Способ генотипирования полиморфного локуса rs1801310 (A>G) гена GSS у человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов Российский патент 2024 года по МПК C12Q1/6806 C12Q1/6827 C12Q1/686 

Область техники, к которой относится изобретение. Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярно-генетической диагностики, в частности к оценке однонуклеотидного полиморфизма rs1801310 (A>G) гена GSS молекулярно-генетическим методом исследования.

Уровень техники. Глутатион важен для множества биологических функций, включая защиту клеток от окислительного повреждения свободными радикалами, детоксикацию ксенобиотиков и мембранный транспорт. Белок, кодируемый геном GSS , функционирует как гомодимер, катализируя второй этап биосинтеза глутатиона, который представляет собой АТФ-зависимое превращение гамма-L-глутамил-L-цистеина в глутатион. Заболевания, связанные с GSS, включают дефицит глутатионсинтетазы и гемолитическую анемию из-за дефицита глутатионсинтетазы в эритроцитах. Среди связанных с ним путей - конъюгация глутатиона [https://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=GSS&keywords=GSS].

Ген GSS (Gene ID: 2937) локализован на хромосоме 20q11.22. Полиморфный вариант rs1801310, позиция chr20:34929211 (GRCh38.p14) [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/rs1801310] локализован в интроне и характеризуется заменой А>C,G. Однако, аллель С встречается с частотой <0.000001 в европейских популяциях и также характеризуется низкой частотой в различных популяциях мира, в связи с чем именно замена A>G является актуальной для исследований многофакторных болезней человека.

SNP rs1801310 отличается высокой функциональной значимостью. Согласно биоинформатическому ресурсу GTEx Portal, данный генетический вариант влияет на экспрессию генов ACSS2, DYNLRB1, EDEM2, FAM83C, GGT7, GSS, ITCH, MAP1LC3A, MMP24-AS1, MYH7B, NCOA6, NFS1, PIGU, PROCR, RALY, RP5-1125A11.7, TP53INP2, TRPC4AP, UQCC1 в различных органах и тканях посредством eQTL-эффектов [https://gtexportal.org/home/snp/rs1801310]. Кроме того, обнаружено его влияние на модификации гистонов [https://pubs.broadinstitute.org/mammals/haploreg/detail_v4.2.php?query=&id=rs1801310], а также на связывание с транскрипционными факторами [http://atsnp.biostat.wisc.edu/search]. Это создает потребность в создании простого в исполнении, недорого и доступного исследователям, работающим в области генетической эпидемиологии, метода идентификации однонуклеотидного полиморфизма rs1801310 (A>G) гена GSS.

Известен способ анализа генетических вариаций в геноме человека методом секвенирования амплифицированных участков ДНК [Mardis E. R. DNA sequencing technologies: 2006-2016 //Nature protocols. - 2017. - Vol. 12. - №. 2. - P. 213-218]. Недостатками метода являются высокая стоимость оборудования и реагентов, что исключает широкое внедрение метода в экспериментальные исследования, особенно изучение заболеваний, которые требуют большого размера выборок для обеспечения высокой мощности исследований.

Известен способ анализа генетических вариаций в геноме человека методом матричноактивированной лазерной десорбционно-ионизационной масс-спектрометрии (MALDI). Метод заключается в том, анализируемая ДНК переносится на подложку, где она кристаллизуется с матрицей. Затем кристаллизованные аналиты переносят, облучают лазером, вызывая десорбцию и ионизацию молекул в вакуумной камере. Положительно заряженные ионы ДНК ускоряются и мигрируют через вакуумную трубку к высокочувствительному детектору с разной скоростью в зависимости от массы ионов, что приводит к различному времени пролета. Используя время пролета отдельных ионизированных ДНК-аналитов, система определяет массу и отображает масс-спектр, идентифицирующий различные генетические мишени [Li D. et al. MALDI-TOF mass spectrometry in clinical analysis and research //ACS Measurement Science Au. - 2022. - Vol. 2. - №. 5. - P. 385-404]. Недостатками метода являются трудоемкость, высокая стоимость оборудования, высокая стоимость эксперимента, наличие высококвалифицированного персонала.

За прототип выбран коммерческий набор по генотипированию rs1801310 (A/G) GSS (Assay ID C___2142568_20; каталог 4351379) компании ThermoFisher. Однако, генотипирование с использованием коммерческих наборов характеризуется высокой стоимостью, а информация о структуре необходимых для проведения ПЦР праймеров и аллель-специфических зондов является закрытой для исследователей, в связи с чем он не может быть воспроизведен при наличии стандартного набора оборудования и реактивов.

Таким образом, существует реальная потребность в создании быстрого, недорогого и легко воспроизводимого способа идентификации полиморфизма rs1801310 (A>G) гена GSS, с доступной всем исследователям структурой праймеров и аллель-специфических зондов, который мог бы использоваться в качестве «рутинного» метода генотипирования в любой ПЦР-лаборатории.

Раскрытие сущности изобретения. Техническим результатом данного изобретения является разработка простого в исполнении и экономически целесообразного способа генотипирования однонуклеотидного полиморфизма rs1801310 (A>G), локализованного в позиции chr20:34929211 (GRCh38.p14) гена GSS (Gene ID: 2937) методом полимеразной цепной реакции в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических сигнальных зондов, содержащие флуорофоры FAM и ROX.

Технический результат достигается тем, что идентификацию аллельных вариантов rs1801310 (A>G) гена GSS осуществляют с использованием прямого праймера rs1801310 5'-TTCACGGTTGCAAAGGACTT-3' (SEQ ID NO 1), обратного праймера rs1801310 5'-AATGAGGCCAAGGACCCAA-3' (SEQ ID NO 2), rs1801310-A-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда 5'-(FAM)TCATCTGATACCCTGGTAAGGT(RTQ1)-3' (SEQ ID NO 3), rs1801310-G-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда 5'-(ROX)CATCTGATACCCTGGTGAGGT(BHQ2)-3' (SEQ ID NO 4).

Изобретение поясняется следующей фигурой: дискриминация аллелей по локусу rs1801310 (A>G) гена GSS при генотипировании методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов по данным величин RFU (относительные единицы флуоресценции) на амплификаторе CFX96: генотипы rs1801310-A/A показаны оранжевыми кругами, генотипы rs1801310-A/G показаны зелеными треугольниками, генотипы rs1801310-G/G показаны голубыми квадратами; черным ромбом отмечен отрицательный контроль.

Работа над дизайном олигонуклеотидов включала несколько этапов:

1) С применением открытой базы данных Ensembl genome browser 109 [https://www.ensembl.org/index.html] выбран синвенс, фланкирующий искомую однонуклеотидную замену [A/G] rs1801310 гена GSS, и затем с помощью доступного онлайн программного обеспечения Primer3web version 4.1.0 [https://primer3.ut.ee/] подобрана последовательность олигонуклеотидов, используемых для проведения ПЦР-реакции:

прямой общий праймер rs1801310 5'-TTCACGGTTGCAAAGGACTT-3' (SEQ ID NO 1),

обратный общий праймер rs1 rs1801310 5'-AATGAGGCCAAGGACCCAA-3' (SEQ ID NO 2).

Размер амплифицируемого в ходе ПЦР фрагмента гена ITCH составляет 82 пары нуклеотидов:

(TTCACGGTTGCAAAGGACTTCTCATCAGGGCTTCATCTGATACCCTGGT[A/G]AGGTGGGCAGGTCTTGGGTCCTTGGCCTCATT).

2) Для дизайна зондов пользовались практическими рекомендациями [Basu C. (ed.). PCR primer design. - New york : Humana Press, 2015]. В реакции использовались гидролизные зонды. Последовательность зонда подбирали таким образом, чтобы он отжигался на матрицу между прямым и обратным праймерами. Каждый зонд снабжали флуорофором и гасителем флуоресценции, спектр поглощения которого соответствует длинам волн спектра флуорофора. Для гашения флуоресценции FAM пользовались гасителем RTQ1; для гашения флуоресценции ROX - гасителем BHQ2.

На основании изложенных критериев и практических рекомендаций были подобраны зонды со следующей структурой:

rs1801310-A-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5'-(FAM)TCATCTGATACCCTGGTAAGGT(RTQ1)-3' (SEQ ID NO 3), rs1801310-G-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5'-(ROX)CATCTGATACCCTGGTGAGGT(BHQ2)-3' (SEQ ID NO 4).

3) Изготовление праймеров и зондов осуществлялось в сервисном центре НПК «Синтол», Москва.

4) С помощью практических экспериментов подобраны оптимальные условия для проведения генотипирования, которые включают следующие этапы: 50°C в течение 2 минут, 95°C в течение 10 минут, затем 39 циклов [95°C в течение 10 секунд и 61°C в течение 1 минуты].

5) Разработанный способ был апробирован в лаборатории геномных исследований на 200 образцах ДНК здоровых индивидуумов биобанка НИИ генетической и молекулярной эпидемиологии КГМУ. Генотипирование осуществляли по данным величин RFU (относительные единицы флуоресценции) зондов с флуоресцентными красителями. По результатам генотипирования rs1801310 26 человек (13%) оказались гомозиготами по аллелю А (генотип А/А); 85 человек (42,5%) являлись гетерозиготами (генотип A/G), при этом 89 человек (44,5%) оказались гомозиготами по аллелю G (генотип G/G).

6) Валидацию способа проводили методом масс-спектрометрического анализа на геномном времяпролетном масс-спектрометре MassArray analyzer 4 (Agena Bioscience). Результаты обоих способов генотипирования полностью (100% генотипов) совпали. Однако патентуемый способ генотипирования полиморфного локуса rs1801310 (A>G) гена GSS методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических зондов позволяет значительно (на 6 часов) сократить время проведения анализа, а также снижает себестоимость анализа (в 4-5 раз).

Осуществление изобретения.

Способ осуществляют следующим образом:

1. Выделение ДНК из периферической венозной крови. На первом этапе к 0,5 мл крови добавляли 0,5 мл PBS и центрифугировали 10 мин при 12 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость сливали, добавляли 1 мл PBS и вновь центрифугировали при тех же условиях. Надосадочную жидкость сливали, добавляли 200 мкл ТЕ-буфера, пипетировали до растворения осадка и затем последовательно добавляли 10 мкл 1% раствора додецилсульфата натрия SDS и 5 мкл протеиназы К. Пробирки инкубировали в термостате при t=37°C 12 ч. В ходе второго этапа проводили четыре последовательных центрифугирования с фенолом и хлороформом согласно протоколу методики (10 мин, 8 тыс. об/мин), после чего ДНК осаждали ледяным раствором 95% этилового спирта и центрифугировали 10 мин при 14,3 тыс. об/мин. По испарении спирта ДНК растворяли в 100 мкл деионизированной дистиллированной воды. Получаемый раствор ДНК в воде имел чистоту в диапазоне А260/280=1,5-2,0 и среднюю концентрацию около 180-200 нг/мкл.

2. Подготовка образцов ДНК к генотипированию. Качество выделенной ДНК оценивали по степени чистоты и концентрации раствора на спектрофотометре NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, США). Все анализируемые образцы ДНК были разведены деионизированной водой до концентрации 15-20 нг/мкл при А260/280=1,5-2,0.

3. Анализ полиморфизма rs1801310 (A>G) гена GSS с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени с использованием аллель-специфических зондов. Для генотипирования использовали два фланкирующих праймера, прямой (SEQ ID NO 1) и обратный (SEQ ID NO 2), а также аллель-специфические зонды: А-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд (SEQ ID NO 3), G-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд (SEQ ID NO 4).

ПЦР в «реальном времени» проводили в 25 мл реакционной смеси, содержащей 1,25 ЕД ДНК-полимеразы Hot Start Taq («Биолабмикс», Новосибирск, Россия), 20 нг ДНК, по 10 мкМ каждого праймера, по 5 мкМ каждого зонда, 0.03 мМ каждого dNTP, 3,0 мМ MgCl2; 1хПЦР-буфер [67 мМ Tris-HCl, pH 8,8, 16,6 мМ (NH4)2SO4, 0,01% Tween-20]. Реакция амплификации состояла из стадии нагревания до 50°C в течение 2 минут, 95°C в течение 10 минут, затем 39 циклов [95°C в течение 10 секунд и 61°C в течение 1 минуты].

4. Генотипирование. При проведении ПЦР в амплификаторе с флуоресцентной детекцией (Bio-Rad CFX96 или аналогичном амплификаторе) генотипирование осуществляют по данным величин RFU (относительных единиц флуоресценции). Для rs1801310 (A>G) гена GSS зонд с флуоресцентным красителем FAM соответствует аллелю A, зонд с красителем ROX - аллелю G (фиг. 1). На фигуре видно четкое разделение образцов на кластеры, где черный ромб соответствуют отрицательному контролю, кластер оранжевых кругов - соответствует зонду с флуоресцентным красителем FAM и позволяет идентифицировать гомозигот A/A. Кластер синих квадратов соответствует зонду с флуоресцентным красителем ROX и позволяет идентифицировать гомозигот G/G. Кластер зеленых треугольников соответствует накоплению уровня флуоресценции по обоим зондам и позволяет идентифицировать гетерозигот A/G.

Резюме.

Таким образом, разработан эффективный и недорогой способ для экспресс-идентификации полиморфного варианта rs1801310 (A>G) гена GSS у человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов, который может быть использован в медицине при определении предрасположенности к развитию заболеваний, ассоциированных с носительством полиморфизмов гена GSS, а также в научных целях.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Способ

генотипирования полиморфного локуса rs1801310 (A G) гена GSS у

человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением

аллель- специфических флуоресцентных зондов.xml" softwareName="WIPO

Sequence" softwareVersion="2.3.0" productionDate="2024-05-03">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText></ApplicationNumberText>

<FilingDate></FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>2037</ApplicantFileReference>

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное

бюджетное образовательное учреждение высшего образования

&quot;Курский государственный медицинский университет&quot;

Министерства здравоохранения Российской Федерации,</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Kursk State Medical

University</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Способ генотипирования

полиморфного локуса rs1801310 (A&gt;G) гена GSS у человека методом

ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель- специфических

флуоресцентных зондов</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>4</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ttcacggttgcaaaggactt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>aatgaggccaaggacccaa</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tcatctgataccctggtaaggt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q8">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>catctgataccctggtgaggt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу генотипирования полиморфного локуса rs1801310 (A>G) гена GSS у человека. Способ осуществляется посредством метода ПЦР в режиме «реального времени» и предусматривает использование прямого и обратного праймеров с последовательностями SEQ ID NO: 1 и 2, соответственно, а также rs1801310-A- и G-аллель-специфичных флуоресцентно-меченых зондов с последовательностями SEQ ID NO: 3 и 4, соответственно. Настоящее изобретение обеспечивает доступный и простой в исполнении способ генотипирования однонуклеотидного полиморфизма rs1801310 (A>G) гена GSS. 1 ил.

Способ генотипирования полиморфного локуса rs1801310 (A>G) гена GSS у человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов, отличающийся тем, что идентификацию аллельных вариантов rs1801310 (A>G) гена GSS осуществляют с использованием прямого праймера rs1801310 5'-TTCACGGTTGCAAAGGACTT-3' (SEQ ID NO: 1), обратного праймера rs1801310 5'-AATGAGGCCAAGGACCCAA-3' (SEQ ID NO: 2), rs1801310-A-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда 5'-(FAM)TCATCTGATACCCTGGTAAGGT(RTQ1)-3' (SEQ ID NO: 3), rs1801310-G-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда 5'-(ROX)CATCTGATACCCTGGTGAGGT(BHQ2)-3' (SEQ ID NO: 4).