СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА РАЗВИТИЯ ОСЛОЖНЕННОЙ ЯЗВЕННОЙ БОЛЕЗНИ ДВЕНАДЦАТИПЕРСТНОЙ КИШКИ НА ОСНОВЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УРОВНЯ ЭКСПРЕССИИ МИКРОРНК-155 Российский патент 2024 года по МПК G01N33/58 C12Q1/6806 C12Q1/686 

Предлагаемое изобретение относится к области медицины, а именно к медицинской диагностике, и может быть использовано для прогнозирования риска развития осложненной язвенной болезни двенадцатиперстной кишки (ЯБДПК).

Известен способ прогнозирования течения язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, включающий проведение диагностического исследования, отличающийся тем, что на 5-6-е сутки от начала обострения язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки определяют содержание серотонина, гистамина и ацетилхолина в крови, затем в течение 2-3 недель проводят лекарственную терапию и вновь определяют уровень серотонина, гистамина и ацетилхолина в крови и при содержании серотонина в 2-3 раза выше нормы, гистамина в 1,15-1,4 раза выше нормы, а ацетилхолина на 20-45% ниже нормы прогнозируют течение язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки как нерубцующейся язвы [патент RU 2246731 С1, 2003].

Известен способ прогнозирования течения язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, основанный на определении в крови обследуемых пациентов во время обострения язвенной болезни содержания водных фракций в биомакромолекулах форменных элементов крови. При значении коэффициента гидратации, отражающего отношение связанной фракции к свободной, равном 0,36 и ниже, судят о тяжелом течении язвенной болезни; при значении в пределах 0,37-0,43 - о течении средней тяжести; при значении 0,44-0,50 - о легком течении заболевания [патент RU 2312584 С1, 2007].

Известен способ раннего прогнозирования развития язвенной болезни двенадцатиперстной кишки у европеоидов Республики Хакасия, который включает выделение ДНК из лимфоцитов венозной крови и выявление генотипа СС АА полиморфизма +3953 гена IL-1β методом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов и R2R2 IL-IRa VNTR у пациентов носителей генотипа s1s2 vacA Helicobacter pylori методом полимеразной цепной реакции; установленным факторам риска присваивают градации (А1-А2) и числовые значения; после чего определяют прогностические коэффициенты P1, Р2 по формулам:

P1=-1,54+0,57*А1+0,53*А2,

Р2=0,21+1,77*А1+1,70*А2,

где А1 - генотип полиморфизма С+3953Т гена IL-1β: ТТ=0,44, ТС=0,51, СС=2,63; А2 - генотип полиморфизма гена IL-IRa VNTR: R2R2=1,74, R2R3=8,08, R2R4=1,33, R3R3=1,59, R3R4=0,30, R4R4=0,51; при P1>P2 прогнозируют низкий риск, а при P1<P2 прогнозируют высокий риск развития ЯБ [патент RU 2542459 С1, 2022].

При анализе вышеуказанных изобретений выявлены существенные недостатки. Определение серотонина, гистамина и ацетилхолина в крови больных во время обострения, затем после консервативного лечения является длительным процессом. Проведение столь масштабного исследования требует большего внимания, чем аналогичные способы прогнозирования. Способ прогнозирования с определением в крови обследуемых пациентов во время обострения язвенной болезни содержания водных фракций в биомакромолекулах форменных элементов крови не учитывает результаты исследования других заболеваний желудка, которые могут давать схожие коэффициенты гидратации. Кроме того, тяжесть течения заболевания не всегда коррелирует с наличием и видом осложнений. Способ раннего прогнозирования развития язвенной болезни двенадцатиперстной кишки у европеоидов Республики Хакасия основан на выделение ДНК, определении генотипа, установлении градации факторов риска и определении риска развития язвенной болезни по формулам. В методе предлагается рассчитать риск по специальным формулам, указанным выше. Однако работа с формулами подразумевает длительную работу, как с материалом, так и с результатами исследования.

Наиболее близким аналогом изобретения является способ прогнозирования осложненного течения язвенной болезни двенадцатиперстной кишки, включающий исследование показателей рН-метрии желудка, отличающийся тем, что при проведении суточной рН-метрии оценивают ощелачивающую функцию желудка по показателям рН и длительности закисления в антральном отделе, продолжительности дуоденогастрального рефлюкса - средние, дневные и ночные показатели, и при значении рН антрума среднем 2,8±0,22, днем 2,7±0,28, ночью 2,8±0,18, длительности закисления в антруме средней 66±2,8%, днем 64±2,7%, ночью 70±2,8% и продолжительности дуоденогастрального рефлюкса средней 19±1,9%, днем 18±2,1%, ночью 21±1,8% прогнозируют осложненное течение язвенной болезни двенадцатиперстной кишки [заявка RU 2007124068, 2009].

Способ прогнозирования осложненного течения язвенной болезни двенадцатиперстной кишки, включающий исследование показателей рН-метрии желудка, является информативным методом. Однако больные с язвенной болезнью могут иметь противопоказания к проведению пробы, что ограничивает область ее применения. Суточное исследование предполагает нахождение больного во время исследования в условиях стационара. Прием некоторых препаратов (антисекреторные, нестероидные противовоспалительные средства и др.) может влиять на результаты прогноза.

Задачей изобретения является разработка способа прогнозирования течения язвенной болезни двенадцатиперстной кишки с формированием осложненных форм на основании определения уровня экспрессии микроРНК-155 в биоптатах двенадцатиперстной кишки у больных с язвенной болезнью.

Техническим результатом при использовании изобретения является повышение точности прогнозирования высокого риска развития осложненной язвенной болезни двенадцатиперстной кишки.

Предлагаемый способ прогнозирования риска развития осложненной язвенной болезни двенадцатиперстной кишки осуществляется следующим образом.

Согласно клиническим рекомендациям, больным с язвенной болезнью рекомендуется проведение множественной щипцовой биопсии из краев язвенного дефекта при локализации язвы в желудке и вне краев раны при локализации язвы в двенадцатиперстной кишке. Для определения уровня экспрессии микроРНК-155 биопсию проводят в участках слизистой двенадцатиперстной кишки, рекомендованных для эндоскопической диагностики Н. Pylori. При этом, предполагаемый уровень экспрессии микроРНК-155 в участках биопсии и в участке с язвенным дефектом был равнозначный.

С согласия больных во время эндоскопического исследования (ФЭГДС) производят биопсию двенадцатиперстной кишки - по одному на латеральной и медиальной стенкам луковицы. Экстракцию общей РНК и микроРНК проводят с использованием специального набора (Direct-zol™ RNA MiniPrep (Zymo Research)) и с использованием колонки (Zymo-Spin™ II С) согласно инструкции к наборам. Уровень экспрессии микроРНК измеряют методом ПЦР в режиме реального времени с использованием специального набора для анализа микроРНК PCR TaqMan MicroRNA Assays (Applied Biosystems) и системы ПЦР-детекции в режиме реального времени CFX96™ (BioRad). Все реакции проводят в трех повторах для каждого образца. Определяют среднее арифметическое, посчитанное по результатам трех повторов. Для количественной оценки экспрессии микроРНК используют метод 2^-ΔΔCt, предложенный K.J. Livak и соавтором [K.J. Livak, Т.D. Schmittgen., 2001]. Данный метод основан на предположении, что разница в пороге цикла (ΔCt) между геном-мишенью и эталонным геном пропорциональна относительной экспрессии гена-мишени. Малая ядерная РНК U6, характеризующаяся стабильной экспрессией в различных тканях и клетках, использовалась в качестве эндогенного контроля.

ΔΔCt рассчитывают по формуле:

ΔΔCt = (CtmiR - CtRNU6B) опытный образец - (CtmiR-CtRNU6B) контрольный образец

Ct - пороговое значение цикла, полученное в ходе проведения ПЦР. Достоверным считали различия при р≤0.05.

При значении уровня экспрессии микроРНК-155 в биоптатах двенадцатиперстной кишки 2.442±0.096 прогнозируют высокий риск развития осложненной язвенной болезни двенадцатиперстной кишки.

Для анализа данных использовали MS Office Excel (Microsoft) и программные обеспечения GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, Inc, La Jolla, CA). Равенство дисперсий в распределении признаков проверяли с помощью U-критерия Манна-Уитни.

Новизна изобретения заключается в том, что для определения течения язвенной болезни двенадцатиперстной кишки используется оценка уровня экспрессии микроРНК-155.

Изобретение иллюстрируется следующими фигурами: на фиг. 1 представлен анализ экспрессии микроРНК-155 у пациентов с ЯБДПК, где: ЭР- эрозивный гастрит, ПГ-поверхностный гастрит; на фиг. 2 - точечный график, показывающий результаты анализа обогащения пути KEGG для подтвержденных мишеней miRNA-155., N. of Genes - количество генов; на фиг. 3 - сигнальный путь Toll-подобного рецептора, включающий подтвержденные гены-мишени miRNA-155 (выделены красным) согласно базе данных KEGG.

Мы провели анализ экспрессии микроРНК-155 с использованием ПЦР в режиме реального времени у 20 пациентов с язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки, а также у 19 пациентов с эрозивным и 31 с поверхностным гастритом. Дифференциальная экспрессия микроРНК-155 наблюдалась между группами пациентов с осложненным течением ЯБДПК по сравнению с пациентами с эрозивным и поверхностным гастритом.

При анализе вышеуказанных пациентов уровень экспрессии микроРНК-155 показал статистически значимое увеличение экспрессии у групп пациентов с язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки (2.442±0.096; p-value=0.002) по сравнению с группами сравнения (1.995±0.071 и 1.923±0.06; p-value>0.05) (Фиг. 1а-е).

Мы также проанализировали подтвержденные мишени микроРНК-155 из баз данных MirBase, miRDB и MirTarBase для анализа регуляции генов в патогенезе язвенной болезни (Фиг. 2).

Наиболее значимым обогащенным путем был сигнальный путь Toll-подобного рецептора, который включает проанализированные гены MyD88, TRAAF5,IRAK1 и IL-8 (Фиг. 3).

Полученные результаты позволяют предположить, что повышенный уровень экспрессии микроРНК-155 у пациентов с язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки может служить потенциальными прогностическими маркером осложненного течения заболевания.

Сущность изобретения поясняется следующими клиническими примерами:

Пример 1.

Больной Л., 51 года, обратился к хирургу в поликлинику ГБУЗ РБ ГКБ 8 г. Уфы с жалобами на боли в животе, тошноту, изжогу и слабость. В анамнезе хронический панкреатит. Вышеперечисленные жалобы наблюдались в течение 2 недель. Самостоятельно дома не лечился, за медицинской помощью впервые обратился 3 дня назад к терапевту по месту жительства, был направлен на консультацию к хирургу.

При осмотре состояние относительно удовлетворительное, сознание ясное, положение активное. Кожные покровы чистые, розовые. Язык влажный, чистый. В легких везикулярное дыхание, хрипы не выслушиваются. АД 120/80 мм рт.ст., ЧСС - 85 уд. в мин. При пальпации живота отмечается умеренная болезненность в эпигастральной области. Печень не увеличена. Селезенка не пальпируется. Симптомов раздражения брюшины нет. Физиологические отправления не нарушены.

По результатам лабораторных исследований патологических изменений не обнаружено. По данным ультразвукового исследования органов брюшной полости - признаки хронического панкреатита. По ФЭГДС: поверхностный гастрит, обострение. Дуодено-гастральный рефлюкс желчи.

По результатам молекулярно-генетического исследования у больного выявлен нормальный уровень экспрессии микроРНК-155 - 1,920. Данный результат был получен при исследовании больного с поверхностным гастритом и трактован, как отсутствие вероятности развития осложненной язвенной болезни. Больной прошел консервативную терапию. За 12 месяцев динамического наблюдения обострения заболевания, развития осложнений не наблюдалось.

Пример 2.

Больной М., 65 лет, поступил в хирургическое отделение ГБУЗ РБ ГКБ №8 г. Уфы с жалобами на боли в животе, слабость, сухость во рту. В анамнезе установленный гепатит В, гипертоническая болезнь.

Вышеперечисленные жалобы наблюдались в течение 1 недели. Самостоятельно обратился в поликлинику по месту жительства, осмотрен хирургом, направлен на стационарное лечение в хирургическое отделение ГБУЗ РБ ГКБ №8 г Уфы.

При осмотре состояние средней степени тяжести, сознание ясное, положение активное. Кожные покровы чистые, розовые. Язык влажный, обложен белым налетом у корня. В легких везикулярное дыхание, хрипы не выслушиваются. АД 150/80 мм рт.ст., ЧСС - 92 уд. в мин. При пальпации живота отмечается умеренная болезненность в эпигастральной области. Печень не увеличена. Селезенка не пальпируется. Симптомов раздражения брюшины нет. Физиологические отправления не нарушены.

По результатам лабораторных исследований патологических изменений не обнаружено. По данным ультразвукового исследования органов брюшной полости - желчекаменная болезнь, хронический калькулезный холецистит, хронический панкреатит, диффузные изменения печени. По ФЭГДС язва луковицы двенадцатиперстной кишки средних размеров (0,9*0,8 см). Эрозивный гастрит. Повышенная секреторная активность слизистой оболочки желудка.

По результатам молекулярно-генетического исследования у больного выявлен нормальный уровень экспрессии микроРНК-155 - 1,601. Данный результат был трактован как низкий риск развития осложнений язвенной болезни. Стационарное лечение протекало без осложнений, больной выписан на 9 сутки с момента поступления в удовлетворительном состоянии. За 12 месяцев динамического наблюдения обострения заболевания, развития осложнений не наблюдалось.

Пример 3.

Больной М., 74 года, поступил в хирургическое отделение ГБУЗ РБ ГКБ №8 г Уфы с жалобами на слабость, головокружение, рвоту после приема пищи. В анамнезе язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки с 1980 год. Осмотрен хирургом приемного отделения, госпитализирован в РАО. Вышеперечисленные жалобы наблюдались в течение 6 суток.

При осмотре состояние тяжелое, сознание ясное, положение вынужденное. Кожные покровы бледно-розовые. Язык влажный, обложен белым налетом у корня. В легких везикулярное дыхание, хрипы не выслушиваются. АД 110/70 мм рт.ст., ЧСС - 90 уд. в мин. При пальпации живота отмечается умеренная болезненность по всему животу. Печень не увеличена. Селезенка не пальпируется. Симптомов раздражения брюшины нет. Мочеиспускание в норме. Запоры в течение 3 суток.

Per rectum: При внешнем осмотре области ануса без патологических образований. Сфинктер в нормотонусе. На расстоянии 6 см от ануса патологических образований, нависания стенок, болезненностей не выявлено. Ампула пустая, на перчатке стул коричневого цвета.

Данные клинического анализа крови: гемоглобин 130 г/л, эритроциты 4,65×10¹²/л, лейкоциты 15,5×10⁹/л, тромбоциты 164×10⁹/л, СОЭ 23 мм/час, MCV 92 фл, МСН 30,2 пк, МСНС 24,3 г/дл, гематокрит 37,6%. Биохимический анализ крови: общий билирубин 13,2 мкмоль/л, общий белок 60 г/л, глюкоза 5,4 ммоль/л, мочевина 29,6 ммоль/л, креатинин 611 мкмоль/л. Коагулограмма: ПТВ фибриноген 8,6 г/л. По результатам лабораторных исследований выявлен лейкоцитоз, ускорение СОЭ, гипопротеинемия, уремия, гиперкреатининемия, повышение уровней ПТВ и фибриногена.

По данным ультразвукового исследования органов брюшной полости «застойный» желчный пузырь, «застойный» желудок, признаки хронической почечной недостаточности.

По ФЭГДС декомпенсированный бульбостеноз. Кандидозный эзофагит, гастрит.

По результатам молекулярно-генетического исследования у больной выявлен повышенный уровень экспрессии микроРНК-155 - 2,538. Данный результат был трактован как высокий риск развития осложнений язвенной болезни. В динамике состояние больного ухудшилось, больной умер от полиорганной недостаточности.

Пример 4.

Больной П., 65 лет, поступил в хирургическое отделение ГБУЗ РБ ГКБ №8 г Уфы с жалобами на боли в животе. Вышеперечисленные жалобы наблюдались в течение 4 суток. Лечился самостоятельно дома, в связи с ухудшением состояния вызвал бригаду СМП, доставлен в стационар.

При осмотре состояние средней степени тяжести, сознание ясное, положение вынужденное. Кожные покровы бледно-розовые. Язык сухой, обложен белым налетом у корня. В легких везикулярное дыхание, хрипы не выслушиваются. АД 130/90 мм рт.ст., ЧСС - 66 уд. в мин. При пальпации живота отмечается резкая болезненность в эпигастрии. Печень не увеличена. Селезенка не пальпируется. Симптомы раздражения брюшины сомнительные. Физиологические отправления не нарушены.

По результатам лабораторных исследований патологии не выявлено. По данным ультразвукового исследования органов брюшной полости обнаружена желчекаменная болезнь, признаки хронического калькулезного холецистита, хронического панкреатита, диффузные изменения печени. По ФЭГДС прободная язва луковицы двенадцатиперстной кишки среднего размера (0,9*0,8 см). Эрозивный гастрит. Повышенная секреторная активность слизистой желудка.

По результатам молекулярно-генетического исследования у больного выявлен повышенный уровень экспрессии микроРНК-155 - 2,346. Данный результат был трактован как высокий риск развития осложнений язвенной болезни. Стационарное лечение протекало без осложнений, больной выписан на 10 сутки с момента поступления в удовлетворительном состоянии. Больной находился под динамическим наблюдением в течение 12 месяцев. На 6 месяц от начала наблюдения больной был госпитализирован в хирургическое отделение с обострением язвенной болезни, осложненной кровотечением.

Пример 5.

Больная З., 51 года, обратилась к хирургу в поликлинику ГБУЗ РБ ГКБ 8 г. Уфы с жалобами на боли в животе, рвоту, слабость. В анамнезе гипертоническая болезнь. Вышеперечисленные жалобы наблюдались в течение 3 суток. Самостоятельно принимала обезболивающие препараты, за медицинской помощью обратилась к хирургу по месту жительства.

При осмотре состояние относительно удовлетворительное, сознание ясное, положение активное. Кожные покровы чистые, розовые. Язык влажный, чистый. В легких везикулярное дыхание, хрипы не выслушиваются. АД 135/85 мм рт.ст., ЧСС - 79 уд. в мин. При пальпации живота отмечается умеренная болезненность в эпигастральной области. Печень не увеличена. Селезенка не пальпируется. Симптомов раздражения брюшины нет. Физиологические отправления не нарушены.

По результатам лабораторных исследований патологических изменений не обнаружено. По данным ультразвукового исследования органов брюшной полости - патологии не обнаружено. По ФЭГДС эрозивный бульбит, дуоденит, обострение. Недостаточность привратника. Дуоденогастральный рефлюкс желчи. Косвенные признаки дискинезии желчевьшодящих путей.

По результатам молекулярно-генетического исследования у больной выявлен нормальный уровень экспрессии микроРНК-155 - 2,006. Данный результат был получен при исследовании больного с поверхностным гастритом и трактован, как отсутствие вероятности развития осложненной язвенной болезни. Больной прошел консервативную терапию. За 12 месяцев динамического наблюдения обострения заболевания, развития осложнений не наблюдалось.

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской диагностике, и может быть использовано для прогнозирования риска развития осложненной язвенной болезни двенадцатиперстной кишки. Производят биопсию двенадцатиперстной кишки с забором по одному биоптату на латеральной и медиальной стенках луковицы. Определяют уровень экспрессии микроРНК-155, вычисляют среднее арифметическое по результатам трех повторов. При значении 2.442±0.096 прогнозируют высокий риск развития осложненной язвенной болезни двенадцатиперстной кишки. Способ обеспечивает повышение точности прогнозирования высокого риска развития осложненной язвенной болезни двенадцатиперстной кишки за счет определения уровня экспрессии микроРНК-155 в биоптатах двенадцатиперстной кишки. 3 ил., 5 пр.

Способ прогнозирования риска развития осложненной язвенной болезни двенадцатиперстной кишки, включающий исследование слизистой, отличающийся тем, что производят биопсию двенадцатиперстной кишки с забором по одному биоптату на латеральной и медиальной стенках луковицы; проводят экстракцию общей РНК и микроРНК, определяют уровень экспрессии микроРНК-155, вычисляют среднее арифметическое по результатам трех повторов, и при его значении в биоптатах двенадцатиперстной кишки 2.442±0.096 прогнозируют высокий риск развития осложненной язвенной болезни двенадцатиперстной кишки.