Способ получения биогенного стимулятора из тканей кожи Российский патент 2024 года по МПК A61K35/36 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к ветеринарной медицине, а именно к получению биологически активного препарата из тканей кожи собак. Препарат может быть использован для стимуляции регенеративных процессов кожи и мягких тканей при лечении хирургических патологий у собак.

Уровень техники

Известен способ получения препарата ПДЭ (плацента денатурированная эмульгированная), при изготовлении которого используются ткани детской плаценты: ткань амниота, хориона (Беляев В.И., Биологическая активность препаратов из плаценты / В.И. Беляев, А.Г. Нежданов, К.А. Лободин и др. // Ветеринарная практика. - 2006, №7. - С. 58-61). Недостатком этого способа является добавление к препарату химических соединений, изменяющих природные свойства белковых молекул и нуклеиновых кислот, а также использование диспергирования и эмульгирования, приводящего к разрыву химических связей. Всё это приводит к снижению биологической активности препарата.

Известен способ получения плацентарного лечебного препарата на основе плаценты коров (Патент RU 2400241 C1), заключающийся в том, что в период нутровки стельных коров на скотобойне извлекают беременную матку здоровых коров в первую половину стельности (4-5 мес), собирают не разъединенные карункулы и котиледоны с детской и материнской плацент, срезая котиледоны кривыми стерильными ножницами с ткани детской плаценты, выполняя это через продольный разрез серозно-мышечно-слизистого слоя беременного рога матки, путем прокола иглой хориально амниотической оболочки вакуумированием собирают амниотическую жидкость из амниотического пузыря, и измельчают срезанные котиледоны с карункулами резаньем, а затем в механическом гомогенизаторе добавляют ранее собранную из этой же матки амниотическую жидкость из расчета 10:1 гомогенной массы, медленно перемешивают и отстаивают, а затем центрифугируют при 10 тыс. об/мин в течение 10 мин, осуществляют консервацию, надосадочную часть сливают во флаконы и укупоривают.

Известен способ получения биологически активных липофильной и гидрофильной фракций плаценты свиной (Патент РФ №2237486 С1, 10. Патент UA 15241, МПК 6 А61К 35/50, Бюл. №4, 2000 г.), данные способы позволяют получить смесь пептидов, аминокислот, оксикислот методом хлороформно-этанольной и водно-этанольной экстракции с солевым разделением фракций, а также использование хладоновых растворителей для получения липофильной фракции. Недостатком данных способов является наличие ростовых факторов в препаратах без факторов дифференцировки и сигнальных тканевых молекул, что значительно повышает риск неопластических процессов, особенно при отсутствии полинуклиотидов, обладающих выраженным иммуномодулирующим эффектом. Кроме того, способ хлороформно-этанольной и водно-этанольной экстракции и выделения позволяет получить только низкомолекулярные полипептиды и белки с измененной четвертичной и третичной структурой, что снижает специфическую биологическую активность препарата.

Известен способ получения биологически активного препарата из селезенки эмбрионов крупного рогатого скота и фармацевтическая композиция на его основе с иммуномодулирующей, антигипоксической и репаративной активностью (Евразийский патент №004788 В1), данный способ позволяет получить смесь низкомолекулярных пептидов, аминокислот, производных нуклеиновых кислот и других компонентов массой от 5 до 50 кДа из селезенки эмбрионов крупного рогатого скота методом солевой экстракции гомогената 0,9% раствором хлорида натрия с последующей последовательной ультрафильтрацией. Недостатком способа является то, что применяемая солевая экстракция не позволяет получить большой спектр активных соединений, а достаточно высокий процент примесей в виде липопротеидов и пептидгликанов ведет к снижению биологической активности и специфичности фармакологического действия полученного препарата.

Известен способ получения биологически активного комплекса, обладающего нейрорегеративным и нейропротективным действием (Международная заявка WO 2009/088314 А1, 2007 г.). Данный способ позволяет получить смесь белков и полипептидов из головного мозга эмбрионов сельскохозяйственных животных, взятого на определенной стадии гестации (от начала средней трети до середины последней трети), методом анионообменной хроматографии, используя для нанесения на уравновешенную колонку предварительно отфильтрованный супернатант гомогената ткани с буферным раствором рН 7,2-8,4, целевые фракции получают, разделяя связавшиеся с носителем белки и полипептиды, используя в качестве подвижной фазы 0,05 М ТРИС-глициновый буфер, содержащий 0,1 мМ ЭДТА и 1М NaCl, повышая концентрацию ступенчатым градиентом с шагом 5%. Однако, использование на этапе анионообменной хроматографии 1М NaCl создает слишком высокую ионную силу подвижной фазы, равную 1 моль/л. В связи с этим полученная целевая фракция содержит большое количество кислых высокозаряженных белков и полипептидов, имеющих в клетках мозговой ткани преимущественно мембранную локализацию, в основном выполняющие структурные функции и только в незначительной степени регуляторные.

Наиболее близким техническим решением к заявленному изобретению является способ получения биологически активного препарата из тканей мозга, включающий гомогенизацию и состоящий из трёх последовательных процессов: охлаждения, облучения и лиофилизации. Перед гомогенизацией ткани мозга охлаждают в течение 24-48 ч при 2-3°С, а гомогенизат подвергают ультрафиолетовому облучению при мощности бактерицидной лампы 60 Вт и толщине облучаемого слоя 1,8-2,0 мм при скорости течения 100 мл/мин с последующей сублимационной сушкой (Патент RU 2071335 C1). Однако в предложенном способе не использовались ингибиторы протеаз, которые могли существенно снизить активность регуляторных пептидов получаемого биологически активного препарата, путём их протеолиза, кроме того, изначальная солевая экстракция физиологическим раствором не позволяет получить большой спектр активных соединений.

Обращает на себя тот факт, что препараты, полученные из тканей мозга несут в себе риск биологической опасности, так как могут быть фактором передачи прионных инфекций (Spagnolli G. Understanding prion structure and conversion / G. Spagnolli, J.R. Requena, E. Biasini // Prog Mol Biol Transl Sci. - 2020, Vol. 175. - P. 19-30).

Раскрытие изобретения

Задача изобретения заключается в получении биологически активного препарата из тканей кожи собак, экологически чистого, без добавления химических веществ, путем действия естественных физических факторов в оптимальных режимах и при последовательном действии охлаждения, облучения с ультрафиолетовым спектром и сублимации.

Технический результат, который может быть достигнут с помощью предлагаемого изобретения, сводится к получению биологически активного препарата из тканей кожи собак включающего использование 200 грамм тканей трупной донорской кожи собак, которую помещают в термостатический контейнер и выдерживают охлажденную ткань в течение 24 часов, затем ткани кожи гомогенизируют в 400 мл 0,05 М ТРИС-глициново-фосфатного буфера при этом рН - 8,0, содержащего 1 мл этилендиамино-тетрауксусной кислоты (ЭДТА) и 0,1% маннита, в течение 5 минут при 4°С, после чего гомогенизат отделяют от балластных веществ фильтрованием через плотную ткань с последующим центрифугированием при 20 000 об/мин в течение 60 минут и фильтрацией через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм при 4°С, далее полученный фильтрат подвергают облучению, включая ультрафиолетовый спектр лучей при использовании ртутно-кварцевых горелок путем пропускания гомогенизированной массы через двойной цилиндр из кварцевого стекла при расстоянии между стенками 1,8-2 мм и вставленной в нее кварцевой бактерицидной лампой мощностью 60 Вт, скорость движения гомогенизата должна быть 200 мл в 1 мин, после облучения полученная масса расфасовывается в стерильные флаконы и подвергается сублимационной сушке в камере холодильника -40-50°C и в течение 8-16 ч после чего кассеты с замороженной тканью быстро перегружают в подготовленную и охлажденную камеру, подключают датчики, закрывают камеру и включают вакуумные насосы и охлаждают до -35°C, спустя 1-3 ч при достижении показателей вакуума 0,012-0,013 бар включают нагрев полок до 30-40°C до окончания сушки при температуре 25°C в течение 90 часов, после завершения сушки камеру через специальный фильтр, заполняют стерильным осушенным воздухом или инертным газом и вытаскивают из камеры, и закрывают пробками и завальцовывают фольговыми колпачками.

Осуществление изобретения

Ткани кожи получают от трупов здоровых собак, поступивших в ветеринарные учреждения по причине травм, не совместимых с жизнью.

После удаления волосяного покрова 200 грамм донорской кожи помещают в термостатический контейнер и выдерживают охлажденную ткань в течение 24-48 часов. При этом создаются парабиотические условия, обеспечивающие синтез жизненноважных веществ в тканевой массе. Затем ткани кожи гомогенизируют в 400 мл 0,05 М ТРИС-глициново-фосфатного буфера, рН 8,0, содержащего 1 мл этилендиамино-тетрауксусной кислоты (ЭДТА) и 0,1% маннита, в течение 5 минут при 4°С. ЭДТА ингибирует протеолиз и выступает в качестве детергента. Маннит выступает в качестве солюбилизатора, препятствуя коагуляции белковых компонентов. Гомогенат отделяют от балластных веществ фильтрованием через плотную ткань с последующим центрифугированием при 20 000 об/мин в течение 60 минут и фильтрацией через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм при 4°С.

Полученный фильтрат подвергают облучению, включая ультрафиолетовый спектр лучей. Облучение выполняют при использовании ртутно-кварцевых горелок путем пропускания гомогенизированной массы через двойной цилиндр из кварцевого стекла при расстоянии между стенками 1,8-2 мм и вставленной в нее кварцевой бактерицидной лампой. При мощности лампы 60 Вт скорость движения гомогенизата должна быть 200 миллилитров в 1 мин. Более быстрое или более медленное пропускание через аппарат снижает степень активации. После облучения полученная масса расфасовывается в стерильные флаконы и подвергается сублимационной сушке. Сублимация в результате обезвоживания создает условия для длительного хранения.

Сублимационная сушка материала состоит из двух взаимосвязанных процессов, замораживания материала в низкотемпературном холодильнике с последующей его сублимацией в специальном сублимационном аппарате. Флаконы с материалом незамедлительно после разлива помещают в охлажденную до температуры -40-50°C камеру холодильника и промораживают при данной температуре в течение 8-16 ч. В 2-3 флаконах из разных кассет устанавливают 2-3 датчика для снятия в процессе сублимации показаний температуры продукта. Сушку проводят в сублимационных камерных аппаратах типа ТГ-50, КС-30 и др. Кассеты с замороженной тканью, не допуская оттаивания биопрепарата, быстро перегружают в подготовленную и охлажденную камеру, подключают датчики, закрывают камеру и включают вакуумные насосы и охлаждают до -35°C. Спустя 1-3 ч при достижении показателей вакуума 0,012-0,013 бар включают нагрев полок до 30-40°C, в зависимости от объема расфасовки. Нагрев поддерживают при данных температурных показателях до достижения окончания сушки. Плюсовая температура в препарате не должна превышать 25°C. Продолжительность сушки на сублимационных аппаратах различных марок допускается до 90 часов. После завершения сушки камеру через специальный фильтр, заполняют стерильным осушенным воздухом или инертным газом. Флаконы вытаскивают из камеры. После полной сублимации флаконы закрываются пробками и завальцовываются фольговыми колпачками.

Каждая серия полученного тканевого препарата подвергается определению активности и на безвредность по способу К. Бакирджиева [Калашник, И.А. Стимулирующая терапия в ветеринарии / И.А. Калашник. - К.: Урожай, 1990. - 160 с.], основанным на изменении бродильной активности дрожжей под действием испытуемого препарата.

Предложенный способ получения биологически активного препарата из тканей кожи поэтапным воздействием на ткани охлаждения, облучения ультрафиолетовым спектром лучей и сублимации, повышает биологическую активность препарата, обеспечивает его стерилизацию.

Пример 1

Четыре пробирки ёмкостью 30 мл закрывали резиновыми пробками, в центре которых проходят стеклянные трубки с изогнутыми верхними концами. В первые три пробирки наливали по 1 мл раствора пекарских дрожжей (1:20), 28 мл 2% раствора глюкозы и добавляли испытуемый препарат, который предварительно пропускали через двойной цилиндр из кварцевого стекла со вставленной в нее кварцевой бактерицидной лампой, мощностью 60 Вт со скоростью движения гомогенизата 100 мл в 1 минуту. Препарат в пробирки 1, 2 и 3 добавляли в дозе 0,5, мл.

В опытных пробирках изотоническим раствором доводили объём препарата до 1 мл. В контрольную пробирку вместо биостимулятора наливали 1 мл изотонического раствора. Пробирки встряхивали до полного смешивания в них содержимого, проводили заливку пробок парафином, для обеспечения полной герметизации и выдерживали при комнатной температуре в течение трёх суток. Углекислый газ накапливается в верхней части пробирок и при большом его скоплении часть жидкости выталкивается наружу. Высоту столба жидкости в пробирках мы принимали за 100%. Через 24 часа с момента культивирования дрожжей, по высоте столба вытесненной жидкости в контрольной и опытных пробирках судили об активности биостимулятора.

Через 24 часа объём вытесненной жидкости в контрольной пробирке составлял 14,9 % по отношению к первоначальному объёму пробирки. В 1, 2 и 3 опытных пробирках этот объём составлял 27,7±3,1% от первоначального объёма, что на 85,9 % больше, чем в контрольной пробирке.

Пример 2

Четыре пробирки ёмкостью 30 мл закрывали резиновыми пробками, в центре которых проходят стеклянные трубки с изогнутыми верхними концами. В первые три пробирки наливали по 1 мл раствора пекарских дрожжей (1:20), 28 мл 2% раствора глюкозы и добавляли испытуемый препарат, который предварительно пропускали через двойной цилиндр из кварцевого стекла со вставленной в нее кварцевой бактерицидной лампой, мощностью 60 Вт со скоростью движения гомогенизата 200 мл в 1 минуту. Препарат в пробирки 1, 2 и 3 добавляли в дозе 0,5, мл.

В опытных пробирках изотоническим раствором доводили объём препарата до 1 мл. В контрольную пробирку вместо биостимулятора наливали 1 мл изотонического раствора. Пробирки встряхивали до полного смешивания в них содержимого, проводили заливку пробок парафином, для обеспечения полной герметизации и выдерживали при комнатной температуре в течение трёх суток. Углекислый газ накапливается в верхней части пробирок и при большом его скоплении часть жидкости выталкивается наружу. Высоту столба жидкости в пробирках мы принимали за 100%. Через 24 часа с момента культивирования дрожжей, по высоте столба вытесненной жидкости в контрольной и опытных пробирках судили об активности биостимулятора.

Через 24 часа объём вытесненной жидкости в контрольной пробирке составлял 15,3% по отношению к первоначальному объёму пробирки. В 1, 2 и 3 опытных пробирках этот объём составлял 32,92±2,7% от первоначального объёма, что на 115,16% больше, чем в контрольной пробирке.

Пример 3

Четыре пробирки ёмкостью 30 мл закрывали резиновыми пробками, в центре которых проходят стеклянные трубки с изогнутыми верхними концами. В первые три пробирки наливали по 1 мл раствора пекарских дрожжей (1:20), 28 мл 2% раствора глюкозы и добавляли испытуемый препарат, который предварительно пропускали через двойной цилиндр из кварцевого стекла со вставленной в нее кварцевой бактерицидной лампой, мощностью 60 Вт со скоростью движения гомогенизата 300 мл в 1 минуту. Препарат в пробирки 1, 2 и 3 добавляли в дозе 0,5, мл.

В опытных пробирках изотоническим раствором доводили объём препарата до 1 мл. В контрольную пробирку вместо биостимулятора наливали 1 мл изотонического раствора. Пробирки встряхивали до полного смешивания в них содержимого, проводили заливку пробок парафином, для обеспечения полной герметизации и выдерживали при комнатной температуре в течение трёх суток. Углекислый газ накапливается в верхней части пробирок и при большом его скоплении часть жидкости выталкивается наружу. Высоту столба жидкости в пробирках мы принимали за 100%. Через 24 часа с момента культивирования дрожжей, по высоте столба вытесненной жидкости в контрольной и опытных пробирках судили об активности биостимулятора.

Через 24 часа объём вытесненной жидкости в контрольной пробирке составлял 15,1% по отношению к первоначальному объёму пробирки. В 1, 2 и 3 опытных пробирках этот объём составлял 21,54±4,2% от первоначального объёма, что на 42,65% больше, чем в контрольной пробирке.

Таким образом, на этапе облучения препарата с ультрафиолетовым спектром при пропускании через двойной цилиндр из кварцевого стекла со вставленной в нее кварцевой бактерицидной лампой, мощностью 60 Вт с скорость движения гомогенизата должна быть 200 мл в 1 мин, так как более быстрое или более медленное пропускание через аппарат снижает степень активации.

Изобретение относится к ветеринарной медицине, а именно к способу получения биологически активного препарата из тканей кожи собак. Способ получения биологически активного препарата из тканей кожи собак, включающий использование 200 грамм тканей трупной донорской кожи собак, которую помещают в термостатический контейнер и выдерживают охлажденную ткань в течение 24 часов, затем ткани кожи гомогенизируют в 400 мл 0,05 М ТРИС-глициново-фосфатного буфера, при этом рН - 8,0, содержащего 1 мл этилендиамино-тетрауксусной кислоты (ЭДТА) и 0,1% маннита, в течение 5 минут при 4°С, после чего гомогенизат отделяют от балластных веществ фильтрованием через плотную ткань с последующим центрифугированием при 20 000 об/мин в течение 60 минут и фильтрацией через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм при 4°С, далее полученный фильтрат подвергают облучению, включая ультрафиолетовый спектр лучей при использовании ртутно-кварцевых горелок путем пропускания гомогенизированной массы через двойной цилиндр из кварцевого стекла при расстоянии между стенками 1,8-2 мм и вставленной в нее кварцевой бактерицидной лампой мощностью 60 Вт, скорость движения гомогенизата должна быть 200 мл в 1 мин, после облучения полученная масса расфасовывается в стерильные флаконы и подвергается сублимационной сушке в камере холодильника -40-50°C и в течение 8-16 ч, после чего кассеты с замороженной тканью быстро перегружают в подготовленную и охлажденную камеру, подключают датчики, закрывают камеру, и включают вакуумные насосы, и охлаждают до -35°C, спустя 1-3 ч при достижении показателей вакуума 0,012-0,013 бар включают нагрев полок до 30-40°C до окончания сушки при температуре 25°C в течение 90 часов, после завершения сушки камеру через специальный фильтр заполняют стерильным осушенным воздухом или инертным газом, и вытаскивают из камеры, и закрывают пробками, и завальцовывают фольговыми колпачками. Изобретение позволяет получить биологически активный экологически чистый препарат из тканей кожи собак. 3 пр.

Способ получения биологически активного препарата из тканей кожи собак, включающий использование 200 грамм тканей трупной донорской кожи собак, которую помещают в термостатический контейнер и выдерживают охлажденную ткань в течение 24 часов, затем ткани кожи гомогенизируют в 400 мл 0,05 М ТРИС-глициново-фосфатного буфера, при этом рН - 8,0, содержащего 1 мл этилендиамино-тетрауксусной кислоты (ЭДТА) и 0,1% маннита, в течение 5 минут при 4°С, после чего гомогенизат отделяют от балластных веществ фильтрованием через плотную ткань с последующим центрифугированием при 20 000 об/мин в течение 60 минут и фильтрацией через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм при 4°С, далее полученный фильтрат подвергают облучению, включая ультрафиолетовый спектр лучей, при использовании ртутно-кварцевых горелок путем пропускания гомогенизированной массы через двойной цилиндр из кварцевого стекла при расстоянии между стенками 1,8-2 мм и вставленной в нее кварцевой бактерицидной лампой мощностью 60 Вт, скорость движения гомогенизата должна быть 200 мл в 1 мин, после облучения полученная масса расфасовывается в стерильные флаконы и подвергается сублимационной сушке в камере холодильника -40-50°C и в течение 8-16 ч, после чего кассеты с замороженной тканью быстро перегружают в подготовленную и охлажденную камеру, подключают датчики, закрывают камеру, и включают вакуумные насосы, и охлаждают до -35°C, спустя 1-3 ч при достижении показателей вакуума 0,012-0,013 бар включают нагрев полок до 30-40°C до окончания сушки при температуре 25°C в течение 90 часов, после завершения сушки камеру через специальный фильтр заполняют стерильным осушенным воздухом или инертным газом, и вытаскивают из камеры, и закрывают пробками, и завальцовывают фольговыми колпачками.