Система иммуноферментного анализа для определения антител класса А (IgA) против полиовируса в слюне людей для оценки уровня мукозального иммунитета к данному вирусу Российский патент 2024 года по МПК G01N33/53 

Область техники

Изобретение относится к биотехнологии, иммунологии, вакцинологии и вирусологии и предназначено для определения специфических антител класса А (IgA) против полиовируса (типы 1-3) в слюне человека методом иммуноферментного анализа (ИФА) для оценки уровня мукозального иммунитета к данному вирусу при массовых сероэпидемиологических исследованиях и оценки эффективности вакцинации полиовирусными вакцинами.

Уровень техники

Иммунитет слизистой оболочки играет значительную роль в иммунном ответе против полиовируса, а антитела класса А (IgA) в местных секретах (например, в слюне) являются фактором защиты и могут также служить важным маркером иммунитета, особенно индуцированного пероральной полиомиелитной вакциной. Из уровня техники известен документ Ivanov A., Dragunsky E., Ivanova O., Rezapkin G., Potapova S., Chumakov K. Determination of poliovirus-specific IgA in saliva of Oral Poliovirus Vaccine recipients by three ELISA tests. J Virol Meth 2005, v.126, pp. 45-52, в котором описаны 3 варианта ИФА для определения IgA против полиовирусов 1-3 типов в образцах слюны реципиентов оральной полиовирусной вакцины:

- 1) с сенсибилизацией твёрдой фазы анти-IgA («альфа» ИФА), затем инкубация с образцом исследуемой слюны, затем инкубация со стандартным антигеном полиовируса, затем инкубация с биотинилированным IgG против полиовируса и экстравидин-пероксидазным конъюгатом;

- 2) ИФА в варианте нейтрализации – смесь стандартного антигена полиовируса и исследуемого образца слюны добавляется в лунки иммунопанели, сенсибилизированные IgG кролика против полиовируса;

- 3) сенсибилизация иммунопанели IgG против полиовируса, затем добавление стандартного антигена полиовируса, инкубация с исследуемым образцом слюны и добавление коммерческого пероксидазного конъюгата против IgA человека.

Представленные варианты ИФА трудоёмки и сложны в исполнении (используются многослойные «сэндвичи»). Поэтому сохраняется необходимость в разработке простого и эффективного способа ИФА, позволяющего определять антитела класса А (IgA) к полиовирусу типов 1-3 в образцах слюны людей.

Раскрытие изобретения

Задача настоящего изобретения заключается в конструировании системы ИФА, позволяющей определять антитела класса А (IgA) к полиовирусу типов 1-3 в образцах слюны человека («бескровная диагностика») для оценки уровня мукозального иммунитета к полиовирусу.

Поставленная задаче решается в результате осуществления способа определения антител класса A (IgA) против полиовируса 1, 2 и/или 3 типов в образце слюны человека иммуноферментным анализом (ИФА), характеризующийся тем, что в качестве иммуносорбента используют очищенный до уровня вирионов антиген полиовируса 1, 2 и/или 3 типов.

В частных вариантах воплощения изобретения способ включает следующие этапы:

а) нанесение иммуносорбента на лунки иммунопанели;

б) нанесение в параллельные лунки иммунопанели контрольного иммуносорбента;

в) инкубирование во влажной атмосфере;

г) промывка лунок иммунопанели;

д) внесение в лунки иммунопанели 1 % раствора фетальной сыворотки телёнка в буферном растворе и инкубирование во влажной атмосфере;

е) промывка лунок иммунопанели, внесение в лунки образца слюны и инкубирование во влажной атмосфере;

ж) внесение в лунки иммунопанели пероксидазного конъюгата против иммуноглобулина класса A (IgA) человека, инкубирование во влажной атмосфере;

з) промывка лунок иммунопанели, внесение субстрат-индикаторного раствора – тетраметилбензидина, инкубирование при комнатной температуре;

и) внесение в лунки иммунопанели раствора серной кислоты;

к) измерение оптической плотности при длине волны 450 нм.

В частных вариантах воплощения изобретения иммунопанель имеет высокую сорбционной ёмкостью до 500 нанограмм белка/см².

В частных вариантах воплощения изобретения инкубирование на стадии в) осуществляют 18 часов при + 4-8º С.

В частных вариантах воплощения изобретения инкубирование на стадии д) осуществляют 1 час при температуре + 37º С.

В частных вариантах воплощения изобретения инкубирование на стадии е) осуществляют 2 часа при + 37º С или 18 часов при + 4-8º С.

В частных вариантах воплощения изобретения инкубирование на стадии ж) осуществляют 1 час при + 37º С.

В частных вариантах воплощения изобретения инкубирование на стадии з) осуществляют в темноте в течение 25-30 минут.

В результате осуществления изобретения достигаются следующие технические результаты:

- разработан простой и эффективный способ определения антител класса A (IgA) против полиовируса в образцах слюны человека иммуноферментным анализом (ИФА), позволяющей определять антитела класса А (IgA) к полиовирусу типов 1-3 в образцах слюны человека («бескровная диагностика») для оценки уровня мукозального иммунитета к полиовирусу, где в качестве иммуносорбента используют очищенный до уровня вирионов антиген полиовируса;

- разработанный способ по изобретению позволяет проводить массовую и быструю диагностику в широких популяциях и в короткие сроки с целью оценки уровень популяционного иммунитета;

- разработанный способ по изобретению позволяет оценить уровень мукозального иммунитета, а также позволяет оценить эффективность вакцинации в конкретной популяции;

- разработанный способ по изобретению характеризуется простотой выполнения, безопасностью, взятие образцов для осуществления способа безболезненно, что особенно актуально, если субъектами являются дети;

- разработанный способ по изобретению характеризуется отсутствием возможных неспецифических взаимодействий.

Подробное раскрытие изобретения

Определения (термины)

Для лучшего понимания настоящего изобретения ниже приведены некоторые термины и аббревиатуры, использованные в настоящем описании изобретения. Следующие определения применяются в данном документе, если иное не указано явно.

В настоящем описании и в последующей формуле изобретения, если контекстом не предусмотрено иное, слова «иметь», «включать» и «содержать» или их вариации, например такие как «имеет», «имеющий», «включает», «включающий», «содержит» или «содержащий», следует понимать, как включение указанного целого или группы целых, но не исключение любого другого целого или группы целых. Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».

Также здесь перечисление числовых диапазонов по конечным точкам включает все числа, входящие в этот диапазон.

Под типами полиовируса, или вируса полиомиелита, понимают три существующих в природе серотипа дикого полиовируса - тип 1, тип 2 и тип 3, каждый из которых имеет несколько отличающийся капсидный протеин. На текущем заключительном этапе ликвидации полиомиелита в эндемичных районах продолжают циркулировать только дикие полиовирусы типа 1 и 3.

При осуществлении настоящего изобретении могут быть использованы как "дикие" штаммы полиовируса, так и различные модифицированные или аттенуированные штаммы полиовируса, например штамм Сэбин.

Если не определено отдельно, технические и научные термины в данной заявке имеют стандартные значения, общепринятые в научной и технической литературе.

Осуществление изобретения

Нижеследующие примеры осуществления изобретения приведены в целях раскрытия характеристик настоящего изобретения и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения.

Пример 1. Получение препарата очищенного антигена.

Приготовление антигенов полиовируса «диких» или сэбиновских (аттенуированных штаммов), типы 1-3. Очистку антигенов проводят по известным методикам, например: вируссодержащую культуральную жидкость (клетки Vero, титр вируса не менее 9 lg ТЦД₅₀/мл) осветляют, концентрируют, инактивируют вирус формальдегидом, очищают гель-фильтрацией и ионообменной хроматографией. Полученный антиген используют в качестве стандартного антигена (иммуносорбента) в предлагаемом варианте ИФА. Методика приготовления антигена (иммуносорбента) подробно изложена в следующей публикации А. П. Иванов и др./ Экспериментальные подходы к разработке инактивированной полиовирусной вакцины на основе штаммов Сэбина. Эпидемиология и Вакцинопрофилактика/ 2016, 4, 59-63.

Пример 2. Осуществление способа по изобретению

1. В лунки иммунопанели с высокой сорбционной ёмкостью (например, Costar, кат. № 9018 или SPL LifeSciences, кат. № 32296) вносят по 0,1 мл препарата очищенного антигена (А. П. Иванов и др./ Экспериментальные подходы к разработке инактивированной полиовирусной вакцины на основе штаммов Сэбина/ Эпидемиология и Вакцинопрофилактика/ 2016, 4, 59-63) в концентрации 10 мкг/мл в карбонат-бикарбонатном буфере, pH 9,6 (Sigma, кат. № С3041-100 CAP). В параллельные лунки вносят контрольный очищенный антиген, например, вируса желтой лихорадки или хантавирусов или других не энтеровирусов (контрольный антиген) в такой же концентрации, как и препарат очищенного антигена, упомянутый выше. Панель накрывают крышкой и инкубируют во влажной атмосфере 18 часов при + 4-8º С (стандартные условия).

2. Содержимое лунок вытряхивают, панель постукивают по нескольким слоям фильтровальной бумаги (в положении вверх дном) для удаления остатков антигена. Лунки промывают 2 раза фосфатно-солевым буфером (ФСБ) рН 7,2 (Sigma, кат. № Р4417-100ТАВ) с 0,05 % Tween-20 (Sigma, кат. № Р1379-100ml) – ФСБ-Т, внося раствор до края лунок и сразу же удаляют его. Вносят в лунки по 0,2 мл 1 % раствора фетальной сыворотки телёнка (ФС, Gibco или аналог) в ФСБ (ФСБ-ФС), панель накрывают крышкой и инкубируют 1 час при температуре + 37º С во влажной атмосфере (стандартные условия). Это процедура блокирования свободных сайтов лунок панели индифферентным белком.

3. Блокирующий раствор удаляют, лунки промывают 2 раза ФСБ-Т, как описано выше. Вносят в опытные и контрольные лунки по 0,1 мл образца слюны в разведениях, начиная с 1:16 в ФСБ-ФС с 0,05 % Tween-20 (ИФА-буфер). Панель накрывают крышкой и инкубируют 2 часа при + 37º С или 18 часов при + 4-8º С во влажной атмосфере. Это фаза связывания специфического IgA с исследуемым антигеном.

4. Содержимое лунок удаляют, лунки промывают 5 раз ФСБ-Т, как описано выше. Вносят в лунки по 0,1 мл коммерческого пероксидазного конъюгата против иммуноглобулина класса A (IgA) человека (Sigma, кат. № A0295 – 1 ml). Панель накрывают крышкой и инкубируют 1 час при + 37º С во влажной атмосфере (стандартные условия). Это фаза детекции комплекса исследуемого IgA со стандартным антигеном.

5. Содержимое лунок удаляют, лунки промывают 5 раз ФСБ-Т, как описано выше. Вносят в лунки по 0,1 мл готового субстрат-индикаторного раствора – тетраметилбензидина (ТМБ, Sigma, кат. № ТО440-100ml). Панель инкубируют в темноте 25-30 минут при комнатной температуре.

6. Вносят в лунки по 0,05 мл 2М раствора серной кислоты (остановка ферментной реакции).

7. Результат немедленно считывают в ИФА-ридере (любая доступная модель, например: Multiscan FC, Thermo Scientific; MR-96A, Mindray; StatFax 2100, Awareness Technology) по абсорбции при длине волны 450 нм. Результат считается положительным при отношении оптической плотности (ОП) лунок со стандартным антигеном полиовируса к ОП контрольных лунок ≥ 2,1 (P/N).

Оценка уровня мукозального иммунитета (определение анти-полиовирусных IgA в образцах слюны) позволяет выяснить уровень защищённости от полиовирусной инфекции в данной популяции, поскольку входными воротами полиовирусов является глотка, которую и защищает слюна, содержащая анти-полиовирусные IgA. Оценка уровня мукозального иммунитета также позволит судить об эффективности вакцинации в конкретной популяции. Предложенный простой метод позволяет проводить массовую и быструю диагностику в широких популяциях и в короткие сроки оценивать уровень популяционного иммунитета. Определение анти-полиовирусных IgA о образцах слюны особенно актуально у детей (эффективность вакцинации, уровень защищённости от полиовирусной инфекции). Кроме того, важнейшим моментом является использование «бескровной диагностики» у детей, поскольку взятие образцов слюны у детей несравненно проще и безопаснее, нежели взятие образцов крови из вены.

В Таблице 1 представлены результаты определения IgA (оптические плотности) к «дикому» полиовирусу 1 типа (Махони) и к аттенуированному (Сэбин) 1 в образце слюны взрослого человека, вакцинированного живой и инактивированной полиовирусными вакцинами, посредством способа по изобретению. Из Таблицы 1 следует, что титр IgA к вирусу Махони составляет 1: 4096 - 1:8182; титр IgA к вирусу Сэбин1 – 1:4096.

Таблица 1. Результаты определения IgA (оптические плотности) к «дикому» полиовирусу 1 типа (Махони) и к аттенуированному (Сэбин) 1 в образце слюны взрослого человека.

Вирус (антиген)/разведение образца слюны 1:16* 1:64 1:256 1:1024 1:4096 1:16384 Махони (тип 1) 2,201** 1,142 0,661 0,415 0,234 0,137 Сэбин (тип 1) 1,564 0,727 0, 426 0,270 0,177 0,086 Негативный контроль (желтая лихорадка) 0,179 0,132 0,074 0,063 0,051 0,053 * разведение образца слюны;
** оптическая плотность при 450 нм.

В Таблице 2 представлены результаты определения IgA (оптические плотности) к «дикому» полиовирусу 2 типа (МЕФ-1) и к аттенуированному (Сэбин) 2 в образце слюны взрослого человека, вакцинированного живой и инактивированной полиовирусными вакцинами, посредством способа по изобретению. Из Таблицы 2 следует, что титр IgA к вирусу МЕФ-1 составляет 1: 2048; титр IgA к вирусу Сэбин 2 – 1: 2048.

Таблица 2 . Результаты определения IgA (оптические плотности) к «дикому» полиовирусу 2 типа (МЕФ-1) и к аттенуированному (Сэбин) 2 в образце слюны взрослого человека.

Вирус
(антиген)/разведение
образца слюны 1:16* 1:64 1:256 1:1024 1:4096 1:16384 МЕФ-1 (тип 2) 1,501** 1,012 0,478 0,251 0,108 0,089 Сэбин (тип 2) 1,24 0,624 0, 375 0,182 0,096 0,076 Негативный контроль (желтая лихорадка) 0,156 0,124 0,071 0,059 0,054 0,051 * разведение образца слюны;
** оптическая плотность при 450 нм.

В Таблице 3 представлены результаты определения IgA (оптические плотности) к «дикому» полиовирусу 3 типа (Сокетт) и к аттенуированному (Сэбин) 3 в образце слюны взрослого человека, вакцинированного живой и инактивированной полиовирусными вакцинами, посредством способа по изобретению. Из Таблицы 3 следует, что титр IgA к вирусу Сокетт составляет 1: 2048; титр IgA к вирусу Сэбин 3 – 1: 2048.

Таблица 3. Результаты определения IgA (оптические плотности) к «дикому» полиовирусу 3 типа (Сокетт) и к аттенуированному (Сэбин) 3 в образце слюны взрослого человека.

Вирус
(антиген)/разведение
образца слюны 1:16* 1:64 1:256 1:1024 1:4096 1:16384 Сокетт (тип 3) 1,625** 0,978 0,435 0,248 0,102 0,079 Сэбин (тип 3) 1,160 0,579 0, 315 0,163 0,085 0,061 Негативный контроль (желтая лихорадка) 0,159 0,112 0,075 0,067 0,057 0,052 * разведение образца слюны;
** оптическая плотность при 450 нм.

Помимо этого, было проведено сравнительное исследование, где данный образец слюны также исследовался на наличие IgA к трём полиовирусным штаммам Сэбина (1, 2, 3) в варианте «альфа» ИФА (J Virol Meth 2005, v.126, pp. 45-52), при этом титры IgA были аналогичны титрам, полученным предлагаемым методом. Таким образом, представленные в таблицах 1-3 результаты демонстрируют чувствительность способа ИФА по изобретению, сопоставимую с чувствительностью известных вариантов ИФА для определения анти-полиовирусных IgA в слюне людей при исследовании уровня мукозального иммунитета к полиовирусам – важнейшего показателя защищенности популяции. Наряду с этим заявленный метод является более быстрым и простым по сравнению с методом из документа J Virol Meth 2005, v.126, pp. 45-52.

Суммируя вышеизложенное, особенностью настоящего изобретения является использование нового и эффективного варианта ИФА для определения антител класса A (IgA) к полиовирусу (1-3 типы). Преимуществом данной системы является простота и более надёжная специфичность, поскольку используемый вариант ИФА представляет собой минимальный (трёхслойный) «сэндвич», где в качестве иммуносорбента используется очищенный антиген полиовируса. Степень очистки полиовируса на уровне вирионов, что соответствует требованиям для инактивированной полиовирусной вакцины (Expert committee on biological standardization, Geneva, 13 – to 17 October 2014; («Эпидемиология и Вакцинопрофилактика», 2016, 4, 59-63). Способ по изобретению не требует сенсибилизации иммунопанели специфическими антителами (поли- или моноклональными), получение которых сопряжено с известными трудностями (иммунизация животных для получения специфических антител с высокой аффинностью). Но основное преимущество простого «сэндвича» - отсутствие возможных неспецифических взаимодействий между, например, антителами для сенсибилизации иммунопанели и другими компонентами «сэндвича» (детекторными иммуноглобулинами, пероксидазным конъюгатом).

Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.

Изобретение относится к биотехнологии, иммунологии, вакцинологии и вирусологии и предназначено для определения антител класса A (IgA) к полиовирусу (типы 1-3) в образцах слюны людей методом иммуноферментного анализа (ИФА), где в качестве иммуносорбента используют очищенный до уровня вирионов антиген полиовируса, для определения уровня мукозального иммунитета к данному вирусу. Изобретение предлагает простой и эффективный способ определения антител класса A (IgA) против полиовируса для бескровной диагностики с целью оценки уровня популяционного мукозального иммунитета, взятие образцов для осуществления способа безболезненно, способ характеризуется отсутствием возможных неспецифических взаимодействий. 6 з.п. ф-лы, 3 табл., 2 пр.

1. Способ определения антител класса A (IgA) против полиовируса 1, 2 или 3 типа в образце слюны человека иммуноферментным анализом (ИФА), характеризующийся тем, что в качестве иммуносорбента используют очищенный до уровня вирионов антиген полиовируса 1, 2 или 3 типа соответственно, включающий следующие этапы:

а) нанесение иммуносорбента на лунки иммунопанели;

б) нанесение в параллельные лунки иммунопанели контрольного иммуносорбента;

в) инкубирование во влажной атмосфере;

г) промывка лунок иммунопанели;

д) внесение в лунки иммунопанели 1% раствора фетальной сыворотки телёнка в буферном растворе и инкубирование во влажной атмосфере;

е) промывка лунок иммунопанели, внесение в лунки образца слюны и инкубирование во влажной атмосфере;

ж) внесение в лунки иммунопанели пероксидазного конъюгата против иммуноглобулина класса A (IgA) человека, инкубирование во влажной атмосфере;

з) промывка лунок иммунопанели, внесение субстрат-индикаторного раствора – тетраметилбензидина, инкубирование при комнатной температуре;

и) внесение в лунки иммунопанели раствора серной кислоты;

к) измерение оптической плотности при длине волны 450 нм.

2. Способ по п.1, в котором иммунопанель имеет высокую сорбционную ёмкость до 500 нанограмм белка/см².

3. Способ по п.1, в котором инкубирование на стадии в) осуществляют 18 часов при +4-8°С.

4. Способ по п.1, в котором инкубирование на стадии д) осуществляют 1 час при температуре +37°С.

5. Способ по п.1, в котором инкубирование на стадии е) осуществляют 2 часа при +37°С или 18 часов при +4-8°С.

6. Способ по п.1, в котором инкубирование на стадии ж) осуществляют 1 час при +37°С.

7. Способ по п.1, в котором инкубирование на стадии з) осуществляют в темноте в течение 25-30 минут.