СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РИСКА РЕЦИДИВА ПОВЕРХНОСТНОГО РАКА МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ ПОСЛЕ ОПЕРАТИВНОГО ЛЕЧЕНИЯ Российский патент 2018 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, а именно: к онкологии, урологии и может быть использовано для определения риска развития рецидива поверхностного рака мочевого пузыря.

Известен способ цитологической диагностики рака мочевого пузыря (Патент РФ №2547567, G01 №33/48, Бюл. №10, 10.04.2015). В предлагаемом способе, включающем фиброцистоскопию, получение промывных вод мочевого пузыря спиртовым смывом, путем его катетеризации, после чего спиртовой смыв помещают в центрифужную пробирку и центрифугируют при скорости 1500 об/мин в течение 10 минут, после этого надосадочную жидкость сливают, к полученному осадку добавляют 4 мл питательной среды 199 для получения клеточной суспензии, которую затем помещают в фильтр-концентратор, центрифугируют, при этом происходит удаление фоновых элементов и разделение на фракции клеточных элементов для получения монослойного препарата, который после этого сушат на воздухе при комнатной температуре и используют для цитологического и/или иммуноцитохимического исследования. Оптимальный объем клеточной суспензии составляет от 100 до 400 мкл. Способ позволяет получить монослойные tospin-препараты с равномерным, тонкослойным (монослойным) распределением клеточного материала на небольшом участке предметного стекла. Изобретение обеспечивает повышение диагностических возможностей цитологической диагностики рака мочевого пузыря й его рецидивов.

У данного способа есть недостаток, связанный со сложностями получения материала для проведения исследования (инвазивность и трудоемкость методики).

Известен способ диагностики переходноклеточного рака мочевого пузыря (Патент РФ №2456607, G01N 33/50, Бюл. №20, 20.07.2012). Для этого образец утренней мочи от второго мочеиспускания последовательно обрабатывают полиэтиленгликолем, фосфатным буфером, фиксатором Карноя, центрифугируя после каждой обработки. Клеточную суспензию раскапывают в 10-мм лунки предметного стекла до получения 10-20 клеток в поле зрения. Затем препарат нагревают 2-4 ч. при 39°C, добавляют 200 мкл подогретого 0,005% раствора РНКазы, накрывают покровным стеклом, равным по размеру предметному, помещают покровным стеклом вниз во влажную камеру при температуре 37°C на 30 мин. После этого обрабатывают фосфатным буфером, 10% раствором пепсина, фосфатным буфером, 1% раствором формальдегида и обезвоживают спиртом. В целевую лунку наносят смесь из 0,5 мкл ДНК-зонда «UroVysion» и 1 мкл гибридизационного буфера, накрывают ее покровным стеклом диаметром 10 мм и нагревают 5 мин при 74°C и 18-24 ч. при 39°C. Затем препарат промывают в растворах детергента, в лунку добавляют DAPI и анализируют под флуоресцентным микроскопом. Оценивают не менее 25 морфологически аномальных клеток, и если как минимум в 4-х из них обнаружено больше 2-х перицентромерных сигналов не менее чем в двух хромосомах из трех: 3, 7 и 17-й и/или в 12-ти из 25 клеток отсутствует сигнал по локусу 9р21, диагностируют переходноклеточный РМП. Изобретение обеспечивает большую чувствительность способа при ранних стадиях по сравнению с более продвинутыми стадиями, доступен для широкого применения.

К недостаткам данного способа можно отнести высокие финансовые затраты на проведение исследования, потребность в дорогостоящем оборудовании, а также проведение работ высокоспециализированными специалистами.

Наиболее близким к предлагаемому является способ диагностики рака мочевого пузыря на основании клеточного цикла осадка мочи методом проточной цитофлуорометрии (Разрешение на применение новой медицинской технологии серия АА №0001899 ФС №2009/114 от 27 мая 2009 г.). Сущность способа заключается в том, что для исследования забирается утренняя порция мочи, образцы мочи центрифугируются, затем производится фиксация осадка мочи раствором 70% этанола. Выполняется окраска материала с помощью антител к цитокератину (моноклональные антитела к цитокератину IMMUNOTECH, Франция, No 2356) с целью дифференцировки эпителиальных клеток, входящих в состав осадка мочи от прочих. В качестве флуорохрома для метки ДНК эпителиальных клеток используется пропидия йодид (CALBIOCHEM, No 537059). Обработка материала производится с помощью программы ModFitLT 3.0. Данные, полученные в ходе исследования, представляются в виде точечного графика распределения фиксированных клеток в моче по интенсивности флуоресценции PI (пропидия йодида) (F1-2) и Cytoceratin (цитокератина) (F1-1), а также в виде гистограмм, на оси абсцисс которых откладываются каналы флуоресценции, а на оси ординат количество клеток, проходящих через эти каналы.

При обработке результатов проточной цитофлуорометрии анализируются следующие параметры: плоидность эпителиальных клеток, входящих в состав осадка мочи, величина индекса пролиферации (ИП = количество клеток в S-фазе в % + количество клеток в G2-фазе в %), количество гиперплоидных клеток. Диагностические критериями обнаружения рака мочевого пузыря, по данным проточной цитофлуорометрии, являются: обнаружение анеуплоидной линии клеток, величина ИП≥20%, количество гиперплоидных клеток>3%.

По результатам проведенного исследования показатели чувствительности и диагностической эффективности метода проточной цитофлуорометрии оказались выше, нежели цитологического исследования (71,25% и 51,3% (p<0,05); 75% и 67,2%, соответственно). При этом специфичность метода проточной цитофлуорометрии оказалась ниже цитологического исследования - (80,6% и 100% соответственно).

Описанный способ имеет недостаток, связанный с диагностикой рецидива поверхностных форм рака мочевого пузыря после проведенного комбинированного лечения, заключающийся в том, что он не позволяет оценить вероятность развития рецидива заболевания.

Задача предлагаемого способа заключается в определении риска рецидива поверхностного рака мочевого пузыря после хирургического лечения с использованием метода проточной цитометрии и моноклональными антителами CD13 и CD 45.

Поставленную задачу решали следующим способом. Первую утреннюю порцию мочи пациента с поверхностной формой рака мочевого пузыря (T1N0M0, TaN0M0 или TisN0M0) центрифугировали при 2000 об/мин в течение 20 мин для осаждения клеточных элементов. После этого супернатант сливали, к осадку добавляли 2 мл PBS, проводили ресуспендирование путем пипетирования на протяжение 1-2 мин и центрифугировали при 2000 об/мин в течение 10 мин. Описанную процедуру отмывки клеточного осадка проводили дважды. Далее супернатант сливали, к осадку добавляли 0,5 мл PBS, проводили ресуспендирование путем пипетирования на протяжение 1-2 мин. К полученной клеточной взвеси добавляли моноклональные антитела к CD13, меченные фикоэритрином (РЕ - максимум флуоресценции на 578 нм, производитель BD Biosciences, США) в объеме 20 мкл. Перемешивали на персональном вортексе в течение 20 сек. Добавляли моноклональные антитела к CD45, меченные флуоресцеин изотиоционатом (ФИТЦ - максимум флуоресценции на 518 нм, производитель BD Biosciences, США) в объеме 20 мкл. Перемешивали на персональном вортексе в течение 20 сек и убирали в темное место. Инкубацию клеточной взвеси проводили при комнатной температуре на протяжении 15 минут. После инкубации проводили измерение флуоресценции на проточном цитофлуорометре BD FACSCanto II (BectonDickinson, США).

Согласно литературным данным, максимум экспрессии антигена CD13 локализуется на подслизистом слое мочевого пузыря, антиген CD45 является основным лейкоцитарным антигеном и маркирует клетки лимфоидной ткани. Уровни экспрессии антигенов CD13 и CD45 у пациентов с поверхностным раком мочевого пузыря представлены в таблице 1. У пациентов с развитием рецидива заболевания в клеточном осадке мочи количество клеток с экспрессией антигенов CD13 и CD45 отличается от таковых показателей пациентов, у которых развития рецидива диагностировано не было.

Таким образом, при определении у пациентов с поверхностным раком мочевого пузыря уровней экспрессии антигенов CD13 и CD45 можно прогнозировать развитие рецидива у них в дальнейшем в течение 12 месяцев.

Способ осуществляют следующим образом:

У пациентов с неинвазивным раком мочевого пузыря перед трансуретральной резекцией забирается первая утренняя порция мочи. По вышеописанной методике проводится измерение содержания в осадке мочи CD13+ и С045+клеток. Риск развития рецидива рассчитывается согласно таблице 2.

Чувствительность предлагаемого метода прогноза развития рецидива рака мочевого пузыря составляет 72,7%, специфичность - 77,0%, диагностическая точность - 97,6%.

Пример №1.

Больная А., 68 лет

При определении уровней экспрессии антигенов CD13 и CD45 получены следующие показатели: количество СD13⁺клеток - 1,50%; количество СD45⁺клеток - 3,90%. Прогноз согласно предлагаемому способу - вероятность рецидива низкая. До настоящего момента (в течение 14 месяцев) пациент находится под наблюдением специалистов, рецидива рака мочевого пузыря не наблюдается.

Рекомендовано: УЗИ органов малого таза каждые шесть месяцев, цистоскопическое исследование один раз в шесть месяцев.

Пример №2.

Больной Б., 45 лет

При определении уровней экспрессии антигенов CD13 и CD45 получены следующие показатели: количество СD13⁺клеток - 6,00%; количество СD45⁺клеток - 7,30%. Прогноз согласно предлагаемому способу - высокая вероятность рецидива заболевания. Рецидив заболевания был выявлен через 9 мес. после трансуретральной резекции.

Рекомендовано: цистоскопическое исследование каждые 3 месяца, УЗИ брюшной полости, забрюшинного пространства и малого таза каждые 3 месяца.

Предлагаемый способ позволяет прогнозировать развитие рецидива поверхностного рака мочевого пузыря после оперативного лечения с высокой диагностической точностью.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для определения риска рецидива поверхностного рака мочевого пузыря после оперативного лечения. Для этого производят забор первой утренней порции мочи пациента с раком мочевого пузыря T1N0M0, TaN0M0 или TisN0M0. Порцию центрифугируют при 2000 об/мин в течение 20 мин для осаждения клеточных элементов. После этого супернатант сливали, к осадку добавляли 2 мл PBS. Затем проводили ресуспендирование путем пипетирования на протяжении 1-2 мин и центрифугировали при 2000 об/мин в течение 10 мин. Указанную процедуру отмывки клеточного осадка проводили дважды. Далее супернатант сливали, к осадку добавляли 0,5 мл PBS. Затем полученную клеточную взвесь ресуспендировали на протяжении 1-2 минут. К ней добавляли моноклональные антитела к CD 13, меченные фикоэритрином в объеме 20 мкл. Перемешивали на персональном вортексе в течение 20 секунд. Добавляли моноклональные антитела к CD45, меченные флуоресцеин изотиоционатом в объеме 20 мкл. Снова перемешивали на персональном вортексе в течение 20 сек и убирали в темное место. Инкубировали клеточную взвесь при комнатной температуре на протяжении 15 минут. После инкубации проводили измерение флуоресценции на проточном цитофлуорометре. При наличии в осадке мочи количества CD13+ клеток меньше или равного 3% и количества CD45+ клеток меньше или равного 4% считают риск развития рецидива низким. При наличии в осадке мочи количества CD13+ клеток больше 4% и количества CD45+ клеток больше 6% считают риск развития рецидива высоким. Изобретение позволяет оценить риски развития рецидива поверхностного рака мочевого пузыря после оперативного лечения. 2 табл., 2 пр.

Способ определения риска рецидива поверхностного рака мочевого пузыря после оперативного лечения, включающий забор утренней мочи и определение проточной цитофлоуриметрии, отличающийся тем что дополнительно первую утреннюю порцию мочи пациента с раком мочевого пузыря T1N0M0, TaN0M0 или TisN0M0 центрифугировали при 2000 об/мин в течение 20 мин для осаждения клеточных элементов; после этого супернатант сливали, к осадку добавляли 2 мл PBS, проводили ресуспендирование путем пипетирования на протяжении 1-2 мин и центрифугировали при 2000 об/мин в течение 10 мин; описанную процедуру отмывки клеточного осадка проводили дважды, далее супернатант сливали, к осадку добавляли 0,5 мл PBS, проводили ресуспендирование путем пипетирования на протяжении 1-2 минут, к полученной клеточной взвеси добавляли моноклональные антитела к CD 13, меченные фикоэритрином в объеме 20 мкл, перемешивали на персональном вортексе в течение 20 секунд, добавляли моноклональные антитела к CD45, меченные флуоресцеин изотиоционатом в объеме 20 мкл, перемешивали на персональном вортексе в течение 20 сек и убирали в темное место; инкубацию клеточной взвеси проводили при комнатной температуре на протяжении 15 минут, после инкубации проводили измерение флуоресценции на проточном цитофлуорометре, и при наличии в осадке мочи количества CD13+ клеток меньше или равного 3% и количества CD45+ клеток меньше или равного 4% считают риск развития рецидива низким, а при наличии в осадке мочи количества CD13+ клеток больше 4% и количества CD45+ клеток больше 6% считают риск развития рецидива высоким.