Способ генотипирования полиморфного локуса rs143334143 (G>A) гена CCHCR1 у человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов Российский патент 2024 года по МПК C12Q1/68 C12Q1/6876 

Область техники, к которой относится изобретение. Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярно-генетической диагностики, в частности к оценке однонуклеотидного полиморфизма rs143334143 (G>A) гена CCHCR1 молекулярно-генетическим методом исследования.

Уровень техники. Полиморфный маркер rs143334143 (G>A) гена CCHCR1 был установлен широкогеномными исследованиями ассоциаций как вариант, ассоциированный с тяжелым течением COVID-19 [https://www.ebi.ac.uk/gwas/variants/rs143334143]. Ген CCHCR1 (Gene ID: 54535) локализован на хромосоме 6p21.33. Однонуклеотидный полиморфизм rs143334143, позиция
chr6:31153649 (GRCh38.p14) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/rs143334143) локализован в интроне и характеризуется заменой G>A.

Высокая клинико-диагностическая значимость данного генетического варианта относительно тяжелого течения COVID-19 создает потребность в создании простого в исполнении, недорого и доступного исследователям, работающим в области генетической эпидемиологии, метода идентификации однонуклеотидного полиморфизма rs143334143 (G>A) гена CCHCR1.

Известен способ анализа генетических вариаций в геноме человека методом секвенирования амплифицированных участков ДНК [Mardis E. R. DNA sequencing technologies: 2006-2016 //Nature protocols. - 2017. - Vol. 12. - №. 2. - P. 213-218]. Недостатками метода являются высокая стоимость оборудования и реагентов, что исключает широкое внедрение метода в экспериментальные исследования, особенно изучение многофакторных заболеваний, которые требуют большого размера выборок для обеспечения высокой мощности исследований.

За прототип выбран способ анализа генетических вариаций в геноме человека методом матричноактивированной лазерной десорбционно-ионизационной масс-спектрометрии (MALDI). Метод заключается в том, анализируемая ДНК переносится на подложку, где она кристаллизуется с матрицей. Затем кристаллизованные аналиты переносят, облучают лазером, вызывая десорбцию и ионизацию молекул в вакуумной камере. Положительно заряженные ионы ДНК ускоряются и мигрируют через вакуумную трубку к высокочувствительному детектору с разной скоростью в зависимости от массы ионов, что приводит к различному времени пролета. Используя время пролета отдельных ионизированных ДНК-аналитов, система определяет массу и отображает масс-спектр, идентифицирующий различные генетические мишени [Li D. et al. MALDI-TOF mass spectrometry in clinical analysis and research //ACS Measurement Science Au. - 2022. - Vol. 2. - №. 5. - P. 385-404]. Однако, данный метод характеризуется высокой стоимостью, поскольку требует приобретения наборов спектральных чипов и дорогостоящих реактивов для проведения генотипирования, характеризуется высокой стоимостью оборудования, требует наличия высококвалифицированного персонала, в связи с чем он не может быть воспроизведен при наличии стандартного набора оборудования и реактивов.

Методов таргетного генотипирования полиморфизма rs143334143 (G>A) гена CCHCR1 с применением аллель-специфических флюоресцентных зондов до настоящего времени разработано не было.

Таким образом, существует реальная потребность в создании быстрого, недорогого и легко воспроизводимого способа идентификации полиморфизма rs143334143 (G>A) гена CCHCR1, с доступной всем исследователям структурой праймеров и аллель-специфических зондов, который мог бы использоваться в качестве «рутинного» метода генотипирования в любой ПЦР-лаборатории.

Раскрытие сущности изобретения. Техническим результатом данного изобретения является разработка простого в исполнении и экономически целесообразного способа генотипирования однонуклеотидного полиморфизма rs143334143 (G>A), локализованного в позиции chr6:31153649 (GRCh38.p14) гена CCHCR1 (Gene ID: 54535) методом полимеразной цепной реакции в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических сигнальных зондов, содержащие флуорофоры FAM и ROX.

Технический результат достигается тем, что идентификацию аллельных вариантов rs143334143 (G>A) гена CCHCR1 осуществляют с использованием прямого праймера rs143334143 5′- TCTCCCTTGTTTTCTCCCAGT-3′ (SEQ ID NO 1), обратного праймера rs143334143 5′-CGCACCTGTAATCCCAGCTA-3′ (SEQ ID NO 2),

rs143334143-G-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда

5′-(FAM)TGGCACAGTCTCGGCTCACTGCAACCT(RTQ1)-3′ (SEQ ID NO 3),

rs143334143-A-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда

5′-(ROX)TGGCACAGTCTCAGCTCACTGCAACCT(BHQ2)-3′ (SEQ ID NO 4).

Изобретение поясняется следующей фигурой: дискриминация аллелей по локусу rs143334143 (G>A) гена CCHCR1 при генотипировании методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов по данным величин RFU (относительные единицы флуоресценции) на амплификаторе CFX96: генотипы rs143334143-G/G показаны оранжевыми кругами, генотипы rs143334143-G/A показаны зелеными треугольниками, генотипы rs143334143-A/A показаны голубыми квадратами; черным ромбом отмечен отрицательный контроль.

Работа над дизайном олигонуклеотидов включала несколько этапов:

1) С применением открытой базы данных Ensembl genome browser 109 [https://www.ensembl.org/index.html] выбран синвенс, фланкирующий искомую однонуклеотидную замену [G/A] rs143334143 гена CCHCR1, и затем с помощью доступного онлайн программного обеспечения Primer3web version 4.1.0 [https://primer3.ut.ee/] подобрана последовательность олигонуклеотидов, используемых для проведения ПЦР-реакции:

прямой общий праймер rs143334143 5′-TCTCCCTTGTTTTCTCCCAGT-3′ (SEQ ID NO 1),

обратный общий праймер rs143334143 5′-CGCACCTGTAATCCCAGCTA-3′ (SEQ ID NO 2).

Размер амплифицируемого в ходе ПЦР фрагмента гена CCHCR1 составляет 172 пары нуклеотидов:

(TCTCCCTTGTTTTCTCCCAGTTCCTTTTTTATTTTATTTTTTGAGACAGAGTCTTGCTCTGTCGCCCAGGCTGGAGTGCAATGGCACAGTCTC[G/A]GCTCACTGCAACCTCCACTGCCCAGGTTCAAGTGATTCTCCTGCCTCGGCCTCCCAAGTAGCTGGGATTACAGGTGCG).

2) Для дизайна зондов пользовались практическими рекомендациями [Basu C. (ed.). PCR primer design. - New york : Humana Press, 2015]. В реакции использовались гидролизные зонды. Последовательность зонда подбирали таким образом, чтобы он отжигался на матрицу между прямым и обратным праймерами. Зонды подбирали на обратную цепь ДНК. Каждый зонд снабжали флуорофором и гасителем флуоресценции, спектр поглощения которого соответствует длинам волн спектра флуорофора. Для гашения флуоресценции FAM пользовались гасителем RTQ1; для гашения флуоресценции ROX - гасителем BHQ2.

На основании изложенных критериев и практических рекомендаций были подобраны зонды со следующей структурой:

rs143334143-G-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд

5′-(FAM)TGGCACAGTCTCGGCTCACTGCAACCT(RTQ1)-3′ (SEQ ID NO 3),

rs143334143-A-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд

5′-(ROX)TGGCACAGTCTCAGCTCACTGCAACCT(BHQ2)-3′ (SEQ ID NO 4).

3) Изготовление праймеров и зондов осуществлялось в сервисном центре НПК «Синтол», Москва.

4) С помощью практических экспериментов подобраны оптимальные условия для проведения генотипирования, которые включают следующие этапы: 50°C в течение 2 минут, 95°C в течение 10 минут, затем 39 циклов [95°C в течение 10 секунд и 63°C в течение 1 минуты].

5) Разработанный способ был апробирован в лаборатории геномных исследований на 200 образцах ДНК здоровых индивидуумов биобанка НИИ генетической и молекулярной эпидемиологии КГМУ. Генотипирование осуществляли по данным величин RFU (относительные единицы флуоресценции) зондов с флуоресцентными красителями. По результатам генотипирования rs143334143 158 человек (79%) оказались гомозиготами по аллелю G (генотип G/G); 38 человек (19%) являлись гетерозиготами (генотип G/A), 4 человека (2%) индивидуумов оказались гомозиготами по аллелю A (генотип A/A).

6) Валидацию способа проводили методом масс-спектрометрического анализа на геномном времяпролетном масс-спектрометре MassArray analyzer 4 (Agena Bioscience). Результаты обоих способов генотипирования полностью (100% генотипов) совпали. Однако патентуемый способ генотипирования полиморфного локуса rs143334143 (G>A) гена CCHCR1 методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических зондов позволяет значительно (на 6 часов) сократить время проведения анализа, а также снижает себестоимость анализа (в 4-5 раз).

Осуществление изобретения.

Способ осуществляют следующим образом:

1. Выделение ДНК из периферической венозной крови. На первом этапе к 0,5 мл крови добавляли 0,5 мл PBS и центрифугировали 10 мин при 12 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость сливали, добавляли 1 мл PBS и вновь центрифугировали при тех же условиях. Надосадочную жидкость сливали, добавляли 200 мкл ТЕ-буфера, пипетировали до растворения осадка и затем последовательно добавляли 10 мкл 1% раствора додецилсульфата натрия SDS и 5 мкл протеиназы К. Пробирки инкубировали в термостате при t=37°C 12 ч. В ходе второго этапа проводили четыре последовательных центрифугирования с фенолом и хлороформом согласно протоколу методики (10 мин, 8 тыс. об/мин), после чего ДНК осаждали ледяным раствором 95% этилового спирта и центрифугировали 10 мин при 14,3 тыс. об/мин. По испарении спирта ДНК растворяли в 100 мкл деионизированной дистиллированной воды. Получаемый раствор ДНК в воде имел чистоту в диапазоне А260/280=1,5-2,0 и среднюю концентрацию около 180-200 нг/мкл.

2. Подготовка образцов ДНК к генотипированию. Качество выделенной ДНК оценивали по степени чистоты и концентрации раствора на спектрофотометре NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, США). Все анализируемые образцы ДНК были разведены деионизированной водой до концентрации 15-20 нг/мкл при А260/280=1,5-2,0.

3. Анализ полиморфизма rs143334143 (G>A) гена CCHCR1 с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени с использованием аллель-специфических зондов. Для генотипирования использовали два фланкирующих праймера, прямой (SEQ ID NO 1) и обратный (SEQ ID NO 2), а также аллель-специфические зонды: G-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд (SEQ ID NO 3), A-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд (SEQ ID NO 4).

ПЦР в «реальном времени» проводили в 25 мл реакционной смеси, содержащей 1,25 ЕД ДНК-полимеразы Hot Start Taq («Биолабмикс», Новосибирск, Россия), 20 нг ДНК, по 10 мкМ каждого праймера, по 5 мкМ каждого зонда, 0.03 мМ каждого dNTP, 2,5 мМ MgCl2; 1xПЦР-буфер [67 мМ Tris-HCl, pH 8,8, 16,6 мМ (NH4)2SO4, 0,01% Tween-20]. Реакция амплификации состояла из стадии нагревания до 50°C в течение 2 минут, 95°C в течение 10 минут, затем 39 циклов [95°C в течение 10 секунд и 63°C в течение 1 минуты].

4. Генотипирование. При проведении ПЦР в амплификаторе с флуоресцентной детекцией (Bio-Rad CFX96 или аналогичном амплификаторе) генотипирование осуществляют по данным величин RFU (относительных единиц флуоресценции). Для rs143334143 (G>A) гена CCHCR1 зонд с флуоресцентным красителем FAM соответствует аллелю G, зонд с красителем ROX - аллелю A (фиг. 1). На фигуре видно четкое разделение образцов на кластеры, где черный ромб соответствуют отрицательному контролю, кластер оранжевых кругов - соответствует зонду с флуоресцентным красителем FAM и позволяет идентифицировать гомозигот G/G. Кластер синих квадратов соответствует зонду с красителем ROX и позволяет идентифицировать гомозигот A/A. Кластер зеленых треугольников соответствует накоплению уровня флуоресценции по обоим зондам и позволяет идентифицировать гетерозигот G/A.

Резюме.

Таким образом, разработан эффективный и недорогой способ для экспресс-идентификации полиморфного варианта rs143334143 (G>A) гена CCHCR1 у человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов, который может быть использован в медицине при определении предрасположенности к развитию заболеваний, ассоциированных с носительством полиморфизмов гена CCHCR1, а также в научных целях.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Способ

генотипирования полиморфного локуса rs143334143 (G A) гена CCHCR1 у

человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением

аллель-специфических флуоресцентных зондов.xml" softwareName="WIPO

Sequence" softwareVersion="2.3.0" productionDate="2024-02-25">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText></ApplicationNumberText>

<FilingDate></FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>1873</ApplicantFileReference>

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное

бюджетное образовательное учреждение высшего образования

&quot;Курский государственный медицинский университет&quot;

Министерства здравоохранения Российской Федерации,</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Kursk State Medical

University</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Способ генотипирования

полиморфного локуса rs143334143 (G&gt;A) гена CCHCR1 у человека

методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением

аллель-специфических флуоресцентных зондов</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>4</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tctcccttgttttctcccagt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cgcacctgtaatcccagcta</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>27</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..27</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tggcacagtctcggctcactgcaacct</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>27</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..27</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q8">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tggcacagtctcagctcactgcaacct</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области молекулярной биологии. Описан способ генотипирования полиморфного локуса rs143334143 (G>A) гена CCHCR1 у человека методом ПЦР в режиме реального времени с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов. Идентификацию аллельных вариантов rs143334143 (G>A) гена CCHCR1 осуществляют с использованием разработанных праймеров и зондов. Технический результат заключается в разработке простого в исполнении способа генотипирования однонуклеотидного полиморфизма rs143334143 (G>A), локализованного в позиции chr6:31153649 гена CCHCR1 методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с применением аллель-специфических сигнальных зондов, содержащих флуорофоры FAM и ROX. 1 ил., 1 пр.

Способ генотипирования полиморфного локуса rs143334143 (G>A) гена CCHCR1 у человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов, отличающийся тем, что идентификацию аллельных вариантов rs143334143 (G>A) гена CCHCR1 осуществляют с использованием прямого праймера rs143334143 5′- TCTCCCTTGTTTTCTCCCAGT-3′ (SEQ ID NO 1), обратного праймера rs143334143 5′-CGCACCTGTAATCCCAGCTA-3′ (SEQ ID NO 2), rs143334143-G-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда 5′-(FAM)TGGCACAGTCTCGGCTCACTGCAACCT(RTQ1)-3′ (SEQ ID NO 3), rs143334143-A-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда 5′-(ROX)TGGCACAGTCTCAGCTCACTGCAACCT(BHQ2)-3′ (SEQ ID NO 4).