Способ определения антител к SARS-COV-2 в смешанной слюне Российский патент 2022 года по МПК G01N33/536 C12N15/00 

Изобретение относится к области вирусологии и иммунологии и может быть использовано в медицине при изучении коллективного иммунитета к SARS-CoV-2 и при оценке иммуногенности мукозальных вакцин против вируса SARS-CoV-2.

Инфекция COVID-19 является глобальной медико-социальной проблемой вследствие высокой заболеваемости и смертности. К инфекции восприимчивы люди всех возрастных категорий, но пожилое население и пациенты с сопутствующими заболеваниями в анамнезе особо подвержены риску серьезных последствий для здоровья [Muralidar S. et al. The emergence of COVID-19 as a global pandemic: Understanding the epidemiology, immune response and potential therapeutic targets of SARS-CoV-2 // Biochimie. - 2020. - T. 179. - C. 85-100.]. Против нового вируса у человека изначально нет иммунитета, он приобретается после перенесенной болезни или после вакцинации.

Вирус SARS-CoV-2 распространяется воздушно-капельным путем вдыхания распыленных в воздухе частиц. Ротовая полость так же, как и нос, является местом первого контакта ранее несенсибилизированного организма с опасным антигеном [Varghese P.М. et al. Host-pathogen interaction in COVID-19: Pathogenesis, potential therapeutics and vaccination strategies // Immunobiology. - 2020. - T. 225. - №. 6. - C. 152008.].

Достижение успехов в профилактике и лечении новой коронавирусной инфекции прежде всего связано с познанием биологических свойств возбудителя и закономерностей формирования иммунитета. Главным фактором специфического иммунитета против SARS-CoV-2 являются сывороточные и секреторные антитела, первые из которых циркулируют в кровяном русле и являются основным звеном гуморального иммунитета, а вторые - локализуются непосредственно на слизистых ротовой полости и верхних дыхательных путей и отражают состояние местного иммунитета [Russell M.W. et al. Mucosal immunity in COVID-19: a neglected but critical aspect of SARS-CoV-2 infection // Frontiers in Immunology. - 2020. - C. 3221.].

Выявление специфических антител к SARS-CoV-2 наряду с обнаружением вирусного генетического материала методом полимеразно-цепной реакции (ПЦР) является основным методом идентификации COVID-19. При разработке вакцин против коронавирусной инфекции, включая мукозальные [Suvorov A. et al. Construction of the Enterococcal Strain Expressing Immunogenic Fragment of SARS-Cov-2 Virus //Frontiers in Pharmacology. - 2021. - T. 12. - C. 807256-807256.], требуется разработка критериев иммуногенности. Ряд исследований, связанных с COVID-19, предполагают защитную роль клеточного и гуморального иммунитета у человека [Li G. et al. Coronavirus infections and immune responses //Journal of medical virology. - 2020. - T. 92. - №. 4. - C. 424-432.], но оценка параметров клеточного иммунитета является намного более трудоемкой и затратной по сравнению с выявлением антител, включая локальные IgA.

Ротовая полость не только является входными воротами для ряда инфекций. Состояние слизистой оболочки отражает состояние иммунитета всего организма, а слюна является ценным диагностическим материалом для диагностики целого ряда инфекций [Heaney J. L. J. et al. The utility of saliva for the assessment of anti-pneumococcal antibodies: investigation of saliva as a marker of antibody status in serum // Biomarkers. - 2018. - T. 23. - №. 2. - C. 115-122; Beelaert G. et al. Evaluation of the intercept oral specimen collection device with HIV assays versus paired serum/plasma specimens // Journal of virological methods. - 2016. - T. 234. - C. 164-168.], включая SARS-CoV-2 [Pisanic N. et al. COVID-19 serology at population scale: SARS-CoV-2-specific antibody responses in saliva //Journal of clinical microbiology. - 2020. - T. 59. -№. 1. - C. e02204-20.],

Задачей данного изобретения является разработка способа оценки локальных антител к вирусу SARS-COV-2 в смешанной слюне методом иммуноферментного анализа (ИФА) с с использованием рекомбинантного S-белка вируса SARS-CoV-2 (заявка 576). Смешанная слюна - это общий суммарный секрет больших и малых слюнных желез, помимо этого включающий микрофлору полости рта и продукты ее жизнедеятельности, детрит и слущенный эпителий, десневую жидкость, клетки иммунной защиты (лейкоциты и др.), а также назальную слизь и бронхиальные секреты. Часто в литературе употребляется термин «слюна», но понимают под этим словом именно смешанную слюну [Брещенко Е.Е., Быков И.М. Биохимия полости рта, ротовой и десневой жидкостей: учебно-методическое пособие. - Краснодар, 2018. - 63 с.].

Сущностью предлагаемого изобретения является разработка полуколичественного способа для определения содержания антител к вирусу SARS-CoV-2 в смешанной слюне. Поставленная задача решалась путем оптимизации условий протекания реакции, определения способа нормализации и верификации полученных данных путем сравнения с результатами других тестов по выявлению антител к S-белку вируса SARS-CoV-2 в крови и слюни.

Организация исследования.

В исследовании приняли участие 43 человека в возрасте от 20 до 67 лет, разделенные на 3 группы. Исследование одобрено Локальным этическим комитетом ФГБНУ «ИЭМ» (протокол №3/21 от 27.10.2021). От каждого участника было полученное письменное информированное согласие. Для подтверждения иммунологического статуса пациентов в трех исследуемых группах на основании наличия IgG в крови был использован коммерческий набор реактивов «SARS-CoV-2-IgG-ИФА-БЕСТ», Вектор-Бест, г. Новосибирск, Россия согласно прилагаемой к набору инструкции.

Сведения об исследуемых группах пациентов представлены в таблице 1.

Сбор смешанной слюны, обработка и хранение.

За день до сбора материалов каждый пациент получил следующие рекомендации:

1) Не употреблять спиртные напитки за сутки;

2) Не есть, не пить (кроме негазированной воды) за 2 часа до сбора слюны;

3) Негазированную воду рекомендовалось не употреблять за 1 час до сбора слюны;

4) Не чистить зубы, не использовать зубную нить и ирригатор за 2 часа до сбора слюны;

5) Не использовать жевательную резинку для стимуляции выделения слюны. Воздержаться от приема жевательной резинки за 2 часа до сбора слюны;

6) Не курить за 2 часа до сбора слюны;

7) Не пользоваться ополаскивателями для полости рта за 2 часа до сбора слюны;

8) Если в течение нескольких дней до исследования пациент постоянно или периодически принимал любые лекарственные препараты, ему следовало предупредить об этом исследователя.

Условия, сформулированные в письменном виде, должны были быть полностью выполнены перед сбором биологических материалов; в противном случае, пациент не допускался до исследования. Рекомендации были даны пациентам для исключения разбавления слюны (стимуляция слюноотделения, употребление жидкости и др.), для исключения пересушивания слизистой оболочки (курение, употребление алкоголя) и для исключения влияния лекарственных препаратов на ход исследования (к примеру, иммуномодуляторов).

Для исследование требовался однократный сбор нестимулированной смешанной слюны (в состоянии покоя). Пациенту было предложено занять удобное сидячее положение и проглотить всю накопившуюся за длительное время слюну. Далее испытуемый опускал голову вниз, и с этого момента не глотал слюну, а также не двигал губами и языком во время всего периода сбора слюны. Исходя из наблюдения, в среднем слюна накапливалась в полости рта в течение 2 мин, а затем под силой тяжести стекала в приемный сосуд, который удерживался исследователем.

Образцы слюны были заморожены в соответствии с существующими стандартами хранения биологических жидкостей и хранились в морозильной камере при постоянной температуре -20°С.

Образцы слюны были исследованы методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием в качестве антигена рекомбинантного белка S1 SARS-CoV-2, разработанного в отделе молекулярной микробиологии «ИЭМ» [Suvorov A. et al. Construction of the Enterococcal Strain Expressing Immunogenic Fragment of SARS-Cov-2 Virus // Frontiers in Pharmacology. -2021. - T. 12. - C. 807256-807256.]. Рекомбинантный белок включает часть рецептор-связывающего домена (RBD) белка S1 вируса SARS-CoV-2, экспрессирован в E. coli и очищен, как указано в цитируемой публикации.

Осуществление заявляемого способа.

Иммуноферментный анализ проводили в 96-луночных планшетах для иммунологических реакций с плоским дном (Thermo Fisher Scientific, Дания). Для сенсибилизации в лунки каждого планшета вносили по 100 мкл антигена (рекомбинантный S-белок SARS-CoV-2) в концентрации 2 мкг/мл. Сорбцию проводили в 0,1 M бикарбонатном буфере (рН=9,5) в течение 18-20 часов при 4°С. После этого содержимое из планшета удаляли и добавляли в лунки по 100 мкл забуференного физиологического раствора, рН=7,4 (PBS), содержащего 0,05% Твин-20 (PBST). Инкубацию проводили при 37°С в течение 30 мин. Содержимое планшета удаляли и трижды промывали PBST. Затем в лунки планшета вносили пробы слюны (с начальным разведением 1:4) с последующим шагом разведения равным четырем. Все разведения осуществляли в PBST, и каждую пробу дублировали. Инкубацию проводили в течение 1 часа при 37°С. Далее содержимое планшета удаляли, и дважды промывали планшет PBST. После этого в лунки добавляли по 100 мкл кроличьих пероксидазно-меченных антител к IgA человека (Elabsciense, КНР). После часовой инкубации при 37°С содержимое планшета удаляли и четырежды отмывали планшет PBST. Далее для визуализации реакции в лунки планшета вносили по 100 мкл субстратной смеси ТМВ (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine dihydrochloride Monohydrate, BD OptEIA™, США); реакцию останавливали внесением в лунки по 50 мкл 1Н H2SO4 (28 мл концентрированной серной кислоты на 1 литр воды). Реакцию регистрировали при длине волны 450 нм с помощью планшетного фотометра ELx800 (BIO-TEK INSTRUMENTS, INC., США). За титр антител принимали конечное разведение исследуемого материала, которое давало значение оптической плотности при длине волны 450 нм (ОП450) превышающее среднюю ОП450 негативных лунок на величину 3-х стандартных отклонений.

Результаты изучения вирус-специфических IgA в слюне, полученные в ИФА с использованием в качестве подложки рекомбинантного S-белка SARS-Cov-2, были нормализованы для того, чтобы уравновесить значения, так как при увеличенном количестве общих IgA в слюне может возрастать и количество вирус-специфических IgA вне зависимости от уровня иммунитета после контакта с вирусом.

Определение общего IgA в слюне.

Определение содержания общего IgA в слюне проводили с помощью коммерческого набора реагентов ООО «Полигност» (г.Санкт-Петербург, Россия) согласно инструкции производителя.

Определение общего белка в слюне.

Для того, чтобы исключить влияние колебаний концентрации общего белка в исследуемых образцах, этот показатель также учитывали. Определение концентрации общего белка в слюне проводили на спектрофотометре NanoDrop 2000, 190-850 нм, Thermo Scientific, США.

Авторами разработан метод для полуколичественной оценки локальных вирус-специфических IgA в слюне.

Пример 1.

На Фиг. 1 представлены уровни общих IgA и общего белка в одних и тех же пробах смешанной слюны обследованных пациентов.

Нормализованные титры локальных вирус-специфических IgA рассчитывали по формуле:

По оси абсцисс представлены группы пациентов, по оси ординат -концентрации в мг/мл.

На Фиг. 2 представлены усредненные и индивидуальные нормализованные и ненормализованные титры IgA специфичных к рекомбинантному S-белку SARS-Cov-2 антител в слюне исследуемых пациентов. По оси абсцисс представлены группы пациентов, по оси ординат - обратные титры антител. Стартовое разведение - 1:4, шаг - 1:4. * - Р<0,05 согласно критерию Манна-Уитни. Вершины столбцов соответствуют среднегеометрическим титрам антител (СГТ).

Показано, что СГТ локальных IgA после нормализации составили 15,5, 3,5 и 6,6 в группах реконвалесцентов, не переболевших и вакцинированных, соответственно. При сравнении нормализованных титров IgA в различных испытуемых группах были отмечены статистически значимые различия между реконвалесцентами и не переболевшими (Р=0,0159). Без нормализации СГТ антител в слюне были близкими по значению к нормализованным показателям (16,8, 5,0 и 6,6 соответственно), но различия между группами не были статистически значимыми (Фиг. 1).

Пример 2. Данные о корреляции титров IgG и IgA в слюне.

На фиг. 3. представлены результаты корреляционного анализа титров IgA и IgG антител в слюне. По оси абсцисс представлены обратные титры IgG антител, по оси ординат приведены обратные титры IgA антител.

Показана высокая степень корреляции между титрами IgA и IgG в слюне, о чем свидетельствует коэффициент корреляции r²=0,9, что согласно шкале Чеддока соответствует высокой силе связи между переменными.

Пример 3.

Авторы также продемонстрировали связь средней силы между уровнями IgA в крови и слюне у одних и тех же пациентов (r2=0,564), что может объясняться различным происхождением антител в сыворотке и слюне. Полученная корреляция значений титров IgA в крови и слюне отражена на фиг. 4. По оси абсцисс представлены обратные титры IgA антител в слюне, по оси ординат приведены обратные титры IgA антител в крови.

Показана связь высокой силы и прямая зависимость между содержанием локальных IgG и IgA в слюне. Помимо этого, между содержанием IgA в крови и слюне выявлена взаимосвязь средней силы. Это может быть обусловлено различным происхождением антител, выявляемых на поверхности слизистых оболочек, и антител, циркулирующих в крови.

Таким образом, разработан способ количественной оценки содержания локальных антител в слюне с использованием в качестве антигена рекомбинантного S-белка SARS-CoV-2. Методика показала высокую результативность и позволяет повысить эффективность диагностики коронавирусной инфекции за счет определения вирус-специфических иммуноглобулинов в слюне.

Изобретение относится к биотехнологии. Разработан способ количественной оценки содержания локальных антител в слюне с использованием в качестве антигена рекомбинантного S-белка SARS-CoV-2. Способ показал высокую результативность и позволяет повысить эффективность диагностики коронавирусной инфекции за счет определения вирус-специфических иммуноглобулинов в слюне. 4 ил., 1 табл., 3 пр.

Способ определения антител к SARS-COV-2 в смешанной слюне, включающий проведение иммуноферментного анализа образцов жидкой слюны в луночных планшетах для иммунологических реакций с плоским дном, отличающийся тем, что предварительно в лунки каждого планшета вносят по 100 мкл сенсибилизирующего антигена, представляющего собой рекомбинантный S-белок SARS-CoV-2 в концентрации 2 мкг/мл, и проводят сорбцию в 0,1 M бикарбонатном буфере с рН=9,5 в течение 18-20 часов при 4°С, затем содержимое из планшета удаляют и добавляют в лунки по 100 мкл забуференного физиологического раствора PBST, имеющего рН=7,4 и содержащего 0,05% стандартного препарата Твин-20, затем проводят инкубацию при 37°С в течение 30 мин, после чего содержимое планшета удаляют и трижды промывают раствором PBST, затем в лунки планшета вносят пробы слюны с начальным разведением 1:4 и последующим шагом разведения равным четырем, проводят инкубацию в течение 1 часа при 37°С, далее содержимое планшета удаляют, дважды промывают планшет раствором PBST, после чего в лунки добавляют по 100 мкл кроличьих пероксидазно-меченых антител к IgA человека, инкубируют в течение часа при 37°С, содержимое планшета удаляют, четырежды отмывают планшет раствором PBST, далее вносят в лунки планшета по 100 мкл субстратной смеси тетраметилбензидина дигидрохлорид моногидрата и останавливают реакцию внесением в лунки по 50 мкл серной кислоты, разведенной из расчета 28 мл концентрированной серной кислоты на 1 литр воды, после чего регистрируют оптическую плотность материала с помощью планшетного фотометра при длине волны 450 нм, принимая за титр антител конечное разведение исследуемого материала, дающее значение оптической плотности, превышающее среднюю оптическую плотность негативных лунок на величину 3 стандартных отклонений.