СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА РАЗВИТИЯ ОСЛОЖНЕННОЙ ЯЗВЕННОЙ БОЛЕЗНИ ЖЕЛУДКА НА ОСНОВЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УРОВНЯ ЭКСПРЕССИИ МИКРОРНК-146А Российский патент 2024 года по МПК G01N33/58 C12Q1/6806 C12Q1/686 G16H50/30 

Предлагаемое изобретение относится к области медицины, а именно к медицинской диагностике, и может быть использовано для прогнозирования риска развития осложненной язвенной болезни желудка (ЯБЖ).

Известен способ оценки риска развития язвенной болезни двенадцатиперстной кишки у хакасов, на основе генетического анализа, который включает определение полиморфизма интерлейкина IL-8 методом рестрикционного анализа при выделении ДНК из лимфоцитов венозной крови и определение гена cagA Helicobacter pylori методом ПЦР при выделении ДНК из биоптатов слизистой оболочки желудка у пациентов, относящихся к коренным жителям Республики Хакасия - хакасам, установленным генотипам присваивают градации (А1-А2) и числовые значения, определяют прогностические коэффициенты P1, Р2 по формулам: Р1=-17,26+20,9*А1+5,35*А2, Р2=-40,89+6,05*А1+36,25*А2, где А1 - носительство гена cagA Helicobacter pylori: cagA-положительные -2, cagA-отрицательные - 1; А2 - генотип полиморфизма -251 Т>А гена IL-8: АА=3,15, ТА=0,40, ТТ=1,08; и при Р1>Р2 прогнозируют низкий риск, а при Р1<Р2 прогнозируют высокий риск развития ЯБ [патент RU 2563828 С1, 2015].

Известен способ прогнозирования риска развития язвенной болезни двенадцатиперстной кишки у неродственных русских индивидуумов, уроженцев Центрально-Черноземного региона РФ, включающий забор венозной крови, выделение ДНК из периферической венозной крови, анализ полиморфных локусов rsl7576-rs3787268-rs2250889 гена ММР-9 и прогнозирование высокого риска развития язвенной болезни двенадцатиперстной кишки у индивидуумов при выявлении гаплотипа GGC полиморфных локусов rsl7576-rs3787268-rs2250889 гена ММР-9 [патент RU 2782304 С1, 2022].

Известен способ прогнозирования риска развития язвенной болезни желудка у неродственных русских индивидуумов, уроженцев Центрально-Черноземного региона РФ, включающий забор венозной крови, выделение ДНК из периферической венозной крови, анализ полиморфных маркеров гена ММР-9, отличающийся тем, что высокий риск развития язвенной болезни желудка прогнозируют при выявлении гаплотипа CCGA полиморфных локусов rs3918242-rs3918249-rsl7576-rs3787268 гена ММР-9 [патент RU 2780505, 2022].

Основным недостатком вышеперечисленных методов является -невозможность прогнозирования течения язвенной болезни. В первом случае авторы определяют полиморфизм интерлейкина IL-8 методом рестрикционного анализа и наличие гена cagA Helicobacter pylori методом ПЦР. Подсчет риска развития язвенной болезни производится по прогностическим коэффициентам и специальным формулам, что требует больших затрат времени. Bo-втором и в-третьем случае, при анализе полиморфных маркеров гена ММР-9, высокий риск развития язвенной болезни прогнозируют при выявлении гаплотипов GGC и CCGA. Однако данные гаплотипы являются неспецифичными и могут определяться при других заболеваниях.

Известен способ раннего прогнозирования развития язвенной болезни двенадцатиперстной кишки у европеоидов Республики Хакасия, который включает выделение ДНК из лимфоцитов венозной крови и выявление генотипа СС АА полиморфизма +3953 гена IL-1β методом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов и R2R2 IL-IRa VNTR у пациентов носителей генотипа sls2 vacA Helicobacter pylori методом полимеразной цепной реакции; установленным факторам риска присваивают градации (А1-А2) и числовые значения; после чего определяют прогностические коэффициенты P1, P2 по формулам

P1=-1,54+0,57*А1+0,53*A2,

P2=0,21+1,77*A1+1,70*A2, где Al - генотип полиморфизма C+3953T гена IL-1β: TT=0,44, TC=0,51, СС=2,63; А2 - генотип полиморфизма гена IL-1Ra VNTR: R2R2=1,74, R2R3=8,08, R2R4=1,33, R3R3=1,59, R3R4=0,30, R4R4=0,51; при P1>P2 прогнозируют низкий риск, а при P1<P2 прогнозируют высокий риск развития ЯБ [патент RU, 2542459 С1, 2022].

Данный аналог зарекомендовал себя, как способ раннего прогнозирования развития язвенной болезни двенадцатиперстной кишки у европеоидов Республики Хакасия. Из этого следует, что метод применим лишь для ограниченного круга людей. Авторы способа прогнозирования не рассматривали пациентов с язвенной болезнью желудка, что также ограничивает область его применения. В методе предлагается рассчитать риск по специальным формулам, указанным выше. Однако работа с формулами подразумевает длительную работу, как с материалом, так и с результатами.

Наиболее близким аналогом изобретения является способ прогнозирования осложненного течения язвенной болезни двенадцатиперстной кишки, включающий исследование показателей рН-метрии желудка, отличающийся тем, что при проведении суточной рН-метрии оценивают ощелачивающую функцию желудка по показателям рН и длительности закисления в антральном отделе, продолжительности дуоденогастрального рефлюкса - средние, дневные и ночные показатели, и при значении рН антрума среднем 2,8±0,22, днем 2,7±0,28, ночью 2,8±0,18, длительности закисления в антруме средней 66±2,8%, днем 64±2,7%, ночью 70±2,8% и продолжительности дуоденогастрального рефлюкса средней 19±1,9%, днем 18±2,1%, ночью 21±1,8% прогнозируют осложненное течение язвенной болезни двенадцатиперстной кишки [заявка RU 2007124068, 2009].

Однако больные с язвенной болезнью могут иметь противопоказания к проведению пробы, что ограничивает область ее применения. Суточное исследование предполагает нахождение больного во время исследования в условиях стационара. Прием некоторых препаратов (антисекреторные, нестероидные противовоспалительные средства и др.) может влиять на результаты прогноза.

Задачей изобретения является разработка способа прогнозирования течения язвенной болезни желудка с формированием осложненных форм на основании определения уровня экспрессии микроРНК-146а в биоптатах желудка у больных с язвенной болезнью.

Техническим результатом при использовании изобретения является повышение точности прогнозирования высокого риска развития осложненной язвенной болезни желудка.

Предлагаемый способ прогнозирования риска развития осложненной язвенной болезни желудка осуществляется следующим образом. Согласно клиническим рекомендациям, больным с язвенной болезнью рекомендуется проведение множественной щипцовой биопсии из краев язвенного дефекта при локализации язвы в желудке и вне краев раны при локализации язвы в двенадцатиперстной кишке. Для определения уровня экспрессии микроРНК-146а биопсию проводят в участках слизистой желудка, рекомендованных для эндоскопической диагностики Н.Pylori. При этом предполагаемый уровень экспрессии микроРНК-146а в участках биопсии и в участке с язвенным дефектом был равнозначный.

С согласия больных во время эндоскопического исследования (ФЭГДС) производят биопсию желудка: 2 биоптата в области тела и в антральном отделе по большой кривизне, 1 биоптат по малой кривизне в области тела. Экстракцию общей РНК и микроРНК проводят с использованием специального набора (Direct-zol™ RNA MiniPrep (Zymo Research)) и с использованием колонки (Zymo-Spin™ II С) согласно инструкции к наборам. Уровень экспрессии микроРНК измеряют методом ПЦР в режиме реального времени с использованием специального набора для анализа микроРНК PCR TaqMan MicroRNA Assays (Applied Biosystems) и системы ПЦР-детекции в режиме реального времени CFX96™ (BioRad). Все реакции проводят в трех повторах для каждого образца. Определяют среднее арифметическое, посчитанное по результатам трех повторов. Для количественной оценки экспрессии микроРНК используют метод 2^-ΔΔCt, предложенный K.J. Livak и соавтором [К.J. Livak, Т.D. Schmittgen., 2001]. Данный метод основан на предположении, что разница в пороге цикла (ΔCt) между геном-мишенью и эталонным геном пропорциональна относительной экспрессии гена-мишени. Малая ядерная РНК U6, характеризующаяся стабильной экспрессией в различных тканях и клетках, используется в качестве эндогенного контроля.

ΔΔCt рассчитывают по формуле:

ΔΔCt = (CtmiR-CtRNU6B) опытный образец - (CtmiR-CtRNU6B) контрольный образец

Ct -пороговое значение цикла, полученное в ходе проведения ПЦР. Достоверным считали различия при р≤0.05.

При значении уровня экспрессии микроРНК-146а в биоптатах желудка 2,904±0,153 прогнозируют высокий риск развития осложненной язвенной болезни желудка.

Уровень экспрессии микроРНК-146а был статистически значимо выше у пациентов при язвенной болезни желудка (2,904±0,153; р-value=0.0001).

Для анализа данных используют MS Office Excel (Microsoft) и программные обеспечения GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, Inc, La Jolla, CA). Равенство дисперсий в распределении признаков проверяют с помощью U-критерия Манна-Уитни.

Новизна изобретения заключается в том, что для определения течения язвенной болезни используется оценка уровня экспрессии микроРНК-146а.

Изобретение иллюстрируется следующими фигурами: фиг. 1 - анализ экспрессии микроРНК-146а у пациентов с язвенной болезнью желудка; ЭГ- эрозивный гастрит, ПГ-поверхностный гастрит, фиг. 2 -точечный график, показывающий результаты анализа обогащения пути KEGG для подтвержденных мишеней miRNA-146a., N. of Genes -количество генов, фиг. 3-сигнальный путь Toll-подобного рецептора, включающий подтвержденные гены-мишени miRNA-146a (выделены красным) согласно базе данных KEGG.

Мы провели анализ экспрессии микроРНК-146а с использованием ПЦР в режиме реального времени у 20 пациентов с язвенной болезнью желудка, а также у 19 пациентов с эрозивным и 31 с поверхностным гастритом. Дифференциальная экспрессия микроРНК-146а наблюдалась между группами пациентов с осложненным течением ЯБЖ по сравнению с пациентами с эрозивным и поверхностным гастритом.

Уровень экспрессии микроРНК-146а был статистически значимо выше у пациентов при язвенной болезни желудка (2,904±0,153; р-value=0.0001) по сравнению с уровнями экспрессии микроРНК-146а у пациентов с эрозивным и поверхностным гастритом (2,465±0,151; 1,823±0,123; p- value>0.005)(Фиг. 1а-е).

Мы также проанализировали подтвержденные мишени микроРНК-146а из баз данных MirBase, miRDB и MirTarBase для анализа регуляции генов в патогенезе язвенной болезни (Фиг. 2).

Наиболее значимым обогащенным путем был сигнальный путь Toll-подобного рецептора, который включает проанализированные гены MyD88, TRAF5, IRAK1 и IL-8 (Фиг. 3).

Полученные результаты позволяют предположить, что повышенный уровень экспрессии микроРНК-146а у пациентов с язвенной болезнью желудка может служить потенциальными прогностическими маркером осложненного течения заболевания.

Сущность изобретения поясняется следующими клиническими примерами:

Пример 1

Больной Ф., 67 лет, обратился к хирургу в поликлинику ГБУЗ РБ ГКБ 8 г. Уфы с жалобами на боли в животе, однократную рвоту, тошноту, тяжесть в эпигастрии. В анамнезе установленная язвенная болезнь. Вышеперечисленные жалобы наблюдались в течение 10 дней. Самостоятельно дома принимал омепразол, алмагель. В связи с усилением болевого синдрома обратился к хирургу по месту жительства.

При осмотре состояние относительно удовлетворительное, сознание ясное, положение вынужденное. Кожные покровы чистые, розовые. Язык влажный, чистый. В легких везикулярное дыхание, хрипы не выслушиваются. АД 130/90 мм рт.ст., ЧСС - 62 уд. в мин. При пальпации живота отмечается умеренная болезненность в эпигастральной области. Печень не увеличена. Селезенка не пальпируется. Симптомов раздражения брюшины нет. Физиологические отправления не нарушены.

Обследован в амбулаторных условиях. Данные клинического анализа крови: гемоглобин 112 г/л, эритроциты 4,1×10¹²/л, лейкоциты 6,2×10⁹/л, тромбоциты 232×10⁹/л, СОЭ 11 мм/час, MCV 83,1 фл, МСН 28,4 пк, МСНС 34,1 г/дл, гематокрит 37,4%. Биохимический анализ крови: общий билирубин 13,7 мкмоль/л, общий белок 68 г/л, глюкоза 6,0 ммоль/л, мочевина 3,3 ммоль/л, креатинин 77 мкмоль/л. Коагулограмма: ПТВ 13,1¨, фибриноген 2,8 г/л. По результатам лабораторных исследований патологических изменений не обнаружено.

По данным ультразвукового исследования органов брюшной полости - признаки хронического панкреатита.

По ФЭГДС язва тела желудка средних размеров (1,0*1,1 см).

По результатам молекулярно-генетического исследования у больного выявлен повышенный уровень экспрессии микроРНК-146а - 3,057. Больному было выписано стандартное лечение, однако, на 10 сутки после установления диагноза наступило ухудшение состояния. У больного появились жалобы на рвоту, черный стул, головокружение и слабость. Бригадой СМП доставлен в стационар ГБУЗ РБ ГКБ 8. На повторной ФЭГДС язва тела желудка, продолжающееся кровотечение по Ф1с.

Пример 2

Больная О., 53 года, поступила в хирургическое отделение ГБУЗ РБ ГКБ №8 г. Уфы с жалобами на боли в эпи-, мезогастрии, тошноту, слабость. Вышеперечисленные жалобы наблюдались в течение 5 суток. Лечился самостоятельно дома, принимала обезболивающие препараты. В связи с усилением болей, обратилась в приемный покой стационара за медицинской помощью.

При осмотре состояние средней степени тяжести, сознание ясное, положение активное. Кожные покровы бледно-розовые. Язык сухой, обложен белым налетом. В легких везикулярное дыхание, хрипы не выслушиваются. АД 110/80 мм рт.ст., ЧСС - 62 уд. в мин. При пальпации живота отмечается умеренная болезненность в эпигастрии. Печень не увеличена. Селезенка не пальпируется. Симптомы раздражения брюшины отрицательные. Физиологические отправления не нарушены.

Данные клинического анализа крови: гемоглобин 131 г/л, эритроциты 3,3×10¹²/л, лейкоциты 3,8×10⁹/л, тромбоциты 73×10⁹/л, СОЭ 6 мм/час, MCV 81,0 фл, МСН 27,2 пк, МСНС 30,9 г/дл, гематокрит 39,6%. Биохимический анализ крови: общий билирубин 52,4 мкмоль/л, общий белок 64,6 г/л, глюкоза 4,9 моль/л, мочевина 4,2 ммоль/л, креатинин 38,5 мкмоль/л. Коагулограмма: ПТВ 11,8¨, фибриноген 3,6 г/л. По результатам лабораторных исследований выявлена эритропения, тромоцитопения, лейкопения, гипербилирубинемия, снижение уровня креатинина.

По данным ультразвукового исследования органов брюшной полости выявлена гепатоспленомегалия, диффузные изменения печени по типу хронического гепатита.

По ФЭГДС множественные острые язвы желудка. Остановившееся кровотечение с угрозой возобновления по Форрест 2а. Поверхностный гастрит. Эндоклипирование.

По результатам молекулярно-генетического исследования у больной выявлен повышенный уровень экспрессии микроРНК-146а - 2,751. Данный результат был трактован как высокий риск развития осложнений язвенной болезни. Стационарное лечение протекало без осложнений, больной выписан на 14 сутки с момента поступления в удовлетворительном состоянии. Больная находилась под динамическим наблюдением в течение 12 месяцев. На 11 месяцев от начала наблюдения больной был госпитализирован в хирургическое отделение с обострением язвенной болезни, осложненной кровотечением.

Пример 3

Больной Г., 28 лет, поступил в хирургическое отделение ГБУЗ РБ ГКБ №8 г. Уфы с жалобами на боли в животе, тошноту, изжогу. Вышеперечисленные жалобы наблюдались в течение 2 недели. Наблюдался у терапевта по месту жительства с диагнозом - обострение хронического панкреатита. В связи с усилением болезненности в эпигастрии был направлен на ФЭГДС, где выявлена язва малой кривизны желудка, направлен на стационарное лечение.

При осмотре состояние относительно удовлетворительное, сознание ясное, положение активное. Кожные покровы бледно-розовые. Язык влажный, обложен белым налетом у корня. В легких везикулярное дыхание, хрипы не выслушиваются. АД 115/70 мм рт. ст., ЧСС - 90 уд. в мин. При пальпации живота отмечается умеренная болезненность в эпигастральной области. Печень не увеличена. Селезенка не пальпируется. Симптомов раздражения брюшины нет. Физиологические отправления не нарушены.

Per rectum: При внешнем осмотре области ануса без патологических образований. Сфинктер в нормотонусе. На расстоянии 6 см от ануса патологических образований, нависания стенок, болезненностей не выявлено. Ампула пустая, на перчатке стул коричневого цвета.

Данные клинического анализа крови: гемоглобин 119 г/л, эритроциты 4,23×10¹²/л, лейкоциты 4,78×10⁹/л, тромбоциты 213×10⁹/л, СОЭ 10 мм/час, MCV 87,0 фл, МСН 27,6 пк, МСНС 34,0 г/дл, гематокрит 41,5%. Биохимический анализ крови: общий билирубин 10,5 мкмоль/л, общий белок 70,2 г/л, глюкоза 4,1 ммоль/л, мочевина 5,9 ммоль/л, креатинин 89,3 мкмоль/л. Коагулограмма: ПТВ 12,0¨, фибриноген 3,7 г/л. По результатам лабораторных исследований патологических изменений не выявлено.

По данным ультразвукового исследования органов брюшной полости признаки хронического панкреатита.

По ФЭГДС язва малой кривизны желудка размерами 0,3*0,5 см. Заключение: Язва малой кривизны желудка малого размера.

По результатам молекулярно-генетического исследования у больной выявлен нормальный уровень экспрессии микроРНК-146а - 1,842. Данный результат был трактован как низкий риск развития осложнений язвенной болезни. Стационарное лечение протекало без осложнений, больной выписан на 8 сутки с момента поступления в удовлетворительном состоянии. За 12 месяцев динамического наблюдения обострения заболевания, развития осложнений не наблюдалось.

Пример 4

Больная С, 40 лет, проходила плановое обследование в поликлинике ГБУЗ РБ ГКБ 8 г. Уфы перед оперативным лечением по поводу желчекаменной болезни. Из жалоб отмечала периодические боли в правом подреберье, тошноту, горечь во рту, слабость. Вышеперечисленные жалобы наблюдались в течение длительного времени, по УЗИ ОБП ранее обнаружены конкременты в желчном пузыре размерам до 1 см. Самостоятельно дома не лечилась, при болях принимала спазмолитические препараты.

При осмотре состояние относительно удовлетворительное, сознание ясное, положение активное. Кожные покровы чистые, розовые. Язык влажный, чистый. В легких везикулярное дыхание, хрипы не выслушиваются. АД 120/80 мм рт. ст., ЧСС - 85 уд. в мин. При пальпации живота отмечается умеренная болезненность в эпигастральной области, в правом подреберье. Печень не увеличена. Селезенка не пальпируется. Симптомов раздражения брюшины нет. Физиологические отправления не нарушены.

По лабораторным анализам патологических изменений не обнаружено. По данным ультразвукового исследования органов брюшной полости - желчекаменная болезнь (конкременты размером до 1,2 см), хронический калькулезный холецистит. По ФЭГДС впервые установлен диагноз - эрозивный гастрит, обострение. Дуодено-гастральный рефлюкс желчи.

По результатам молекулярно-генетического исследования у больной выявлен нормальный уровень экспрессии микроРНК-146а - 2,319. Данный результат был получен при исследовании больного с эрозивным гастритом и трактован, как отсутствие вероятности развития осложненной язвенной болезни. Больной прошел консервативную терапию. За 12 месяцев динамического наблюдения обострения заболевания, развития осложнений не наблюдалось.

Пример 5

Больная Т., 57 лет, обратилась в поликлинику ГБУЗ РБ ГКБ №8 г. Уфы к хирургу с жалобами на боли в животе, слабость. Вышеперечисленные жалобы наблюдались в течение 5 суток.

При осмотре состояние относительно удовлетворительное, сознание ясное, положение активное. Кожные покровы бледно-розовые. Язык влажный, обложен белым налетом у корня. В легких везикулярное дыхание, хрипы не выслушиваются. АД 120/85 мм рт. ст., ЧСС - 69 уд. в мин. При пальпации живота отмечается умеренная болезненность в эпигастрии. Печень не увеличена. Селезенка не пальпируется. Симптомы раздражения брюшины сомнительные. Физиологические отправления не нарушены.

По результатам лабораторных исследований и ультразвукового исследования патологии не выявлено. По ФЭГДС поверхностный гастрит, бульбит.

По результатам молекулярно-генетического исследования у больной выявлен повышенный уровень экспрессии микроРНК-146а - 1,853. Данный результат был получен при исследовании больного с поверхностным гастритом и трактован, как отсутствие вероятности развития осложненной язвенной болезни. Больной прошел консервативную терапию. За 12 месяцев динамического наблюдения обострения заболевания, развития осложнений не наблюдалось.

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской диагностике, и может быть использовано для прогнозирования риска развития осложненной язвенной болезни желудка. Производят биопсию желудка с забором двух биоптатов: в области тела и в антральном отделе по большой кривизне, одного биоптата по малой кривизне в области тела. Определяют уровень экспрессии микроРНК-146а, вычисляют среднее арифметическое по результатам трех повторов. При значении 2,904±0,153 прогнозируют высокий риск развития осложненной язвенной болезни желудка. Способ обеспечивает повышение точности прогнозирования высокого риска развития осложненной язвенной болезни желудка за счет определения уровня экспрессии микроРНК-146а в биоптатах желудка. 3 ил., 5 пр.

Способ прогнозирования риска развития осложненной язвенной болезни желудка, включающий исследование слизистой желудка, отличающийся тем, что производят биопсию желудка с забором двух биоптатов, в области тела и в антральном отделе по большой кривизне, одного биоптата по малой кривизне в области тела; проводят экстракцию общей РНК и микроРНК, определяют уровень экспрессии микроРНК-146а, вычисляют среднее арифметическое по результатам трех повторов и при его значении в биоптатах желудка 2,904±0,153 прогнозируют высокий риск развития осложненной язвенной болезни желудка.