Способ получения нанодисков, содержащих β1-адренорецептор в нативной конформации Российский патент 2024 года по МПК A61K33/00 B82B1/00 B82Y5/00 

Изобретение относится к биохимии и медицине, в частности к иммунологии.

Аутоантитела к β1-адренорецептору (АДРБ1 AT) часто обнаруживаются в сыворотке крови больных с хронической сердечной недостаточностью (ХСН) различной этиологии. В частности, АДРБ1 AT выявляются у больных болезнью Чагаса, дилатационной кардиомиопатией (ДКМП), перипартальной кардиомиопатией. В ряде работ показано, что АДРБ1 AT играют патогенетическую роль, что делает их потенциальной терапевтической мишенью. Наличие АДРБ1 AT имеет также прогностическое значение при дилатационной кардиомиопатии. Следовательно, определение в крови пациентов аутоантител к β1-адренорецептору (АДРБ1 AT) является насущной потребностью клинической практики. Формат иммуноферментного анализа (ИФА) представляется наиболее подходящим для решения этой задачи. Использование в ИФА в качестве антигена пептидов, воспроизводящих отдельные фрагменты аминокислотной последовательности β1-адренорецептора (АДРБ1), приводит к неадекватным результатам, поскольку, АДРБ1 AT узнают конформационно-зависимые эпитопы, образующиеся при формировании уникальной третичной структуры рецептора.

Известен способ получения нанодисков, в котором для стабилизации нанодисков используется мембранный каркасный белок (MSP, membrane scaffold protein) (Sun R. Mak S. Haschemi J. Horn P. Boege F. Luppa PB. (2019) Nanodiscs Incorporating Native (31 Adrenergic Receptor as a Novel Approach for the Detection of Pathological Autoantibodies in Patients with Dilated Cardiomyopathy. J Appl Lab Med. 4(3):391-403. DOI: 10.1373/jalm.2018.028225).

Недостатком данного способа является низкая эффективность солюбилизации АДРБ1, неудобство в использовании из-за сложности выполнения, а, кроме того, MSP значительно дороже синтетических амфипатических полимеров.

Известен способ синтеза β1-адренорецептора (АДРБ1) в бесклеточной системе с последующим встраиванием β1-адренорецептора в преформированные нанодиски, стабилизированные при помощи мембранного каркасного белка (MSP) (Kock Z, Ermel U, Martin J, Morgner N, Frangakis AS, Dotsch V, Hilger D and Bernhard F. (2022). Biochemical Characterization of Cell-free Synthesized Human pi Adrenergic Receptor Cotranslationally Inserted into Nanodiscs. J Molecular Biol, 434 (16), 167687 DOI: 10.1016/j.jmb.2022.167687).

Недостатком данного способа также является его низкая производительность, высокая стоимость получаемых препаратов адренорецептора и низкая эффективность солюбилизации АДРБ1.

Задачей изобретения является создание надежного и удобного в использовании способа получения нанодисков, содержащих β1-адренорецептор (АДРБ1) в нативной конформации, повышающего эффективность солюбилизации, при котором препарат АДРБ1 после солюбилизации сохраняет способность распознаваться специфическими антителами.

Технический результат изобретения заключается в повышении эффективности солюбилизации АДРБ1.

Это достигается тем, что в заявляемом способе получения нанодисков, содержащих β1-адренорецептор в нативной конформации, используют амфипатические полимеры Ultrasolute Amphipol 17, Ultrasolute Amphipol 18, AASTY 11-45, AASTY 11-50, AASTY 6-50.

Выделение АДРБ1, сохраняющего нативную конформацию и функциональные свойства, возможно с использованием амфипатических полимеров, формирующих нанодиски, что позволяет успешно солюбилизировать мембранные белки. Повышение эффективности солюбилизации достигается за счет применения ранее не используемых амфипатических полимеров.

Сохранение нативной конформации и функциональной активности мембранных белков при их выделении и очистке является сложной задачей. На начальном этапе при выделении мембранных белков из клеток-продуцентов применяется их солюбилизация в форме нанодисков.

Нанодиски представляют собой планарные фрагменты бислойной мембраны, опоясанные тем или иным амфипатическим агентом, содержащие в своем составе мембранный белок в той же топологии, что и в исходной клеточной мембране. В качестве амфипатического агента могут выступать различные амфипатические полимеры. Использование амфипатических полимеров представляет особый интерес, поскольку позволяет полностью исключить применение детергентов. Амфипатические полимеры способны напрямую экстрагировать мембранные белки в нативном липидном окружении непосредственно из живых клеток либо мембранных везикул. Это особенно важно для сохранения исходной функциональной активности мембранного белка, которая зависит от свойств окружающих его липидов, их заряда, гибкости и длины молекулы.

Осуществление способа

Получают препарат мембранной фракции (МФ) из клеток, экспрессирующих на своей поверхности АДРБ1. К аликвотам препарата МФ добавляют один из амфмпатических полимеров: Ultrasolute Amphipol 17, Ultrasolute Amphipol 18, AASTY 11-45, AASTY 11-50, AASTY 6-50 и инкубируют при 37o при перемешивании. Затем образцы центрифугируют в течение 1 часа при 100000 G, 4°С. Осадок выбрасывают. Получившийся супернатант содержит АДРБ1 в солюбилизированном виде. Далее этот препарат обозначается как МФ+ПОЛ (мембранная фракция + полимер). Тестирование МФ+ПОЛ на наличие солюбилизированного АДРБ1, а также оценку эффективности солюбилизации проводят с помощью ИФА. Для этого препараты МФ+ПОЛ адсорбируют на поверхности планшетов для ИФА. АДРБ1 выявляют с помощью рекомбинантных антител к АДРБ1.

Пример осуществления способа

В качестве продуцента АДРБ1 в функционально активном состоянии использовали линию клеток ADL-7A, полученную ранее путем трансфекции клеток HEK293 плазмидой, содержащей ген АДРБ1, с последующим отбором стабильных трансфектантов.

Получение мембранной фракции (МФ) клеток ADL-7А

Клетки линии ADL-7A выращивали в чашках Петри диаметром 10 см (Corning Inc, США) до плотности около 106 клеток на чашку, отмывали фосфатно-солевым буфером (ФСБ), снимали силиконовым скребком. Клетки осаждали при 300 g в течение 15 мин, после чего ресуспендировали в 5 мл буфера, содержащего 20 мМ HEPES, 1 мМ EDTA, 250 мМ сахарозы, 10 мМ ацетата магния, 1 мМ PMSF, 5 мкг/мл апротинина и лейпептина, рН 7,5. Суспензию клеток обрабатывали ультразвуком, дебрис осаждали при 1000 g в течение 15 мин. Супернатант отбирали, переносили в пробирки для ультрацентрифугирования и осаждали МФ при 100000 g, 4°С в течение 1 часа. Осадок ресуспендировали в буфере, содержащем 50 мМ NaH₂PO₄, 200 мМ NaCl, 5 мкг/мл апротинина и лейпептина, рН 8,0, аликвотировали и хранили при -70°С.

Солюбилизация мембранных белков амфипатическими полимерами

На этапе поиска полимеров, которые лучше всего солюбилизируют АДРБ1, было протестировано 17 различных амфипатических полимеров, входящих в набор для скрининга полимеров от фирмы Cube Biotech, Германия (Synthetic Nanodisc Screening Kit MAXI, кат. №18295). В результате тестирования этих полимеров было отобрано шесть из них (Ultrasolute Amphipol 17, Ultrasolute Amphipol 18, AASTY 11-45, AASTY 11-50, AASTY 6-50, AASTY 6-55), которые показали эффективность солюбилизации не менее 60% (см. далее). Готовили 10%-ные (вес/объем) сток-растворы полимеров в соответствии с рекомендациями производителя. Образцы МФ размораживали и определяли в них концентрацию белка методом Бредфорда. Для солюбилизации использовали образцы МФ с концентрацией белка 600-700 мкг/мл. Определение оптимальной концентрации полимеров показало, что наилучший показатель солюбилизации (УПС, см. далее) наблюдался при концентрации указанных полимеров 0,0625%. К образцам МФ добавляли тот или иной полимер в данной концентрации.

Образцы инкубировали при 37°С с перемешиванием на ротаторе (Hematology Chemistry Mixer model 346, Fisher, USA) в течение 1 часа, затем центрифугировали при 100000 g, 4°С в течение 1 часа. Супернатанты, содержащие МФ, солюбилизированную полимерами (МФ+ПОЛ), отбирали и использовали в дальнейшей работе.

Иммуноферментный анализ

Образцы исходной МФ и МФ+ПОЛ адсорбировали на поверхности 96-луночных полистироловых планшетов для ИФА (Corning, кат. №9018) в ФСБ при 4°С в течение ночи. Готовили серии последовательных разведений в ФСБ каждого образца в диапазоне от 10 мкг/мл до 0,08 мкг/мл с шагом 2 и вносили их в лунки по 100 мкл.

На следующий день лунки планшетов промывали 4 раза ФСБ с 0,1% Tween-20 и вносили в них по 100 мкл раствора химерных (мышь/человек, 1,5 мкг/мл) рекомбинантных антител hAB2367 ко второй внеклеточной петле АДРБ1, в блокирующем растворе, содержащем 20% казеинового концентрата СВС1 (SDT GmbH, Германия), 0,02% консерванта Proclin 300 (Sigma, США) и 0,1% Tween-20 в ФСБ. Инкубацию проводили в течение 1 часа при комнатной температуре с перемешиванием на орбитальном шейкере (Kodak Amerlite Shaker Incubator, model code ZLE 164, Великобритания), при скорости 750 об/мин. Затем лунки промывали 4 раза ФСБ с 0,1% Tween-20 и инкубировали 30 мин в тех же условиях с мышиными моноклональными AT к человеческим IgG, конъюгированными с пероксидазой хрена, которые вносили в рабочем разведении в блокирующем растворе по 100 мкл в каждую лунку.

Количество связавшегося конъюгата определяли при помощи хромогенного субстрата 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (ТМБ). Значения оптической плотности (ОП) при 450 нм (после остановки реакции раствором серной кислоты) считывали при помощи микропланшетного ридера Stat Fax-2100 (Awareness Technology, США). Анализ каждого образца проводили дважды, полученные значения ОП усредняли.

Результаты ИФА представляли в виде графиков зависимости ОП от концентрации МФ и соответствующих разведений препаратов МФ+ПОЛ. На Фиг. 1 показана Зависимость связывания специфических антител hAB2367 к АДРБ1, регистрируемого по поглощению (ОП) при 450 нм, от количества внесенных в лунки препаратов МФ и препаратов МФ+ПОЛ, где: МФ - препарат мембранной фракции, UA17 - Ultrasolute Amphipol 17, ОП450 - оптическая плотность при 450 нм. Как можно видеть, наилучшая солюбилизация наблюдается при концентрации полимера 0,0625% (эта кривая лежит выше остальных, более всего приближаясь к кривой МФ).

Помимо этого, результаты ИФА были представлены как отношение значения ОП для образцов МФ+ПОЛ к значению ОП для МФ (ОПМФ+ПОЛ/ОПМФ), взятых в одинаковых разведениях. Эта величина была выражена в процентах. Условный показатель солюбилизации (УПС) вычисляли как среднее арифметическое двух значений ОПМФ+ПОЛ/ОПМФ, соответствующих максимальным концентрациям белка 10 и 5 мкг/мл. При таких концентрациях значения ОП для МФ и препаратов МФ+ПОЛ близки к выходу на плато. Ниже приведены значения УПС для отобранных 6 полимеров:

Ultrasolute Amphipol 17 - 87%

Ultrasolute Amphipol 18 - 62%

AASTY 11-45 - 76%

AASTY 6-55 - 72%

AASTY 6-50 - 78,5%

AASTY 11-50 - 77%.

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ получения нанодисков, содержащих АДРБ1 в нативной конформации. Данный способ включает: получение препарата мембранной фракции из клеток, экспрессирующих на своей поверхности АДРБ1; добавление к препарату мембранной фракции из клеток амфипатического полимера, выбранного из группы: Ultrasolute Amphipol 17, Ultrasolute Amphipol 18, AASTY 11-45, AASTY 11-50, AASTY 6-50, AASTY 6-55; центрифугирование и удаление осадка. Технический результат изобретения заключается в повышении эффективности солюбилизации АДРБ1 за счет использования амфипатических полимеров. 1 ил., 1 пр.

Способ получения нанодисков, содержащих АДРБ1 в нативной конформации, включающий:

- получение препарата мембранной фракции из клеток, экспрессирующих на своей поверхности АДРБ1;

- добавление к препарату мембранной фракции из клеток амфмпатического полимера, выбранного из группы: Ultrasolute Amphipol 17, Ultrasolute Amphipol 18, AASTY 11-45, AASTY 11-50, AASTY 6-50, AASTY 6-55;

- центрифугирование и удаление осадка.