СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ПОЛЛИНОЗА "IN VITRO" В СЛЮНЕ Российский патент 2008 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической аллергологии, и предназначено для диагностики поллинозов.

Поллинозы - это аллергические заболевания, вызываемые пыльцой растений. Наиболее эффективным способом лечения поллиноза является устранение контакта пациента с аллергенами (пыльцой растений, вызвавшей сенсибилизацию пациентов). Диагностика поллинозов путем выявления растений, к пыльце которых возникла сенсибилизация, позволяет пациентам избегать мест произрастания этих растений во время их цветения, что в свою очередь предупреждает появление клинических признаков заболевания, диагностика пыльцевой аллергии путем постановки внутрикожных проб с аллергенами (разведениями экстракта пыльцы растений), а также различных провокационных проб (назальной, конъюктивальной, бронхиальной) [Зисельсон А.Д. Поллиноз у детей. - М.: 1989, стр.159; Пыцкий В.И., Адрианова Н.В. Артомасова А.В. Аллергические заболевания. - М.: 1991, стр.197-207).

Перечисленные способы являются достаточно информативными, однако существенным недостатком всех перечисленных аллергологических проб с экстрактами пыльцы растений является тот момент, что они проводятся in vivo, поэтому их постановка сопровождается неприятными субъективными ощущениями пациентов, а также риском развития осложнений. Вместе с тем аллергологические пробы являются достаточно трудоемкими, требуют специального обучения медицинского персонала, их проведение возможно только в условиях специализированного аллергологического кабинета.

Известен способ выявления аллергенов при поллинозе путем постановки антиген-индуцированной (в качестве аллергенов используются экстракты пыльцы растений) реакции дегрануляции базофилов in vitro (Новиков Д.К., Доценко Э.А., Жаков Г.Я. Применение прямого теста дегрануляции базофилов для диагностики аллергии. // Лабораторное дело, 1990, № 9, стр.58-61). При этом определяют число дегранулированных базофилов в лейкоцитарной взвеси, окрашенной 0,3% спиртовым раствором нейтрального красного, до и после инкубации с аллергенами. Положительным результатом реакции является увеличение числа дегранулированных базофилов на 15% по сравнению с контролем.

Недостатками этого способа являются его недостаточная точность, значительная трудоемкость и необходимость работы с кровью пациентов. В качестве прототипа заявляемого способа выбран способ диагностики поллинозов путем спектрофотометрического определения коэффициента пропускания инфракрасного излучения слюной до и после инкубации слюны с экстрактами пыльцы растений (RU 2153171, C1 G01N 33/483, опуб. 20.07.2000 г.). Достоинствами способа являются простота и быстрота выполнения исследования (в среднем 5 минут на 1 пробу), небольшое количество биологического материала (0,1 мл слюны) для постановки одной пробы, возможность проведения исследования с любым числом аллергенов, объектом исследования является слюна, что обеспечивает легкость ее забора пациентами самостоятельно без участия медицинских работников, постановка реакции с аллергеном осуществляется in vitro, что делает метод безопасным для больных.

Однако метод не достаточно точный и специфичный, так как дает перекрестные реакции между различными аллергенами, что затрудняет диагностику, выбор методов лечения и оценку их эффективности.

Задачей, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, является расширение арсенала средств, используемых для диагностики поллиноза.

Техническим результатом, который может быть получен при осуществлении изобретения, является диагностика поллиноза с большой клинической достоверностью.

Поставленная задача достигается тем, что в способе диагностики поллиноза, включающем проведение аллергологической пробы «in vitro» в слюне, новизна заключается в том, что образцы слюны инкубируют с антигеном полыни, проводят определение специфических к нему иммуноглобулинов класса А (IgA-антител) с помощью твердофазного иммуноферментного анализа и по сравнению показателей оптической плотности уровня антител OD₄₉₂ в индивидуальных образцах слюны больных поллинозом и доноров, диагностируют поллиноз при снижении этого показателя на величину трехкратного стандартного отклонения от среднего значения OD₄₉₂ в ИФА для группы доноров.

Предпочтительно, чтобы интервал разведения слюны составлял 1:15-1:25.

Наилучшие результаты получают в интервале концентрации сорбируемого антигена, составляющем 5-15 мкг/мл.

До настоящего времени ни в одном из известных методов специфические IgA не определяют, а именно этот прием позволяет узнать, что заболевание происходит из-за их сниженного уровня, в то время как при терапии, направленной на лечение поллиноза, их уровень повышается. Нами установлено, что с наибольшей клинической достоверностью снижение уровня специфических IgA определяется к антигену полыни с помощью твердофазного иммуноферментного анализа.

В таблице приведены результаты зависимости величины оптической плотности как от концентрации иммобилизованного на планшете антигена, так и от разведения анализируемого образца, полученные в результате исследования.

Материалы и методы

В работе использованы следующие реагенты и приборы: конъюгаты антител против IgA человека, меченные пероксидазой хрена ("Sigma"). ИФА проводили на 96-луночных планшетах "Nunc" (Дания). Результаты ИФА учитывали на спектрофотометре с вертикальным ходом луча фирмы "Multiscan" (Финляндия) при длине волны 492 нм.

Для разработки метода ИФА применяли пул образцов слюны практически здоровых людей и больных поллинозом. Для постановки одной пробы брали 0,1 мл слюны.

Обследованы 19 здоровых лиц (контрольная группа) и 29 пациентов в возрасте от 21 до 49 лет (16 мужчин, 13 женщин), страдающих поллинозом и имеющих гиперчувствительность к аллергенам пыльцы полыни. Клинические проявления поллиноза были сочетанными и характеризовались чаще всего риноконъюнктивальным синдромом (85%). Явления бронхоспазма отмечены у 35% больных. Другие проявления поллиноза встречались в единичных случаях.

Все больные прошли полное аллергологическое обследование, которое включало сбор аллергологического анамнеза, определение общего и аллергенспецифических IgE-антител, постановку кожных проб методом pric-теста с использованием набора пыльцевых аллергенов ("СЕВАФАРМА", Чехия).

У больных собирали слюну утром натощак после ополаскивания ротовой полости водой путем сплевывания ее в пробирку в течение 10-15 минут. Далее образцы слюны центрифугировали (10 тыс.об/мин) в течение 15 минут, собирали надосадок и хранили при температуре -20°С.

Пример 1

В день постановки иммуноферментного анализа образцы размораживали, ИФА проводили в одних для всех образцов условиях: концентрация антигена 10 мкг/мл, а разведение слюны 1:20.

ИФА выполняли на полистирольных планшетах фирмы «Nunc», которые сенсибилизировали раствором (100 мкл в лунку) антигена полыни в 0,02 М карбонатном буфере (рН 9,5) в течение 18 ч при температуре 40°С. После инкубации планшеты трижды отмывали 0,005% раствором твина-20 в фосфатном буфере (ФСБ-Т) и вносили в лунки по 100 мкл исследуемых образцов слюны в ФСБ-Т, содержащем 0,01% твин-20. Планшеты инкубировали в течение часа при температуре 37°С, отмывали, как описано выше, добавляли в лунки конъюгат антител против IgA человека, меченных пероксидазой хрена, в разведении 1:1000. Планшеты инкубировали в течение часа при температуре 37°С, промывали, как описано выше, и заполняли субстратной смесью, содержащей 0,4% мМ о-фенилендиамина и 0,4% перекиси водорода в 0,05 М фосфатно-цитратном буфере. После 20-минутного инкубирования в темноте добавляли по 50 мкл 10% раствора серной кислоты и измеряли оптическую плотность на спектрофотометре с вертикальным ходом луча фирмы "Multiscan" (Финляндия) при длине волны 492 нм.

На основании разработанного ИФА провели анализ содержания антител IgA к полыни в индивидуальных образцах слюны.

Полученные данные обрабатывали с применением статистических формул программы Microsoft Excel версия 5.0 для определения достоверности различий средних показателей по критерию Стьюдента.

Среднее значение оптической плотности в ИФА составляло 0,3843±0,0149 для больных поллинозом против 0,531±0.0387 (р<0,001) в контрольной группе у здоровых людей.

Пример 2

Исследование влияния концентраций сорбируемого антигена полыни и разведении слюны на показатель оптической плотности уровня антител.

ИФА выполняли на 96-луночных полистирольных планшетах, которые сенсибилизировали раствором (100 мкл в лунку) антигена полыни в 0,02 М карбонатном буфере (рН 9,5) в течение 18 ч при температуре 40°С. При этом в ряду с А по Н проводили титрование антигена с помощью двойных разведений, начиная с концентрации по белку 50 мкг/мл. После инкубации планшеты трижды отмывали 0,005% раствором твина-20 в фосфатном буфере (ФСБ-Т) и вносили в лунки по 100 мкл исследуемых образцов слюны в ФСБ-Т, содержащем 0,01% твин-20; образцы слюны предварительно раститровывали с 1-го по 10-й ряд с помощью двойных разведений, начиная с разведения 1:2. Планшеты инкубировали в течение часа при температуре 370°С, отмывали, как описано выше, добавляли в лунки конъюгат антител либо против IgA человека, меченных пероксидазой хрена, в разведении 1:1000. Планшеты инкубировали в течение часа при температуре 370°С, промывали, как описано выше, и заполняли субстратной смесью, содержащей 0,4% мМ о-фенилендиамина и 0,4% перекиси водорода в 0,05 М фосфатно-цитратном буфере. После 20-минутного инкубирования в темноте добавляли по 50 мкл 10% раствора серной кислоты и измеряли оптическую плотность на спектрофотометре с вертикальным ходом луча фирмы "Multiscan" (Финляндия) при длине волны 492 нм.

Полученные данные обрабатывали с применением статистических формул программы Microsoft Excel версия 5.0 для определения достоверности различий средних показателей по критерию Стьюдента.

В таблице приведены результаты полученных измерений.

Как видно из таблицы, хотя значения оптической плотности уровня антител больных поллинозом во всем диапазоне измерений меньше, чем у здоровых лиц, наиболее четко разница значений оптической плотности между донорским пулом и пулом больных поллинозом видна в интервале концентраций сорбируемого антигена от 5 до 15 мкг/мл и при разведении анализируемого образца слюны от 1:15 до 1:25.

Предлагаемый способ прошел успешную апробацию в 4-й Городской больнице г.Пензы как для первоначального диагностирования больных поллинозом, так и для оценки эффективности их лечения с помощью специфической иммунотерапией (СИТ).

Показаниями для проведения СИТ служили следующие критерии: наличие симптомов поллиноза у больных в период цветения причинно-значимых растений, наличие у больных положительных кожных тестов с аллергеном "Осенняя смесь трав", наличие специфических IgE к полыни.

Курс лечения состоял из 38 приемов аллергена per os в возрастающих дозах от 0,05 PNU до введения пороговой дозы аллергена в разведении 10000 PNU и продолжался 146 дней.

В процессе СИТ у всех больных выявлено повышение уровня специфических секреторных IgA-антител в среднем в 1,6 раза и при этом OD₄₉₂ в ИФА соответствовала значению 0,6771±0,0507 (р<0,001). У части пациентов (14%) уровень IgA-антител повысился более чем в 2 раза.

Результаты проведенных исследований показали, что клиническая достоверность предлагаемого способа составляет 92%, что превышает на 18% известные в настоящее время методы диагностирования поллиноза (Лабораторное дело. 1990, № 9, стр.58-61) и в то же время предлагаемый способ отличается простотой проведения анализа, возможностью широкого применения в клинической практике благодаря использованию доступного оборудования.

Эти данные по исследованию уровня специфических секреторных IgA-антител согласуются с результатами исследований ряда авторов, показывающими, что благодаря длительному контакту аллергена с лимфоидными образованиями мукозальной системы происходит максимальная стимуляция продукции IgA и IgG-антител, секреторного IgA, усиление фагоцитарного ответа и повышение барьерной функции слизистых оболочек. Блокирующие антитела, конкурирующие с IgE-антителами за антиген, многими исследователями относятся к антителам А и G классов.

Таким образом, разработан иммуноферментный метод анализа специфических IgA антител у больных поллинозом. Результаты проведенных клинико-иммунологических исследований позволяют рассматривать возможность и целесообразность использования разработанной методики в качестве простого, доступного для клинической практики способа диагностики поллиноза и метода контроля эффективности СИТ при использовании пероральных аллергенов.

Способ диагностики поллиноза «in vitro» в слюнеРазведение слюныКонцентрация сорбируемого антигена, мкг/мл501510531,5Без развед.Пул дон.0,6290,5800,5500,5500,5500,549 Пул бол.0,6210,5980,5480,5450,5400,5361:2Пул дон.0,6300,5490,5210,5170,5300,509 Пул бол.0,6090,4180,4990,4600,4900,4901:5Пул дон.0,5700,5380,5190,5060,5200,525 Пул бол.0,5600,4000,3800,4100,5010,4481:15Пул дон.0,5650,6280,5990,5490,3900,385 Пул бол.0,5200,3860,3610,3300,3700,3651:20Пул дон.0,5600,5960,5430,5290,3800,380 Пул бол.0,5580,3250,3150,3090,3500,3601:25Пул дон.0,5500,5200,5090,4990,3600,370 Пул бол.0,5400,3000,2960,2810,3000,3501:50Пул дон.0,5320,5010,4200,4000,3500,360 Пул бол.0,5360,5000,3900,3800,3000,3501:100Пул дон.0,5360,5300,5000,5200,3100,300 Пул бол.0,5390,5400,5400,4100,3000,289

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической аллергологии, и предназначено для диагностики поллинозов. Способ диагностики поллиноза включает проведение аллергологической пробы «in vitro» в слюне, отличающийся тем, что образцы слюны в интервале разведения 1:15-1:25 инкубируют с антигеном полыни, интервал концентрации которой составляет 5-15 мкг/мг, затем проводят определение специфических к нему иммуноглобулинов класса А (IgA-антител) с помощью твердофазного иммуноферментного анализа и по сравнению показателей оптической плотности уровня антител OD₄₉₂ в индивидуальных образцах слюны больных поллинозом и доноров, диагностируют поллиноз при снижении этого показателя на величину трехкратного стандартного отклонения от среднего значения OD₄₉₂ в ИФА для группы доноров. Способ обеспечивает простоту проведения анализа, возможность широкого применения в клинической практике с наибольшей клинической достоверностью. 1 табл.

Способ диагностики поллиноза, включающий проведение аллергологической пробы «in vitro» в слюне, отличающийся тем, что образцы слюны в интервале разведения 1:15-1:25 инкубируют с антигеном полыни, интервал концентрации которой составляет 5-15 мкг/мг, затем проводят определение специфических к нему иммуноглобулинов класса А (IgA-антител) с помощью твердофазного иммуноферментного анализа и по сравнению показателей оптической плотности уровня антител OD₄₉₂ в индивидуальных образцах слюны больных поллинозом и доноров диагностируют поллиноз при снижении этого показателя на величину трехкратного стандартного отклонения от среднего значения OD₄₉₂ в ИФА для группы доноров.