных полипептидов ВАЧС составляет 9 или менее, 8 или менее, 7 или менее или 6 или менее.

Соответственно, количество разных полипептидов ВАЧС составляет 3, 4, 5, 6, 7 или 8.

Соответственно, количество разных полипептидов ВАЧС равно 3.

Соответственно, количество разных полипептидов ВАЧС равно 5.

Соответственно, количество разных полипептидов ВАЧС равно 6.

Соответственно, количество разных полипептидов ВАЧС равно 8.

ВЕКТОР

В контексте настоящего изобретения термин «вектор» может представлять собой любой агент, способный доставлять или поддерживать нуклеиновую кислоту в клетке-хозяине, и включает вирусные, бактериальные и эукариотические векторы, плазмиды, «голые» нуклеиновые кислоты, нуклеиновые кислоты в комплексе с полипептидом или другими молекулами и нуклеиновые кислоты, иммобилизованные на частицах твердой фазы.

Полинуклеотиды в соответствии с настоящим изобретением могут быть доставлены путем вирусного или невирусного переноса.

Неинфекционные системы доставки включают, без ограничения, способы трансфекции ДНК. В контексте настоящего описания трансфекция включает процесс с использованием неинфекционного вектора для доставки нуклеиновой кислоты по изобретению в клетку-мишень.

Типичные методы трансфекции включают электропорацию, биолистику нуклеиновых кислот, трансфекцию, опосредованную липидами, трансфекцию, опосредованную плотно упакованными нуклеиновыми кислотами, липосомы, иммунолипосомы, липофектин, трансфекцию с использованием катионных агентов, катионные поверхностные амфифилы (CFA), поливалентные катионы, такие как спермин, катионные липиды или полилизин, 1,2,-бис(олеоилокси)-3-(триметиламмонио)пропан (DOTAP)-холестериновые комплексы и их комбинации.

Невирусные системы доставки также могут включать, без ограничения, бактериальные системы доставки. Бактерии ранее использовались в качестве противораковых агентов и в качестве агентов доставки противораковых препаратов.

Молекулы клеточной адгезии представляют собой большую группу молекул, участвующих в различных межклеточных взаимодействиях и взаимодействиях между клетками и внеклеточным матриксом (ECM), и используются несколькими патогенными микроорганизмами в качестве рецепторов для проникновения в клетки. Эти молекулы могут быть использованы для нацеливания и захвата систем доставки как генов, так и лекарственных веществ.

Для доставки ДНК также может быть использована система доставки с помощью генной пушки.

Вирусные системы доставки включают, без ограничения, аденовирусные векторы, векторы модифицированного вируса осповакцины Анкара, аденоассоциированные вирусные (AAV) векторы, герпесвирусные векторы, такие как вектор вируса псевдобешенства, ретровирусные векторы, лентивирусные векторы или бакуловирусные векторы, векторы на основе вируса венесуэльского конского энцефалита (VEE), поксвирусов, таких как: вирус оспы канареек, энтомопокс-вирус, альфавирус пингвинов и ДНК-векторы на основе альфавируса.

В одном из вариантов осуществления вектор может представлять собой аденовирусный вектор.

Аденовирус представляет собой двухцепочечный линейный ДНК-вирус, который не реплицируется через промежуточную РНК. Существует более 50 различных серотипов аденовирусов человека, разделенных на 6 подгрупп в зависимости от их генетической последовательности.

Аденовирусы представляют собой безоболочечные вирусы с двухцепочечной ДНК, способные к трансдукции in vivo, ex vivo и in vitro широкого спектра типов клеток человеческого и нечеловеческого происхождения. Эти клетки включают эпителиальные клетки дыхательных путей, гепатоциты, мышечные клетки, сердечные миоциты, синовиоциты, первичные эпителиальные клетки молочной железы и постмитотически терминально дифференцированные клетки, такие как нейроны. Аденовирусные векторы также способны трансдуцировать неделящиеся клетки.

Аденовирусы использовались в качестве векторов для генной терапии и для экспрессии гетерологичных генов. Большой (36 т. п. н.) геном может вмещать до 8 т. п. н. чужеродной ДНК-вставки и способен эффективно реплицироваться в комплементарных клеточных линиях с получением очень высоких титров, вплоть до 10¹² единиц трансдукции на мл. Таким образом, аденовирус является одной из лучших систем для изучения экспрессии генов в первичных нерепликативных клетках. Для экспрессии вирусных или чужеродных генов из аденовирусного генома не требуется реплицирующаяся клетка. Аденовирусные векторы проникают в клетки посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза. Оказавшись внутри клетки, аденовирусные векторы редко интегрируются в хромосому хозяина. Вместо этого они функционируют эписомально (независимо от генома хозяина) в виде линейного генома в ядре хозяина.

В одном из вариантов осуществления вектор может представлять собой вектор модифицированного вируса осповакцины Анкара (MVA). Вирус MVA является родственным вирусу коровьей оспы, члену рода Orthopoxvirus семейства Poxviridae. Вирус MVA был получен путем 516 последовательных пассажей вируса Chorioallantois осповакцины Анкара (CVA) на фибробластах куриных эмбрионов. В ходе процесса аттенуации путем многократного пассирования на курином материале в качестве субстрата для производства вирус MVA потерял примерно 15% геномной ДНК во многих участках (Mayr and Munz, 1964, Zentralbl Bakteriol Orig, 195, 24-35; Meyer et al., 1991 в J Gen Virol 72 (Pt 5), 1031-1038). Вирус MVA был проанализирован для определения изменений в геноме относительно штамма CVA дикого типа. Было идентифицировано шесть основных делеций геномной ДНК (делеции I, II, III, IV, V и VI), в общей сложности 31000 пар оснований (Meyer, et al. 1991 в J Gen Virol 72 (Pt 5), 1031-1038). MVA не реплицируется в клетках человека и приматов, отличных от человека.

Альтернативы векторам коровьей оспы включают векторы оспы птиц, такие как оспа птиц или оспа канареек, известные как ALVAC, и полученные от них штаммы, которые могут инфицировать и экспрессировать рекомбинантные белки в клетках человека, но не способны к репликации.

Примеры других векторов включают системы доставки ex vivo, которые включают, без ограничения, способы трансфекции ДНК, такие как электропорация, биолистика ДНК, трансфекция, опосредованная липидами, и трансфекция, опосредованная плотно упакованной ДНК.

Вектор может быть вектором плазмидной ДНК. В контексте настоящего описания термин «плазмида» относится к дискретным элементам, которые используются для введения гетерологичной ДНК в клетки либо для ее экспрессии, либо для репликации.

В одном из вариантов осуществления вектор может содержать более одной последовательности нуклеиновой кислоты, все из которых кодируют разные полипептиды, как описано в контексте применения в вакцине по изобретению.

Соответственно, один или более векторов могут содержать несколько последовательностей нуклеиновых кислот, которые кодируют комбинацию полипептидов, как описано в контексте применения в вакцине по изобретению.

В одном из вариантов осуществления вектор может содержать более одной последовательности нуклеиновой кислоты, таким образом, вектор содержит последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют комбинацию полипептидов, как описано в контексте применения в вакцине по изобретению.

Для экспрессии более чем одной последовательности нуклеиновой кислоты в векторе могут присутствовать две или более единиц транскрипции, по одной для каждой последовательности нуклеиновой кислоты. В одном из вариантов осуществления для инициации трансляции второй (и последующих) кодирующей(-их) последовательности(-ей) в полицистронном сигнале используется участок внутренней посадки рибосомы (IRES) (Adam et al., 1991, J. Virol. 65, 4985).

Вставка элементов IRES в ретровирусные векторы совместима с циклом ретровирусной репликации и позволяет экспрессировать несколько кодирующих областей с одного промотора (Adam et al. (см. выше); Koo et al. (1992) Virology 186:669-675; Chen et al. 1993 J. Virol 67:2142-2148). Элементы IRES были впервые обнаружены на нетранслируемых 5'-концах пикорнавирусов, где они способствуют кэп-независимой трансляции вирусных белков (Jang et al. (1990) Enzyme 44:292-309). Расположенные между открытыми рамками считывания в РНК элементы IRES обеспечивают эффективную трансляцию находящейся ниже открытой рамки считывания, способствуя проникновению рибосомы в элемент IRES с последующей инициацией трансляции нижележащих элементов.

Обзор IRES можно найти у Mountford and Smith (TIG, May 1995, vol.11, No.5:179-184). Известно несколько разных последовательностей IRES, включая последовательности вируса энцефаломиокардита (EMCV) (Ghattas, IR, et al., Mol. Cell. Biol., 11:5848-5859 (1991); белок BiP [Macejak and Sarnow, Nature 353:91 (1991)], ген Antennapedia дрозофилы (экзоны d и e) [Oh, et al., Genes & Development, 6:1643-1653 (1992)], и ген полиовируса (PV) [Pelletier и Sonenberg, Nature 334:320-325 (1988), см. также Mountford and Smith, TIG 11, 179-184 (1985)].

Термин «IRES» включает любую последовательность или комбинацию последовательностей, которые функционируют как IRES или улучшают функцию IRES.

IRES может иметь вирусное происхождение (например, последовательности EMCV IRES, PV IRES или FMDV 2A-подобные последовательности), или клеточное происхождение (например, FGF2 IRES, NRF IRES, Notch 2 IRES или EIF4 IRES).

Чтобы IRES мог инициировать трансляцию каждого полинуклеотида, он должен быть расположен в геноме вектора между полинуклеотидами или перед ними.

Полинуклеотид может кодировать полипептид, который содержит два или более иммуногенных полипептида для применения в вакцине по изобретению, причем каждый полипептид соединен сайтом расщепления. Сайт расщепления может быть саморасщепляющимся, таким, что при получении полипептида он сразу расщепляется на отдельные иммуногенные полипептиды без необходимости применения какой-либо внешней расщепляющей активности.

Известны различные саморасщепляющиеся сайты, включая саморасщепляющийся пептид 2a вируса ящура (FMDV), который имеет следующую последовательность:

SEQ ID NO:19

RAEGRGSLLTCGDVEENPGP.

или

SEQ ID NO: 18

QCTNYALLKLAGDVESNPGP

«Саморасщепляющийся пептид» относится к пептиду, который функционирует таким образом, что при получении нового полипептида, содержащего два или более полипептидов для использования в вакцине по изобретению и саморасщепляющийся пептид, он сразу «расщепляется» или разделяется на отдельные и дискретные полипептиды ВАЧС без необходимости применения какой-либо внешней расщепляющей активности.

В вариантах осуществления, в которых полипептид содержит несколько полипептидов ВАЧС для использования в вакцине по изобретению, например, три или более полипептидов ВАЧС, саморасщепляющийся полипептид может присутствовать между каждым из полипептидов ВАЧС. Соответственно, саморасщепляющийся полипептид может присутствовать между первым и вторым полипептидами ВАЧС, вторым и третьим полипептидами ВАЧС и т. д.

Саморасщепляющийся пептид может представлять собой саморасщепляющийся пептид 2А из апто- или кардиовируса. Первичное расщепление 2А/2В апто- и кардиовирусов опосредовано «расщеплением» 2А на своем собственном С-конце. У аптовирусов, таких как вирусы ящура (FMDV) и вирус ринита лошадей А, область 2А представляет собой короткий участок, состоящий примерно из 18 аминокислот, который вместе с N-концевым остатком белка 2В (консервативный остаток пролина) представляет собой автономный элемент, способный опосредовать «расщепление» на своем собственном С-конце.

Экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты можно контролировать с помощью контрольных последовательностей, которые включают промоторы/энхансеры и другие сигналы регуляции экспрессии. Можно использовать прокариотические промоторы и промоторы, функционирующие в эукариотических клетках. Можно использовать тканеспецифические или стимул-специфические промоторы. Также можно использовать химерные промоторы, содержащие элементы последовательности из двух или более разных промоторов.

Подходящими последовательностями в качестве промоторов являются сильные промоторы, в том числе полученные из геномов вирусов, таких как вирус полиомы, аденовирус, вирус оспы птиц, вирус папилломы крупного рогатого скота, вирус саркомы птиц, цитомегаловирус (CMV), ретровирус и обезьяний вирус 40 (SV40), или полученные из гетерологичных промоторов млекопитающих, таких как промотор актина, EF1a, CAG, TK, SV40, промотор убиквитина, PGK или рибосомного белка. В качестве альтернативы, для управления транскрипцией могут быть использованы тканеспецифические промоторы, такие как промотор родопсина (Rho), родопсинкиназы (RhoK), гена колбочко-палочкового гомеобокса (CRX), белка лейциновой молнии, специфичного для нейронной сетчатки (NRL), гена вителиморфной макулярной дистрофии 2 (VMD2), промотор гена тирозингидроксилазы, промотор нейрон-специфической енолазы (NSE), промотор специфического для астроцитов глиального фибриллярного кислого белка (GFAP), промотор α1-антитрипсина человека (hAAT), промотор гена фосфоенолпируваткарбоксикиназы (PEPCK), промотор белка, связывающего жирные кислоты печени, Flt-1 промотор, промотор INF-β, промотор Mb, промотор SP-B, промотор SYN1, промотор WASP, промотор SV40/hAlb, SV40/CD43, SV40/CD45, промотор NSE/RU5', промотор ICAM-2, промотор GPIIb, промотор GFAP, промотор фибронектина, промотор эндоглина, промотор эластазы-1, промотор десмина, промотор CD68, промотор CD14 и промотор B29.

Транскрипция гена может быть дополнительно увеличена путем вставки в вектор энхансерной последовательности. Энхансеры являются относительно независимыми от ориентации и положения; однако можно использовать энхансер из вируса эукариотической клетки, такой как энхансер SV40 на поздней стороне точки начала репликации (100-270 п. н.) и энхансер раннего промотора CMV. Энхансер может быть сплайсирован в векторе в 5'- или 3'-положении относительно промотора, но предпочтительно он расположен на 5'-участке относительно промотора.

Промотор может дополнительно иметь признаки, обеспечивающие или увеличивающие экспрессию в подходящей клетке-мишени. Например, такие признаки могут быть консервативными областями, т. е. бокс Прибнова (Pribnow) или TATA бокс. Промотор может содержать другие последовательности для воздействия (например, поддержания, увеличения или уменьшения) уровня экспрессии нуклеотидной последовательности. Другие подходящие последовательности включают интрон Sh1 или интрон ADH. Другие последовательности включают индуцибельные элементы, такие как температурные, химические, световые или стресс-индуцибельные элементы. Также могут присутствовать подходящие элементы для усиления транскрипции или трансляции.

ВАКЦИНА

В контексте настоящего описания термин «вакцина» относится к препарату, который при введении субъекту индуцирует или стимулирует защитный иммунный ответ. Вакцина позволяет сформировать невосприимчивость организм к конкретному заболеванию, например, в данном случае к АЧС. Вакцина по настоящему изобретению индуцирует таким образом иммунный ответ у субъекта, защищающий от последующего заражения ВАЧС.

Вакцина по изобретению может содержать вектор, рекомбинантный полипептид и/или рекомбинантный полинуклеотид, представленные в настоящем описании.

В одном из вариантов осуществления вакцина по изобретению содержит множество векторов, рекомбинантных полипептидов и/или рекомбинантных полинуклеотидов, определенных в настоящем описании.

В контексте настоящего описания термин «множество» используется для обозначения более чем одного вектора, рекомбинантного полипептида и/или рекомбинантного полинуклеотида согласно настоящему описанию. Например, множество может означать два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или десять рекомбинантных полипептидов и/или рекомбинантных полинуклеотидов, определенных в настоящем описании.

Вакцина может быть полезна для профилактики африканской чумы свиней.

Вакцинная композиция необязательно может содержать фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель, вспомогательное вещество или адъювант. Фармацевтический носитель, вспомогательное вещество или разбавитель может быть выбран с учетом предполагаемого пути введения и стандартной фармацевтической практики. Вакцинная композиция может содержать в качестве (или в дополнение к) носителя, вспомогательного вещества или разбавителя, любое подходящее(-ие) связующее(-ие), смазывающее(-ие) вещество(-а), суспендирующее(-ие) вещество(-а), покрывающее(-ие) вещество(-а), солюбилизирующее(-ие) вещество(-а) и другие агенты-носители, которые могут облегчить или улучшить доставку или иммуногенность вакцины.

Такой состав может быть, например, в форме, пригодной для перорального, внутривенного, внутримышечного, подкожного, интраназального, внутрикожного введения или применения в виде суппозиториев или имплантации (например, с использованием молекул с медленным высвобождением).

Вакцина может дополнительно содержать адъювант. Примеры адъювантов включают, без ограничения, соли алюминия, масляные эмульсии и бактериальные компоненты (например, LPS и липосомы).

СПОСОБЫ ПРОФИЛАКТИКИ/ЛЕЧЕНИЯ

Настоящее изобретение также относится к способу профилактики и/или лечения АЧС у субъекта путем введения эффективного количества вакцины по изобретению.

Настоящее изобретение дополнительно относится к вакцине по первому аспекту настоящего изобретения для применения при лечении и/или профилактике АЧС.

Термин «профилактика» означает предотвращение, задержку, ингибирование или сдерживание распространения АЧС. Вакцина может, например, предотвращать или снижать вероятность проникновения инфекционного ВАЧС в клетку.

Термин «лечение» означает уменьшение или облегчение по меньшей мере одного симптома существующей инфекции АЧС.

ВВЕДЕНИЕ

Вакцину можно вводить удобным способом, например, перорально, внутривенно, внутримышечно, подкожно, интраназально, внутрикожно или в виде суппозиториев, или путем имплантации (например, с использованием молекул с медленным высвобождением).

Как правило, ветеринар или производитель способен определить фактическую дозировку, которая будет наиболее подходящей для отдельного субъекта или группы субъектов, которая может меняться, например, в зависимости от возраста, веса и реакции конкретного субъекта(-ов). Дозировка является достаточной для уменьшения и/или предотвращения симптомов заболевания.

Специалистам в данной области техники очевидно, например, что способ доставки (например, пероральный или внутривенный, или подкожный, или внутриопухолевый и т. д.) может влиять на величину дозы, и/или требуемая величина дозы может определять путь доставки. Например, когда интерес представляют особенно высокие концентрации агента на конкретном участке или в конкретном месте (например, в опухоли), может быть желательной и/или полезной целенаправленная доставка (например, в этом примере, внутриопухолевая доставка). Другие факторы, которые следует учитывать при оптимизации путей и/или графика дозирования для данного терапевтического режима, могут включать, например, конкретный вид рака, подлежащий лечению (например, тип, стадия, локализация и т. д.), клиническое состояние субъекта (например, возраст, общее состояние здоровья и др.), наличие или отсутствие комбинированной терапии и другие факторы, известные практикующим врачам.

Дозировка является достаточной для стабилизации или улучшения симптомов заболевания.

Вакцину можно вводить после режима первичной бустерной вакцинации. Например, после первой прививки субъект может получить вторую бустерную дозу спустя некоторое время (например, через 3-21, 3-14, 5-14 или 5-7 дней). Например, субъект может получить второе бустерное введение примерно через 3, 5, 7, 14 или 21 день после первой прививки.

В одном из вариантов осуществления первая инокуляция может быть выполнена в виде одного или более аденовирусных векторов, представленных в настоящем описании; и вторая инокуляция может быть выполнена в виде одного или более векторов MVA, определенных в настоящем описании. Обычно бустерное введение осуществляется в более высокой дозе, чем первичное введение.

Применительно ко всем позвоночным вектор, иммуногенная композиция или вакцина могут быть введены парентерально, например, путем инъекции либо подкожно, либо внутримышечно. Дополнительные составы, подходящие для других способов введения, включают суппозитории и пероральные составы. Когда иммуногенная композиция или вакцина лиофилизированы, лиофилизированный материал может быть восстановлен перед введением, например в виде суспензии.

СУБЪЕКТ

Субъектом может быть любое животное, восприимчивое к инфекции АЧС. Животные, восприимчивые к АЧС, включают домашних свиней, бородавочников, кустарниковых свиней и клещей.

Субъект, вакцинированный по настоящему изобретению, может представлять собой домашнюю свинью.

Субъект может быть восприимчив к инфекции АЧС.

В тех случаях, когда вакцина используется для лечения установленной инфекции, у субъекта может быть диагностировано заболевание и/или может быть проявлен один или более симптомов, связанных с инфекцией.

Настоящее изобретение не ограничено иллюстративными способами и материалами, раскрытыми в настоящем описании, и на практике или при тестировании вариантов осуществления настоящего изобретения могут быть использованы любые способы и материалы, аналогичные или эквивалентные тем, которые раскрыты в настоящем описании. Числовые диапазоны включают числа, определяющие диапазон. Если не указано иное, любые последовательности нуклеиновых кислот записаны слева направо в ориентации от 5' к 3'-концу; аминокислотные последовательности записаны слева направо в амино-карбоксильной ориентации, соответственно.

В случае, когда представлен диапазон значений, подразумевается, что также специально определено каждое промежуточное значение между верхним и нижним пределами этого диапазона с точностью до десятой доли единицы нижнего предела, если из контекста в явном виде не следует иное. В объем настоящего изобретения включен каждый меньший диапазон между любым заявленным значением или промежуточным значением в указанном диапазоне и любым другим заявленным или промежуточным значением в указанном диапазоне. Верхние и нижние пределы этих меньших диапазонов могут быть независимо включены в диапазон или исключены из него, и каждый диапазон, в котором любой из этих пределов, ни один из них или оба предела не включены в меньшие диапазоны, также входит в объем настоящего изобретения с учетом любого специально исключенного предела в заявленном диапазоне. В тех случаях, когда указанный диапазон включает один или оба предела, диапазоны, исключающие один или оба из этих включенных пределов, также включены в объем изобретения.

Следует отметить, что используемые в настоящем описании и в прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают ссылки на множественное число, если из контекста в явном виде не следует иное.

В контексте настоящего описания термины «содержащий», «содержит» и «содержащийся» являются синонимами слов «включающий», «включает» или «состоящий из», «состоит из» и являются включающими или открытыми и не исключают дополнительные, неперечисленные члены, элементы или этапы способа. Термины «содержащий», «содержит» и «содержащийся» также включают термин «состоящий из».

Публикации, обсуждаемые в настоящем описании, представлены исключительно для их раскрытия до даты подачи настоящей заявки. Ничто в настоящем описании не должно быть истолковано как допущение того, что такие публикации составляют предшествующий уровень техники для прилагаемой формулы изобретения.

Изобретение далее описано в виде примеров, которые приведены с целью облегчения осуществления изобретения специалистом в данной области и никоим образом не предназначены для ограничения объема изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Иммунизация свиней пулами полипептидов субъединиц ВАЧС и контрольное заражение ВАЧС

Различные полинуклеотиды, кодирующие разные полипептиды ВАЧС, независимо клонировали в векторы рекомбинантного аденовируса и вектор модифицированного вируса осповакцины Анкара (MVA). Клонированные последовательности получали из штамма OURT88/3 генотипа I, за исключением EP153R и MGF360-11L, которые были получены из штамма Benin 1997/1 генотипа I.

Десять групп свиней иммунизировали, как показано в таблице 1.

Свиней в экспериментах AR000737 и AR000742 примировали 5E9 МЕ аденовируса и 7,5E7 БОЕ MVA. Свиней в экспериментах AR000750 и AR000858 примировали 1,5×10¹⁰ инфекционных единиц каждого рекомбинантного аденовирусного вектора и стимулировали 2×10⁸ бляшкообразующих единиц каждого рекомбинантного вектора MVA.

Подробная информация о разных комбинациях антигенов, векторов, используемых для примирующих и бустерных доз и индукции защиты, представлена в таблице 1.

B602L, E183L и EP153R присутствуют во всех группах, в которых наблюдалась защита после заражения. Защиту определяли по факту того, что животные не достигали заранее определенных гуманных конечных точек исследования.

Однако и B602L, и EP153R также находились в пуле B эксперимента 2, в котором защита не наблюдалась. E183L находился в пуле 5 эксперимента 4, в котором защита наблюдалась после контрольного заражения. Таким образом, комбинация только B602L и EP153R является недостаточной для защиты, так же, как и наличие одного E183L является недостаточным для защиты.

Материалы и методы

Вирусы африканской чумы свиней и клетки

Изолят OUR T88/1 выращивали в первичных макрофагах из костного мозга свиньи. Вирусные штаммы готовили из суспензии селезенки инфицированной свиньи, титры определяли путем предельного разведения с помощью реакции гемадсорбции для выявления инфицированных вирусом клеток, и титры вычисляли методом Спирмена-Карбера.

Иммунизация свиней и заражение

Свиньи были либо аутбредными гибридами, полученными от скрещивания пород Крупной Белой и Ландрас, либо аутбредными гибридами, полученными от скрещивания пород Белой, Ландрас и Гэмпшир с фермы с высоким статусом здоровья. В начале экспериментов средний вес свиньи составлял 20 кг.

Рекомбинантные аденовирусы (rAd) и модифицированные вирусы осповакцины Анкара вводили внутримышечной инъекцией в максимальном общем объеме 5 мл в два отдельных участка. Бустерные дозы MVA или rAd вводили свиньям через 4 недели после первоначальной прививки rAd. Свиней внутримышечно заражали 10⁴ HAD₅₀ вируса Georgia 2007/1 через четыре-восемь недель после введения бустерной дозы. Свиней наблюдали на появление клинических признаков, и оценивали с помощью ранее использовавшейся системы подсчета баллов. Для измерения уровня репликации вируса собирали образцы крови и тканей.

Все публикации, упомянутые в приведенном выше описании, включены в него в качестве ссылки. Специалистам в данной области техники будут очевидны различные модификации и вариации описанных способов и систем изобретения, не выходящие за рамки объема и сущности изобретения. Хотя изобретение было описано в контексте конкретных предпочтительных вариантов осуществления, следует понимать, что заявленное изобретение не следует неправомерно ограничивать до указанных конкретных вариантов осуществления. Действительно, предполагается, что различные модификации описанных способов осуществления изобретения, очевидные для специалистов в данной области, входят в объем приведенной ниже формулы изобретения.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> The Pirbright Institute

<120> ВАКЦИНА ПРОТИВ АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ

<130> P111907PCT

<150> GB 1910794.5

<151> 2019-07-29

<160> 19

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 674

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид вируса африканской чумы свиней

(ASFV), B602L (OUR T88/3)

<400> 1

Met Ala Glu Phe Asn Ile Asp Glu Leu Leu Lys Asn Val Leu Glu Asp

1 5 10 15

Pro Ser Thr Glu Ile Ser Glu Glu Thr Leu Lys Gln Leu Tyr Gln Arg

20 25 30

Thr Asn Pro Tyr Lys Gln Phe Lys Asn Asp Ser Arg Val Ala Phe Cys

35 40 45

Ser Phe Thr Asn Leu Arg Glu Gln Tyr Ile Arg Arg Leu Ile Met Thr

50 55 60

Ser Phe Ile Gly Tyr Val Phe Lys Ala Leu Gln Glu Trp Met Pro Ser

65 70 75 80

Tyr Ser Lys Pro Thr His Thr Thr Lys Thr Leu Leu Ser Glu Leu Ile

85 90 95

Thr Leu Val Asp Thr Leu Lys Gln Glu Thr Asn Asp Val Pro Ser Glu

100 105 110

Ser Val Val Asn Thr Ile Leu Ser Ile Ala Asp Ser Cys Lys Thr Gln

115 120 125

Thr Gln Lys Ser Lys Glu Ala Lys Thr Thr Ile Asp Ser Phe Leu Arg

130 135 140

Glu His Phe Val Phe Asp Pro Asn Leu His Ala Gln Ser Ala Tyr Thr

145 150 155 160

Cys Ala Ser Thr Cys Ala Asp Thr Asn Val Asp Thr Cys Ala Ser Thr

165 170 175

Cys Ala Ser Thr Cys Ala Ser Thr Cys Ala Ser Thr Cys Ala Ser Thr

180 185 190

Cys Ala Ser Thr Cys Ala Ser Thr Cys Ala Ser Thr Cys Ala Ser Thr

195 200 205

Cys Ala Ser Thr Cys Ala Ser Thr Cys Ala Ser Thr Cys Ala Ser Thr

210 215 220

Gly Ala Ser Thr Gly Ala Ser Thr Cys Ala Asp Thr Asn Val Asp Thr

225 230 235 240

Cys Ala Ser Thr Cys Ala Asp Thr Asn Val Asp Thr Cys Ala Ser Thr

245 250 255

Cys Ala Ser Thr Cys Ala Ser Thr Cys Ala Ser Thr Cys Ala Ser Thr

260 265 270

Gly Ala Ser Thr Cys Ala Asp Thr Asn Val Asp Thr Cys Ala Ser Thr

275 280 285

Cys Ala Asp Thr Asn Val Asp Thr Cys Ala Ser Thr Cys Ala Asp Thr

290 295 300

Asn Val Asp Thr Cys Ala Ser Thr Cys Ala Asp Thr Asn Val Asn Thr

305 310 315 320

Cys Ala Ser Met Cys Ala Asp Thr Asn Val Asp Thr Cys Ala Ser Thr

325 330 335

Cys Ala Asn Thr Cys Ala Ser Thr Glu Tyr Thr Asp Leu Ala Asp Pro

340 345 350

Glu Arg Ile Pro Leu His Ile Met Gln Lys Thr Leu Asn Val Pro Asn

355 360 365

Glu Leu Gln Ala Asp Ile Asp Ala Ile Thr Gln Thr Pro Gln Gly Tyr

370 375 380

Arg Ala Ala Ala His Ile Leu Gln Asn Ile Glu Leu His Gln Ser Ile

385 390 395 400

Lys His Met Leu Glu Asn Pro Arg Ala Phe Lys Pro Ile Leu Phe Asn

405 410 415

Thr Lys Ile Thr Arg Tyr Leu Ser Gln His Ile Pro Pro Gln Asp Thr

420 425 430

Phe Tyr Lys Trp Asn Tyr Tyr Ile Glu Asp Asn Tyr Glu Glu Leu Arg

435 440 445

Ala Ala Thr Glu Ser Ile Tyr Pro Glu Lys Pro Asp Leu Glu Phe Ala

450 455 460

Phe Ile Ile Tyr Asp Val Val Asp Ser Ser Asn Gln Gln Lys Val Asp

465 470 475 480

Glu Phe Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asp Gln Ile Phe Ser Glu Val Ser Ser

485 490 495

Ile Gln Leu Gly Asn Trp Thr Leu Leu Gly Ser Phe Lys Ala Asn Arg

500 505 510

Glu Arg Tyr Asn Tyr Phe Asn Gln Asn Asn Glu Ile Ile Lys Arg Ile

515 520 525

Leu Asp Arg His Glu Glu Asp Leu Lys Ile Gly Lys Glu Ile Leu Arg

530 535 540

Asn Thr Ile Tyr His Lys Lys Ala Lys Asn Ile Gln Glu Thr Gly Pro

545 550 555 560

Asp Ala Pro Gly Leu Ser Ile Tyr Asn Ser Thr Phe His Thr Asp Ser

565 570 575

Gly Ile Lys Gly Leu Leu Ser Phe Lys Glu Leu Lys Asn Leu Glu Lys

580 585 590

Ala Ser Gly Asn Ile Lys Lys Ala Arg Glu Tyr Asp Phe Ile Asp Asp

595 600 605

Cys Glu Glu Lys Ile Lys Gln Leu Leu Ser Lys Glu Asn Leu Thr Pro

610 615 620

Asp Glu Glu Ser Glu Leu Ile Lys Thr Lys Lys Gln Leu Asn Asn Ala

625 630 635 640

Leu Glu Met Leu Asn Val Pro Asp Asp Thr Ile Arg Val Asp Met Trp

645 650 655

Val Asn Asn Asn Asn Lys Leu Glu Lys Glu Ile Leu Tyr Thr Lys Ala

660 665 670

Glu Leu

<210> 2

<211> 183

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид ASFV, E183L (p54) (OUR T88/3)

<400> 2

Met Asp Ser Glu Phe Phe Gln Pro Val Tyr Pro Arg His Tyr Gly Glu

1 5 10 15

Cys Leu Ser Pro Val Thr Pro Pro Ser Phe Phe Ser Thr His Met Tyr

20 25 30

Thr Ile Leu Ile Ala Ile Val Val Leu Val Ile Ile Ile Ile Val Leu

35 40 45

Ile Tyr Leu Phe Ser Ser Arg Lys Lys Lys Ala Ala Ala Ala Ile Glu

50 55 60

Glu Glu Asp Ile Gln Phe Ile Asn Pro Tyr Gln Asp Gln Gln Trp Ala

65 70 75 80

Glu Val Thr Pro Gln Pro Gly Thr Ser Lys Pro Ala Gly Ala Thr Thr

85 90 95

Ala Ser Ala Gly Lys Pro Val Thr Gly Arg Pro Ala Thr Asn Arg Pro

100 105 110

Ala Thr Asn Lys Pro Val Thr Asp Asn Pro Val Thr Asp Arg Leu Val

115 120 125

Met Ala Thr Gly Gly Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ser Ala His

130 135 140

Pro Thr Glu Pro Tyr Thr Thr Val Thr Thr Gln Asn Thr Ala Ser Gln

145 150 155 160

Thr Met Ser Ala Ile Glu Asn Leu Arg Gln Arg Asn Thr Tyr Thr His

165 170 175

Lys Asp Leu Glu Asn Ser Leu

180

<210> 3

<211> 153

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид ASFV, EP153R (Benin 1997/1)

<400> 3

Met Tyr Phe Lys Lys Lys Tyr Ile Gly Leu Ile Asp Lys Asn Cys Glu

1 5 10 15

Lys Lys Ile Leu Asp Asp Ser Ser Thr Ile Lys Ile Cys Tyr Ile Leu

20 25 30

Ile Gly Ile Leu Ile Gly Thr Asn Met Ile Thr Leu Ile Tyr Asn Phe

35 40 45

Ile Phe Trp Asp Asn Tyr Ile Lys Cys Tyr Arg Asn Asn Asp Lys Met

50 55 60

Phe Tyr Cys Pro Asn Asp Trp Val Gly Tyr Asn Asn Ile Cys Tyr Tyr

65 70 75 80

Phe Ser Asn Gly Ser Phe Ser Lys Asn Tyr Thr Ala Ala Ser Asn Phe

85 90 95

Cys Arg Gln Leu Asn Gly Thr Leu Ala Asn Asn Asp Thr Asn Leu Leu

100 105 110

Asn Leu Thr Lys Ile Tyr Asn Asn Gln Ser Met Tyr Trp Val Asn Asn

115 120 125

Thr Val Ile Leu Arg Gly Asp Asn Lys Tyr Ser Gln Lys Val Asn Tyr

130 135 140

Thr Asp Leu Leu Phe Ile Cys Gly Lys

145 150

<210> 4

<211> 646

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид ASFV, B646L (OUR T88/3)

<400> 4

Met Ala Ser Gly Gly Ala Phe Cys Leu Ile Ala Asn Asp Gly Lys Ala

1 5 10 15

Asp Lys Ile Ile Leu Ala Gln Asp Leu Leu Asn Ser Arg Ile Ser Asn

20 25 30

Ile Lys Asn Val Asn Lys Ser Tyr Gly Lys Pro Asp Pro Glu Pro Thr

35 40 45

Leu Ser Gln Ile Glu Glu Thr His Leu Val His Phe Asn Ala His Phe

50 55 60

Lys Pro Tyr Val Pro Val Gly Phe Glu Tyr Asn Lys Val Arg Pro His

65 70 75 80

Thr Gly Thr Pro Thr Leu Gly Asn Lys Leu Thr Phe Gly Ile Pro Gln

85 90 95

Tyr Gly Asp Phe Phe His Asp Met Val Gly His His Ile Leu Gly Ala

100 105 110

Cys His Ser Ser Trp Gln Asp Ala Pro Ile Gln Gly Thr Ala Gln Met

115 120 125

Gly Ala His Gly Gln Leu Gln Thr Phe Pro Arg Asn Gly Tyr Asp Trp

130 135 140

Asp Asn Gln Thr Pro Leu Glu Gly Ala Val Tyr Thr Leu Val Asp Pro

145 150 155 160

Phe Gly Arg Pro Ile Val Pro Gly Thr Lys Asn Ala Tyr Arg Asn Leu

165 170 175

Val Tyr Tyr Cys Glu Tyr Pro Gly Glu Arg Leu Tyr Glu Asn Val Arg

180 185 190

Phe Asp Val Asn Gly Asn Ser Leu Asp Glu Tyr Ser Ser Asp Val Thr

195 200 205

Thr Leu Val Arg Lys Phe Cys Ile Pro Gly Asp Lys Met Thr Gly Tyr

210 215 220

Lys His Leu Val Gly Gln Glu Val Ser Val Glu Gly Thr Ser Gly Pro

225 230 235 240

Leu Leu Cys Asn Ile His Asp Leu His Lys Pro His Gln Ser Lys Pro

245 250 255

Ile Leu Thr Asp Glu Asn Asp Thr Gln Arg Thr Cys Ser His Thr Asn

260 265 270

Pro Lys Phe Leu Ser Gln His Phe Pro Glu Asn Ser His Asn Ile Gln

275 280 285

Thr Ala Gly Lys Gln Asp Ile Thr Pro Ile Thr Asp Ala Thr Tyr Leu

290 295 300

Asp Ile Arg Arg Asn Val His Tyr Ser Cys Asn Gly Pro Gln Thr Pro

305 310 315 320

Lys Tyr Tyr Gln Pro Pro Leu Ala Leu Trp Ile Lys Leu Arg Phe Trp

325 330 335

Phe Asn Glu Asn Val Asn Leu Ala Ile Pro Ser Val Ser Ile Pro Phe

340 345 350

Gly Glu Arg Phe Ile Thr Ile Lys Leu Ala Ser Gln Lys Asp Leu Val

355 360 365

Asn Glu Phe Pro Gly Leu Phe Ile Arg Gln Ser Arg Phe Ile Pro Gly

370 375 380

Arg Pro Ser Arg Arg Asn Ile Arg Phe Lys Pro Trp Phe Ile Pro Gly

385 390 395 400

Val Ile Asn Glu Ile Ser Leu Thr Asn Asn Glu Leu Tyr Ile Asn Asn

405 410 415

Leu Phe Val Thr Pro Glu Ile His Asn Leu Phe Val Lys Arg Val Arg

420 425 430

Phe Ser Leu Ile Arg Val His Lys Thr Gln Val Thr His Thr Asn Asn

435 440 445

Asn His His Asp Glu Lys Leu Met Ser Ala Leu Lys Trp Pro Ile Glu

450 455 460

Tyr Met Phe Ile Gly Leu Lys Pro Thr Trp Asn Ile Ser Asp Gln Asn

465 470 475 480

Pro His Gln His Arg Asp Trp His Lys Phe Gly His Val Val Asn Ala

485 490 495

Ile Met Gln Pro Thr His His Ala Glu Ile Ser Phe Gln Asp Arg Asp

500 505 510

Thr Ala Leu Pro Asp Ala Cys Ser Ser Ile Ser Asp Ile Ser Pro Val

515 520 525

Thr Tyr Pro Ile Thr Leu Pro Ile Ile Lys Asn Ile Ser Val Thr Ala

530 535 540

His Gly Ile Asn Leu Ile Asp Lys Phe Pro Ser Lys Phe Cys Ser Ser

545 550 555 560

Tyr Ile Pro Phe His Tyr Gly Gly Asn Ala Ile Lys Thr Pro Asp Asp

565 570 575

Pro Gly Ala Met Met Ile Thr Phe Ala Leu Lys Pro Arg Glu Glu Tyr

580 585 590

Gln Pro Ser Gly His Ile Asn Val Ser Arg Ala Arg Glu Phe Tyr Ile

595 600 605

Ser Trp Asp Thr Asp Tyr Val Gly Ser Ile Thr Thr Ala Asp Leu Val

610 615 620

Val Ser Ala Ser Ala Ile Asn Phe Leu Leu Leu Gln Asn Gly Ser Ala

625 630 635 640

Val Leu Arg Tyr Ser Thr

645

<210> 5

<211> 194

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид ASFV, CP204L (p30) (OUR T88/3)

<400> 5

Met Asp Phe Ile Leu Asn Ile Ser Met Lys Met Glu Val Ile Phe Lys

1 5 10 15

Thr Asp Leu Arg Ser Ser Ser Gln Val Val Phe His Ala Gly Ser Leu

20 25 30

Tyr Asn Trp Phe Ser Val Glu Ile Ile Asn Ser Gly Arg Ile Val Thr

35 40 45

Thr Ala Ile Lys Thr Leu Leu Ser Thr Val Lys Tyr Asp Ile Val Lys

50 55 60

Ser Ala His Ile Tyr Ala Gly Gln Gly Tyr Thr Glu His Gln Ala Gln

65 70 75 80

Glu Glu Trp Asn Met Ile Leu His Val Leu Phe Glu Glu Glu Thr Glu

85 90 95

Ser Ser Ala Ser Ser Glu Ser Ile His Glu Lys Asn Asp Asn Glu Thr

100 105 110

Asn Glu Cys Ala Ser Ser Phe Glu Thr Leu Phe Glu Gln Glu Pro Ser

115 120 125

Ser Glu Glu Pro Lys Asp Ser Lys Leu Tyr Met Leu Ala Gln Lys Thr

130 135 140

Val Gln His Ile Glu Gln Tyr Gly Lys Ala Pro Asp Phe Asn Lys Val

145 150 155 160

Ile Arg Ala His Asn Phe Ile Gln Thr Ile His Gly Thr Pro Leu Lys

165 170 175

Glu Glu Glu Lys Glu Val Val Arg Leu Met Val Ile Lys Leu Leu Lys

180 185 190

Lys Lys

<210> 6

<211> 199

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид ASFV, E199L (OUR T88/3)

<400> 6

Met Ser Cys Met Pro Val Ser Thr Lys Cys Asn Asp Ile Trp Val Asp

1 5 10 15

Phe Ser Cys Thr Gly Pro Ser Ile Ser Glu Leu Gln Lys Lys Glu Pro

20 25 30

Lys Ala Trp Ala Ala Ile Leu Arg Ser His Thr Asn Gln Gln Thr Ala

35 40 45

Glu Asp Asp Asn Ile Ile Gly Ser Ile Cys Asp Lys Arg Gly Leu Cys

50 55 60

Ser Lys Asp Glu Tyr Ala Tyr Ser Gln Tyr Cys Ala Cys Val Asn Ser

65 70 75 80

Gly Thr Leu Trp Ala Glu Cys Ala Phe Ala Pro Cys Asn Gly Asn Lys

85 90 95

Asn Ala Tyr Lys Thr Thr Glu Gln Arg Asn Ile Leu Thr Asn Lys Gln

100 105 110

Cys Pro Ser Gly Leu Thr Ile Cys Gln Asn Ile Ala Glu Tyr Arg Gly

115 120 125

Ser Gly Asn Ile Ser Asp Leu Tyr Gln Asn Phe Asn Cys Asn Ser Val

130 135 140

Ile Asn Thr Phe Leu Ile Asn Val Met Asn His Pro Phe Leu Thr Leu

145 150 155 160

Ile Leu Ile Ile Leu Ile Leu Ile Ile Ile Tyr Arg Leu Met Pro Ser

165 170 175

Ser Gly Gly Lys His Asn Asp Asp Lys Leu Pro Pro Pro Ser Leu Ile

180 185 190

Phe Ser Asn Leu Asn Asn Phe

195

<210> 7

<211> 317

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид ASFV, F317L (OUR T88/3)

<400> 7

Met Val Glu Thr Gln Met Asp Lys Leu Gly Phe Leu Leu Asn His Ile

1 5 10 15

Gly Lys Gln Val Thr Thr Lys Val Leu Ser Asn Ala His Ile Thr Gln

20 25 30

Thr Met Lys Glu Ile Ile Leu Glu Asn His Gly Val Asp Gly Gly Ala

35 40 45

Ala Lys Asn Val Ser Lys Gly Lys Ser Ser Pro Lys Glu Lys Lys His

50 55 60

Trp Thr Glu Phe Glu Ser Trp Glu Gln Leu Ser Lys Ser Lys Arg Ser

65 70 75 80

Phe Lys Glu Tyr Trp Ala Glu Arg Asn Glu Ile Val Asn Thr Leu Leu

85 90 95

Leu Asn Trp Asp Asn Val Arg Gly Ala Ile Lys Lys Phe Leu Asp Asp

100 105 110

Asp Arg Glu Trp Cys Gly Arg Ile Asn Met Ile Asn Gly Val Pro Glu

115 120 125

Ile Val Glu Ile Ile Pro Ser Pro Tyr Arg Ala Gly Glu Asn Ile Tyr

130 135 140

Phe Gly Ser Glu Ala Met Met Pro Ala Asp Ile Tyr Ser Arg Val Ala

145 150 155 160

Asn Lys Pro Ala Met Phe Val Phe His Thr His Pro Asn Leu Gly Ser

165 170 175

Cys Cys Gly Gly Met Pro Ser Ile Cys Asp Ile Ser Thr Thr Leu Arg

180 185 190

Tyr Leu Leu Met Gly Trp Thr Ala Gly His Leu Ile Ile Ser Ser Asn

195 200 205

Gln Val Gly Met Leu Thr Val Asp Lys Arg Ile Ile Val Asp Leu Trp

210 215 220

Ala Asn Glu Asn Pro Arg Trp Leu Met Ala Gln Lys Ile Leu Asp Ile

225 230 235 240

Phe Met Met Leu Thr Ser Arg Arg Ser Leu Val Asn Pro Trp Thr Leu

245 250 255

Arg Asp Leu Lys Lys Ile Leu Gln Asp Tyr Gly Ile Glu Tyr Ile Ile

260 265 270

Phe Pro Ser Asn Asp Phe Phe Ile Tyr Glu Asp Glu Arg Leu Leu Met

275 280 285

Phe Ser Lys Lys Trp Thr Asn Phe Phe Thr Leu His Glu Leu Leu Asp

290 295 300

Asp Leu Glu Thr Ile Glu Thr Lys Ala Ser Ser Thr Thr

305 310 315

<210> 8

<211> 498

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид ASFV, MGF505-5R (OUR T88/3)

<400> 8

Met Phe Ser Leu Gln Glu Ile Cys Arg Lys Asn Ile Tyr Phe Leu Pro

1 5 10 15

Asp Trp Leu Ser Glu His Val Ile Gln Arg Leu Gly Leu Tyr Trp Glu

20 25 30

Lys His Gly Ser Leu Gln Arg Ile Gly Asp Asp Tyr Val Leu Ile Gln

35 40 45

Gln Asp Leu Ile Ile Pro Ile Asn Glu Ala Leu Arg Met Ala Gly Glu

50 55 60

Glu Gly Asn Asp Glu Val Val Gln Leu Leu Leu Leu Trp Glu Gly Asn

65 70 75 80

Ile His Tyr Ala Ile Ile Gly Ala Leu Glu Ser Asp His Tyr Ser Leu

85 90 95

Ile Arg Lys Leu Tyr Asp Gln Ile Gly Asp Cys His Asp Ile Leu Pro

100 105 110

Leu Ile Gln Asp Pro Lys Ile Phe Glu Lys Cys His Glu Leu Asp Lys

115 120 125

Phe Cys Asn Ile Leu Cys Leu Val Leu His Ala Val Lys Asn Asp Met

130 135 140

Leu Cys Ile Leu Gln Glu Tyr Lys Met His Leu Ser Gly Glu Asp Ile

145 150 155 160

Gln Val Val Phe Glu Thr Ala Cys Arg Ser Gln Lys Asn Asp Ile Val

165 170 175

Ser Trp Met Gly Gln Asn Ile Ala Ile Tyr Asn Ser Gly Val Ile Phe

180 185 190

Asp Ile Ala Phe Asp Lys Met Asn Val Ser Leu Leu Ser Ile Gly Tyr

195 200 205

Thr Leu Leu Phe Asn His His Ile Asn Asn Thr Asn Glu Asn Ile Asn

210 215 220

Ser Leu Leu Thr Gln His Leu Glu Trp Ala Ala Gly Met Gly Leu Leu

225 230 235 240

His Phe Met Leu Glu Thr Leu Lys Tyr Gly Gly Asp Val Thr Ile Ile

245 250 255

Val Leu Ser Glu Ala Val Lys Tyr Asp His Arg Lys Ile Leu Asp Tyr

260 265 270

Phe Leu Arg Arg Lys Asn Leu Tyr Gln Glu Asp Leu Glu Glu Leu Leu

275 280 285

Leu Leu Ala Ile Arg Ala Asp Cys Ser Lys Lys Thr Leu Asn Leu Leu

290 295 300

Leu Ser Tyr Leu Asn Tyr Ser Ile Asn Asn Ile Arg Lys Lys Ile Leu

305 310 315 320

Gln Cys Val Lys Glu Tyr Glu Thr Thr Val Ile Ile Lys Ile Leu Trp

325 330 335

Lys Arg Lys Ile Asn Leu Ile Glu Pro Ile Leu Ala Asp Phe Ile Gly

340 345 350

Tyr His Ser Tyr Thr Tyr Met Val Asp Phe Met Arg Glu Phe Ser Ile

355 360 365

His Pro Glu Lys Met Ile Lys Met Ala Ala Arg Glu Ser Arg Glu Asp

370 375 380

Leu Ile Ile Lys Phe Ser Lys Lys Val Cys Lys Glu Pro Lys Asp Arg

385 390 395 400

Leu His Tyr Leu Lys Ser Leu Val Tyr Thr Met Arg His Lys Glu Gly

405 410 415

Lys Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Ile His Asn Leu Tyr Lys Ala Cys His

420 425 430

Leu Glu Ser Lys Glu Met Phe Asn Leu Ala Arg Phe Tyr Ala Arg His

435 440 445

Asn Ala Val Ile Gln Phe Lys Ser Ile Cys His Asp Leu Ser Lys Leu

450 455 460

Asn Ile Asn Ile Lys Asn Leu Leu Leu Glu Cys Leu Gly Ile Ala Ile

465 470 475 480

Lys Lys Asn Tyr Phe Gln Leu Ile Lys Thr Ile Glu Thr Asp Met Arg

485 490 495

Tyr Glu

<210> 9

<211> 2025

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая последовательность, кодирующая

полипептид ASFV B602L (OUR T88/3)

<400> 9

atggcagaat ttaatattga tgagcttctc aaaaacgtat tggaggatcc ctctactgaa 60

atatccgaag aaacgcttaa acagctttat caaaggacga acccttacaa acagttcaaa 120

aatgatagca gggtggcctt ttgctctttt acaaatttgc gggagcagta tattcgacgt 180

cttataatga ctagctttat tggatatgtc ttcaaagctc tgcaggaatg gatgccttcc 240

tattcaaaac ctacccacac gaccaaaact cttctcagtg agctaataac gttagttgat 300

actttgaaac aggaaactaa tgatgttccc tctgaatcgg tagtaaatac aattttatct 360

atagcggata gctgcaaaac ccagacgcag aaaagcaagg aagctaaaac aacgatcgat 420

agctttttac gagaacattt tgtgtttgat cctaatcttc atgctcaaag tgcgtatact 480

tgtgcaagca cttgtgcaga taccaatgta gacacctgtg caagcacttg tgcaagcact 540

tgtgcaagca cttgtgcaag cacttgtgca agcacttgtg caagcacttg tgcaagcact 600

tgtgcaagca cttgtgcaag cacttgtgca agcacttgtg caagcacttg tgcaagcact 660

tgtgcaagca caggtgcaag cacaggtgca agcacttgtg cagataccaa tgtagacacc 720

tgtgcaagca cttgtgcaga taccaatgta gacacctgtg caagcacttg tgcaagcact 780

tgtgcaagca cttgtgcaag cacttgtgca agcacaggtg caagcacttg tgcagatacc 840

aatgtagaca cctgtgcaag cacttgtgca gataccaatg tagacacctg tgcaagcact 900

tgtgcagata ccaatgtaga cacctgtgca agcacttgtg cagataccaa tgtaaacact 960

tgtgcaagca tgtgtgcaga taccaatgta gacacctgtg caagcacctg tgcaaacacc 1020

tgtgcaagca cagaatacac cgatttagca gatcctgagc gcatcccttt acacatcatg 1080

caaaaaacat taaatgtgcc taatgagctt caggccgata ttgatgcaat tacccaaacc 1140

ccacagggct atagggcagc agcccacata ttacaaaata tagaacttca tcaaagcatt 1200

aaacatatgc ttgaaaatcc gagggcgttt aaacccattc tctttaacac aaaaattact 1260

agatatcttt cgcagcatat tccacctcag gatacttttt ataagtggaa ttattacatt 1320

gaggataatt acgaagagtt gcgggccgct acggaaagca tctacccaga aaagcccgac 1380

ctagagtttg ccttcattat ttatgatgtg gtggatagca gcaaccaaca aaaggttgat 1440

gaattttatt ataaatataa agaccagatt ttctcagagg tttcatccat tcaattaggc 1500

aactggacac tcctgggaag ctttaaggcc aacagagagc gctacaatta ttttaatcaa 1560

aataatgaaa taataaaacg gattttggac cgtcatgagg aagacctaaa gataggaaaa 1620

gagattctac gaaataccat ttaccacaaa aaagcaaaaa atatacaaga aaccggcccg 1680

gatgctccgg ggctctccat ctataattca acctttcaca cggatagcgg gattaaggga 1740

ctgctttcct ttaaggagct aaaaaaccta gaaaaagcat ctggaaatat caaaaaagct 1800

cgagagtatg attttataga cgactgcgaa gaaaaaatta agcaactgct tagtaaagaa 1860

aatttaaccc ccgatgaaga aagcgagctg ataaaaacaa aaaaacagtt aaataatgcg 1920

cttgaaatgc tcaatgtgcc tgatgatacg atacgggtag atatgtgggt caacaataat 1980

aataaactcg aaaaagaaat tttatataca aaagcagaat tgtaa 2025

<210> 10

<211> 552

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая последовательность, кодирующая E183L (p54)

(OUR T88/3)

<400> 10

atggattctg aattttttca accggtttat ccgcggcatt atggtgagtg tttgtcacca 60

gtcaccccac caagcttctt ctccacacat atgtatacta ttctcattgc tatcgtggtc 120

ttagtcatta ttatcatcgt tctaatctat ctattctctt caagaaagaa aaaagctgct 180

gccgctattg aggaggaaga tatacagttt ataaatcctt atcaagatca gcaatgggca 240

gaagtcactc cacaaccagg tacctctaaa ccggctggag cgactacagc aagtgcaggc 300

aaaccagtca cgggcagacc ggcaacaaac agaccagcaa caaacaaacc agtcacggac 360

aacccagtta cggacagact agtcatggca actggcgggc cagcggccgc acctgcggcc 420

gcgagtgctc atccgactga gccttacacg acagtcacta ctcagaacac tgcttcacaa 480

acaatgtcgg ctattgaaaa tttacgacaa agaaacacct atacgcataa agacctagaa 540

aactccttgt aa 552

<210> 11

<211> 462

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая последовательность, кодирующая EP153R

(Benin 1997/1)

<400> 11

atgtatttta agaaaaaata catcggtctt attgataaga actgtgaaaa aaaaatatta 60

gatgattcta gtacaataaa aatttgttac atattaattg gaatattgat tggaactaat 120

atgataactc ttatttataa tttcatattc tgggataatt atataaaatg ttaccgaaat 180

aatgataaaa tgttttactg tcctaatgat tgggttggat ataataatat ttgttactat 240

tttagtaatg gtagtttttc taaaaattat acagctgcta gtaatttttg tagacaatta 300

aatggtacac ttgctaataa tgatactaat ttattaaatc taactaaaat atataataat 360

caatctatgt attgggttaa caatacggta atattacgtg gtgataataa atatagtcaa 420

aaagttaact atacagattt attatttatt tgtggtaaat aa 462

<210> 12

<211> 1941

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая последовательность, кодирующая B646L (OUR T88/3)

<400> 12

atggcatcag gaggagcttt ttgtcttatt gctaacgatg ggaaggccga caagattata 60

ttggcccaag acttgcttaa tagcaggatt tctaacatta aaaatgtgaa caaaagttat 120

gggaaacccg accccgaacc cactttgagt caaatcgaag aaacacattt ggttcatttt 180

aatgcgcatt ttaagcctta tgttccagta gggtttgaat acaataaagt acgcccgcat 240

acgggtaccc ccaccttggg aaacaagctt acctttggta ttccccagta cggagacttt 300

ttccatgata tggtgggcca ccatatattg ggtgcatgtc attcgtcctg gcaggatgct 360

ccgattcagg gcacggccca gatgggggcc catggtcagc ttcaaacgtt tcctcgcaac 420

ggatatgact gggacaacca aacaccttta gagggcgccg tttacacgct tgtagatccc 480

tttggaagac ctattgtacc cggcacaaag aatgcgtacc gaaacttggt ttactactgc 540

gaataccccg gagaacgact ttatgaaaac gtaagattcg atgtaaatgg aaattccctg 600

gacgaatata gttcggatgt cacaacgctt gtgcgcaaat tttgcatccc aggggataaa 660

atgactggat ataagcactt ggtcggccag gaggtatcgg tggagggaac tagtggccct 720

ctcctatgca acattcatga tttgcacaag ccgcaccaaa gcaaacctat tcttaccgat 780

gaaaatgata cgcagcgaac gtgcagccat accaacccga aattcctttc acaacatttt 840

cccgagaact ctcacaatat ccaaacagca ggtaaacaag atattactcc tattacggac 900

gcaacgtatc tggacataag acgtaatgtt cattacagct gtaatggacc tcaaacccct 960

aaatactatc agccccctct tgcgctctgg attaagctgc gcttttggtt taacgagaac 1020

gtgaaccttg ctattccctc ggtatccatt cccttcggcg agcgctttat caccataaag 1080

cttgcatcgc aaaaggattt ggtgaatgaa tttcctggac tttttatacg ccagtcgcgt 1140

tttatacctg gacgccccag tagacgcaat atacgcttta aaccatggtt tatcccagga 1200

gtcattaatg aaatctcgct cacgaataat gaactttaca tcaataacct gtttgtaacc 1260

cctgaaatac acaacctttt tgtaaaacgc gttcgatttt ccctgatacg tgtccataaa 1320

acgcaggtga cccacaccaa caataaccac cacgatgaaa aactaatgtc tgctcttaaa 1380

tggcccattg aatatatgtt tataggatta aaacctacct ggaacatctc cgatcaaaat 1440

cctcatcaac accgagattg gcacaagttc ggacatgttg ttaacgccat tatgcagcct 1500

actcaccacg cagagataag ctttcaggat agagatacag ctcttccaga cgcatgttca 1560

tctatatcgg atattagccc cgttacgtat ccgatcacat tacctattat taaaaacatt 1620

tccgtaactg ctcatggtat caatcttatc gataagtttc catcaaagtt ctgcagctct 1680

tacataccct tccactacgg aggcaatgca attaaaaccc ccgatgatcc gggtgcgatg 1740

atgattacct ttgctttgaa gccacgggag gaataccaac ccagtggtca tattaacgta 1800

tccagagcaa gagaatttta tattagttgg gacacggatt acgtggggtc tatcactacg 1860

gctgatcttg tggtatcggc atctgctatt aactttcttc ttcttcagaa cggttcagct 1920

gtgctgcgtt acagtaccta a 1941

<210> 13

<211> 585

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая последовательность, кодирующая CP204L (p30)

(OUR T88/3)

<400> 13

atggatttta ttttaaatat atccatgaaa atggaggtca tcttcaaaac ggatttaaga 60

tcatcttcac aagttgtgtt tcatgcgggt agcttgtata attggttttc tgttgagatt 120

atcaatagcg gtagaattgt tacgaccgct ataaaaacat tgctcagtac tgttaagtat 180

gatattgtga aatctgctca tatatatgca gggcaagggt atactgaaca tcaggctcaa 240

gaagaatgga atatgattct gcatgtgctg tttgaagagg agacagaatc ctcagcatca 300

tcggaaagca ttcatgaaaa aaatgataat gaaaccaatg aatgcgcatc ctcctttgaa 360

acattgtttg agcaagagcc ctcatcagag gaacctaaag actccaagct gtatatgctt 420

gcacaaaaga ctgtgcaaca tattgaacaa tatggaaagg cacctgattt taacaaggtt 480

attagagcac ataactttat tcaaaccatt catggaaccc ctctaaagga agaagaaaaa 540

gaggtggtaa gactcatggt cattaaactt ttaaaaaaaa aataa 585

<210> 14

<211> 600

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая последовательность, кодирующая E199L (OUR T88/3)

<400> 14

atgtcttgca tgccagtttc cacgaaatgc aatgatattt gggtcgactt tagctgtaca 60

ggcccttcga tttccgagct gcaaaaaaag gagcccaagg cctgggccgc tattttacgc 120

tcgcatacaa atcaacaaac ggcggaggat gacaatatta ttgggagcat atgcgataaa 180

cggggattgt gctcaaagga tgagtatgcg tatagccagt attgtgcctg tgtgaactcc 240

ggcaccctat gggctgaatg tgcgtttgct ccgtgtaatg gaaataaaaa tgcctataaa 300

acaacggagc aaagaaatat tttgaccaac aagcagtgcc cctccggact caccatatgt 360

cagaacattg cagaatacag aggctcgggc aatatttccg acctatacca aaatttcaac 420

tgcaacagcg ttataaatac gtttttaatt aatgtgatga atcatccttt tttaaccctt 480

atattaatca ttttgattct tataattatt taccgtttga tgccttccag tgggggtaaa 540

cacaatgacg ataagttgcc ccctccatct cttatttttt caaacctaaa caatttttaa 600

<210> 15

<211> 954

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая последовательность, кодирующая F317L (OUR T88/3)

<400> 15

atggttgaga cacaaatgga caaacttggt tttctgctaa atcacatagg taaacaggtt 60

accactaagg tgcttagcaa tgcccatata actcaaacga tgaaggagat tattttggaa 120

aatcatggtg tagatggtgg agccgcaaaa aatgtttcaa aagggaagtc ttccccaaaa 180

gaaaaaaaac attggaccga gttcgaatcc tgggaacagc tcagcaagtc taaaagaagt 240

ttcaaggaat actgggcgga gcgtaatgag attgtgaaca ctctgttgct taattgggac 300

aatgttcggg gtgccatcaa aaaatttttg gacgatgacc gtgaatggtg cggccgcatt 360

aatatgataa acggtgtacc cgagatagtg gaaatcattc caagccccta tagggcagga 420

gagaacattt attttggcag cgaggctatg atgcctgctg atatttatag cagggtggcc 480

aacaagcctg ctatgtttgt gtttcacacg catcctaatt tgggttcatg ttgtggagga 540

atgccttcca tatgtgacat ttctacaacg ctgcgttatc tacttatggg gtggaccgcc 600

gggcatctaa tcatttcttc gaatcaagta ggaatgctca cggttgataa gagaattatt 660

gttgatttgt gggccaatga gaatccgcgc tggctcatgg cgcaaaaaat attagatatt 720

tttatgatgc tcacttcgcg tagaagcctg gtaaatccct ggaccctgag agacctaaaa 780

aaaatattac aagactatgg tattgagtat atcatttttc cttcgaatga cttttttatt 840

tatgaagacg aacgtctttt aatgttttca aaaaaatgga ccaacttttt tacgttacat 900

gagttattgg atgacctcga aactattgag acaaaggcat cgtccacaac atag 954

<210> 16

<211> 1497

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая последовательность, кодирующая MGF505-5R

(OUR T88/3)

<400> 16

atgttctccc tccaggagat ctgtcgaaag aacatctact ttctacctga ctggctcagt 60

gagcatgtga ttcagcgact aggtctgtac tgggaaaaac atggttctct tcagcgaatc 120

ggagacgact atgtacttat acaacaggat ctcatcatcc ccatcaatga agctctaaga 180

atggcagggg aggaggggaa tgatgaggtg gtacaactcc tattactatg ggagggaaac 240

attcattatg ccatcatagg agctttggag agtgaccatt atagcctaat acgtaagctc 300

tatgaccaaa tcggagactg tcacgacatc cttcccttaa ttcaagaccc aaaaatcttt 360

gaaaaatgcc atgaattaga taaattttgt aacattttat gtctcgtatt acacgccgta 420

aaaaacgata tgctttgcat tcttcaagag tataaaatgc atctaagtgg agaggatatt 480

caagtggtgt ttgaaacagc atgccgttca caaaaaaacg atattgtgtc atggatggga 540

caaaatattg caatatacaa ctccggagtt atttttgata ttgcctttga taagatgaat 600

gtgtccttat tatctatagg gtacacgctt cttttcaatc atcatataaa taatacgaac 660

gaaaatatta attctttatt gacacaacat cttgaatggg ctgccggcat gggccttctt 720

cattttatgc tggaaacttt aaagtatggc ggggatgtaa cgataatagt tttgtctgag 780

gccgtaaaat atgaccacag aaagatttta gattattttc tccgtcgaaa aaacttgtac 840

caagaagatc ttgaagaact attattgttg gcgatacgtg cagattgttc taaaaagacc 900

ttaaacttgt tattatctta cttaaactat tccataaaca atatccgtaa aaaaatatta 960

caatgtgtaa aagaatatga aacgaccgtt attataaaaa ttctatggaa aagaaagata 1020

aatctgatag agcccatttt ggcagacttt ataggatatc atagctatac ctatatggta 1080

gattttatgc gcgagttttc catccatccg gaaaaaatga tcaaaatggc tgcgcgagaa 1140

tcgagggagg acttaatcat aaaattttcc aaaaaagttt gcaaagagcc taaagataga 1200

cttcactatc tcaaaagctt agtgtatact atgcgacata aagaaggcaa acaactgtta 1260

atttatacaa tccataactt atacaaagct tgtcatctag agagtaaaga aatgtttaat 1320

ttggcacgat tttatgcacg gcataatgca gtgatccagt tcaaatcgat ttgtcacgat 1380

ctctccaagc tgaatattaa tatcaaaaac ttgttgttag aatgtttagg tattgctatt 1440

aaaaaaaatt actttcaact tatcaaaaca atagaaacgg atatgcgtta tgagtaa 1497

<210> 17

<211> 158

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид ASFV, 17 EP153R (Генотип II)

<400> 17

Met Phe Ser Asn Lys Lys Tyr Ile Gly Leu Ile Asn Lys Lys Glu Gly

1 5 10 15

Leu Lys Lys Lys Ile Asp Asp Tyr Ser Ile Leu Ile Ile Gly Ile Leu

20 25 30

Ile Gly Thr Asn Ile Leu Ser Leu Ile Ile Asn Ile Ile Gly Glu Ile

35 40 45

Asn Lys Pro Ile Cys Tyr Gln Asn Asp Asp Lys Ile Phe Tyr Cys Pro

50 55 60

Lys Asp Trp Val Gly Tyr Asn Asn Val Cys Tyr Tyr Phe Gly Asn Glu

65 70 75 80

Glu Lys Asn Tyr Asn Asn Ala Ser Asn Tyr Cys Lys Gln Leu Asn Ser

85 90 95

Thr Leu Thr Asn Asn Asn Thr Ile Leu Val Asn Leu Thr Lys Thr Leu

100 105 110

Asn Leu Thr Lys Thr Tyr Asn His Glu Ser Asn Tyr Trp Val Asn Tyr

115 120 125

Ser Leu Ile Lys Asn Glu Ser Val Leu Leu Arg Asp Ser Gly Tyr Tyr

130 135 140

Lys Lys Gln Lys His Val Ser Leu Leu Tyr Ile Cys Ser Lys

145 150 155

<210> 18

<211> 20

<212> Белок

<213> Вирус ящура

<400> 18

Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser

1 5 10 15

Asn Pro Gly Pro

20

<210> 19

<211> 20

<212> Белок

<213> Вирус ящура

<400> 19

Arg Ala Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu

1 5 10 15

Asn Pro Gly Pro

20

<---

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и ветеринарии. Предложена вакцина на основе субъединиц вируса африканской чумы свиней (ВАЧС), которая содержит: (i) один или более рекомбинантных полинуклеотидов, которые кодируют полипептиды, приведенные в SEQ ID NO: 1, 2 и 3, или их иммуногенные фрагменты; или вариант, на по меньшей мере 90% идентичный одной из последовательностей SEQ ID NO: 1, 2 или 3; при этом общее количество разных полипептидов ВАЧС, кодируемых одним или более рекомбинантными полинуклеотидами, составляет 10 или менее; или (ii) рекомбинантные полипептиды, приведенные в SEQ ID NO: 1, 2 и 3, или их иммуногенные фрагменты; или вариант, на по меньшей мере 90% идентичный одной из последовательностей SEQ ID NO: 1, 2 и 3; при этом вакцина содержит 10 или менее разных полипептидов ВАЧС. Предложены: способ лечения и/или профилактики африканской чумы свиней у субъекта, представляющего собой свинью, включающий введение субъекту, представляющему собой свинью, терапевтически эффективного количества заявленной вакцины; применение рекомбинантного полинуклеотида или рекомбинантного полипептида в получении лекарственного средства для лечения и/или профилактики африканской чумы свиней у субъекта, представляющего собой свинью. Использование вакцины по изобретению позволяет вызывать защиту от заражения вирусом АЧС. 4 н. и 12 з.п. ф-лы, 4 ил., 2 табл., 1 пр.

1. Вакцина на основе субъединиц вируса африканской чумы свиней (ВАЧС), содержащая эффективное количество:

(i) одного или более рекомбинантных полинуклеотидов, которые кодируют полипептиды, приведенные в:

(а) SEQ ID NO: 1 или вариант с по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с ней,

(b) SEQ ID NO: 2 или вариант с по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с ней, и

(с) SEQ ID NO: 3 или вариант с по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с ней; или их иммуногенные фрагменты; причем общее количество разных полипептидов ВАЧС, кодируемых одним или более рекомбинантными полинуклеотидами, равно 10 или менее; или

(ii) рекомбинантные полипептиды, приведенные в

(а) SEQ ID NO: 1 или вариант с по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с ней,

(b) SEQ ID NO: 2 или вариант с по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с ней, и

(с) SEQ ID NO: 3 или вариант с по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с ней; или их иммуногенные фрагменты; причем вакцина содержит 10 или менее разных полипептидов ВАЧС.

2. Вакцина по п. 1, в которой количество разных полипептидов ВАЧС, кодируемых одним или более рекомбинантными полинуклеотидами, составляет 9 или менее, 8 или менее, 7 или менее, или 6 или менее; или где вакцина содержит 9 или менее, 8 или менее, 7 или менее или 6 или менее полипептидов ВАЧС.

3. Вакцина по п. 1 или 2, содержащая:

(i) один или более дополнительных рекомбинантных полинуклеотидов, кодирующих полипептид ВАЧС, выбранный из SEQ ID NO: 4-8, или их иммуногенные фрагменты, или вариант, на по меньшей мере 90% идентичный одной из последовательностей SEQ ID NO: 4-8, или его иммуногенный фрагмент; или

(ii) один или более дополнительных полипептидов, выбранных из SEQ ID NO: 4-8, или их иммуногенные фрагменты; или вариант, на по меньшей мере 90% идентичный одной из последовательностей SEQ ID NO: 4-8, или его иммуногенный фрагмент.

4. Вакцина по любому из пп. 1-3, содержащая:

(а) рекомбинантный(ые) полинуклеотид(ы), который(ые) кодирует(ют) полипептиды, содержащие SEQ ID NO: 1-8, или их иммуногенные фрагменты, или вариант, на по меньшей мере 90% идентичный последовательностям SEQ ID NO: 1-8, или его иммуногенный фрагмент; или рекомбинантные полипептиды, содержащие SEQ ID NO: 1-8, или их иммуногенные фрагменты, или варианты, на по меньшей мере 90% идентичные последовательностям SEQ ID NO: 1-8, или их иммуногенные фрагменты;

(b) рекомбинантный(ые) полинуклеотид(ы), который(ые) кодирует(ют) полипептиды, содержащие SEQ ID NO: 1-3 и 6-8, или их иммуногенные фрагменты, или варианты, на по меньшей мере 90% идентичные последовательностям SEQ ID NO: 1-3 и 6-8, или их иммуногенные фрагменты; или рекомбинантные полипептиды, содержащие SEQ ID NO: 1-3 и 6-8, или их иммуногенные фрагменты, или варианты, на по меньшей мере 90% идентичные последовательностям SEQ ID NO: 1-3 и 6-8, или их иммуногенные фрагменты; или

(c) рекомбинантный(ые) полинуклеотид(ы), который(ые) кодирует(ют) полипептиды, содержащие SEQ ID NO: 1-5, или их иммуногенные фрагменты, или варианты, на по меньшей мере 90% идентичные последовательностям SEQ ID NO: 1-5, или их иммуногенные фрагменты; или рекомбинантные полипептиды, содержащие SEQ ID NO: 1-5, или их иммуногенные фрагменты, или варианты, на по меньшей мере 90% идентичные последовательностям SEQ ID NO: 1-5, или их иммуногенные фрагменты.

5. Вакцина по п. 1, где рекомбинантные полинуклеотиды содержат SEQ ID NO: 9, 10 и 11 или их варианты, идентичные на по меньшей мере 90%.

6. Вакцина по п. 3, где дополнительные полинуклеотиды содержат одну или более последовательностей SEQ ID NO: 12-16 или их варианты, идентичные на по меньшей мере 90%.

7. Вакцина по любому из пп. 1-6, где полинуклеотид присутствует в векторе.

8. Вакцина по п. 7, где вектор выбирают из аденовируса, вектора модифицированного вируса осповакцины Анкара и вектора вируса псевдобешенства.

9. Вакцина по п. 7 или 8, где каждый из рекомбинантных полинуклеотидов содержится в одном и том же векторе.

10. Применение вакцины по любому из пп. 1-9 в качестве лечения и/или профилактики африканской чумы свиней у субъекта, представляющего собой свинью.

11. Способ лечения и/или профилактики африканской чумы свиней у субъекта, представляющего собой свинью, включающий введение субъекту, представляющему собой свинью, терапевтически эффективного количества вакцины по любому из пп. 1-9.

12. Применение рекомбинантного полинуклеотида или рекомбинантного полипептида по любому из пп. 1-9 в получении лекарственного средства для лечения и/или профилактики африканской чумы свиней у субъекта, представляющего собой свинью.

13. Применение или способ по любому из пп. 10-12, где субъектом является домашняя свинья.

14. Применение или способ по любому из пп. 10-13, где вакцину вводят в соответствии с процедурой первичной бустерной вакцинации.

15. Применение или способ по п. 14, где примирующая композиция содержит один или более аденовирусных векторов, и бустерная композиция содержит один или более векторов модифицированного вируса осповакцины Анкара.

16. Применение или способ по любому из пп. 10-15, где вакцину вводят перорально, внутривенно, внутримышечно, подкожно, интраназально или внутрикожно.