СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ХРОНИЧЕСКОГО ЭНДОМЕТРИТА У ЖЕНЩИН С ЭНДОМЕТРИОЗОМ Российский патент 2020 года по МПК G01N33/577 G01N1/30 

Область техники к которой относится изобретение

Изобретение относится к области медицины, а именно к патологической анатомии и гинекологии и может быть использовано для диагностики хронического эндометрита (ХЭ) у женщин с эндометриозом с помощью иммуногистохимической оценки экспрессии маркера макрофагов (CD68) в эутопическом эндометрии.

В научной литературе обсуждается связь хронического эндометрита с эндометриозом. Небезызвестна высокая корреляция эндометриоза с воспалительными заболеваниями органов малого таза (ВЗОМТ). Так, в масштабном ретроспективном исследовании Tai F.W. и соавт. (2018) с участием 141460 пациентов было подтверждено, что риск развития эндометриоза у пациентов с ВЗОМТ повышен в 3 раза [1]. По данным Takebayashi A. и соавт. (2014) ХЭ был ассоциирован с эндометриозом в 53% наблюдений, но корреляций между степенью тяжести и формой эндометриоза с наличием ХЭ выявлено не было [2]. Cicinelli E. и соавт. (2017) опубликовали данные о том, что ХЭ у женщин с эндометриозом наблюдается в 2,7 раза чаще, что составляет примерно 40% [3]. При ХЭ отмечено изменение эндо-миометральной перистальтики, что способствует более активному менструальному рефлюксу крови в брюшную полость [4]. Эндометриоз же известен наличием иммунной дисфункции. Логично предположить, что ХЭ можно рассматривать как сопутствующий фактор в развитии эндометриоза и имплантационных нарушений, а эндометриоз - как фактор, усугубляющий и поддерживающий эти изменения.

Действительно, ХЭ и эндометриоз имеют общие черты: оба являются хроническими воспалительными заболеваниями, в патогенезе которых отчетливо прослеживается изменение иммунного статуса, оба часто сочетаются с ВЗОМТ, оба имеют сходные клинические проявления (нарушения менструальной и репродуктивной функции, хроническая тазовая боль). И тот, и другой отличаются особым микробиологическим составом эндометрия и негативно влияют на рецептивность эндометрия, являясь активными участниками в реализации нарушений фертильности на эндометриальном уровне. В связи с этим использование эндометриоз-специфичного маркера ХЭ с целью диагностики последнего представляется оправданным.

Уровень техники

В патентной литературе описано множество способов диагностики хронического эндометрита, как при помощи гистологического исследования заданных параметров (патенты РФ №247574 и №2674155), определения в менструальной крови уровней различных биомолекул (патенты РФ №2108750, №2697195 и №2587720), а также иммуногистохимическом исследовании экспрессии маркеров иммунной системы как важной патогенетической составляющей в реализации и поддержании ХЭ (патенты РФ №2236013 и №2587325) и определении количественной ОТ-ПЦР в режиме реального времени фактора ангиогенеза (патент РФ №2642621).

В качестве прототипа избран способ диагностики хронического эндометрита и характера воспаления (патент РФ №2236013), согласно которому осуществляют определение маркеров иммунокомпетентных клеток эндометрия иммуногистохимическим методом, позволяющим выявить наличие хронического воспаления в эндометрии и степень его выраженности; для этого исследуют в эндометрии лимфоциты, экспрессирующие маркеры естественных киллерных клеток CD56+ и CD16+ и лимфоциты, экспрессирующие маркер активации HLA-DR+ II класса, участвующие в распознавании антигена. По нарастанию количественных показателей исследуемых маркеров определяют выраженность воспалительного процесса.

Основным недостатком способа-прототипа является недостаточная оценка ХЭ у женщин страдающих эндометриозом. Эутопический эндометрий при эндометриозе отличается наличием иммунных нарушений, проявляющихся в аберрантной экспрессии иммунокомпетентных клеток, что необязательно свидетельствует о наличии ХЭ. В связи с этим способ-прототип не может использоваться для диагностики ХЭ при эндометриозе ввиду большой вероятности постановки неправильного диагноза.

Решаемой технической проблемой явилась диагностика ХЭ у женщин с эндометриозом.

Раскрытие сущности изобретения

Достигаемым техническим результатом является диагностика ХЭ у женщин с эндометриозом по уровню иммуногистохимической экспрессии эндометриоз-специфичного маркера ХЭ в эутопическом эндометрии - CD68.

Нами впервые выявлено, что у женщин с эндометриозом и ХЭ экспрессия маркера макрофагов (CD68) в эутопическом эндометрии достоверно выше как в среднюю стадию фазы секреции, так и среднюю стадию фазы пролиферации при сравнении с женщинами со здоровым эндометрием без эндометриоза. Повышенное количество макрофагов в эндометрии отражает активацию воспалительного процесса и стимуляцию процессов фиброгенеза. Важным преимуществом и отличием данного способа от других является повышение точности диагностики ХЭ у женщин с эндометриозом. Кроме того, оценка специфичного для эндометриоза маркера ХЭ не только в среднюю стадию фазы пролиферации, но и в среднюю стадию фазы секреции, когда эндометрий становится наиболее восприимчивым для имплантации, позволяет использовать дополнительные методы для изучения его рецептивных свойств и прогнозирования вероятности наступления беременности.

Разработан способ диагностики ХЭ у женщин с эндометриозом, согласно которому производят пайпель-биопсию эндометрия в среднюю стадию фазы пролиферации и секреции менструального цикла у женщин с эндометриозом. Полученный материал исследуют методом иммуногистохимии с применением моноклонального антитела - Bond Ready-to-Use Primary Antibody CD68 (514H12). Оценка количества макрофагов (CD68) проводится под увеличением х400 в 5-ти случайных полях зрения путем подсчета позитивно-окрашенных пятен диаметром от 20 до 30 мкм. Результат фиксируется в виде средней плотности распределения макрофагов в эндометрии, то есть количества позитивно-окрашенных клеток на 1 мм².

Если количество позитивно-окрашенных клеток CD68 эндометрия на 1 мм² в среднюю стадию фазы пролиферации от 151 до 293 или в среднюю стадию фазы секреции от 425 до 523, то выставляется диагноз хронический эндометрит.

Если количество позитивно-окрашенных клеток CD68 эндометрия на 1 мм² в среднюю стадию фазы пролиферации от 49 до 150 или в среднюю стадию фазы секреции от 74 до 424, что соответствует норме, то диагноз хронический эндометрит не ставится.

Если количество позитивно-окрашенных клеток CD68 эндометрия на 1 мм² в среднюю стадию фазы пролиферации менее 48 или более 294 или в среднюю стадию фазы секреции менее 73 или более 524, данные значения не соответствуют норме, что свидетельствует об ошибке метода.

В настоящее исследование были включены 55 женщин в возрасте от 29 до 40 лет.

Основную группу (n=40) составили пациентки с морфологически и лапароскопически верифицированным диагнозом наружный генитальный эндометриоз (код по МКБ10 - N80.0), заинтересованные в реализации репродуктивной функции, у которых пайпель-биопсия эндометрия проводилась в связи с заподозренной патологией эндометрия по данным УЗИ, при повторных неудачных попытках переноса эмбрионов в программах вспомогательных репродуктивных технологий при нормальной УЗИ-картине, а также в качестве контроля эффективности лечения ранее гистологически подтвержденного гиперпластического процесса эндометрия.

Группу морфологического контроля (n=15) составили здоровые женщины без эндометриоза и ХЭ (исключенного при гистологическом и иммуногистохимическом исследованиях биоптатов эндометрия), давшие добровольное информированное согласие на участие в исследовании.

Предварительно было проведено стандартное морфологическое исследование биоптатов эндометрия, полученных методом пайпель-биопсии. Материал после гистологической проводки в автоматическом гистопроцессоре Leica ASP 30, заливали в парафин на станции Leica ST 5010. Микроскопическое исследование осуществлялось на триокулярном микроскопе Leica DMLB (окуляры с увеличением х10) с использованием цифровой камеры Leica DFC 420 (Германия). В полученных микропрепаратах проводилась гистологическая оценка стадии и фазы менструального цикла, а также диагностировалась возможная патология эндометрия. Из 40 образцов в основной группе было выявлено 17 (42,5%) - с признаками ХЭ, 5 (12,5%) - с признаками гиперпластического процесса эндометрия в виде очаговой железистой гиперплазии, 7 (17,5%) - с полипами эндометрия, 2 (5%) - с выраженным фиброзом эндометрия и внутриматочными синехиями, 9 (22,5%) - с нормальной морфологической картиной эндометрия, соответствующей исследуемой фазе менструального цикла.

При стандартном гистологическом исследовании признаки ХЭ обнаруживаются не всегда ввиду низкой точности диагностики данного метода, потому что достаточно часто встречаются стертые формы ХЭ эндометрита без классических морфологический проявлений. Таким образом, если не обнаружены классические гистологические признаки ХЭ, нельзя судить о его реальном отсутствии, поэтому с целью повышения точности диагностики все биоптаты эндометрия были исследованы с помощью иммуногистохимии на предмет выявления маркера ХЭ - плазмоцитов (CD138).

Из 40 образцов в основной группе положительное окрашивание клеток выявилось в 29 образцах, что составило 72,5%, тогда как при стандартном морфологическом исследовании ХЭ был выявлен в 17 образцах (42,5%), что в 1,7 раза увеличило точность диагностики. Это позволило окончательно верифицировать ХЭ и скорректировать основную группу исследования, представленную женщинами с эндометриозом и ХЭ, с целью проведения следующего этапа, направленного на изучение экспрессии эндометриоз-специфичного маркера хронического эндометрита - CD68.

Согласно ряду исследований как при эндометриозе, так и при ХЭ отмечена чрезмерная инфильтрация эндометрия иммунными клетками, в частности макрофагами [5,6,7,8]. Макрофаги - это мононуклеарные фагоциты, которые играют важную роль в обеспечении тканевого гомеостаза, иммунной защиты и активации воспалительных реакций за счет высокой экспрессии провоспалительных цитокинов. В норме в эндометрии макрофаги усиливают процессы его циклического ремоделирования и репарации. Фенотип и функции макрофагов регулируются воздействием местных цитокинов, факторов роста и гормонов, аберрантная экспрессия которых наблюдается при эндометриозе и ХЭ. В данном случае повышенное количество макрофагов отражает активацию воспалительного процесса и стимуляцию процессов фиброгенеза. В связи с этим и был выбран исследуемый маркер.

Иммуногистохимическое исследование биоптатов эндометрия, взятых методом пайпель-биопсии, проводилось в качестве второго этапа исследования с использованием моноклонального антитела - Bond Ready-to-Use Primary Antibody CD68 (514H12). Иммуногистохимическое окрашивание производилось в иммуностейнере Leica BOND-maX (Германия). Оценка количества макрофагов (CD68) проводилась на триокулярном микроскопе Leica DMLB (окуляры с увеличение х10) с использованием цифровой камеры Leica DFC 420 (Германия) под увеличением х400 в 5-ти случайных полях зрения путем подсчета позитивно-окрашенных пятен диаметром от 20 до 30 мкм. Результат фиксировался в виде средней плотности распределения макрофагов в эндометрии, то есть количества позитивно-окрашенных клеток на 1 мм².

В ходе исследования выявлено, что у женщин с эндометриозом и ХЭ экспрессия CD68 достоверно выше при сравнении с женщинами со здоровым эндометрием. Об этом свидетельствует статистически значимая высокая экспрессия CD68 как в среднюю стадию фазы пролиферации (в 2 раза; 195,8 против 99,3, соответственно, р<0,05), так и фазы секреции менструального цикла (в 1,7 раза; 412,2 против 111,3 соответственно, р<0,05) при сравнении с контролем.

Таким образом, на основании полученных статистически значимых результатов установлены уровни экспрессии специфичного для эндометриоза маркера ХЭ - CD68 -, который может использоваться для диагностики данного состояния, а именно:

Если количество позитивно-окрашенных клеток CD68 эндометрия на 1 мм² в среднюю стадию фазы пролиферации от 151 до 293 или в среднюю стадию фазы секреции от 425 до 523, то выставляется диагноз хронический эндометрит.

Если количество позитивно-окрашенных клеток CD68 эндометрия на 1 мм² в среднюю стадию фазы пролиферации от 49 до 150 или в среднюю стадию фазы секреции от 74 до 424, что соответствует норме, то диагноз хронический эндометрит не ставится.

Если количество позитивно-окрашенных клеток CD68 эндометрия на 1 мм² в среднюю стадию фазы пролиферации менее 48 или более 294 или в среднюю стадию фазы секреции менее 73 или более 524, данные значения не соответствуют норме, что свидетельствует об ошибке метода.

Осуществление изобретения

Проводят пайпель-биопсию эндометрия в среднюю стадию фазы пролиферации и секреции менструального цикла. Полученный материал после гистологической проводки в автоматическом гистопроцессоре Leica ASP 30, заливают в парафин на станции Leica ST 5010 (Германия). Иммуногистохимическое исследование (ИГХ) окрашивание cрезов производят в иммуностейнере Leica BOND-maX (Германия) с применением моноклонального антитела - Bond Ready-to-Use Primary Antibody CD68 (514H12). Оценка количества макрофагов (CD68) проводится под увеличением х400 в 5-ти случайных полях зрения путем подсчета позитивно-окрашенных пятен диаметром от 20 до 30 мкм. Результат фиксируется в виде средней плотности распределения макрофагов в эндометрии, то есть количества позитивно-окрашенных клеток на 1 мм². Трактовка ИГХ реакции проводится путем сравнения полученных данных со следующими параметрами:

Если количество позитивно-окрашенных клеток CD68 эндометрия на 1 мм² в среднюю стадию фазы пролиферации от 151 до 293 или в среднюю стадию фазы секреции от 425 до 523, то выставляется диагноз хронический эндометрит.

Если количество позитивно-окрашенных клеток CD68 эндометрия на 1 мм² в среднюю стадию фазы пролиферации от 49 до 150 или в среднюю стадию фазы секреции от 74 до 424, что соответствует норме, то диагноз хронический эндометрит не ставится.

Если количество позитивно-окрашенных клеток CD68 эндометрия на 1 мм² в среднюю стадию фазы пролиферации менее 48 или более 294 или в среднюю стадию фазы секреции менее 73 или более 524, данные значения не соответствуют норме, что свидетельствует об ошибке метода.

Клинический пример 1.

Пациентка А, 32 года, обратилась с жалобами на отсутствие наступления беременности при регулярной половой жизни в браке без контрацепции в течение 2 лет. Соматически не отягощена. В анамнезе операция по поводу наружного генитального эндометриоза (II-III стадии AFS) 3 года назад, диагноз которого установлен на основании гистологического результата исследования макропрепаратов. Менструальная функция нарушена по типу олигоменореи после инструментального опорожнения полости матки по поводу неразвивающейся беременности на сроке 6-7 недель 2 года назад, которая наступила после завершения гормонального лечения эндометриоза в послеоперационном периоде.

Было проведено генетическое исследование кариотипа эмбриона: хромосомных аномалий не выявлено. Реабилитационные мероприятия после внутриматочного вмешательства не проводились. При микробиологическом обследовании данных за наличие генитальной инфекции не получено. По данным ультразвукового исследования признаки ХЭ не выявлены.

Учитывая жалобы, анамнез и данные лабораторного и инструментального исследований пациентки, выполнена пайпель-биопсия эндометрия в пролиферативную фазу менструального цикла. При гистологическом исследовании биоптата эндометрий соответствовал средней стадии фазы пролиферации, морфологических признаков ХЭ обнаружено не было.

При иммуногистохимической оценке количества позитивно-окрашенных клеток CD68 эндометрия на 1мм², согласно описанной методике, было выявлено 212 клеток, что позволило установить диагноз хронический эндометрит (Фиг.1 - ИГХ с антителом к CD68. Выявлена экспрессия позитивных клеток как в строме эндометрия, так и внутриматочных железах, что соответствует диагнозу хронический эндометрит, ув. 20).

При иммуногистохимической оценке количества позитивно-окрашенных плазмоцитов CD138 в 10 полях зрения было выявлено 15 клеток (при норме 0 клеток), что позволило подтвердить поставленный диагноз и назначить комплексное лечение.

Клинический пример 2.

Пациентка С, 29 лет, обратилась с жалобами на отсутствие наступления беременности при регулярной половой жизни в браке без контрацепции в течение 8 лет. Соматически не отягощена. Отмечает периодические перименструальные выделения. В анамнезе 2 операции по поводу наружного генитального эндометриоза (II-III стадии AFS), диагноз которого установлен при морфологическом исследовании полученных макропрепаратов. Было проведено послеоперационное гормональное лечение после обеих операций. В течение года после отмены гормонального лечения пыталась забеременеть естественным путем. В связи с отсутствием наступления беременности была направлена в центр ВРТ для лечения бесплодия. В анамнезе 3 неудачные попытки переноса эмбрионов в полость матки. При микробиологическом обследовании данных за наличие генитальной инфекции не получено.

Была проведена диагностическая гистероскопия в среднюю стадию фазы секреции менструального цикла - патологических изменений в полости матки не обнаружено. Взят биоптат - обнаружены воспалительные инфильтраты, состоящие преимущественно из лимфо-плазмациарных элементов преимущественно вокруг маточных желез и в строме эндометрия, что в неполной мере отражает морфологическую картину ХЭ, эндометрий в средней стадии фазы секреции.

При иммуногистохимической оценке количества позитивно-окрашенных клеток CD68 эндометрия на 1мм², согласно описанной методике, было выявлено 437 клеток, что позволило установить диагноз хронический эндометрит (Фиг. 2. ИГХ с антителом к CD68. Выявлена выраженная экспрессия позитивных клеток как в строме эндометрия, так и внутриматочных железах, что соответствует диагнозу хронический эндометрит, ув.10).

При иммуногистохимической оценке количества позитивно-окрашенных плазмоцитов CD138 в 10 полях зрения было выявлено 17 клеток (при норме 0 клеток), что позволило подтвердить поставленный диагноз и назначить комплексное лечение.

Клинический пример 3.

Пациентка К, 26 лет, обратилась с жалобами на нерегулярный менструальный цикл по типу олигоменореи и перименструальные кровяные выделения из половых путей. Соматически не отягощена. В анамнезе лапароскопия, вылущивание эндометриоидной кисты, подтвержденной морфологически. Беременность 1 (своевременные роды доношенным здоровым плодом), на данный момент в реализации репродуктивной функции не заинтересована. Нуждается в длительной контрацепции. При микробиологическом обследовании данных за наличие генитальной инфекции не получено. По данным УЗИ органов малого таза выявлены признаки полипа эндометрия и диффузного аденомиоза.

Проведена гистероскопия в пролиферативную фазу менструального цикла, при осмотре полости матки в нижней трети по задней стенке обнаружено полиповидное образование бледно-розового цвета на широком основании 5х3 мм, проведена полипэктомия и биопсия эндометрия. Обнаружены косвенные гистероскопические признаки ХЭ: очаговое усиление сосудистого рисунка, неравномерность эндометрия на всем протяжении, участки мелкоточечной гиперемии, - а также рельеф стенок полости матки в виде хребтов и крипт, что свидетельствует об аденомиозе. При микроскопическом исследовании эндометрий в средней стадии фазы пролиферации, признаков ХЭ не обнаружено.

При иммуногистохимической оценке количества позитивно-окрашенных клеток CD68 эндометрия на 1мм², согласно описанной методике, было выявлено 57 клеток, что исключает ХЭ, несмотря на его косвенные признаки при гистероскопии (Фиг.3 ИГХ с антителом к CD68. Выявлена скудная экспрессия позитивных клеток в строме эндометрия, что не соответствует диагнозу хронический эндометрит, ув.20).

При иммуногистохимической оценке количества позитивно-окрашенных плазмоцитов CD138 в 10 полях зрения не было выявлено ни одной клетки, что подтверждает отсутствие ХЭ. Учитывая отсутствие противопоказаний и наличие аденомиоза с целью контрацепции рекомендована установка ВМК.

Клинический пример 4.

Пациентка М, 30 лет, планирует беременность. В анамнезе наружный генитальный эндометриоз и гиперпластический процесс эндометрия; диагнозы подтверждены морфологически. С целью контроля эффективности лечения гиперпластического процесса эндометрия проведена пайпель-биопсия эндометрия в секреторную фазу менструального цикла. При гистологическом исследовании биоптата эндометрий соответствовал средней стадии фазы секреции, морфологических признаков ХЭ и ГПЭ обнаружено не было. При иммуногистохимической оценке количества позитивно-окрашенных клеток CD68 эндометрия на 1мм², согласно описанной методике, было выявлено 311 клеток, что исключает ХЭ.

При иммуногистохимической оценке количества позитивно-окрашенных плазмоцитов CD138 в 10 полях зрения не было выявлено ни одной клетки, что подтверждает отсутствие ХЭ.

Литература:

1. Tai FW, Chang CY, Chiang JH et al. Association of Pelvic Inflammatory Disease with Risk of Endometriosis: A Nationwide Cohort Study Involving 141,460 Individuals. J Clin Med. 2018; 7(11).

2. Takebayashi A, Kimura F, Kishi Y et al. The association between endometriosis and chronic endometritis. PLoS One. 2014; 9(2): e88354.

3. Cicinelli E, Trojano G, Mastromauro M et al. Higher prevalence of chronic endometritis in women with endometriosis: a possible etiopathogenetic link. Fertil Steril. 2017; 108(2): 289-295.e1.

4. Pinto V, Matteo M, Tinelli R et al. Altered uterine contractility in women with chronic endometritis. Fertil Steril. 2015; 103(4): 1049-1052.

5. Berbic M, Schulke L, Markham R, Tokushige N, Russell P, Fraser IS. Macrophage expression in endometrium of women with and without endometriosis. Hum Reprod. 2009 Feb;24(2):325-32.

6. Takebayashi A, Kimura F, Kishi Y, Ishida M, Takahashi A, Yamanaka A, Wu D, Zheng L, Takahashi K, Suginami H, Murakami T. Subpopulations of macrophages within eutopic endometrium of endometriosis patients. Am J Reprod Immunol. 2015 Mar;73(3):221-31.

7. Sukhikh GT, Shurshalina AV, Veryasov VN. Immunomorphological characteristics of endometrium in women with chronic endometritis. Bull Exp Biol Med. 2006 Jan;141(1):104-6.

8. Li Y, Yu S, Huang C, Lian R, Chen C, Liu S, Li L, Diao L, Markert UR, Zeng Y. Evaluation of peripheral and uterine immune status of chronic endometritis in patients with recurrent reproductive failure. Fertil Steril. 2020 Jan;113(1):187-196.e1.

Изобретение относится к области медицины, в частности к патологической анатомии и гинекологии, и предназначено для диагностики хронического эндометрита у женщин с эндометриозом. Проводят пайпель-биопсию эндометрия в среднюю стадию фазы пролиферации или фазы секреции менструального цикла. Проводят иммуногистохимическое исследование полученного биоматериала путем окрашивания cрезов с применением моноклонального антитела – Bond Ready-to-Use Primary Antibody CD68. Определяют количество макрофагов CD68 путем подсчета количества позитивно-окрашенных клеток на 1 мм². Если количество позитивно-окрашенных клеток CD68 эндометрия на 1 мм² в среднюю стадию фазы пролиферации от 151 до 293 или в среднюю стадию фазы секреции от 425 до 523, то диагностируют хронический эндометрит. Если количество позитивно-окрашенных клеток CD68 эндометрия на 1 мм² в среднюю стадию фазы пролиферации от 49 до 150 или в среднюю стадию фазы секреции от 74 до 424, это соответствует норме. Изобретение обеспечивает эффективную диагностику хронического эндометрита у женщин с эндометриозом. 3 ил., 4 пр.

Способ диагностики хронического эндометрита у женщин с эндометриозом, включающий проведение пайпель-биопсии эндометрия в среднюю стадию фазы пролиферации или фазы секреции менструального цикла, проводят иммуногистохимическое исследование полученного биоматериала путем окрашивания cрезов с применением моноклонального антитела – Bond Ready-to-Use Primary Antibody CD68, определяют количество макрофагов CD68 путем подсчета количества позитивно-окрашенных клеток на 1 мм², если количество позитивно-окрашенных клеток CD68 эндометрия на 1 мм² в среднюю стадию фазы пролиферации от 151 до 293 или в среднюю стадию фазы секреции от 425 до 523, то диагностируют хронический эндометрит; если количество позитивно-окрашенных клеток CD68 эндометрия на 1 мм² в среднюю стадию фазы пролиферации от 49 до 150 или в среднюю стадию фазы секреции от 74 до 424, что соответствует норме; если количество позитивно-окрашенных клеток CD68 эндометрия на 1 мм² в среднюю стадию фазы пролиферации менее 48 или более 294 или в среднюю стадию фазы секреции менее 73 или более 524, данные значения не соответствуют норме, что свидетельствует об ошибке метода.