СПОСОБ БИОДЕТЕКЦИИ АКРИЛАМИДА ИММОБИЛИЗОВАННЫМИ КЛЕТКАМИ АМИДАЗОСОДЕРЖАЩИХ БАКТЕРИЙ Российский патент 2024 года по МПК G01N27/26 C12N11/04 

Изобретение относится к биотехнологии и касается способа биодетекции акриламида в воде и водных вытяжках из пищевых продуктов и других материалов, основанного на повышении электропроводности раствора при трансформации акриламида в акриловую кислоту внутриклеточной бактериальной амидазой живых иммобилизованных бактериальных клеток. Клетки бактерий, обладающих амидазной активностью, иммобилизованы включением в гель агарозы или альгината бария или самоиммобилизованы при выращивании биопленки на терморасширенном графите. Для измерения электропроводности раствора используется кондуктометр.

Акриламид обладает нейротоксичностью, тератогенностью, генотоксичностью и канцерогенностью. Акриламид широко используют в промышленности как мономер для производства акриловых полимеров, поэтому он является распространенным промышленным загрязнителем и обнаруживается в стоках промышленных предприятий в концентрации свыше 1 г/л. Полиакриламидные флокулянты, которые используются при очистке природных и сточных вод от взвешенных частиц, являются одним из источников акриламида в водных объектах. Также акриламид образуется в результате реакции Майяра при термообработке (>120°С) богатой углеводами пищи, содержащей природную аминокислоту аспарагин и редуцирующие сахара. Содержание акриламида в воде нормируется, и оно по не должно превышать 0,35 мг/л для водных объектов рыбохозяйственного значения и 0,0001 мг/л для питьевой воды. Для определения содержания акриламида существуют различные аналитические подходы: метод газовой хроматографии (ГХ), метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), основанный на УФ-детектировании или масс-спектрометрии. В пищевой промышленности основными методами определения акриламида являются метод газовой хроматографии - масс-спектрометрии (ГХ-МС), метод жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектрометрии (ЖХ-МС).

Однако определение этого загрязняющего вещества высокоточными аналитическими методами требует специального оборудования, лабораторных условий, обученного персонала и затрат времени. Как альтернатива могут быть использованы биосенсоры на определение акриламида в воде и пищевых продуктах. Биосенсоры обладают высокой чувствительностью, способны к быстрому и специфичному ответу на присутствие токсиканта в среде, не требуют специальных условий, специально обученного персонала, больших временных затрат, реагентов и растворителей.

Известны биосенсоры на акриламид, основанные на различных принципах: на определении респираторной активности клеток Brevibacterium sp. [Ignatov O.V., Rogatcheva S.M., Kozulin S.V., Khorkina N.A. Acrylamide and acrylic acid determination using respiratory activity of microbial cells // Biosensors & Bioelertronics. 1997. V. 12, N. 2. P. 105-111], на снижении генерации тока при обратимой конверсии Fe(II)/Fe(III) иммобилизованным гемоглобином при образовании аддуктов этого белка с акриламидом [Batra В. et al. An acrylamide biosensor based on immobilization of hemoglobin onto multiwalled carbon nanotube/copper nanoparticles/polyaniline hybrid film // Analytical Biochemistry. 2013. V. 433. P. 210-217], на взаимодействии с ДНК [Li D. et al. Label-free Electrochemical Biosensor for Acrylamide Based on DNA Immobilized on Graphene Oxide-Modified Glassy Carbon Electrode // Int. J. Electrochem. Sci. 2014. V. 9. P. 7217-7227], на конверсии акриламида в акриловую кислоту амидазой микроорганизмов [Silva N., Gil D., Karmali A., Matos M. Biosensor for acrylamide based on an ion-selective electrode using whole cells of Pseudomonas aeruginosa containing amidase activity // Biocat. Biotrans. 2009. V. 27. N. 2. 143-151].

В биосенсорах в качестве распознающего агента могут использоваться целые клетки микроорганизмов. Известен способ оценки токсичности продукции из полимерных и текстильных материалов, заключающийся в том, что используют биосенсор на основе кислородного электрода, иммобилизуют целые клетки микроорганизмов на поверхности кислородного электрода, измеряют дыхательную активность микроорганизмов в присутствии пробы, оценивают токсичность проб. Способ отличается тем, что иммобилизуют целые клетки бактерий Е. coli К-12 на поверхности кислородного электрода с помощью полупроницаемой мембраны и измеряют дыхательную активность с помощью термооксиметра [Патент RU 2518306 С1]. Описана композиция для получения гидрогеля на основе поливинилового спирта для иммобилизации микроорганизмов, состоящая из поливинилового спирта и катализатора сшивки церий-аммоний нитрата, обеспечивающая образование нерастворимого в воде гидрогеля для иммобилизации микроорганизмов с целью повышения точности и чувствительности анализа с использованием биосенсора [Патент RU 2614249 С1]. Для иммобилизации дрожжевых клеток Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3492 с целью разработки биосенсора на тринитротолуол используют ткань из стекловолокна, иммобилизацию клеток осуществляют путем адсорбции клеток на матрицу [Патент RU 2437930 С1]. Композиция из поливинилового спирта и сополимера N-винилпирролидона предложена для получения полимерной пленки для иммобилизации микроорганизмов в биосенсорных анализаторах [Патент RU 2461625 С2]. Предложен способ детекции загрязнителей в окружающей среде с использованием генетически модифицированных бактерий Escherichia coli BL21 DE3 pClcRFP, способных к синтезу флуоресцентного белка, изменяющих свечение при взаимодействии с анализируемым соединением, отличающийся тем, что клетки бактерий иммобилизуют в агарозные «бусины» [Патент RU 2015152945 А]. Известен биосенсор для оценки загрязненности сточных вод производства синтетических моющих средств, включающий электрод Кларка, сопряженный с биорецептором, содержащим на носителе иммобилизованные клетки Pseudomonas rathonis ВКПМ-В-2330 [Патент RU 101037 U1]. Предложен биосенсор на основе рН-чувствительного полевого транзистора для определения дихлорметана, содержащий клетки аэробных метилотрофных бактерий Methylobacterium dichloromethanicum ДМ4, способных к биодеградации дихлорметана [Патент RU 107156 U1].

Известно техническое решение для определения акриламида в его аддуктах с белками [Патент RU 2105305 С1]: этот способ заключается в количественном определении акриламида с использованием газовой хроматографии и масс-спектрометрии, при этом подготовку образцов к количественному определению осуществляют путем окисления атома серы в алкилированных белках до сульфоксидной формы с помощью перекиси водорода с последующим освобождением акриламида из сульфоксидной формы при температуре 300°С в инъекционной камере газового хроматографа.

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому прототипом является способ определения акриламида биосенсором на основе целых бактериальных клеток с амидазной активностью. Элементом биологического распознавания потенциометрического биосенсора являются целые клетки Pseudomonas aeruginosa, внутриклеточная амидаза которых катализирует гидролиз акриламида с образованием ионов аммония (NH⁴⁺) и акриловой кислоты. Процесс преобразования сигнала осуществляют с помощью ионоселективного электрода, специфичного к иону аммония. Целые клетки иммобилизуют высушиванием на дисках полимерных мембран из полиэфирсульфона, нейлона и поликарбоната и прикрепляют к поверхности селективного электрода [Silva N.A.F., Matos M.J., Karmali A., Rocha М.М. An Electrochemical Biosensor for Acrylamide Determination: Merits and Limitations // Portugaliae Electrochimica Acta. 2011. V. 29(5). P. 361-373].

Недостатками данного способа являются:

- использование специального ионоселективного электрода;

- использование способа иммобилизации клеток (высушивания на мембране), не обеспечивающего прочной фиксации клеток, что может приводить к их смыванию с электрода в раствор, а также приводящего к потере активности фермента;

- использование бактерий, относящихся к условно-патогенному виду Pseudomonas aeruginosa (синегнойная палочка).

Задачей изобретения является селективное определение акриламида в жидкостях без использования сложного аналитического оборудования.

Техническим результатом заявляемого изобретения является детекция акриламида в воде и водных вытяжках, которая достигается за счет осуществления способа, при котором клетки амидазосодержащих бактерий иммобилизуют в структуре геля агарозы, в структуре геля альгината бария, в биопленках на терморасширенном графите, присутствие акриламида в среде определяют по изменению электропроводности раствора при гидролизе акриламида до акриловой кислоты амидазой иммобилизованных клеток, для определения электропроводности используют кондуктометрический датчик. Изобретение обеспечивает селективное определение акриламида в жидкостях без использования сложного аналитического оборудования.

Заявляемое техническое решение основано на использовании более легкого в применении и универсального кондуктометрического электрода и таких процессов иммобилизации бактериальных клеток, которые обеспечивают прочную фиксацию клеток без повреждения фермента включение в структуру гелей и выращивание биопленок на терморасширенном графите. Эти методы иммобилизации бактериальных клеток позволяют получить биокатализатор, который обладает стабильностью, может многократно использоваться и длительно храниться при различных условиях. Кроме того, получение биопленок на терморасширенном графите объединяет этап выращивания клеточной биомассы и этап иммобилизации на носителе, что позволяет сократить затраты времени и материалов на получение биоселектирующего агента. В заявляемом способе используются штаммы бактерий непатогенных видов Rhodococcus erythropolis и Alcaligenes faecalis.

Для достижения технического результата клетки бактерий с амидазной активностью иммобилизуют на поверхности кондуктометрического электрода. В варианте 1 бактериальные клетки иммобилизуют в геле агарозы. В варианте 2 бактериальные клетки иммобилизуют в геле альгината бария. В варианте 3 выращивают биопленки бактерий в питательной среде с электродом из терморасширенного графита и отмывают терморасширенный графит от питательной среды фосфатным буфером (рН 7-8). Электрод с иммобилизованными бактериальными клетками присоединяют к кондуктометру. Калибруют датчик по раствору акриламида с концентрацией от 1 до 100 мМ. Присутствие акриламида в среде определяют по изменению электропроводности раствора при трансформации акриламида в акриловую кислоту иммобилизованными клетками бактерий, содержащими амидазу.

Таким образом, в сравнении с известным способом (прототипом) заявленный способ позволяет получить биоселективный электрод с прочно иммобилизованными бактериальными клетками, которые способны к многократной трансформации акриламида в акриловую кислоту, при этом ответ кондуктометра линейно зависит от концентрации акриловой кислоты.

Способ поясняется иллюстрациями:

Фиг. 1. Электропроводность 5-100 мМ растворов акриловой кислоты.

Фиг. 2. Динамика изменения электропроводности раствора при трансформации акриламида в акриловую кислоту клетками A. faecalis 2, иммобилизованными в геле агарозы.

Фиг. 3. Трансформация акриламида в акриловую кислоту биопленками R. erythropolis 11-2, выращенными на терморасширенном графите.

Фиг. 4. Трансформация акриламида в акриловую кислоту биопленками A. faecalis 2, выращенными на терморасширенном графите.

Способ иллюстрирован примерами:

Пример 1. Иммобилизация бактериальных клеток в геле агарозы

Раствор агарозы в концентрации 4% нагревали до температуры кипения. После охлаждения до 40°С смешивали в соотношении 3:1 раствор агарозы с суспензией клеток бактерий (ОП₅₄₀=1) Rhodococcus erythropolis 4-1, R. erythropolis 11-2, Alcaligenes faecalis 2 с амидазной активностью (0,1-5 Ед/мг) и наносили на поверхность кондуктометрического датчика. При охлаждении гель с включенными в его структуру бактериальными клетками застывал и образовывал пленку.

Пример 2. Иммобилизация бактериальных клеток в геле альгината бария

Альгинат натрия растворяли в кипящей воде в концентрации 4% и автоклавировали при 121°С в течение 15 минут. После охлаждения до 40°С к раствору альгината натрия добавляли клеточную суспензию (ОП₅₄₀=1) с активностью 0,1-5 Ед/мг в соотношении 2:1 и тщательно перемешивали. Полученную смесь наносили на поверхность кондуктометрического датчика, опуская датчик в раствор альгината с клетками, затем помещали датчик с тонким слоем альгината с включенными в его структуру клетками в 0,1 М раствора BaCl₂, имеющий температуру 4-10°С. Перемещали датчик со слоем затвердевшего альгината в свежий раствор BaCl₂ на 24 ч при температуре 4-6°С. После этого датчик с затвердевшим слоем альгината бария с включенными в его структуру клетками отмывали дистиллированной водой.

Пример 3. Многоцикловая трансформация акриламида в акриловую кислоту бактериальными клетками, иммобилизованными в структуру гелей, после хранения в различных условиях

Клетки A. faecalis 2, иммобилизованные в структуру геля альгината бария и агарозы (см. пример 2), хранили 7 месяцев в различных условиях: 1) предварительно высушивали при 37°С, хранили при +22…+25°С; 2) помещали в калий-фосфатный буферный раствор (рН 7-7,5), хранили при +22…+25°С; 3) помещали в калий-фосфатный буферный раствор (рН 7-7,5), хранили при +4…+6°С; 4) иммобилизованные клетки отделяли от жидкости фильтрованием, хранили при 20°С; 5) иммобилизованные клетки отделяли от жидкости фильтрованием, хранили при -80°С. После хранения помещали гель с иммобилизованными клетками в калий-фосфатный буферный раствор (рН 7-7,5), вносили раствор акриламида до концентрации 100 мМ, после 24 ч реакции при 30°С отбирали пробу, останавливали реакцию внесением концентрированной HCl до 5% от общего объема пробы, центрифугировали 10 мин при 10000-14000 g и определяли концентрацию образовавшейся акриловой кислоты методом ВЭЖХ на хроматографе Infinity II JC 1260 (Agilent, Германия) с колонкой Synergi 4u Hydro-RP 80A (250×4,6 мм). После проведения реакционного цикла иммобилизованные бактериальные клетки отфильтровывали через бумажный фильтр (марки «белая лента» или «красная лента»), отмывали 0,1 М калий-фосфатным буфером (рН 7-7,5) и использовали в следующем цикле.

Проводили 7 циклов реакции (Табл. 1). Во всех вариантах, за исключением реакции с иммобилизованными бактериальными клетками, предварительно высушенными при 37°С (вариант 1), количество акриловой кислоты к 7-му циклу трансформации акриламида составляло не менее 67% от первого реакционного цикла.

Пример 4. Определение электропроводности водного раствора акриламида при его трансформации в акриловую кислоту клетками амидазосодержащих бактерий, иммобилизованными в структуре гелей

Определили электропроводность 1-100 мМ раствора акриловой кислоты (Фиг. 1). Измерение удельной электропроводности проводили на мультимониторе TDS/EC/Sal/Res SanXin SX650 (SanXin Instrumentation, Китай).

Электропроводность реакционной среды с иммобилизованными клетками R. erythropolis 4-1, R. erythropolis 11-2 и A. faecalis 2, включенных в структуру геля агарозы и альгината бария, оценивали по изменению проводимости раствора при трансформации 100 мМ акриламида в акриловую кислоту при 25°С. Измерение удельной электропроводности проводили сразу после добавления субстрата и через 10, 20, 30, 40, 50 и 60 мин экспозиции (Табл. 2). Изменение электропроводности раствора при трансформации акриламида в акриловую кислоту было линейным в диапазоне 0-60 мин (Фиг. 2). Удельная электропроводность раствора акриламида без иммобилизованных бактериальных клеток и иммобилизованных бактериальных клеток без акриламида не изменялась.

Пример 5. Иммобилизация бактериальных клеток на терморасширенном графите

Биопленки Rhodococcus erythropolis 4-1, R. erythropolis 11-2, Alcaligenes faecalis 2 на электродах из терморасширенного графита выращивали следующим образом. Готовили минеральную среду следующего состава (г/л): KH₂PO₄ - 1,0; K₂HPO₄ × 3Н₂О - 3,7; NaCl - 0,5; MgSO₄ × 7Н₂О - 0,5; FeSO₄ × 7H₂O - 0,005; CoCl₂ × 6Н₂О - 0,01, рН 7,2±0,2. Терморасширенный графит автоклавировали в конических колбах объемом 200 мл в 100 мл минеральной среды 1 час при 121°С. Асептически добавляли инокулят бактериальной биомассы в соотношении 1:100 (ОП₅₄₀=1) в автоклавированную среду с терморасширенным графитом и вносили источники углерода и азота. В качестве источника углерода для родококков использовали глюкозу в концентрации 0,1%, источником азота служили ацетонитрил в концентрации 0,05%, хлористый аммоний и ацетамид - 10 мМ и 2,5 мМ соответственно. Для штамма A. faecalis 2 источником углерода и азота был ацетамид в концентрации 0,1 М. Культивировали в течение 7 дней на шейкере со скоростью вращения 120 об/мин при температуре 25-30°С. Выращенные биопленки на терморасширенном графите отмывали однократно от среды культивирования 0,9% раствором хлорида натрия или 0,1 М калий-фосфатным буфером (рН 7,2±0,2).

Пример 6. Многоцикловая трансформация акриламида в акриловую кислоту биопленками амидазосодержаших бактерий на терморасширенном графите

Терморасширенный графит с биопленками R. erythropolis 11-2 и A. faecalis 2 помещали в калий-фосфатный буферный раствор (рН 7-7,5), вносили раствор акриламида до концентрации 100 мМ, проводили реакцию при 30°С в течение 24 ч, отбирали пробу, останавливали реакцию внесением концентрированной HCl до 5% от общего объема пробы, центрифугировали 10 мин при 10000-14000 g и определяли концентрацию образовавшейся акриловой кислоты методом ВЭЖХ на хроматографе Infinity II JC 1260 (Agilent, Германия) с колонкой Synergi 4u Hydro-RP 80A (250×4,6 мм). После проведения реакционного цикла биопленки на терморасширенном графите отделяли от реакционной среды фильтрованием через бумажный фильтр (марки «белая лента» или «красная лента»), отмывали 0,1 М калий-фосфатным буфером (рН 7-7,5) и использовали в следующем цикле.

Проводили 30 циклов реакции трансформации акриламида в акриловую кислоту. Амидазная активность биопленок R. erythropolis 11-2 (Фиг. 3) и A. faecalis 2 (Фиг. 4) на терморасширенном графите сохранялась на протяжении 30 проведенных циклов. Не менее 50% исходной активности биопленок R. erythropolis 11-2 и A. faecalis 2 сохранялось в течение 432 и 216 ч трансформации акриламида соответственно.

Пример 7. Определение электропроводности водного раствора акриламида при его трансформации в акриловую кислоту биопленками амидазосодержащих бактерий на терморасширенном графите

Измерение удельной электропроводности проводили на мультимониторе TDS/EC/Sal/Res SanXin SX650 (SanXin Instrumentation, Китай). Удельная электропроводность раствора акриловой кислоты линейно зависела от ее концентрации.

Электропроводность реакционной среды с биопленками A. faecalis 2 на терморасширенном графите оценивали по изменению проводимости раствора при трансформации 1-100 мМ акриламида в акриловую кислоту при 25°С. Измерение удельной электропроводности проводили сразу после добавления субстрата и через 10, 20, 30, 40, 50 и 60 мин экспозиции. Изменение электропроводности раствора при трансформации акриламида в акриловую кислоту было линейным в диапазоне 0-60 мин. Удельная электропроводность раствора акриламида без биопленок A. faecalis 2 и биопленок A. faecalis 2 без акриламида не возрастала на протяжении времени измерения (60 мин и более).

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ определения акриламида, включающий иммобилизацию бактериальных клеток с амидазной активностью методом смешивания бактериальной суспензии с 4% агарозой при температуре 45-50°С, нанесения геля на поверхность кондуктометрического электрода, остужения агарозного геля с клетками бактерий до температуры 20-25°С, закрепления электрода в кондуктометре. Следом идёт определение электропроводности раствора с помощью кондуктометра; оценку содержания акриламида в растворе по изменению проводимости раствора за 10-60 минут. Изобретение обеспечивает селективное определение акриламида в жидкостях без использования сложного аналитического оборудования. 2 з.п. ф-лы, 4 ил., 2 табл., 7 пр.

1. Способ определения акриламида, включающий иммобилизацию бактериальных клеток с амидазной активностью методом смешивания бактериальной суспензии с 4% агарозой при температуре 45-50°С, нанесения геля на поверхность кондуктометрического электрода, остужения агарозного геля с клетками бактерий до температуры 20-25°С, закрепления электрода в кондуктометре; определение электропроводности раствора с помощью кондуктометра; оценку содержания акриламида в растворе по изменению проводимости раствора за 10-60 минут.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что бактериальные клетки с амидазной активностью иммобилизуют следующим образом: смешивают бактериальную суспензию с 4%-ным раствором альгината натрия, наносят гель на поверхность кондуктометрического электрода, помещают датчик с нанесенным гелем в 0,1 М раствор хлорида бария, отмывают затвердевший гель альгината бария от хлорида бария 0,9% раствором хлорида натрия или фосфатным буфером с рН 7, электрод закрепляют в кондуктометре.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что бактериальные клетки с амидазной активностью иммобилизуют следующим образом: вносят бактериальные клетки в питательную среду с электродом из терморасширенного графита, культивируют в течение 3-7 суток, терморасширенный графит с биопленкой отмывают буфером от питательной среды, электрод закрепляют в кондуктометре.