БИОСЕНСОРНАЯ СИСТЕМА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ 2,4-ДИНИТРОФЕНОЛА И ИОНОВ НИТРИТА И БИОСЕНСОРЫ ДЛЯ ЭТОЙ СИСТЕМЫ Российский патент 2003 года по МПК C12Q1/02 C12Q1/12 G01N33/18 C12Q1/02 C12R1/01 

Изобретение относится к области биотехнологии охраны окружающей среды, в частности к разработке микробных биосенсоров для определения 2,4-динитрофенола (2,4-ДНФ) и нитрита в водных растворах. Изобретения могут быть использованы в природоохранных целях для быстрого обнаружения и определения концентрации 2,4-ДНФ и нитрита. Это особенно важно для контроля технологического процесса очистки сточных вод, содержащих 2,4-ДНФ и ионы нитрита.

Традиционно используемые в настоящее время способы обнаружения 2,4-ДНФ и ионов нитрита предусматривают использование дорогостоящего оборудования и высококвалифицированного персонала (фотометрические методы, жидкостная хроматография высокого давления и др.). Эти же недостатки характерны дня иммуноанализа и, в частности, для иммуносенсоров.

Известен микробный биосенсор для определения фенола и хлорфенолов, состоящий из кислородного электрода Кларка, включающего платиновую проволоку, запаянную в стекло и питаемую напряжением (-0,7 вольт) от источника постоянного тока, сопряженную с хлорсеребряным электродом сравнения, заключенную в корпус с 300 мМ раствором КС1, закрытый газопроницаемой мембраной, и биорецептора, представляющего собой иммобилизованные в пленке поливинилового спирта (28 кДа) клетки штамма бактерий Rhodococcus sp. P1 [К. Riedel, J. Hensel, S. Rothe, B. Neumann. F. Scheller. Microbial sensors for detеrmination of aromatics and their chloroderivatives. Part II: Determination of chlorinated phenols using a Rhodococcus-containing biosensor. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1993. V. 38. - P. 556-559].

Известна способность трансформации 2,4-ДНФ культурой бактерий Rhodococcus erythropolis HL РМ-1, в процессе которой наблюдается выделениe ионов нитрита (Takayama К., Каnо К., Ikeda T. Mediated electrocatalytic reduction of nitrate and nitrite based on the denitrifying activity of Paracoccus denitrificans. Applied Enviromental Microbiology. 1992. V. 58. 9. Р. 2928-2932).

Микробный биосенсор для определения 2,4-динитрофенола не известен.

Известен микробный биосенсор для определения ионов нитрита, содержащий медиаторный электрод, модифицированный дурогидрохиноном, сопряженный с биорецептором, представляющим собой носитель, на котором иммобилизованы клетки бактерий Paracoccus denitficans (Chemistry Letters N 11, 1996, р.1009 и 1010).

Недостатком этого биосенсора является его дороговизна.

Известен микробный биосенсор для определения ионов нитрита, который представляет собой кислородный электрод Кларка, сопряженный с биорецептором, представляющим собой носитель - мембрану Millipore, на котором иммобилизованы клетки бактерий Nitrobactеr [I. Karube et al., Amperometric determination of sodium nitrite by a microbial sensor. European. Journal of Appl. Microbiol. Biotechn., V. 15, 2, 1982, p. 127-132]. Измерительная ячейка этого биосенсора разделена полупроницаемыми мембранами на три отсека, в которых поддерживаются разные величины рН. Нижний предел детекции - 10 мкМ. Общая воспроизводимость - 4%. Операционная стабильность биорецептора - свыше 21 сут (400 измерений). Время ответа - 25 мин. Селективность не указана. Штамм не идентифицирован, требует длительного культивирования (в течение 7 месяцев).

Микробные биосенсоры для определения 2,4-динитрофенола и ионов нитрита при их совместном присутствии в растворе не известны.

Задача, на решение которой направлено заявляемое изобретение, - разработка высокочувствительной биосенсорной системы для одновременного определения 2,4-ДНФ и нитрита, а также биосенсоров для определения каждого из соединений.

Технический результат, который может быть получен при осуществлении предлагаемого изобретения, заключается в том, что биосенсорная система обеспечивает при определении 2,4-ДНФ и нитрита высокую чувствительность и селективность.

Предложена биосенсорная система для определения 2,4-динитрофенола и ионов нитрита в водных средах, содержащая четыре биосенсора, преобразователями которых являются погруженные в проточные, соединенные между собой измерительные ячейки электроды Кларка, в качестве биорецепторов первый и третий биосенсоры содержат клетки Rhodococcus erythropolis HL РМ-1, иммобилизованные на носителе, четвертый биосенсор - клетки бактерий Nitrobacter vulgaris DSM 10236, иммобилизованные на носителе, второй биосенсор включает реактор колоночного типа с иммобилизованными на носителе клетками бактерий Rhodococcus erythropolis HL РМ-1 в качестве биорецептора, при этом электрод Кларка второго биосенсора размещен на выходе реактора.

Предложен биосенсор для определения 2,4-динитрофенола в водных средах, включающий электрод Кларка, сопряженный с биорецептором мембранного или реакторного типа, содержащий иммобилизованные на носителе клетки Rhodococcus erythropolis HL PM-1. Носитель может быть размещен или на электроде Кларка, или помещен в реактор, при этом электрод Кларка размещен на выходе реактора.

Предложен биосенсор для определения ионов нитрита в водных средах, включающий электрод Кларка, на котором размещен биорецептор, содержащий иммобилизованные на носителе клетки Nitrobacter vulgaris DSM 10236.

На Фиг. 1 представлена общая схема биосенсорной системы для определения 2,4-динитрофенола и ионов нитрита.

На Фиг. 2 представлена схема биосенсора для определения 2,4-динитрофенола: а) носитель на мембране, б) носитель в реакторе.

На Фиг.3 представлена схема биосенсора для определения нитрита.

Биосенсорная система для определения 2,4-динитрофенола и ионов нитрита в водных средах содержит четыре биосенсора 1-4, преобразователями которых являются погруженные в проточные, соединенные между собой измерительные ячейки электроды Кларка, в качестве биорецепторов биосенсоры 1 и 3 содержат клетки Rhodococcus erythropolis HL РМ-1, иммобилизованные на носителе, который размещен на электроде, биосенсор 2 - иммобилизованные на носителе клетки бактерий Rhodococcus erythropolis HL PM, которые помещены в реактор колоночного типа 5, биосенсор 4 - клетки бактерий Nitrobacter vulgaris DSM 10236, иммобилизованные на носителе, при этом в биосенсоре 2 электрод Кларка размещен на выходе реактора. Биосенсоры 1 и 3 в качестве биорецептора содержат клетки Rhodococcus erythropolis HL PM-1, иммобилизованные на носителе, который размещен на электроде.

Биосенсор 2 с реактором 5 с иммобилизованными на носителе клетками бактерий Rhodococcus erythropolis HL PM-1 предназначен для определения 2,4-ДНФ. При этом в реакторе 5 происходит генерирование ионов нитрита, концентрация которых (пропорциональная количеству переработанного в реакторе 2,4-ДНФ) затем регистрируется биосенсором 4 с биорецептором на основе клеток бактерий Nitrobacter vulgaris DSM 10236.

Биосенсор 4 содержит в качестве биорецептора клетки бактерий Nitrobacter vulgaris DSM 10236, иммобилизованные на носителе.

Из трех биосенсоров мембранного типа биосенсоры 1 и 3 предназначены для определения 2,4-ДНФ и биосенсор 4 - для определения нитрита.

Носителями для клеток Rhodococcus erythropolis HL PM-1 и Nitrobacter vulgaris DSM 10236, используемых в мембранных биосенсорах, могут служить полисахаридные гели, поливиниловые спирты, целлюлозные мембраны, стекловолокно, в частности стеклобумага.

Носителями для клеток бактерий Rhodococcus erythropolis HL PM-1, используемых в реакторе колоночного типа, могут служить полисахаридные гели, керамика, порошковая целлюлоза.

Авторы изобретения использовали иммобилизованные клетки Rhodococcus erythropolis HL РМ-1 и показали, что процесс трансформации 2,4-ДНФ сопровождается потреблением молекулярного кислорода.

Культура бактерий Nitrobacter vulgaris DSM 10236 переводит ионы нитрита в ионы нитрата также с потреблением молекулярного кислорода.

Принцип определения 2,4-ДНФ и ионов нитрита основан на регистрации изменений респираторной активности клеток, т.е. скорости потребления кислорода в растворе, содержащем указанные соединения.

Потребление кислорода приводит к изменению силы тока кислородного электрода Кларка, что может быть зарегистрировано с помощью регистрирующего устройства. Амплитуда изменения силы тока (ΔI, нА) и максимальная скорость этого изменения (dI/dt, нА/с) коррелируют с концентрацией анализируемого соединения и используются в качестве измеряемых параметров.

Для создания биорецептора биосенсора, позволяющего определять 2,4-ДНФ, был использован штамм бактерий Rhodococcus erythropolis HL РМ-1, полученный из Института микробиологии (Штуттгартский университет, ФРГ).

Штамм выращивают на жидкой среде следующего состава (г/л): аминопептид гидролизата крови 60,0, триптон 50,0, дрожжевой экстракт 10,0, экстракт сои 30,0. Культивирование производят в пробирках (рабочий объем 10 мл) при 28^oС на качалке (220-240 мин^-1). После 18 ч культивирования клетки центрифугируют при 3000 g в течение 15 мин, дважды промывают 50 мМ калий-фосфатным буфером (рН 7,4), ресуспендируют в том же буфере до концентрации 50 мг/мл (сырой вес) и инкубируют при 4^oС в течение 12 ч.

Биорецептор мембранного биосенсора для определения 2,4-ДНФ (1 и 3) был создан на основе клеток Rhodococcus erythropolis HL РМ-1 путем нанесения суспензии клеток на носитель (Фиг.2).

В реакторном варианте биосенсора для определения 2,4-ДНФ рецепторным элементом являются клетки Rhodococcus erythropolis HL PM-1, помещенные в биореактор колоночною типа с вытеснением и постоянной подачей раствора.

Такие иммобилизованные клетки получают по следующей схеме: к 50 мл суспензии клеток Rhodococcus erythropolis HL PM-1 (20 мг/мл, сырой вес) добавляют 1,5 г порошковой целлюлозы (размер частиц 0,2-1,25 мм), перемешивают на качалке (200 мин^-1) в течение 20 мин при 24^oС и выдерживают в течение ночи при 4^oС. Для отделения несвязанных клеток носитель промывают буферным раствором декантацией 10 раз с отбором 1-минутных фракций. Иммобилизованные клетки помещают в колонку с рабочим объемом 10 мл. Концентрация клеток в биореакторе составляет 170 мг клеток/г носителя (сырой вес).

Для индукции систем деградации 2,4-ДНФ через колонку пропускают раствор 2,4-ДНФ (100 мкМ) в течение 6 ч со скоростью 1 мл/мин. После индукции выход биореактора подключают непосредственно к входу проточной ячейки с установленным электродом.

Для создания биорецептора биосенсора для определения ионов нитрита используют клетки бактерий Nitrobacter vulgaris DSM 10236, который был получен из Коллекции культур микроорганизмов и клеток Германии.

Клетки штамма Nitrobacter vulgaris DSM 10236 культивируют в пробирках (объем 20 мл) без перемешивания при 30^oС в течение 3 недель. Рост клеток контролируют до убыли субстрата - нитрита натрия колориметрически с использованием реактива Грисса. После исчезновения субстрата биомассу собирают центрифугированием и используют для формирования биорецепторного элемента.

Культуру выращивают на миксотрофной среде следующего состава: NaNO₂ - 2,0 г/л, дрожжевой экстракт - 1,5 г/л, пептон - 1,5 г/л, пируват натрия - 0,55, г/л, раствор микроэлементов - 1,0 мл, раствор солей - 100 мл, дистиллированная вода - 900 мл, рН 7,4 (титрование NaOH).

При этом раствор солей (г/л) включает СаСО₃ - 0,07, NaСl - 5,0, MgSO₄ • 7H₂O - 0,5, KH₂PO₄ - 1,5, а раствор микроэлементов (г/л): MnSO₄ • H₂O - 0,0338, Н₃ВО₃ - 0,0494, ZnSO₄ • 7Н₂О - 0,0431, (NН₄)₆Мо₇О₂₄ - 0,0371, FеSO₄ • 7Н₂О - 0,973, CuSO₄ • 5H₂O - 0,025.

Концентрацию клеток в суспензии определяют спектрофотометрически (спектрофотометр "Specol-221", λ= 540 nm), используя предварительно полученную калибровочную зависимость оптической плотности суспензии от концентрации клеток.

Иммобилизацию клеток проводят адсорбцией на хроматографической стеклобумаге Whatman GF/A. С этой целью 5 мкл клeтoчнoй суспензии наносят на бумагу, формируя пятно диаметром 3-5 мм, и высушивают на воздухе в течение 30 мин. Полученный биорецептор помещают на рабочую поверхность электрода и фиксируют. Поверхностная плотность клеток в биорецепторе - около 10⁶ клеток/мм².

Биосенсор для определения 2,4-динитрофенола в водных средах включает электрод Кларка 16, сопряженный с биорецептором 17, содержащим иммобилизованные на носителе клетки Rhodococcus erythropolis HL PM-l.

При этом используется биорецептор мембранного (Фиг.2а) или реакторного (Фиг. 2б) типа, содержащий иммобилизованные на носителе клетки Rhodococcus erythropolis HL РМ-1.

Биосенсор для определения нитрита в водных средах включает погруженный в измерительную ячейку электрод Кларка 18, сопряженный с биорецептором 19, содержащим иммобилизованные на носителе клетки Nitrobacter vulgaris DSM 10236 (Фиг.3).

Биосенсорная система работает следующим образом.

Измерения проводят в проточном режиме.

Базовый раствор, представляющий собой фосфатный буфер, подают в систему из емкости 6 через переключатель 7 с помощью перистальтического насоса 8.

При прохождении базового раствора через ячейки биосенсоров 1-4 (переключатель 9 в положении "включено", а переключатель 10 в положении "выключено") после усиления системой усилителей 11 регистрируются фоновые сигналы биосенсоров 1-4 регистрирующим устройством 12 (например, компьютером или самописцем).

Затем из емкости 13 анализируемый раствор через переключатель 14 с помощью перистальтического насоса 8 подается в систему биосенсоров. В измерительной ячейке мембранного биосенсора 1 регистрируется его сигнал для последующего расчета "условной" концентрации 2,4-ДНФ.

"Условная" концентрация - концентрация анализируемого соединения, рассчитанная с использованием калибровочной кривой, представляющей собой зависимость ответа биосенсора от концентрации эталонных растворов анализируемого соединения, на основе ответа неселективного биосенсора на смесь неизвестного состава.

Если переключатель 9 находится в положении "включено", а переключатель 10 - в положении "выключено", то анализируемый раствор проходит через биореактор 5.

В реакторном биосенсоре 2 (комбинация биореактора 5 и электрода Кларка) происходит трансформация 2,4-ДНФ, сопровождающаяся потреблением кислорода и появлением ионов нитрита. При этом регистрируется сигнал биосенсора 2 для последующего расчета условной концентрации 2,4-ДНФ в анализируемом растворе. При прохождении анализируемого раствора через ячейку биосенсора 3 регистрируется сигнал биосенсора для последующего расчета "условной" концентрации 2,4-ДНФ на выходе биореактора 5.

При прохождения анализируемого раствора через ячейку мембранного биосенсора 4 регистрируется сигнал, используемый для расчета концентрации нитрита, включая нитрит, образующийся в биореакторе. Отработанный раствор поступает в емкость 15.

Для определения концентрации нитрита в анализируемом растворе после промывания системы базовым раствором анализируемый раствор через переключатель 10 (поток, направленный в обход реактора) пропускают в проточные ячейки биосенсоров 2, 3 и 4, при этом регистрируют сигнал биосенсора 4.

Все сигналы биосенсоров 1-4 регистрируются после усиления системой усилителей 11 регистрирующим устройством 12 (например, компьютером или самописцем). В случае использования компьютерной регистрации применяется ранее разработанная программа "Sensors for Windows".

Измерения проводит при постоянном протоке со скоростью 1 мл/мин и температуре 20^oС. В качестве базового раствора был использован 30 мМ калий-фосфатный буфер, рН 7,0.

При наличии в анализируемом растворе неизвестных соединений в неизвестном соотношении расчет, проводимый на основе данных, полученных с использованием предлагаемого устройства, включает следующие стадии:
1) оценку условной концентрации 2,4-ДНФ на основании показаний биосенсоров 1 и 2;
2) оценку условного количества переработанного в реакторе 2,4-ДНФ на основании показаний сенсора 3;
3) регистрацию общего ответа биосенсора 4, включая влияние нитрита, предположительно полученного в реакторе в результате деградации 2,4-ДНФ;
4) после восстановления системы путем промывки базовым раствором регистрацию общего ответа биосенсора 4 при потоке, направленном в обход реактора (через переключатель 10);
5) сравнение ответов биосенсора 4 при протоке, направленном через реактор (через переключатель 9) и в обход него, и вычисление концентрации и количества нитрита, реально выработанного биореактором 5;
6) расчет концентрации 2,4-ДНФ в анализируемом растворе на основании результатов стадии 5 согласно предварительно полученной зависимости концентрации нитрита на выходе биореактора от исходной эталонной концентрации 2,4-ДНФ;
7) сравнение значения, полученного на стадии 6, с данными стадий 1-3, и расчет относительного влияния мешающих соединений (в частности, таких как фенол, катехол и т.п.).

Первые три стадии расчета по этой схеме позволяют получить значения неселективных ответов, которые используются только как вспомогательные данные для дальнейших расчетов. Стадия 5 предоставляет точную оценку нитрита, продуцированного реактором, на основе которой затем рассчитывают концентрацию 2,4-ДНФ в образце. Стадия 7 позволяет оценить относительное влияние мешающих соединений на ответ сенсора, что может представлять косвенную информацию об их содержании в образце.

Общее время анализа может составлять 30-40 мин.

При наличии в анализируемом растворе смеси, состоящей только из 2,4-ДНФ и нитрита, пропускают анализируемый раствор через мембранные биосенсоры 1 и 3 с клетками R. erythropolis HL РМ-1 и биосенсор 4 с клетками N. vulgaris DSM 10236 (в обход биореактора). Показания биосенсора 1 дают возможность определить концентрацию 2,4-ДНФ. Использование показаний биосенсора 3 позволяют повысить точность определения концентрации 2,4-ДНФ. Затем на основе предварительно полученной калибровочной поверхности и показаний биосенсора 4 определяют концентрацию нитрита.

При наличии в анализируемом растворе только 2,4-ДНФ используют одноканальный мембранный биосенсор 1 или 3 на основе Rhodococcus erythropolis HL РМ-1. Диапазон определения 10-250 мкМ. Время анализа 10 мин в проточном режиме.

При наличии в анализируемом растворе только нитрита используют одноканальный биосенсор 4. Диапазон определения 0,02-10 мМ. Время анализа 10 мин в проточном режиме.

Биосенсор для определения 2,4-ДНФ работает следующим образом.

А) При погружении электрода Кларка с размещенным на нем носителем, содержащим иммобилизованные клетки штамма Rhodococcus erythropolis HL РМ-1 (мембранный биорецептор), происходит трансформация 2,4-ДНФ с потреблением молекулярного кислорода.

Потребление кислорода приводит к изменению силы тока кислородного электрода Кларка, что может быть зарегистрировано с помощью регистрирующего устройства. Амплитуда изменения силы тока (ΔI, нА) и максимальная скорость этого изменения (dI/dt, нА/с) коррелируют с концентрацией анализируемого соединения и используются в качестве измеряемых параметров.

Б) При пропускании анализируемого раствора через биореактор с носителем, содержащим иммобилизованные клетки штамма Rhodococcus erythropolis HL РМ-1 (реакторный биорецептор), происходит трансформация 2,4-ДНФ с потреблением молекулярного кислорода.

Потребление кислорода приводит к изменению силы тока кислородного электрода Кларка, который размещен на выходе реактора, изменение силы тока может быть зафиксировано регистрирующим устройством. Амплитуда изменения силы тока (ΔI, нА) коррелирует с концентрацией анализируемого соединения и используется в качестве измеряемого параметра.

Нижний предел детекции 10 мкМ. Операционная стабильность 21 сут. Воспроизводимость показаний 5%. Сенсор чувствителен к фенолу, катехолу, некоторым углеводам и спиртам и органическим кислотам (всего протестировано 22 соединения).

Биосенсор для определения нитрита работает следующим образом.

При погружении электрода Кларка с размещенным на нем носителем, содержащим иммобилизованные клетки штамма Nitrobacter vulgaris DSM 10236, происходит трансформация нитрита в ионы нитрата с потреблением молекулярного кислорода, скорость которого регистрируется кислородным электродом Кларка.

Нижний предел детекции 10 мкМ. Операционная стабильность 7 сут. Воспроизводимость показаний 5%. Сенсор чувствителен к 2,4-динитрофенолу, катехолу (всего протестировано 17 соединений).

Таким образом, предлагаемая система обеспечивает возможность точного определения 2,4-ДНФ в диапазоне 25-250 мкМ и нитрита в диапазоне 0,02-10 мМ при их одновременном присутствии в водных растворах.

Высокая чувствительность и селективность системы достигаются за счет использования в предлагаемой биосенсорной системе комбинации биосенсора реакторного типа 2 и биосенсора 4, позволяющего определить концентрацию продукта трансформации 2,4-ДНФ - ионов нитрита.

По нашим сведениям, в литературе не описаны биосенсорные системы, основанные на указанном подходе.

Введение дополнительного биосенсора 3, осуществляющего измерение 2,4-ДНФ, повышает точность измерения в соответствии с известной закономерностью снижения ошибки измерения при увеличении количества измерений.

Наличие в системе биосенсоров 1 и 3 позволяет производить предварительную оценку концентрации 2,4-ДНФ и относительное влияние мешающих соединений (в частности, таких как фенол, катехол и т.п.).

Изобретение предназначено для быстрого обнаружения и определения 2,4-динитрофенола и нитрита в водных растворах. Биосенсорная система содержит четыре биосенсора, преобразователями которых являются погруженные в проточные ячейки электроды Кларка, в качестве биорецепторов первый и третий мембранные биосенсоры содержат иммобилизованные на носителе клетки Rhodococcus erythropolis HL PM-1, четвертый мембранный биосенсор содержит иммобилизованные на носителе клетки бактерий Nitrobacter vulgaris DSM10236, второй биосенсор выполнен в виде реактора колоночного типа с иммобилизованными на носителе клетками бактерий Rhodococcus erythropolis HL PM-1, при этом электрод Кларка размещен на выходе реактора биосенсора, а проточные ячейки биосенсоров последовательно соединены между собой. Предложены также биосенсор для определения 2,4-ДНФ и биосенсор для определения ионов нитрита. Биосенсорная система обеспечивает при определении 2,4-ДНФ и нитрита высокую чувствительность и селективность, позволяет определять наличие данных веществ одновременно. 3 с. и 2 з.п.ф-лы, 3 ил.

1. Биосенсорная система для определения 2,4-динитрофенола и ионов нитрита, содержащая четыре биосенсора, преобразователями которых являются погруженные в проточные ячейки электроды Кларка, в качестве биорецепторов первый и третий мембранные биосенсоры содержат иммобилизованные на носителе клетки Rhodococcus erythropolis HL PM-1, четвертый мембранный биосенсор содержит иммобилизованные на носителе клетки бактерий Nitrobacter vulgaris DSM10236, второй биосенсор выполнен в виде реактора колоночного типа с иммобилизованными на носителе клетками бактерий Rhodococcus erythropolis HL PM-1, при этом электрод Кларка размещен на выходе реактора биосенсора, а проточные ячейки биосенсоров последовательно соединены между собой. 2. Биосенсор для определения 2,4-динитрофенола, включающий электрод Кларка, сопряженный с биорецептором, содержащим иммобилизованные на носителе клетки Rhodococcus erythropolis HL PM-1. 3. Биосенсор для определения 2,4-динитрофенола по п.2, содержащий носитель, размещенный на электроде Кларка. 4. Биосенсор для определения 2,4-динитрофенола по п.2, содержащий носитель, помещенный в реактор, при этом электрод Кларка размещен на выходе реактора. 5. Биосенсор для определения ионов нитрита, включающий электрод Кларка, сопряженный с биорецептором, содержащим иммобилизованные на носителе клетки Nitrobacter, отличающийся тем, что биорецептор содержит клетки Nitrobacter vulgaris DSM10236.