Способ регуляции пищеварительных процессов в организме крупного рогатого скота Российский патент 2024 года по МПК A23K10/30 A23K20/174 A23K50/10 

Изобретение относится к области сельского хозяйства и может быть использовано в отрасли животноводства.

В последние годы проведено множество исследований возможности изменения микробного разнообразия рубца и улучшения продуктивных качеств животных, за счет корректировки системы кормления [1, 2].

Продуктивность жвачных животных во многом определяется работой микрофлоры преджелудков, ее численностью и соотношением отдельных видов. Популяции бактерий в рубце жвачных животных также координируют коллективное поведение посредством процесса передачи сигналов «клетка-клетка», опосредованного диффундирующими сигнальными молекулами [3, 4].

Долгое время основная роль в успешном развитии животноводства во всем мире принадлежала кормовым антибиотикам, применение которых в субтерапевтических дозах приводит к развитию антибиотикорезистентности микроорганизмов, что в свою очередь представляет потенциальную угрозу для человека [5].

Это обстоятельство определило интерес к исследованию возможных механизмов подавления QS [6]. При этом ожидаемыми преимуществами новых решений являются минимизация воздействия на естественную микрофлору крупного рогатого скота и повышение продуктивности. В настоящее время для таких целей рассматриваются различные классы веществ: пробиотики, пребиотики, ферменты, органические кислоты, металлы и другие [7]. В то же время значительный интерес вызывают фитохимические вещества (малые молекулы растительного происхождения, вторичные метаболиты растений) [8, 9], которые являются наиболее перспективным объектом исследований вместо кормовых антибиотиков [10] и уже используются в разведении сельскохозяйственных животных [11] и птицы [12]. Известна добавка фитохимических веществ введения которой в рацион жвачных животных приводит к изменению микробиома рубца [13], улучшению переваримости кормов, увеличению среднесуточных привесов [14] и снижению выбросов метана [15]. Исследования показали, что ванилин обладает противомикробным действием против таких микроорганизмов, как дрожжевые грибки, плесень и бактерии. В подтверждение этого соединение (10-40 мМ) показало значения минимальной ингибирующей концентрации (МИК) 15, 75 и 35 мМ для E. coli, Lactobacillus plantarum и Listeria innocua соответственно [16].

Введение в рацион поросят ванилина в составе ароматической композиции способствует повышению аппетита, вследствие чего происходит увеличение суточного потребления корма, в результате, повышается продуктивность [17].

Известен способ улучшения ферментации и снижения концентрации метана в рубце жвачных животных путем введения экстракта травы полыни в дозировке 10,0 г на 1 кг сухого вещества рациона, а также корневищ и корней девясила в рационе. дозировка 6,0 г на 1 кг сухого вещества рациона [18].

В опыте при включении в рацион бройлеров композиции фитохимических соединений при выращивании цыплят-бройлеров, по итогам эксперимента выявлено, что опытная добавка влияет не только на подавление зоопатогенных бактерий, но и на увеличение прироста живой массы на 20,3 % [19].

Известен способ подавления чувство кворума у бактерий посредством композиции на основе фитоэкстрактов [20]. Применение Quercetin Hydrate и Trans-cinnamaldehyde в качестве кормовой добавки способствует ингибированию «quorum sensing» LuxI/LuxR-типа у бактерий [21].

В других опытах ученых при использовании кверцетина происходило ингибирование развития биопленки у Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Streptococcus mutans, Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa, подавляя бактериальную адгезию, пути восприятия кворума и разрушая или изменяя плазматическую мембрану, нарушая работу ионных насосов и синтез нуклеиновых кислот [22].

Анализируя вышеизложенное можно сказать, что фитохимические вещества, в частности, такие как ванилин и кверцетин, являются перспективными соединениями в области кормления сельскохозяйственных животных, они обладают Quorum sensing ингибирующей активностью, проявляют низкий уровень токсичности и при этом разрешены в качестве пищевых добавок. Ввиду этого изучение действия малых молекул растительного происхождения на экосистему рубца КРС представляется практически выгодным для разработки новых подходов к кормлению животных.

В этой связи, задачей является применение фитохимических веществ для регуляции пищеварительных процессов в организме крупного рогатого скота, за счет регулирования микробиологического состава и снижения уровня метана.

Пример

В качестве объекта исследования были использованы следующие фитохимические вещества:

ванилин (ВН) (молярная масса: 152,15 г/моль; производство: Acros Organics, США) – фенольный альдегид с присутствием гидроксильной и эфирной группы, прикрепленные к ароматическому кольцу. Компонент экстракта Vanilla planifolia с выраженными антибиотическими и кворум ингибирующими свойствами [22]; кверцетин (КВ) (молярная масса: 302,24 г/моль; производство: Acros Organics, США) – флавоноидное соединение обладает антиоксидантной, антибактериальной и противопаразитарной активностью [23].

Методы исследования

Эксперимент проводили методом in vitro c помощью установки – инкубатора ANKOM DaisyII (Ankom Technology, NY) (модель искусственного рубца) с рубцовой жидкостью, 48-часовая экспозиция. Рубцовую жидкость, отбирали через хроническую фистулу рубца, через 3 часа после кормления, у бычков казахской белоголовой породы в возрасте 11 месяцев, массой 255±7,0 кг. Перед экспериментом рубцовую жидкость тщательно встряхивали и процеживали через сложенную в 4 слоя стерильную марлю. В качестве кормового субстрата для микроорганизмов рубцовой жидкости опытной и контрольной группы, в искусственный рубец, помещали микрорацион который включал 30% концентратов и 70% грубых кормов (в измельченном виде); при этом в опытную группу были добавлены фитохимические вещества ванилин и кверцетин (их комбинация), производство Acros Organics BVBA (Бельгия), при этом ванилин в дозировке - 1,5 мг/кг концентрированной части рациона и кверцетин в дозировке 5,9 мг/кг концентрированной части рациона.

По истечению инкубации (48 часов) производился отбор проб газа (для определения метана) и рубцовой жидкости (для метагеномного анализа).

Для определения таксономического разнообразия микроорганизмов в образцах рубцовой жидкости выделяли тотальную ДНК при помощи набора FastDNA® SPIN Kit for Faeces (MP Biomedicals Inc., Solon, OH, USA) с использованием лизирующего матрикса Lysing Matrix E. Образцы гомогенизировали на приборе TissueLyser LT (Qiagen, Venlo, Netherlands). Время гомогенизации было увеличено до 5 минут, по сравнению с протоколом производителя. Качество выделенной ДНК проверяли методом горизонтального электрофореза в 1% агарозном геле, и спектрофотометрическим методом на приборе Nanodrop 8000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Концентрацию ДНК измеряли на приборе Qubit 4 Fluorometer (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) при помощи набора dsDNA High Sensitivity Assay Kit.

Приготовление ДНК-библиотек были выполнены в соответствии с протоколом Illumina (Part #15044223, Rev. B.). Ампликоны региона V3-4 гена 16S SSU rRNA были получены с использованием праймеров S-D-Bact-0341-b-S-17 и S-D-Bact-0785-a-A-21 [24]. Реакционная смесь (25 µL) содержала 10 ng матрицы; прямой и обратный праймеры, 0.2 µM каждого; 80 µM ДНТФ; 0.2 единицы активности Q5 High-Fidelity DNA полимеразы (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA). ДНК-библиотеки очищали методом твердофазной иммобилизации на парамагнитных частицах при Agencourt AMPure XP beads (Beckman Coulter, Brea, CA, USA). Качество библиотек проверяли методом капиллярного электрофореза на приборе Qiaxcel Advanced System (Qiagen, Hilden, Germany) с использованием картриджа QIAxcel DNA Screening Kit. Парноконцевое секвенирование ампликоновых ДНК-библиотек было выполнено на платформе Illumina MiSeq с использованием набора реактивов MiSeq Reagent Kit v.2 (500-cycle) (Illumina, San Diego, CA, USA).

После инкубирования проводили отбор проб газа для определения уровня метана на приборе «Кристаллюкс-2000М» (Хроматэк, РФ) методом газовой хроматографии. Определение содержания предельных углеводородов в газовой пробе основано на газохроматографическом разделении компонентов на колонке, заполненной окисью алюминия, модифицированной едким натром, с последующей их регистрацией пламенно-ионизационным детектором. Газовые цельностеклянные шприцы с анализируемыми пробами предварительно выдерживали в помещении до комнатной температуры. Ввод пробы в хроматограф осуществлялся краном-дозатором не менее 3 раз. Кран-дозатор переводили в положение «отбор», подсоединяли шприц и вытесняли пробу (в объеме 20 - 30 см3) в дозу. Вытеснение проб из шприца осуществлялся насыщенным раствором хлористого натрия. Затем отсоединяли шприц от крана-дозатора для выравнивания в нём давления далее переводили кран-дозатор в положение «анализ».

Результаты исследований

Анализ рубцовой жидкости показал, что микробиом рубца крупного рогатого скота в контрольной группе на 96,85% представлен бактериями и на 3,15 % не классифицировались на уровне Kingdom (таблица 1). В то время в опытной группе, ванилин+кверцетин число неклассифицированных микроорганизмов уменьшалось и составляло 1,86% от общего числа (таблица 2).

Таксономический состав рубца подопытных был представлен филумами: Bacillota 51,45% от общего числа бактерий в пробе, в контроле против 69,19% в группе ванилин+кверцетин, Bacteroidota (9,56% против 5,00%), Fusobacteriota (6,06% против 1,19%), Proteobacteria (3,69% против 2,70%), остальные филумы в исследуемых группах в сумме не превышали 1,0 %.

Таксономические группы микробиома рубца, на уровне класса в исследуемых образцах, соответствовали значению численного преобладания представителей таксона филум. Введение композиции ванилин+кверцетин уменьшает содержание Bacilli на 11,58%, Fusobacteriia на 4,87%, Gammaproteobacteria на 1,0% и увеличивает Clostridia на 8,99%, Negativicutes на 0,7% относительно контрольной группы, остальные таксоны на уровне филума находились приблизительно в одинаковых числовых диапазонах в исследуемых группах.

Сравнительный анализ родов бактерий показал значительное увеличение численности представителей рода Streptococcus (18,32% и 7,75% от общего числа), (особенно в контрольном образце), принадлежащих к семейству Streptococcaceae, а также неклассифицированных представителей семейства Lachnospiraceae (филум Bacillota, класс Clostridia). На этом фоне наблюдалось уменьшение количества представителей рода Clostridium, Anaerotignum, Pseudobutyrivibrio (филум Bacillota, класс Clostridia). Количество бактерий семейства Bacteroidales было равно количеству бактерий филума Bacteroidota и значительно снизилось в опытной группе (8,71% против 4,81% от общего числа). Установлено, что бактерии рода Butyrivibrio и Pseudobutyrivibrio (филум Bacillota, класс Clostridia, семейство Lachnospiraceae) участвуют в процессе деградации клетчатки и белков, биогидрирования липидов [25]. Основные представители данных филумов участвуют в переваривании углеводов: бактерии филума Bacillota обладают фибролитической и целлюлолитической активностью, а Actinomycetota и Pseudomonadota расщепляют целлюлозу и гемицеллюлозу [26]. При добавлении композиции ванилина+кверцетина было зарегистрировано снижение количества представителей семейства Fusobacteriaceae на 4,84% относительно контроля (филум Fusobacteriota).

Внесение комбинации ванилин + кверцетин в большей степени снижало (на 61,9%) выработку метана (Р ≤ 0,001) (таблица 3). В контрольном образце, установлено наибольшее количество углекислого газа (СО₂) – на 11,51 е/г. Во всех группах была отмечена прямая зависимость между уровнем СН₄ и СО₂.

Это позволяет сделать вывод о возможности использования данных фитохимических веществ как альтернативы антибиотикам для регуляции пищеварительных процессов в организме крупного рогатого скота. Установлено, что комбинация фитохимических веществ ванилин+кверцетин, влияет изменение микробиома рубца у крупного рогатого скота, повышая бактерии, обладающие фибролитической и целлюлолитической активностью, а именно филума Bacillota, а также снижает выработку метана, что позволяет рекомендовать композицию фитохимических веществ в качестве кормовой добавки для крупного рогатого скота.

Источники информации:

1. Abecia, L. Natural and artificial feeding management before weaning promote different rumen microbial colonization but not differences in gene expression levels at the rumen epithelium of newborn goats / L. Abecia, E. Jiménez, G. Martínez-Fernandez, A.I. Martín-García, E. Ramos-Morales, E. Pinloche, S.E. Denman, C.J. Newbold, D.R. Yáñez-Ruiz // PLOS ONE. – 2017. – vol. 12. – no. 8. – DOI: 10.1371/journal.pone.0182235.

2. Yáñez-Ruiz, D.R. Manipulating rumen microbiome and fermentation through interventions during early life: a review / D.R. Yáñez-Ruiz, L. Abecia, C.J. Newbold // Front. Microbiol. – 2015. – vol. 6. – pp. 1133. – DOI: 10.3389/fmicb.2015.01133.

3. Schauder, S. The languages of bacteria Genes Dev / S. Schauder, B.L. Bassler // Department of Molecular Biology, Princeton University, Princeton. – 2001. – № 15. – P. 1468-1480.

4. Rutherford, S.T. Bacterial quorum sensing: its role in virulence and possibilities for its control / S.T. Rutherford, B.L. Bassler // Cold Spring Harb Perspect Med. – 2012. – Vol. 11. – № 2. – P. 235-242.

5. Frederix, M. Quorum sensing: regulating the regulators / M. Frederix. J.A. Downie // Advances in Microbial Physiology. – 2011. – Vol. 195. – № 16. – P. 3583-3589.

6. Calsamiglia, S. Invited review: essential oils as modifiers of rumen microbial fermentation / S. Calsamiglia, M. Busquet, P. Cardozo, L. Castillejos, A. Ferret // J. Dairy Sci. – 2007. – vol. 90. – pp. 2580-2595. – DOI: 10.3168/jds.2006-644.

7. Hassan, F. Phytogenic additives can modulate rumen microbiome to mediate fermentation kinetics and methanogenesis through exploiting diet–microbe interaction / F. Hassan, M.A. Arshad, H.M. Ebeid, M.S. Rehman, M.S. Khan, S. Shahid, C. Yang // Front Vet Sci. – 2020. – vol. 7. – pp. 575801. – DOI: 10.3389/fvets.2020.575801.

8. Ornaghi, M. Natural plant-based additives can improve ruminant performance by influencing the rumen microbiome / M. Ornaghi, R.M. Prado, T.R. Ramos, F.R. Catalano, C. Mottin, C.J. Creevey, S.A. Huws, I.N. Prado // Research square. –2020. – DOI: 10.21203/rs.3.rs-29748/v1.

9. Lillehoj, H. Phytochemicals as antibiotic alternatives to promote growth and enhance host health / H. Lillehoj, Y. Liu, S. Calsamiglia, M.E. Fernandez-Miyakawa, F. Chi, R.L. Cravens, S. Oh, C.G. Gay // Vet Res. – 2018. – vol. 49. – no. 1. – pp. 76. – DOI: 10.1186/s13567-018-0562-6.

10. Atlanderova, K. Change In The taxonomic composition of ruminal microflora against the background of copper and plant extract / K. Atlanderova, A. Makaeva, S. Miroshnikov, G. Duskaev // Journal Of Animal Science. – 2021. – vol. 99. – no. S3. – pp. 235-236. – DOI: 10.1093/jas/skab235.430.

11. Hassan, F. Phytogenic additives can modulate rumen microbiome to mediate fermentation kinetics and methanogenesis through exploiting diet–microbe interaction / F. Hassan, M.A. Arshad, H.M. Ebeid, M.S. Rehman, M.S. Khan, S. Shahid, C. Yang // Front Vet Sci. – 2020, vol. 7. – pp. 575801. – DOI: 10.3389/fvets.2020.575801.

12. Дускаев, Г.К. Влияние малых молекул растительного происхождения на микробное разнообразие слепого отдела кишечника цыплят-бройлеров / Г.К. Дускаев, Л.В. Власенко, Д.Б. Косян, М.Я. Курилкина // Птицеводство. – 2023. – № 4. – С. 6-51. – DOI: 10.33845/0033-3239-2023-72-4-46-51.

13. Min, Y.W. The role of microbiota on the gut immunology / Y.W. Min. P.-L. Rhee // Clin. Ther. – 2015. – vol. 37. – no. 5. – pp. 968-975. – DOI: 10.1016/j.clinthera.2015.03.009.

14. Aguerre, M.J. Effect of quebracho-chestnut tannin extracts at 2 dietary crude protein levels on performance, rumen fermentation, and nitrogen partitioning in dairy cows / M.J. Aguerre, M.C. Capozzolo, P. Lencioni, C. Cabral, M.A. Wattiaux // J. Dairy Sci. – 2016. – vol. 99. – no. 6. – pp. 4476-4486. – DOI: 10.3168/jds.2015-10745.

15. Bodas, R. Manipulation of rumen fermentation and methane production with plant secondary metabolites / R. Bodas, N. Prieto, R. Garcia-Gonzalez, S. Andres, F.J. Giraldez, S. Lopez // Anim. Feed Sci. Technol. – 2012. – vol. 176. – pp. 78-93. – DOI: 10.1016/j.anifeedsci.2012.07.010.

16. Fitzgerald, D.J. Mode of antimicrobial action of vanillin against Escherichia coli, Lactobacillus plantarum and Listeria innocua / D.J. Fitzgerald, M. Stratford, M.J. Gasson, J. Ueckert, A. Bos, A. Narbad // Journal of Applied Microbiology, Volume 97. – Issue 1. – 1 July 2004. – Pages 104-113. – DOI: 10.1111/j.1365-2672.2004.02275.x.

17. Патент на изобретение RU № 2485801 Ароматизированная композиция и способ повышения аппетита у поросят с ее помощью / Креспо Ксавьер: опубликовано: 27.06.2013.

18. Патент на изобретение RU № 2780832 Способ снижения концентрации метана в рубце жвачных животных / Б.С. Нуржанов, В.А. Рязанов, Е.В. Шейда, Г.К. Дускаев, Ш.Г. Рахматуллин: опубликовано 04.10.2022. Бюл. № 28.

19. Патент на изобретение RU № 2649812 Способ экстракции из твердого растительного сырья композиции химических соединений для подавления зоопатогенных бактерий / Д.Г. Дерябин, А.А. Галаджиева, С.А. Мирошников, Г.К. Дускаев, Б.Г. Рогачев, Л.Н. Павлов: опубликовано: 04.04.2018.

20. Патент на изобретение RU № 2542464 Композиция на основе фитоэкстрактов, подавляющая чувство кворума у бактерий / Д.Г. Дерябин, А.А. Толмачева: опубликовано 20.02.2015, Бюл. № 5.

21. Инчагова К.С. Применение quercetin hydrate и trans-cinnamaldehyde в качестве ингибиторов «quorum sensing» LuxI/LuxR-типа у бактерий // Симбиоз-Россия 2020: сб. ст. XII Всероссийский конгресс молодых ученых-биологов с международным участием. – Пермь: Пермский гос. нац. исследовательский институт. – 2020. – С. 106-108.

22. Memariani, H. An overview on anti-biofilm properties of quercetin against bacterial pathogens / H. Memariani, M. Memariani, A. Ghasemian // World Journal of Microbiology and Biotechnology. – 2019. – Vol. 35. – P. 1-16. (url: https://link.springer.com/article/10.1007/s11274-019-2719-5).

23. Свидетельство о регистрации базы данных №2022620937 Биотестирование кормовых добавок / В.А. Рязанов, Е.В. Шейда, Г.К. Дускаев, Ш.Г. Рахматуллин, Г.И. Левахин, К.С. Инчагова: опубликовано 25.04.2022. Заявка № 2022620811 от 12.04.2022.

24. Salehi, B. Therapeutic potential of quercetin: new insights and perspectives for human health / B. Salehi, L. Machin, L. Monzote, J. Sharifi-Rad, S.M. Ezzat, M.A. Salem, W.C. Cho // Acs Omega. – 2020. – v. 5. – no. 20. – pp. 11849-11872. – DOI: 10.1021/acsomega.0c01818.

25. Klindworth, A. Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies / A. Klindworth et al. // Nucleic Acids Research. – 2013. – Vol. 41 (1). – DOI: 10.1093/nar/gks808.

26. Wallace, R.J. Clostridium proteoclasticum: A ruminal bacterium that forms stearic acid from linoleic acid / R.J. Wallace, L.C. Chaudhary, N. McKain, N.R. McEwan, A.J. Richardson, P.E. Vercoe, N.D. Walker, D. Paillard // FEMS Microbiol. Lett. – 2006. – vol. 265. – pp. 195-201. – DOI: 10.1111/j.1574-6968.2006.00487.x.

27. Patel, D.D. Microbial and carbohydrate active enzyme profile of buffalo rumen metagenome and their alteration in response to variation in the diet / D.D. Patel, A.K. Patel, N.R. Parmar, M.T. Shah, J.B. Patel, P.R. Pandya, C.G. Joshi // Gene. – 2014. – vol. 545. – pp. 88-94. – DOI: 10.1016/j.gene.2014.05.003.

Изобретение относится к сельскому хозяйству. Способ регуляции пищеварительных процессов в организме крупного рогатого скота характеризуется тем, что в их рацион вводят комбинацию фитохимических веществ ванилина и кверцетина, при этом ванилина в дозировке - 1,5 мг/кг концентрированной части рациона и кверцетина в дозировке 5,9 мг/кг концентрированной части рациона. Изобретение позволяет снизить уровень метана. 3 табл., 1 пр.

Способ регуляции пищеварительных процессов в организме крупного рогатого скота, характеризующийся тем, что в их рацион вводят комбинацию фитохимических веществ ванилина и кверцетина, при этом ванилина в дозировке - 1,5 мг/кг концентрированной части рациона и кверцетина в дозировке 5,9 мг/кг концентрированной части рациона.