Способ дифференциальной диагностики заболеваний мочевого пузыря воспалительной и опухолевой природы Российский патент 2024 года по МПК G01N33/52 G01N33/493 G01N33/533 G01N33/574 G01N33/577 G01N1/30 

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, урологии, и может быть использовано для дифференциальной диагностики заболеваний мочевого пузыря воспалительной и опухолевой природы.

Известен способ диагностики переходноклеточного рака мочевого пузыря, предлагающий определение в препарате, приготовленном из осадка второй порции утренней мочи аномальных клеток и их анализ. Для исследования утренней мочи, взятой начиная со второго акта мочеиспускания, применяется комплексный подход, включающий серию обработок, включающий добавление ДНК-зонда «UroVysion» и 1 мкл гибридизационного буфера с последующей промывкой в растворах детергента и добавлением DAPI. С использованием флуорисцентного микроскопа, анализируют не менее 25 морфологически аномальных клеток. Если как минимум в 4-х из них обнаруживают больше 2-х перицентромерных сигналов не менее чем в двух хромосомах из трех: 3, 7 и 17-й и/или в 12-ти из 25 клеток отсутствует сигнал по локусу 9р21, делают заключение о наличии генетических изменений в эпителиальных клетках мочевого пузыря, характерных для рака, и диагностируют рак мочевого пузыря.

Однако данный способ, включающий анализ хромосомных перестроек в клетках эпителия мочевого пузыря, имеет следующие недостатки:

1. Не предназначен для дифференциальной диагностики злокачественных и доброкачественных патологий, отчего не может быть использован для диагностики неонкологических заболеваний мочевого пузыря.

2. Требует выполнения многочисленных инструментальных, биохимических и аналитических параметров, что является довольно трудоемким и материально затратным исследованием (стоимость анализа - 8000-10000 руб.) (Патент РФ 2456607, опубл. 20.07.2012 Бюл. № 20).

Известен способ дооперационной диагностики распространенности рака мочевого пузыря, предполагающий определение в одноразовой порции мочи, находящейся в мочевом пузыре не менее 3 часов, специфических маркеров рака мочевого пузыря, таких как UBC, BTA и NMP-22. В случае, если у обследуемого больного все три маркера превышают дискриминантный уровень нижнего предела (ДУ) и ни один из маркеров по своему уровню не превышает ДУ верхнего предела, у больного диагностируют поверхностный рак мочевого пузыря с диагностической точностью 87%. При наличии одного, двух или всех трех показателей, значительно превышающих дискриминантный уровень верхнего предела, больного направляют на дополнительное инструментальное обследование с целью определения степени инвазии рака мочевого пузыря.

Данный способ, включающий расчеты диагностических индексов по сумме показателей, имеет следующие недостатки:

1) Этот метод не пригоден для выявления конкретных форм злокачественных опухолей и, следовательно, имеет низкую диагностическую чувствительность при раке мочевого пузыря, а также не может использоваться для диагностики воспалительных заболеваний мочевого пузыря.

2) Метод предполагает проведение большого количества, биохимических и математических параметров, что требует значительных усилий и финансовых затрат (BY 13555 C1, опубл. 2010.08.30).

Известен также способ диагностики хронического цистита у женщин, осуществляемый путем анализа средней доли порции и измерения в ней уровня аэробных бактерий (АБ) и неклостридиальных анаэробных бактерий (НАБ), при помощи чего можно выявить хронический цистит при условии, что концентрация АБ составляет 10^∧3 КОЕ/мл, а НАБ - 10^∧4 КОЕ/мл.

Недостатком этого способа является длительность его осуществления: на посев бактерий и получение их колоний уходит 4-7 суток, что может негативно сказаться на течении заболевания при отсутствии лечения. Также данный способ требует наличия бактериологической лаборатории и врачей-микробиологов что может быть затруднительно для медицинских организаций, находящихся в отдаленных населенных пунктах от крупных городов (Патент РФ 2444016, опубл. 27.02.2012 Бюл. № (6).

Задача предлагаемого способа заключается в проведении дифференциальной диагностики циститов и рака мочевого пузыря с использованием метода проточной цитометрии клеточного осадка мочи.

Поставленную задачу решали следующим способом. Первую утреннюю порцию мочи пациентов с циститами и поверхностными формами рака мочевого пузыря (T1N0M0, TаN0M0 или TisN0M0) центрифугировали при 2000 об/мин в течение 20 мин для осаждения клеточных элементов. После этого супернатант сливали, к осадку добавляли 2 мл PBS, проводили ресуспендирование путем пипетирования на протяжении 1-2 мин и центрифугировали при 2000 об/мин в течение 10 мин. Описанную процедуру отмывки клеточного осадка проводили дважды. Далее супернатант сливали, к осадку добавляли 0,5 мл PBS, проводили ресуспендирование путем пипетирования на протяжении 1-2 мин. Изучение клеточного цикла осуществляли с использованием метода флуоресцентного окрашивания антителами к ki-67 и йодидом пропидия. К выделенным клеточным элементам из осадка мочи добавляли 3 мл 96% этилового спирта. После этого клеточную взвесь инкубировали при +2 - +8°C в течение 30 минут, затем дважды отмывали в PBS. В дальнейшем проводили окрашивание моноклональными антителами к ki-67 меченными флуоресцеин изотиоционатом (ФИТЦ - максимум поглощения на 492 нм, максимум флуоресценции на 518 нм, производитель BD Biosciences, США) в объеме 20 мкл. Также добавляли йодид пропидия (фенантридин-3,8-диамино-5-[3-(диэтилметиламмоний) пропил]-6-фенил-дийодид) в концентрации 2 мг/мл (максимум поглощения на 488 нм, максимум флуоресценции на 610 нм, Sigma-Aldrich, США) в объеме 20 мкл, после чего взвесь перемешивали и инкубировали в темноте 15 минут. После инкубации проводили измерение флуоресценции на проточном цитофлуорометре BD FACSCanto II (BectonDickinson, США).

Фактическое распределение клеток по различным фазам клеточного цикла в осадке мочи у наблюдаемых пациентов представлено в табл. 1. Достоверность различий между показателями групп пациентов оценивали с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни. У пациентов с циститом в клеточном осадке мочи количество и соотношение клеток в различных фазах клеточного цикла отличается от таковых показателей пациентов со злокачественным новообразованием.

Таблица 1

Сравнительная характеристика количество клеток в различных фазах клеточного цикла у пациентов с воспалительными заболеваниями и раком мочевого пузыря

Показатель Пациенты с циститом
N=44
Me (С25-С75) Пациенты с раком мочевого пузыря
N=58
Me (С25-С75) Достоверность различий между группой пациентов с циститом и группой пациентов с раком мочевого пузыря Количество клеток в S-фазе (синтетическая фаза клеточного цикла), % 51,90
(47,60-63,60) 68,80
(61,20-75,30) р>0,001 Количество клеток в G1-фазе (пресинтетическая фаза клеточного цикла), % 16,55
(11,50-21,50) 7,90
(5,10-12,10) р>0,01 Количество клеток в G2-фазе (постсинтетическая фаза клеточного цикла), % 26,05
(17,80-28,80) 19,65
(14,50-27,90) Количество клеток в G0-фазе (фаза покоя клеточного цикла), % 5,60
(1,60-7,30) 10,90
(6,90-15,30) р>0,0001 Количество клеток в митозе, % 5,6
(1,60-8,30) 1,40
(0,90-1,90) р>0,05

Таким образом, в клеточном осадке мочи были обнаружены различия в количестве клеток в различных фазах клеточного цикла у пациентов с циститами и с поверхностным раком мочевого пузыря.

Способ осуществляют следующим образом:

При обращении пациента с жалобами, которые врач может интерпретировать как проблемы, связанные с заболеваниями мочевого пузыря, у таких пациентов забирается первая утренняя порция мочи. По вышеописанной методике проводится измерение содержания в осадке мочи клеток в различных фазах клеточного цикла. Вероятность наличия воспалительного или опухолевого заболевания рассчитывается согласно табл. 2.

Таблица 2

Определение наличия у пациентов воспалительного или злокачественного заболевания

Показатель Наличие цистита Наличие РМП Количество клеток в S-фазе, % ≤61,2% >61,2% Количество клеток в G1-фазе, % >12,1% ≤12,1% Количество клеток в митозе, % >1,9% ≤1,9% Количество клеток в G0-фазе, % ≤6,9% >6,9%

Чувствительность предлагаемого метода прогноза развития рецидива рака мочевого пузыря составляет 78,9%, специфичность - 87,0%, диагностическая точность - 98,4%. С учетом показателей диагностической точности мы можем с высокой вероятностью 98,4% провести дифференциальную диагностику между воспалительными и не воспалительными заболеваниями мочевого пузыря.

Техническим результатом изобретения является дифференциальная диагностика заболеваний мочевого пузыря с высокой диагностической точностью, что позволяет при первом обращении поставить верный диагноз и своевременно начать лечение.

Пример №1

Больная В., 27 лет

Жалобы: на боль в нижней части живота, дискомфорт при мочеиспускании, высокую частоту вынужденного посещения туалета в течение трёх лет. В анамнезе две госпитализации в урологическое отделение по поводу лечения хронического вирусного цистита.

Результаты обследования пациентки:

Общий анализ мочи: лейкоциты 50-70 в поле зрения, удельный вес 1020, рН-6,5, эпителий - 7-9 в поле зрения, эритроциты - 2-4 в поле зрения, слизь - большое количество.

Бактериологическое исследование мочи: роста бактерий нет.

УЗИ мочевого пузыря - объем мочевого пузыря 260 мл, взвесь в мочевом пузыре, стенка ровная, 7 мм, остаточная моча 20 мл.

Цистоскопия - признаки хронического инфекционно-воспалительного процесса в стенке мочевого пузыря диффузного характера, взята биопсия.

Гистологическое исследование: признаки хронического воспаления, изменения уротелия с образованием койлоцитов, ядра с широкой областью светлой цитоплазмы - койлоциты, явления пикноза и наличие лимфоцитарной инфильтрации.

На основании полученных данных у пациентки имеются признаки вирусного воспалительного процесса мочевого пузыря, подтвержденное морфологическим исследованием и данными инструментальной диагностики.

При измерении в осадке мочи клеток в различных фазах клеточного цикла, установлено: количество клеток в S-фазе = 45,1%, в G1-фазе = 24%, G0-фазе = 3%, общее количество клеток в митозе = 4,5%, что, согласно предлагаемому способу, может расцениваться как высокая вероятность наличия цистита. С учетом полученных данных не требуется проведение инструментальных методов (цистоскопия) для морфологической диагностики заболевания, пациенту рекомендована стандартная терапия цистита под наблюдением врача уролога.

Пример №2

Пациент А., 60 лет

Жалобы: на примесь крови в моче, боль при мочеиспускании в течение трёх месяцев, чувство неполного опорожнения мочевого пузыря. Из анамнеза известно, что дедушка по отцовской линии страдал раком почки. Госпитализирован в урологическое отделение городской межрайонной больницы.

Результаты обследования пациента:

Общий анализ мочи: лейкоциты 10 в поле зрения, удельный вес 1018, рН - 5, эпителий - 13 в поле зрения, эритроциты - сплошь, слизь - незначительное количество.

Бактериологическое исследование мочи: роста бактерий нет.

УЗИ мочевого пузыря - объем мочевого пузыря 300 мл, взвесь в мочевом пузыре, по левой стенке определяется образование до 6 см, остаточная моча 110 мл.

МРТ органов малого таза с в/в контрастированием:

В области левой стенки мочевого пузыря справа определяется объёмное образование с неровными бугристыми контурами примерными размерами 6×2×4,7 см, распространяющееся на все слои стенки мочевого пузыря, инвазирующее устье правого мочеточника. Отмечается увеличение тазовых л.у. справа до 1,7 см.

Цистоскопия - признаки солитарной папиллярной опухоли правой стенки мочевого пузыря 6×1,5 см, частично перекрывающее просвет правого мочеточника. Взята биопсия.

Гистологическое исследование: уротелиальная карцинома.

На основании жалоб, клинических данных, морфологического исследования у пациента верифицирован рак мочевого пузыря.

При измерении в осадке мочи клеток в различных фазах клеточного цикла, установлено: количество клеток в S-фазе = 72,5%, в G1-фазе = 11,9%, G0-фазе = 7,8%, общее количество клеток в митозе = 1,6%, что, согласно предлагаемому способу, может расцениваться как высокая вероятность наличия рака мочевого пузыря.

С учетом полученных данных у пациента требовалось проведения инструментальных методов для уточнения диагноза (цистоскопия), после уточняющей диагностики начато стандартное лечение с учетом клинических рекомендаций.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, урологии, и может быть использовано для дифференциальной диагностики воспалительных и злокачественных заболеваний мочевого пузыря. Осуществляют забор утренней мочи и проведение проточной цитофлоуриметрии. Первую утреннюю порцию мочи пациентов с жалобами центрифугируют при 2 000 об/мин в течение 20 мин для осаждения клеточных элементов, затем супернатант сливают, к осадку добавляют 2 мл PBS, проводят ресуспендирование путем пипетирования на протяжении 1-2 минут и центрифугируют при 2 000 об/мин в течение 10 мин. Процедуру отмывки клеточного осадка проводят дважды, затем супернатант сливают, к осадку добавляют 0,5 мл PBS, проводят ресуспендирование путем пипетирования на протяжении 1-2 минут. Осуществляют изучение клеточного цикла с использованием метода флуоресцентного окрашивания антителами к ki-67 и йодидом пропидия. К выделенным клеточным элементам из осадка мочи добавляют 3 мл 96% этилового спирта, клеточную взвесь инкубируют на холоде в течение 30 минут, затем дважды отмывают в PBS. Проводят окрашивание моноклональными антителами к ki-67, меченными флуоресцеин изотиоционатом в объеме 20 мкл с добавлением йодид пропидия - фенантридин-3,8-диамино-5-[3-(диэтилметиламмоний) пропил]-6-фенил-дийодида в концентрации 2 мг/мл в объеме 20 мкл, после чего взвесь перемешивают и инкубируют в темноте 15 минут. После инкубации проводят измерение флуоресценции на проточном цитофлуорометре BD FACSCanto II. Наличие у пациентов воспалительного или злокачественного заболевания определяют по таблице 2 описания. Способ обеспечивает возможность осуществления дифференциальной диагностики заболеваний мочевого пузыря с высокой диагностической точностью, что позволяет при первом обращении поставить верный диагноз и своевременно начать лечение, за счет оценки распределения клеток в осадке мочи пациентов по различным фазам клеточного цикла с использованием метода проточной цитометрии путем флуоресцентного окрашивания клеток антителами к ki-67 и йодидом пропидия. 2 табл., 2 пр.

Способ дифференциальной диагностики воспалительных и злокачественных заболеваний мочевого пузыря, включающий забор утренней мочи и проведение проточной цитофлоуриметрии, характеризующийся тем, что первую утреннюю порцию мочи пациентов с жалобами центрифугируют при 2 000 об/мин в течение 20 мин для осаждения клеточных элементов, затем супернатант сливают, к осадку добавляют 2 мл PBS, проводят ресуспендирование путем пипетирования на протяжении 1-2 минут и центрифугируют при 2 000 об/мин в течение 10 мин; процедуру отмывки клеточного осадка проводят дважды, затем супернатант сливают, к осадку добавляют 0,5 мл PBS, проводят ресуспендирование путем пипетирования на протяжении 1-2 минут, после этого осуществляют изучение клеточного цикла с использованием метода флуоресцентного окрашивания антителами к ki-67 и йодидом пропидия, для чего к выделенным клеточным элементам из осадка мочи добавляют 3 мл 96% этилового спирта, клеточную взвесь инкубируют на холоде в течение 30 минут, затем дважды отмывают в PBS; затем проводят окрашивание моноклональными антителами к ki-67, меченными флуоресцеин изотиоционатом в объеме 20 мкл с добавлением йодид пропидия - фенантридин-3,8-диамино-5-[3-(диэтилметиламмоний) пропил]-6-фенил-дийодида в концентрации 2 мг/мл в объеме 20 мкл, после чего взвесь перемешивают и инкубируют в темноте 15 минут, а после инкубации проводят измерение флуоресценции на проточном цитофлуорометре BD FACSCanto II; наличие у пациентов воспалительного или злокачественного заболевания определяют по таблице 2 описания.