БЕЛКОВАЯ СИГНАТУРА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ КОЛОРЕКТАЛЬНОГО РАКА ИЛИ ЕГО ПРЕДРАКОВОЙ СТАДИИ Российский патент 2024 года по МПК G01N33/68 G01N33/574 

Настоящее изобретение можно отнести к области медицины. В частности, настоящее изобретение относится к способу диагностики in vitro колоректального рака и/или его предраковой стадии.

Колоректальный рак (CRC) (также известный как рак толстой кишки, рак прямой кишки или рак толстого кишечника) представляет собой злокачественное образование в толстой или прямой кишке (отделах толстого кишечника). Подавляющее большинство злокачественных опухолей толстого кишечника представляют собой аденокарциномы. Причиной этого является то, что в толстой кишке находится множество желез в тканях. Когда эти железы претерпевают ряд изменений на генетическом уровне, то предсказуемо они переходят от доброкачественного состояния к инвазивному злокачественному образованию в толстой кишке. Аденомы толстого кишечника, в частности, прогрессирующая колоректальная аденома (AA), являются доброкачественным вариантом злокачественных аденокарцином, но все же имеют потенциал к малигнизации, если их не удалить (обычно их удаляют за счет их способности к малигнизации и приводить к раку толстого кишечника).

Скрининг представляет собой эффективный способ профилактики и снижения смертности от колоректального рака, и его рекомендуется проводить в возрасте от 50 до 75 лет. Самый известный и наиболее часто используемый скрининговый тест на колоректальный рак называется фекальным иммунохимическим тестом (FIT). С использованием FIT обнаруживается скрытая кровь в образцах кала, что может быть признаком предракового состояния или онкологического заболевания. Если получены аномальные результаты, то обычно рекомендуется провести колоноскопию, которая позволяет врачу обследовать внутреннюю часть толстой и прямой кишки для постановки диагноза. Небольшие полипы при обнаружении во время колоноскопии могут быть удалены. Если обнаружен большой полип или опухоль, то может быть проведена биопсия для уточнения их злокачественного характера. Гастроэнтеролог использует колоноскопию для обнаружения и удаления этих аденом и полипов, чтобы предотвратить дальнейшее развитие генетических изменений, которые приведут к инвазивной аденокарциноме.

Несмотря на то, как пояснялось выше, FIT в настоящее время используется для скрининга колоректального рака, важно отметить, что FIT обеспечивает низкую чувствительность для выявления AA (примерно 20-30% в зависимости от данных в разных литературных источниках), означая, что большинство пациентов указанного типа могут ошибочно классифицироваться как не имеющие заболевания. Следовательно, FIT не может выявлять аденомы за счет своей низкой чувствительности. Более того, поскольку в FIT используются образцы кала, то метод имеет низкую комплаентность. С другой стороны, колоноскопия представляет собой инвазивный метод, при котором наиболее серьезным осложнением обычно является перфорация желудочно-кишечного тракта. С другой стороны, в настоящее время колоноскопия представляет собой процедуру, включающую анестезию, и применение слабительных средств, которые обычно принимают при подготовке кишечника к колоноскопии, что связано с рядом проблем с пищеварением.

Важно отметить, что способы, используемые в настоящее время для скрининга общей популяции, подверженной риску заболевания CRC или AA, ассоциируются с высоким уровнем ложноположительных результатов. Следовательно, в настоящее время выполняется большое количество ненужных последующих колоноскопий.

Настоящее изобретение обеспечивает четкое решение вышеуказанных проблем, поскольку оно базируется на способе in vitro выявления или скрининга субъектов, подверженных риску заболевания колоректальным раком или колоректальными аденомами (в частности прогрессирующими колоректальными аденомами), с отклонением от уровня концентрации белковых биомаркеров, выделенных из образцов, полученных малоинвазивными процедурами, таких как кровь, сыворотка или плазма. Поскольку способ по настоящему изобретению основан на образцах крови, сыворотки или плазмы, то ожидается, что он улучшит комплаентность субъектов к скринингу на колоректальный рак. Кроме того, способ по настоящему изобретению обеспечивает высокую чувствительность и специфичность, означая, что это надежный и экономичный метод выявления как колоректального рака, так и колоректальных аденом.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к способу in vitro диагностики, идентификации или скрининга субъектов-людей, подверженных риску заболевания колоректальным раком и/или прогрессирующими колоректальными аденомами, с отклонением от уровня концентрации белковых биомаркеров, выделенных из образцов, полученных малоинвазивными процедурами, таких как кровь, сыворотка или плазма. Способ по изобретению обеспечивает высокую чувствительность и специфичность, означая, что это надежный и экономичный способ обнаружения как колоректального рака, так и колоректальных аденом.

Поскольку способ по изобретению имеет более высокую чувствительность и специфичность по сравнению со способом, используемым в настоящее время (FIT) для скрининга общей популяции, подверженной риску заболевания CRC или AA, то он ассоциируется с более низким процентом ложноположительных результатов. Следовательно, способ, описанный в настоящем изобретении, четко помогает уменьшить количество последующих колоноскопий, тем самым улучшая скрининг или диагностику, используемые в настоящее время, у пациентов. После выполнения способа по изобретению, если определено, что пациенты могут страдать колоректальным раком и/или предраковой стадией, то результат подтверждается колоноскопией. Однако если не установлено, что пациент может страдать колоректальным раком и/или предраковой стадией, то отсутствует необходимость в проведении колоноскопии, и рекомендуется рутинное обследование с использованием способа по изобретению, описанного ниже.

В частности, первый вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу (далее «способ по изобретению») диагностики in vitro колоректального рака и/или его предраковой стадии, который включает: a) измерение уровня концентрации, по меньшей мере, Flt3L в биологическом образце, полученном от субъекта, и b) где, если обнаруживается отклонение или изменение уровня концентрации, по меньшей мере, Flt3L по сравнению с референсным уровнем концентрации, измеренным у здоровых контрольных субъектов, то это указывает на то, что субъект страдает колоректальным раком и/или предраковой стадией.

В особенно предпочтительном варианте осуществления способ по изобретению включает измерение уровня концентрации, по меньшей мере, комбинации [Flt3L и CYFRA21-1] в биологическом образце, полученном от субъекта.

В этом отношении важно учитывать, что все наиболее надежные сигнатуры, заявленные в настоящем изобретении, включают Flt3L, предпочтительно [Flt3L и CYFRA21-1], с получением тем самым различных сигнатур биомаркеров, включающих Flt3L, предпочтительно [Flt3L и CYFRA21-1], такие как [Flt3L, и CYFRA21-1, и AREG], [Flt3L, и CYFRA21-1, и AREG, и ErbB4] или [Flt3L, и CYFRA21-1, и AREG, и CLEC2C], с площадью под кривой (AUC) примерно 0,9 для выявления CRC и с хорошей эффективностью также для выявления AA (см. табл. 12). Несмотря на то, что любую из сигнатур, включающих Flt3L, предпочтительно [Flt3L и CYFRA21-1], можно эффективно использовать в соответствии с настоящим изобретением, следующие сигнатуры, содержащие Flt3L, предпочтительно [Flt3L и CYFRA21-1], являются особенно предпочтительными, поскольку они обеспечивают значение AUC выше 0,9 для выявления CRC и хорошую эффективность для выявления AA: [Flt3L, и CYFRA21-1, и AREG, и ErbB4] (AUC для CRC=0,931) или [Flt3L, и CYFRA21-1, и AREG, и CLEC2C] (AUC для CRC=0,915) (см. табл. 12).

Второй вариант осуществления настоящего изобретения относится к набору элементов, содержащему реагенты для определения уровня концентрации любой из вышеуказанных сигнатур. В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению in vitro набора, содержащего реагенты для определения уровня концентрации Flt3L или комбинации [Flt3L и CYFRA21-1], предпочтительно [Flt3L, и CYFRA21-1, и AREG], [Flt3L, и CYFRA21-1, и AREG, и ErbB4] или [Flt3L, и CYFRA21-1, и AREG, и CLEC2C] для диагностики колоректального рака и/или его предраковой стадии.

Согласно способу по изобретению после измерения уровня концентрации любой из вышеуказанных комбинаций биомаркеров получают значение оценки для сигнатуры, и это значение оценки сравнивают с пороговым значением, которое определяет диагностическое правило. Если данное значение оценки выше порогового значения, то соответствующий образец классифицируется как положительный, указывая на то, что пациент может страдать колоректальным раком и/или его предраковой стадией. Пороговое значение было определено для оптимизации показателей чувствительности и специфичности. Следовательно, в предпочтительном варианте осуществления способ по изобретению включает: a) измерение уровня концентрации любой из вышеуказанных комбинаций биомаркеров в биологическом образце, полученном от субъекта, b) обработку значений концентрации для получения оценки риска и c) где, если обнаруживается отклонение или изменение значения оценки риска, полученного для любой из вышеуказанных комбинаций биомаркеров, по сравнению с референсным значением, то это указывает на то, что субъект страдает колоректальным раком и/или предраковой стадией.

Третий вариант осуществления настоящего изобретения относится к применению in vitro любого из вышеуказанных биомаркеров или сигнатур для диагностики колоректального рака и/или его предраковой стадии.

В предпочтительном варианте осуществления предраковая стадия колоректального рака представляет собой прогрессирующую колоректальную аденому.

В предпочтительном варианте осуществления диагноз колоректального рака и/или его предраковой стадии подтверждается методом визуальной оценки, предпочтительно колоноскопией.

В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу in vitro выявления колоректального рака и/или его предраковой стадии, где указанный способ включает: а) получение образца плазмы от пациента-человека; и b) определение присутствия любых из вышеуказанных белковых биомаркеров или сигнатур в образце плазмы, посредством контактирования образца плазмы с антителом, направленным против указанных белковых биомаркеров или сигнатур, и детектирование связывания между белками и антителом.

Четвертый вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу диагностики и лечения колоректального рака или его предраковой стадии, который включает: а) получение образца плазмы от пациента-человека; b) определение присутствия любых вышеуказанных белковых биомаркеров или сигнатур в образце плазмы; c) диагностирование у пациента колоректального рака или его предраковой стадии, когда детектируется присутствие указанных белковых биомаркеров или сигнатур в образце плазмы; и проведение колоноскопии пациенту с последующим удалением колоректального рака или полипов.

В качестве альтернативы пятый вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу (далее «способ по изобретению») диагностики in vitro колоректального рака и/или его предраковой стадии, который включает: a) измерение уровня концентрации, по меньшей мере, AREG в биологическом образце, полученном от субъекта, и b) где, если обнаруживается отклонение или изменение уровня концентрации, по меньшей мере, AREG по сравнению с референсным уровнем концентрации, измеренным у здоровых контрольных субъектов, то это указывает на то, что субъект страдает колоректальным раком и/или предраковой стадией.

В особенно предпочтительном варианте осуществления способ по изобретению включает измерение уровня концентрации, по меньшей мере, комбинации [AREG и CYFRA21-1] в биологическом образце, полученном от субъекта.

В связи с этим важно учитывать, что все наиболее надежные сигнатуры, заявленные в настоящем изобретении, включают AREG, предпочтительно [AREG и CYFRA21-1], с получением тем самым различных сигнатур биомаркеров, включающих AREG, предпочтительно включающих [AREG и CYFRA21-1], с площадью под кривой (AUC) примерно 0,9 для выявления CRC и также для выявления AA с хорошей эффективностью (см. табл. 12-2). Следовательно, несмотря на то, что любая из сигнатур, включающая AREG, предпочтительно включающая [AREG и CYFRA21-1], может эффективно использоваться в соответствии с настоящим изобретением, следующие сигнатуры, включающие AREG, предпочтительно включающие [AREG и CYFRA21-1], являются особенно предпочтительными, поскольку они обеспечивают значение AUC выше 0,9 для выявления CRC и хорошую эффективность для выявления AA: [AREG, и CYFRA21-1, и Flt3L, и ErbB4] (AUC для CRC=0,931) или [AREG, и CYFRA21-1, и Flt3L, и CLEC2C] (AUC для CRC=0,915) (см. табл. 12-2).

Таким образом, в особенно предпочтительном варианте осуществления способ по изобретению включает измерение уровня концентрации, по меньшей мере, комбинации [AREG, и CYFRA21-1, и Flt3L], или комбинации [AREG, и CYFRA21-1, и CLEC2C], или комбинации [AREG, и CYFRA21-1, и ErbB4], или комбинации [AREG, и CYFRA21-1, и FasL], или комбинации [AREG, и CYFRA21-1, и CD147], или комбинацию [AREG, и CYFRA21-1, и HGFR], или комбинации [AREG, и CYFRA21-1, и Flt3L, и ErbB4], или комбинации [AREG, и CYFRA21-1, и Flt3L, и CLEC2C], или комбинации [AREG, и CYFRA21-1, и HGFR, и CD147] в биологическом образце, полученном от субъекта.

В особенно предпочтительном варианте осуществления способ по изобретению включает измерение уровня концентрации, по меньшей мере, комбинации [AREG и CD147], или комбинации [AREG и CLEC2C], или комбинации [AREG и HGFR], или комбинации [AREG, и CD147, и HGFR], в биологическом образце, полученном от субъекта.

Шестой вариант осуществления настоящего изобретения относится к применению in vitro любой из вышеуказанных сигнатур для диагностики колоректального рака и/или его предраковой стадии.

Согласно способу по изобретению после измерения уровня концентрации любой из вышеуказанных комбинаций биомаркеров получают значение оценки для сигнатуры, и данное значение оценки сравнивают с пороговым значением, которое определяет диагностическое правило. Если данное значение оценки выше порогового значения, то соответствующий образец классифицируется как положительный, указывая на то, что пациент может страдать колоректальным раком и/или его предраковой стадией. Пороговое значение было определено для оптимизации показателей чувствительности и специфичности. Следовательно, в предпочтительном варианте осуществления способ по изобретению включает: a) измерение уровня концентрации любой из вышеуказанных комбинаций биомаркеров в биологическом образце, полученном от субъекта, b) обработку значений концентрации для получения оценки риска и c) где, если обнаруживается отклонение или изменение значения оценки риска, полученного для любой из вышеуказанных комбинаций биомаркеров, по сравнению с референсным значением, то это указывает на то, что субъект страдает колоректальным раком и/или предраковой стадией.

Седьмой вариант осуществления настоящего изобретения относится к набору элементов, содержащему реагенты для определения уровня концентрации любой из вышеуказанных сигнатур. В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению in vitro набора, включающего реагенты для определения уровня концентрации любой из вышеуказанных комбинаций биомаркеров для диагностики колоректального рака и/ или его предраковой стадии.

В предпочтительном варианте осуществления предраковая стадия колоректального рака представляет собой прогрессирующую колоректальную аденому.

В предпочтительном варианте осуществления диагноз колоректального рака и/или его предраковой стадии подтверждается методом визуальной оценки, предпочтительно колоноскопией.

В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу выявления in vitro колоректального рака и/или его предраковой стадии, где указанный способ включает: а) получение образца плазмы от пациента-человека; и b) определение присутствия любых из указанных белковых биомаркеров или сигнатур в образце плазмы, посредством контактирования образца плазмы с антителом, направленным против указанных белковых биомаркеров или сигнатур, и детектирование связывания между белками и антителом.

Последний вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу диагностики и лечения колоректального рака или его предраковой стадии, который включает: а) получение образца плазмы от пациента-человека; b) определение присутствия любых из вышеуказанных белковых биомаркеров или сигнатур в образце плазмы; c) диагностирование у пациента колоректального рака или его предраковой стадии, когда обнаруживается присутствие указанных белковых биомаркеров или сигнатур в образце плазмы; и проведение колоноскопии пациенту с последующим удалением колоректального рака или полипов.

Для целей настоящего изобретения приводится определение следующих терминов:

- Термин «колоректальный рак» представляет собой заболевание, характеризующееся наличием злокачественной опухоли, происходящей из клеток кишечного тракта ниже тонкого кишечника (т. е. толстого кишечника (толстой кишки), включая слепую кишку, восходящую ободочную кишку, поперечную ободочную кишку, нисходящую ободочную кишку, сигмовидную кишку, и прямую кишку).

- Выражение «колоректальная аденома» относится к аденомам толстого кишечника, также называемым аденоматозными полипами, которые являются доброкачественной и предраковой стадией колоректального рака, но все же имеют высокий риск прогрессирования до колоректального рака.

- Выражение «прогрессирующая колоректальная аденома» относится к аденомам, имеющим размер не менее 10 мм или гистологически имеющим дисплазию высокой степени или ворсинчатый компонент на площади более 20%.

- Выражение «биологический образец, полученный малоинвазивной процедурой» относится к любому образцу, отобранному из тела пациента без необходимости применения травматичных инструментов, кроме тонких игл, используемых для взятия крови у пациента, и, следовательно, без причинения вреда для пациента. В частности, биологический образец, полученный малоинвазивной процедурой, в настоящем изобретении относится к образцам крови, сыворотки или плазмы.

- Выражение «референсный уровень концентрации, измеренный у здоровых контрольных субъектов» относится к «референсному значению» уровня концентрации белков. Если обнаруживается отклонение уровня концентрации белков относительно указанного «референсного уровня концентрации, измеренного у здоровых контрольных субъектов», то это указывает на колоректальный рак или его предраковую стадию. В частности, если уровень концентрации биомаркеров или сигнатур по настоящему изобретению достоверно выше или ниже по сравнению с указанным «референсным значением», то это указывает на колоректальный рак или его предраковую стадию.

- Выражение «оценка риска» относится к значению риска, полученному после обработки одного или более значений концентрации в одно значение (или значение риска), которое представляет вероятность развития заболевания у человека. Данное значение риска должно сравниваться с референсным значением для оценки того, может ли пациент страдать колоректальным раком и/или его предраковой стадией.

- «Референсное значение» может представлять собой «пороговое значение» или «отсекающее значение». Обычно «пороговое значение» или «отсекающее значение» можно определить экспериментально, эмпирически или теоретически. Пороговое значение также может быть выбрано произвольно на основе существующих экспериментальных и/или клинических данных, что понятно специалистам в данной области. Пороговое значение необходимо определить для получения оптимальной чувствительности и специфичности в соответствии с функцией теста и соотношением польза/риск (клинические последствия ложноположительных и ложноотрицательных результатов). Предпочтительно, специалист в данной области может сравнивать уровни (или оценки) биомаркеров, полученные в соответствии со способом по изобретению, с определенным пороговым значением. Как правило, оптимальную чувствительность и специфичность (и, следовательно, пороговое значение) можно определить с помощью рабочей характеристической кривой (ROC) на основе экспериментальных данных. Например, после определения уровней биомаркеров в референсной группе можно использовать алгоритмический анализ для статистической обработки измеренных концентраций биомаркеров в биологических образцах, подлежащих тестированию, и, таким образом, получить классификационный стандарт, имеющий статистическую достоверность для классификации образцов. Полное название ROC-кривой представляет собой рабочая характеристическая кривая, которая также известна как операционная характеристическая кривая наблюдателя. Термин в основном используется для клинических биохимических диагностических тестов. ROC-кривая представляет собой комплексный показатель, который отражает непрерывные переменные: частоту истинных положительных результатов (чувствительность) и частоту ложноположительных результатов (1-специфичность). Термин раскрывает взаимосвязь между чувствительностью и специфичностью метода композиции изображения. Серии различных отсекающих значений (пороговые или критические значения, пограничные значения между нормальными и аномальными результатами диагностического теста) устанавливаются как непрерывные переменные для расчета серии значений чувствительности и специфичности. Затем чувствительность используется как вертикальная координата, и специфичность - как горизонтальная координата для построения кривой. Чем выше площадь под кривой (AUC), тем выше точность диагностики. На ROC-кривой точка, ближайшая к дальнему верхнему левому углу координатной диаграммы, является критической точкой, имеющей как высокую чувствительность, так и высокие значения специфичности. Значение AUC ROC-кривой составляет от 1,0 до 0,5. Когда AUC>0,5, то результат диагностики становится все лучше и лучше по мере приближения AUC к 1. Когда AUC находится в диапазоне от 0,5 до 0,7, то точность невысока. Когда AUC составляет от 0,7 до 0,9, то точность хорошая. Когда AUC выше 0,9, то точность довольно высока. Данный алгоритмический метод предпочтительно выполняется с помощью компьютера. Существующее программное обеспечение или системы в данной области техники можно использовать для построения ROC-кривой, например: MedCalc 9.2.0.1 программное обеспечение для медицинской статистики, SPSS 9.0.

- Под термином «содержащий» подразумевается, включая, не ограничиваясь этим, все, что следует за словом «содержащий». Таким образом, использование термина «содержащий» указывает на то, что перечисленные элементы являются необходимыми или обязательными, а другие элементы являются необязательными и могут присутствовать или не присутствовать.

- Под термином «состоящий из» подразумевается «включая и ограничиваясь», все, что следует за выражением «состоящий из». Таким образом, выражение «состоящий из» указывает на то, что перечисленные элементы являются необходимыми или обязательными, и что никакие другие элементы не могут присутствовать.

Для целей настоящего изобретения следующие белки идентифицированы согласно базе данных Uniprot:

Сокращение Название белка Номер по Uniprot AREG Амфирегулин P15514 CD147 Базигин P35613 CLEC2C Ранний антиген активации CD69 Q07108 CYFRA21-1 Фрагмент цитокератинового антигена 21-1 N/A ErbB4 Рецепторная тирозинпротеинкиназа erbB-4 Q15303 FasL Член суперсемейства лигандов фактора некроза опухолей 6 P48023 Flt3L Fms-подобный лиганд тирозинкиназы 3 P49771 HGFR Рецептор фактора роста гепатоцитов P08581 IFNgamma Интерферон гамма P01579

Краткое описание фигур

На фиг. 1 - Рабочая характеристическая кривая (ROC) для: A) [Flt3L и CYFRA21-1] при колоректальном раке. Площадь под кривой (AUC) = 0,865. B) [Flt3L и CYFRA21-1] при прогрессирующей колоректальной аденоме. Площадь под кривой (AUC) = 0,606. Ось X представляет специфичность. Ось Y представляет чувствительность.

На фиг. 2 - Рабочая характеристическая кривая (ROC) для: A) [Flt3L, и CYFRA21-1, и AREG] при колоректальном раке. Площадь под кривой (AUC) = 0,899. B) [Flt3L, и CYFRA21-1, и AREG] при прогрессирующей колоректальной аденоме. Площадь под кривой (AUC) = 0,720. Ось X представляет специфичность. Ось Y представляет чувствительность.

На фиг. 3 - Рабочая характеристическая кривая (ROC) для: A) [Flt3L, и CYFRA21-1, и AREG, и ErbB4] при колоректальном раке. Площадь под кривой (AUC) = 0,931. B) [Flt3L, и CYFRA21-1, и AREG, и ErbB4] при прогрессирующей колоректальной аденоме. Площадь под кривой (AUC)=0,707. Ось X представляет специфичность. Ось Y представляет чувствительность.

На фиг. 4 - Рабочая характеристическая кривая (ROC) для: A) [Flt3L, и CYFRA21-1, и AREG, и CLEC2C] при колоректальном раке. Площадь под кривой (AUC) = 0,915. B) [Flt3L, и CYFRA21-1, и AREG, и CLEC2C] при прогрессирующей колоректальной аденоме. Площадь под кривой (AUC)=0,727. Ось X представляет специфичность. Ось Y представляет чувствительность.

На фиг. 5 - Рабочая характеристическая кривая (ROC) для: A) [AREG и CYFRA21-1] при колоректальном раке. Площадь под кривой (AUC) = 0,878. В) [AREG и CYFRA21-1] при прогрессирующей колоректальной аденоме. Площадь под кривой (AUC) = 0,722. Ось X представляет специфичность. Ось Y представляет чувствительность.

На фиг. 6 - Рабочая характеристическая кривая (ROC) для: A) [AREG, и CYFRA21-1, и Flt3L, и ErbB4] при колоректальном раке. Площадь под кривой (AUC) = 0,931. Б) [AREG, и CYFRA21-1, и Flt3L, и ErbB4] при прогрессирующей колоректальной аденоме. Площадь под кривой (AUC)=0,707. Ось X представляет специфичность. Ось Y представляет чувствительность.

На фиг. 7 - Рабочая характеристическая кривая (ROC) для: A) [AREG, и CYFRA21-1, и Flt3L, и CLEC2C] при колоректальном раке. Площадь под кривой (AUC)=0,915. B) [AREG, и CYFRA21-1, и Flt3L, и CLEC2C] при прогрессирующей колоректальной аденоме. Площадь под кривой (AUC)=0,727. Ось X представляет специфичность. Ось Y представляет чувствительность.

На фиг. 8 - Рабочая характеристическая кривая (ROC) для: A) [AREG, и CYFRA21-1, и CD147, и HGFR] при колоректальном раке. Площадь под кривой (AUC) = 0,888. B) [AREG, и CYFRA21-1, и CD147, и HGFR] при прогрессирующей колоректальной аденоме. Площадь под кривой (AUC)=0,769. Ось X представляет специфичность. Ось Y представляет чувствительность.

Подробное описание изобретения

Пример 1. Материалы и методы

Пример 1.1. Популяция в исследовании

В общей сложности 96 субъектов из восьми испанских госпиталей (Госпиталь де Бургос, Госпиталь де Виго, Госпиталь де Доности, Госпиталь де Оренсе, Госпиталь дель Бьерсо, Госпиталь де Бельтвигте и Госпиталь де Сарагоса) были перспективно включены в данное исследование: 64 пациента с впервые поставленным диагнозом спорадическая колоректальная неоплазия (32 с CRC и 32 с AA) и 32 здоровых субъекта без онкологического заболевания в анамнезе и с недавно проведенной колоноскопией, подтверждающей отсутствие колоректальных неопластических поражений. Пациенты с АА имели аденомы размером не менее 10 мм или гистологически имели дисплазию высокой степени или>20% ворсинчатого компонента. Характеристики участников приведены в табл. 1. Образцы крови отбирали перед эндоскопией или хирургической операцией у всех субъектов.

Таблица 1.
Клинико-патологическая характеристика исследуемой когорты Случаи Контроль (CTL) AA CRC В общем Средний возраст (SD) 64,3 (44-86) 65,1 (52-88) 71,6 (54-85) 67 (44-88) Мужчины 13 18 18 49 (51%) Женщины 19 14 14 47 (49%) Признаки колоректального рака
Стадия TNM I 4 II 9 III 10 IV 6 Неизвестно 3 Локализация Восходящая ободочная и слепая кишка 10 Нисходящая ободочная и слепая кишка 12 Поперечная ободочная кишка 3 Прямая кишка 3 Неизвестно 4 Признаки прогрессирующей колоректальной аденомы Размер=>10 мм 28 Небольшая AA=(>15 мм) 19 Большая AA=(>15 мм) 13 Средний размер (мм) (SD) 18,8 Отсутствие АА среднее значение (SD) 2,3 Дисплазия высокой степени Да 9 Нет 21 Неизвестно 2 Ворсинчатый компонент Да 13 Нет 17 Неизвестно 2

Исследование было одобрено комитетом по институциональной этике в каждой больнице, и от всех участников было получено письменное информированное согласие в соответствии с Хельсинкской декларацией.

Пример 1.2. Получение образцов

Десять мл цельной крови от каждого участника отбирали в пробирки с ЭДТА К2. Образцы крови помещали при 4°C для отделения плазмы. Образцы центрифугировали при 1600 g в течение 10 мин при 4°C для осаждения клеток крови, и плазму переносили в другие пробирки с последующим центрифугированием при 16000 g в течение 10 мин при 4°C для полного удаления клеточных компонентов.

Пример 1.3. Молекулярный анализ

Концентрацию биомаркеров в образцах плазмы определяли с использованием коммерческого набора для ELISA (иммуноферментный анализ) и CLIA (хемилюминесцентный иммуноанализ), и следуя соответствующим указаниям производителя. HGFR и ErbB4 анализировали с использованием набора для ELISA производства Cloud clone Corp. Уровень CD147, CLEC2C, Flt3L и FasL измеряли с использованием набора для ELISA производства Elabscience. В случае IFNgamma использовали набор ELISA производства Abcam. CLIA, CYFRA21-1 и AREG анализировали с использованием набора для анализа CLIA производства Cloud Clone Corp.

Пример 1.4. Количественная оценка данных

На стадии количественного определения белков образцы обрабатывали с использованием соответствующего набора (ELISA/CLIA) и распределяли по экспериментальным таблицам. Каждая таблица содержала также контрольные данные, использованные для построения стандартной кривой. Данные по флуоресценции, полученные в каждом анализе (выраженные в виде целых чисел), были скорректированы на фон для каждого образца и количественно определяли с использованием стандартной кривой, построенной с использованием полиномиальной регрессионной модели степени 2.

Пример 1.5. Статистический анализ

При анализе учитывали три группы субъектов. CRC (субъекты с диагнозом колоректальный рак), AA (субъекты с диагностированной прогрессирующей аденомой) и CTL (субъекты без заболевания).

Необработанные количественные данные преобразовали посредством применения функции квадратного корня, и затем центрирования и масштабирования так, чтобы после преобразования каждый белковый показатель имел среднее значение 0 и стандартное отклонение 1. Значения количественной оценки обобщены в табл. 2 и табл. 3, где каждый белок описан как медианное значение и интерквартильный размах в различных рассматриваемых группах.

Нормальность данных подтверждали критерием Шапиро-Уилка, и, следовательно, критерий суммы рангов Уилкоксона использовали для сравнения либо случаев CRC, либо случаев AA против субъектов, входящих в группу CTL.

Диагностическую эффективность отдельных белков и некоторых их комбинаций оценивали по их рабочим характеристическим кривым (ROC) и площади под ROC-кривыми (AUC). Кроме того, чувствительность, специфичность, положительные прогностические и отрицательные прогностические значения (PPV и NPV) для различных тестов рассчитывали в оптимальной точке отсечения, определенной оптимальным индексом Юдена (или, что эквивалентно, точке ROC, которая максимизирует сумму чувствительности и специфичность).

Оценки, использованные для получения ROC-AUC и остальных значений эффективности, получали с использованием модели одномерной логистической регрессии для отдельных белков и моделей многомерной логистической регрессии для различных комбинаций рассматриваемых белков. 95% доверительный интервал для AUC получали с использованием методологии Делонга как для отдельных маркеров, так и для их комбинации.

Пример 2. Результаты

Пример 2.1. Результаты по отдельным маркерам

Были определены различные показатели для оценки отдельных белков, а также для следующих сравнений: CRC/AA против CTL. Можно отметить, что AREG, CYFRA21-1 и Flt3L достоверно различаются между группами CRC и CTL, и их AUC статистически значимо отличается от 0,5 (поскольку их 95% доверительный интервал не включает 0,5). В случае группы AA, то AREG также показывает статистические различия по сравнению с группой CTL.

В табл. 2 и 3 приведены показатели для отдельных белков, включая значение p из теста Уилкоксона (p.Wilc), площадь под ROC-кривой (AUC) и чувствительность (Sens.), Специфичность (Spec.) и положительные (VPP) и отрицательные (VPN) прогностические значения, вычисленные в точке отсечения ROC-кривой с оптимальным индексом Юдена. Столбец, обозначенный «знак», для биомаркеров с p-значением <0,25, указывает, насколько высокие уровни маркера повышают или снижают риск заболевания (+ и - соответственно).

Таблица 2 CRC против CTL p, Wilc. Знак AUC Чувствительность Специфичность VPP VPN AREG 0,0008 + 0,744 (0,619,0,868) 65,62 81,25 77,78 70,27 CD147 0,5280 0,546 (0,402,0,691) 53,12 62,50 58,62 57,14 CLEC2C 0,2021 + 0,593 (0,452,0,734) 93,75 28,12 56,60 81,82 CYFRA21-1 0,0000 + 0,795 (0,682,0,909) 90,62 68,75 74,36 88,00 ErbB4 0,1177 - 0,614 (0,47,0,758) 53,12 75,00 68,00 61,54 FasL 0,1859 + 0,598 (0,454,0,741) 54,84 68,75 62,96 61,11 Flt3L 0,0191 - 0,67 (0,531,0,809) 56,25 84,38 78,26 65,85 HGFR 0,1729 + 0,6 (0,452,0,747) 65,62 68,75 67,74 66,67 IFNgamma 0,1537 + 0,604 (0,464,0,745) 68,75 53,12 59,46 62,96

Таблица 3 AA против CTL p.Wilc. Знак AUC Чувствительность Специфичность VPP VPN AREG 0,0286 + 0,66 (0,525,0,795) 87,50 40,62 59,57 76,47 CD147 0,1772 + 0,599 (0,458,0,739) 87,50 31,25 56,00 71,43 CLEC2C 0,7831 0,521 (0,376,0,665) 100,00 9,38 52,46 100,00 CYFRA21-1 0,1412 + 0,607 (0,467,0,748) 90,62 37,50 59,18 80,00 ErbB4 0,3270 0,572 (0,427,0,716) 50,00 71,88 64,00 58,97 FasL 0,5730 0,542 (0,394,0,689) 74,19 46,88 57,50 65,22 Flt3L 0,8155 0,518 (0,372,0,663) 43,75 75,00 63,64 57,14 HGFR 0,0678 + 0,633 (0,493,0,773) 68,75 62,50 64,71 66,67 IFNgamma 0,8467 0,515 (0,37,0,659) 81,25 31,25 54,17 62,50

Пример 2.2. Наилучшие комбинации биомаркеров

С целью улучшения индивидуальной диагностической эффективности комбинации белков были исследованы с помощью следующей процедуры: на основе маркеров с p<0,25 в сравнении CRC против CTL (табл. 3) или AA против CTL (табл. 4), авторы изобретения использовали многомерную логистическую регрессию, чтобы исследовать все возможные комбинации двух, трех и четырех из этих белков, взятых одновременно.

В табл. 4, 5, 5-2, 6 и 6-2 приведены значения AUC, полученные для комбинаций двух, трех и четырех биомаркеров соответственно, в сравнении CRC против CTL.

Таблица 4 Комбинации двух биомаркеров в CRC против CTL AUC AREG, CYFRA21-1 0,8779297 Flt3L, CYFRA21-1 0,8652344 CYFRA21-1, ErbB4 0,8359375 AREG, CLEC2C 0,8349609 CYFRA21-1, IFNgamma 0,8017578 CYFRA21-1, FasL 0,7993952 CLEC2C, CYFRA21-1 0,7988281 CYFRA21-1, HGFR 0,7919922 AREG, Flt3L 0,7832031 AREG, HGFR 0,7626953 AREG, IFNgamma 0,7431641 AREG, ErbB4 0,7324219 AREG, FasL 0,7247984 Flt3L, HGFR 0,6982422 CLEC2C, Flt3L 0,6953125 ErbB4, Flt3L 0,6914062 FasL, Flt3L 0,6814516 Flt3L, IFNgamma 0,6708984 ErbB4, IFNgamma 0,6318359 ErbB4, HGFR 0,6142578 CLEC2C, IFNgamma 0,6083984 CLEC2C, ErbB4 0,6064453 FasL, HGFR 0,6018145 HGFR, IFNgamma 0,5869141 CLEC2C, FasL 0,5866935 ErbB4, FasL 0,5856855 FasL, IFNgamma 0,5836694 CLEC2C, HGFR 0,5810547

Таблица 5 Комбинации трех биомаркеров в CRC против CTL, поддерживающие комбинацию
Flt3L+CYFRA21-1 AUC Flt3L, CYFRA21-1, AREG 0,8994141 AREG, CLEC2C, CYFRA21-1 0,8955078 AREG, CYFRA21-1, ErbB4 0,8955078 AREG, CYFRA21-1, FasL 0,8931452 Flt3L, CYFRA21-1 0,8847656 AREG, CYFRA21-1, IFNgamma 0,8837891 AREG, CYFRA21-1, HGFR 0,8759766 Flt3L, CYFRA21-1, CLEC2C 0,8681641 Flt3L, CYFRA21-1, FasL 0,8679435 Flt3L, CYFRA21-1, IFNgamma 0,8671875 Flt3L, CYFRA21-1, HGFR 0,8662109 AREG, CLEC2C, Flt3L 0,8427734 CYFRA21-1, ErbB4, HGFR 0,8388672 CYFRA21-1, ErbB4, IFNgamma 0,8359375 CLEC2C, CYFRA21-1, ErbB4 0,8349609 AREG, CLEC2C, HGFR 0,8330078 CYFRA21-1, ErbB4, FasL 0,8326613 AREG, CLEC2C, FasL 0,8316532 AREG, CLEC2C, ErbB4 0,8300781 AREG, CLEC2C, IFNgamma 0,8173828 AREG, Flt3L, HGFR 0,8066406 CLEC2C, CYFRA21-1, IFNgamma 0,8066406 CYFRA21-1, FasL, IFNgamma 0,8054435 CYFRA21-1, HGFR, IFNgamma 0,8037109 CYFRA21-1, FasL, HGFR 0,8014113 CLEC2C, CYFRA21-1, FasL 0,7973790 CLEC2C, CYFRA21-1, HGFR 0,7968750 AREG, ErbB4, Flt3L 0,7841797 AREG, Flt3L, IFNgamma 0,7832031 AREG, FasL, Flt3L 0,7782258 AREG, ErbB4, HGFR 0,7705078 AREG, HGFR, IFNgamma 0,7666016 AREG, FasL, HGFR 0,7641129 AREG, ErbB4,IFNgamma 0,7451172 AREG, FasL,IFNgamma 0,7358871 AREG, ErbB4, FasL 0,7197581 ErbB4, Flt3L, HGFR 0,7119141 CLEC2C, FasL, Flt3L 0,7076613 CLEC2C, ErbB4,Flt3L 0,7031250 ErbB4, FasL, Flt3L 0,7006048 CLEC2C, Flt3L, HGFR 0,6962891 FasL, Flt3L, HGFR 0,6935484 CLEC2C, Flt3L, IFNgamma 0,6933594 Flt3L, HGFR, IFNgamma 0,6894531 ErbB4, Flt3L, IFNgamma 0,6875000 FasL, Flt3L, IFNgamma 0,6814516 ErbB4, FasL, IFNgamma 0,6250000 ErbB4, HGFR, IFNgamma 0,6230469 CLEC2C, ErbB4, IFNgamma 0,6191406 ErbB4, FasL, HGFR 0,6139113 CLEC2C, ErbB4, HGFR 0,6123047 CLEC2C, ErbB4, FasL 0,6068548 CLEC2C, FasL, IFNgamma 0,6048387 FasL, HGFR, IFNgamma 0,5997984 CLEC2C, FasL, HGFR 0,5967742 CLEC2C, HGFR, IFNgamma 0,5966797

Таблица 5-2 Комбинации трех биомаркеров в CRC против CTL, поддерживающие комбинацию
AREG+CYFRA21-1 AUC AREG, CYFRA21-1, Flt3L 0,8994141 AREG, CYFRA21-1, CLEC2C 0,8955078 AREG, CYFRA21-1, ErbB4 0,8955078 AREG, CYFRA21-1, FasL 0,8931452 CYFRA21-1,ErbB4, Flt3L 0,8847656 AREG, CYFRA21-1, IFNgamma 0,8837891 AREG, CYFRA21-1, HGFR 0,8759766 CLEC2C, CYFRA21-1, Flt3L 0,8681641 CYFRA21-1, FasL, Flt3L 0,8679435 CYFRA21-1, Flt3L, IFNgamma 0,8671875 CYFRA21-1, Flt3L, HGFR 0,8662109 AREG, CLEC2C, Flt3L 0,8427734 CYFRA21-1, ErbB4, HGFR 0,8388672 CYFRA21-1, ErbB4, IFNgamma 0,8359375 CLEC2C, CYFRA21-1, ErbB4 0,8349609 AREG, CLEC2C, HGFR 0,8330078 CYFRA21-1, ErbB4, FasL 0,8326613 AREG, CLEC2C, FasL 0,8316532 AREG, CLEC2C, ErbB4 0,8300781 AREG, CLEC2C, IFNgamma 0,8173828 AREG, Flt3L, HGFR 0,8066406 CLEC2C, CYFRA21-1, IFNgamma 0,8066406 CYFRA21-1, FasL, IFNgamma 0,8054435 CYFRA21-1, HGFR, IFNgamma 0,8037109 CYFRA21-1, FasL, HGFR 0,8014113 CLEC2C, CYFRA21-1, FasL 0,7973790 CLEC2C, CYFRA21-1, HGFR 0,7968750 AREG, ErbB4,Flt3L 0,7841797 AREG, Flt3L, IFNgamma 0,7832031 AREG, FasL, Flt3L 0,7782258 AREG, ErbB4, HGFR 0,7705078 AREG, HGFR, IFNgamma 0,7666016 AREG, FasL, HGFR 0,7641129 AREG, ErbB4, IFNgamma 0,7451172 AREG, FasL, IFNgamma 0,7358871 AREG, ErbB4, FasL 0,7197581 ErbB4, Flt3L, HGFR 0,7119141 CLEC2C, FasL, Flt3L 0,7076613 CLEC2C, ErbB4, Flt3L 0,7031250 ErbB4, FasL, Flt3L 0,7006048 CLEC2C, Flt3L, HGFR 0,6962891 FasL, Flt3L, HGFR 0,6935484 CLEC2C, Flt3L, IFNgamma 0,6933594 Flt3L, HGFR, IFNgamma 0,6894531 ErbB4, Flt3L, IFNgamma 0,6875000 FasL, Flt3L, IFNgamma 0,6814516 ErbB4, FasL, IFNgamma 0,6250000 ErbB4, HGFR, IFNgamma 0,6230469 CLEC2C, ErbB4, IFNgamma 0,6191406 ErbB4, FasL, HGFR 0,6139113 CLEC2C, ErbB4, HGFR 0,6123047 CLEC2C, ErbB4, FasL 0,6068548 CLEC2C, FasL, IFNgamma 0,6048387 FasL, HGFR, IFNgamma 0,5997984 CLEC2C, FasL, HGFR 0,5967742 CLEC2C, HGFR, IFNgamma 0,5966797

Таблица 6 Комбинации трех биомаркеров в CRC против CTL, поддерживающие комбинацию
Flt3L+CYFRA21-1 AUC Flt3L, CYFRA21-1, ErbB4, AREG 0,9306641 Flt3L, CYFRA21-1, AREG, CLEC2C 0,9150391 AREG, CLEC2C, CYFRA21-1, ErbB4 0,9023438 AREG, CYFRA21-1, ErbB4, FasL 0,9022177 AREG, CLEC2C, CYFRA21-1, IFNgamma 0,9003906 Flt3L, CYFRA21-1, HGFR, AREG, 0,9003906 AREG, CLEC2C, CYFRA21-1, FasL 0,9002016 AREG, CYFRA21-1, ErbB4, IFNgamma 0,8994141 Flt3L, CYFRA21-1, IFNgamma, AREG 0,8984375 Flt3L, CYFRA21-1, FasL, AREG 0,8981855 AREG, CYFRA21-1,FasL, IFNgamma 0,8951613 AREG, CYFRA21-1, ErbB4, HGFR 0,8945312 AREG, CLEC2C, CYFRA21-1, HGFR 0,8935547 AREG, CYFRA21-1, FasL, HGFR 0,8901210 Flt3L, CYFRA21-1, ErbB4, HGFR 0,8867188 Flt3L, CYFRA21-1, ErbB4, IFNgamma 0,8867188 AREG, CYFRA21-1,HGFR, IFNgamma 0,8847656 Flt3L, CYFRA21-1, ErbB4, CLEC2C 0,8847656 Flt3L, CYFRA21-1, ErbB4, FasL 0,8830645 Flt3L, CYFRA21-1, FasL, IFNgamma 0,8689516 Flt3L, CYFRA21-1, HGFR, IFNgamma 0,8671875 Flt3L, CYFRA21-1, FasL, HGFR 0,8669355 Flt3L, CYFRA21-1, IFNgamma, CLEC2C 0,8662109 Flt3L, CYFRA21-1, FasL, CLEC2C 0,8649194 Flt3L, CYFRA21-1, HGFR, CLEC2C 0,8632812 AREG, CLEC2C, Flt3L, HGFR 0,8564453 AREG, CLEC2C, ErbB4, Flt3L 0,8457031 AREG, CLEC2C, FasL, Flt3L 0,8447581 AREG, CLEC2C, Flt3L, IFNgamma 0,8447266 CYFRA21-1,ErbB4,HGFR, IFNgamma 0,8417969 CLEC2C, CYFRA21-1, ErbB4, HGFR 0,8398438 AREG, CLEC2C, ErbB4, HGFR 0,8378906 CLEC2C, CYFRA21-1,ErbB4,IFNgamma 0,8359375 AREG, CLEC2C, ErbB4, FasL 0,8346774 AREG, CLEC2C, FasL, HGFR 0,8326613 CLEC2C, CYFRA21-1, ErbB4, FasL 0,8326613 CYFRA21-1, ErbB4, FasL, IFNgamma 0,8326613 CYFRA21-1, ErbB4, FasL, HGFR 0,8316532 AREG, CLEC2C, HGFR, IFNgamma 0,8271484 AREG, CLEC2C, ErbB4, IFNgamma 0,8251953 AREG, CLEC2C, FasL, IFNgamma 0,8245968 AREG, ErbB4, Flt3L, HGFR 0,8203125 CLEC2C, CYFRA21-1, FasL, IFNgamma 0,8074597 AREG, Flt3L, HGFR, IFNgamma 0,8066406 CYFRA21-1, FasL, HGFR, IFNgamma 0,8064516 CLEC2C, CYFRA21-1, HGFR, IFNgamma 0,8056641 AREG, FasL, Flt3L, HGFR 0,7993952 CLEC2C, CYFRA21-1, FasL, HGFR 0,7983871 AREG, ErbB4, Flt3L, IFNgamma 0,7861328 AREG, ErbB4, HGFR, IFNgamma 0,7802734 AREG, ErbB4, FasL, Flt3L 0,7802419 AREG, FasL, Flt3L, IFNgamma 0,7772177 AREG, ErbB4, FasL, HGFR 0,7721774 AREG, FasL, HGFR, IFNgamma 0,7681452 AREG, ErbB4, FasL, IFNgamma 0,7419355 ErbB4, FasL, Flt3L, HGFR 0,7358871 CLEC2C, ErbB4, FasL, Flt3L 0,7167339 CLEC2C, FasL, Flt3L, HGFR 0,7086694 CLEC2C, FasL, Flt3L, IFNgamma 0,7056452 CLEC2C, ErbB4, Flt3L, HGFR 0,7050781 ErbB4,Flt3L, HGFR, IFNgamma 0,7050781 CLEC2C, ErbB4, Flt3L, IFNgamma 0,7011719 ErbB4,FasL, Flt3L, IFNgamma 0,6985887 CLEC2C, Flt3L, HGFR, IFNgamma 0,6933594 FasL, Flt3L, HGFR, IFNgamma 0,6895161 CLEC2C, ErbB4, FasL, IFNgamma 0,6290323 CLEC2C, ErbB4, FasL, HGFR 0,6239919 CLEC2C, ErbB4, HGFR, IFNgamma 0,6220703 ErbB4,FasL, HGFR, IFNgamma 0,6118952 CLEC2C, FasL, HGFR, IFNgamma 0,6088710

Таблица 6-2 Комбинации трех биомаркеров в CRC против CTL, поддерживающие комбинацию
AREG+CYFRA21-1 AUC AREG, CYFRA21-1, Flt3L, ErbB4 0,9306641 AREG, CYFRA21-1, Flt3L, CLEC2C 0,9150391 AREG, CYFRA21-1, ErbB4, CLEC2C 0,9023438 AREG, CYFRA21-1, ErbB4, FasL 0,9022177 AREG, CYFRA21-1, CLEC2C, IFNgamma 0,9003906 AREG, CYFRA21-1, Flt3L, HGFR 0,9003906 AREG, CYFRA21-1, CLEC2C, FasL 0,9002016 AREG, CYFRA21-1, ErbB4, IFNgamma 0,8994141 AREG, CYFRA21-1, Flt3L, IFNgamma 0,8984375 AREG, CYFRA21-1, Flt3L, FasL, 0,8981855 AREG, CYFRA21-1, FasL, IFNgamma 0,8951613 AREG, CYFRA21-1, ErbB4, HGFR 0,8945312 AREG, CYFRA21-1, HGFR, CLEC2C, 0,8935547 AREG, CYFRA21-1, FasL, HGFR 0,8901210 CYFRA21-1,ErbB4, Flt3L, HGFR 0,8867188 CYFRA21-1, ErbB4, Flt3L, IFNgamma 0,8867188 AREG, CYFRA21-1, HGFR, IFNgamma 0,8847656 CLEC2C, CYFRA21-1, ErbB4, Flt3L 0,8847656 CYFRA21-1, ErbB4, FasL, Flt3L 0,8830645 CYFRA21-1, FasL, Flt3L, IFNgamma 0,8689516 CYFRA21-1, Flt3L, HGFR, IFNgamma 0,8671875 CYFRA21-1, FasL, Flt3L, HGFR 0,8669355 CLEC2C, CYFRA21-1, Flt3L, IFNgamma 0,8662109 CLEC2C, CYFRA21-1, FasL, Flt3L 0,8649194 CLEC2C, CYFRA21-1, Flt3L, HGFR 0,8632812 AREG, CLEC2C, Flt3L, HGFR 0,8564453 AREG, CLEC2C, ErbB4, Flt3L 0,8457031 AREG, CLEC2C, FasL, Flt3L 0,8447581 AREG, CLEC2C, Flt3L, IFNgamma 0,8447266 CYFRA21-1, ErbB4, HGFR, IFNgamma 0,8417969 CLEC2C, CYFRA21-1, ErbB4, HGFR 0,8398438 AREG, CLEC2C, ErbB4, HGFR 0,8378906 CLEC2C, CYFRA21-1, ErbB4, IFNgamma 0,8359375 AREG, CLEC2C, ErbB4, FasL 0,8346774 AREG, CLEC2C, FasL, HGFR 0,8326613 CLEC2C, CYFRA21-1,ErbB4, FasL 0,8326613 CYFRA21-1, ErbB4,FasL, IFNgamma 0,8326613 CYFRA21-1, ErbB4, FasL, HGFR 0,8316532 AREG, CLEC2C, HGFR, IFNgamma 0,8271484 AREG, CLEC2C, ErbB4, IFNgamma 0,8251953 AREG, CLEC2C, FasL, IFNgamma 0,8245968 AREG, ErbB4, Flt3L, HGFR 0,8203125 CLEC2C, CYFRA21-1, FasL, IFNgamma 0,8074597 AREG, Flt3L, HGFR, IFNgamma 0,8066406 CYFRA21-1, FasL, HGFR,IFNgamma 0,8064516 CLEC2C, CYFRA21-1, HGFR, IFNgamma 0,8056641 AREG, FasL, Flt3L, HGFR 0,7993952 CLEC2C, CYFRA21-1, FasL, HGFR 0,7983871 AREG, ErbB4, Flt3L, IFNgamma 0,7861328 AREG, ErbB4, HGFR, IFNgamma 0,7802734 AREG, ErbB4, FasL, Flt3L 0,7802419 AREG, FasL, Flt3L, IFNgamma 0,7772177 AREG, ErbB4, FasL, HGFR 0,7721774 AREG, FasL, HGFR, IFNgamma 0,7681452 AREG, ErbB4, FasL, IFNgamma 0,7419355 ErbB4, FasL, Flt3L, HGFR 0,7358871 CLEC2C, ErbB4, FasL, Flt3L 0,7167339 CLEC2C, FasL, Flt3L, HGFR 0,7086694 CLEC2C, FasL, Flt3L, IFNgamma 0,7056452 CLEC2C, ErbB4, Flt3L, HGFR 0,7050781 ErbB4, Flt3L, HGFR, IFNgamma 0,7050781 CLEC2C, ErbB4, Flt3L, IFNgamma 0,7011719 ErbB4, FasL, Flt3L, IFNgamma 0,6985887 CLEC2C, Flt3L, HGFR, IFNgamma 0,6933594 FasL, Flt3L, HGFR, IFNgamma 0,6895161 CLEC2C, ErbB4, FasL, IFNgamma 0,6290323 CLEC2C, ErbB4, FasL, HGFR 0,6239919 CLEC2C, ErbB4, HGFR, IFNgamma 0,6220703 ErbB4, FasL, HGFR, IFNgamma 0,6118952 CLEC2C, FasL, HGFR, IFNgamma 0,6088710

В табл. 7, 8 и 9 приведены значения AUC, полученные для комбинаций двух, трех и четырех биомаркеров, соответственно для сравнения AA против CTL.

Таблица 7 Комбинация биомаркеров в AA против CTL AUC AREG, CD147 0,7548828 AREG, HGFR 0,7460938 AREG, CYFRA21-1 0,7221680 CYFRA21-1, HGFR 0,6250000 CD147, HGFR 0,6191406 CD147, CYFRA21-1 0,6152344

Таблица 8 Комбинация биомаркеров в AA против CTL AUC AREG, CD147, CYFRA21-1 0,7617188 AREG, CYFRA21-1, HGFR 0,7607422 AREG, CD147, HGFR 0,7539062 CD147, CYFRA21-1, HGFR 0,6337891

Таблица 9 Комбинация биомаркеров в AA против CTL AUC AREG, CYFRA21-1, HGFR, CD147 0,7685547

На основе их соответствующих значений AUC были отобраны наилучшие модели. В табл. 10 и 10-2 приведены наилучшие результаты для CRC. В табл. 11 и 11-2 приведены наилучшие результаты для AA. Включены показатели для лучших комбинаций белков, включая площадь под кривой ROC (AUC), чувствительность (Sens.), специфичность (Spec.), а также положительные (PPV) и отрицательные (NPV) прогностические значения, вычисленные в точке отсечения ROC-кривой с использованием оптимального индекса Юдена.

Таблица 10 CRC против CTL Комбинация биомаркеров, поддерживающая Flt3L+CYFRA21-1 AUC (95%CI) Чувствительность Специфичность PPV NPV Flt3L, CYFRA21-1 0,865 (0,779,0,952) 0,625 0,969 0,952 0,721 Flt3L, CYFRA21-1, AREG 0,899 (0,821,0,978) 0,781 0,938 0,926 0,811 Flt3L, CYFRA21-1, AREG, ErbB4 0,931 (0,861,1) 0,875 0,938 0,933 0,882 Flt3L, CYFRA21-1, AREG, CLEC2C 0,915 (0,848,0,982) 0,844 0,844 0,844 0,844

Таблица 10-2 CRC против CTL Комбинация биомаркеров, поддерживающая AREG+CYFRA21-1 AUC (95%CI) Чувствительность Специфичность PPV NPV AREG, CYFRA21-1 0,878 (0,789,0,966) 0,875 0,844 0,848 0,871 AREG, CLEC2C 0,835 (0,729,0,941) 0,906 0,812 0,829 0,897 AREG, HGFR 0,763 (0,643,0,883) 0,656 0,812 0,778 0,703 AREG, CD147 0,842 (0,734,0,95) 0,844 0,844 0,844 0,844 AREG, CYFRA21-1, Flt3L 0,899 (0,821,0,978) 0,781 0,938 0,926 0,811 AREG, CYFRA21-1, CLEC2C 0,896 (0,814,0,977) 0,875 0,844 0,848 0,871 AREG, CYFRA21-1, ErbB4 0,896 (0,812,0,979) 0,875 0,844 0,848 0,871 AREG, CYFRA21-1, FasL 0,893 (0,81,0,976) 0,903 0,812 0,824 0,897 AREG, CYFRA21-1, CD147 0,886 (0,797,0,975) 0,875 0,844 0,848 0,871 AREG, CYFRA21-1, HGFR 0,876 (0,787,0,965) 0,875 0,844 0,848 0,871 AREG, CD147, HGFR 0,843 (0,735,0,951) 0,844 0,844 0,844 0,844 AREG, CYFRA21-1, ErbB4, Flt3L 0,931 (0,861,1) 0,875 0,938 0,933 0,882 AREG, CYFRA21-1, Flt3L, CLEC2C 0,915 (0,848,0,982) 0,844 0,844 0,844 0,844 AREG, CYFRA21-1, CD147, HGFR 0,888 (0,801,0,975) 0,875 0,844 0,848 0,871

Таблица 11 AA против CTL Комбинация биомаркеров, поддерживающая Flt3L+CYFRA21-1 AUC (95%CI) Чувствительность Специфичность PPV NPV Flt3L, CYFRA21-1 0,606 (0,466,0,747) 0,906 0,312 0,569 0,769 Flt3L, CYFRA21-1, AREG 0,72 (0,591,0,848) 0,812 0,625 0,684 0,769 Flt3L, CYFRA21-1, AREG, ErbB4 0,707 (0,578,0,836) 0,656 0,75 0,724 0,686 Flt3L, CYFRA21-1, AREG, CLEC2C 0,727 (0,6,0,853) 0,812 0,625 0,684 0,769

Таблица 11-2 AA против CTL Комбинация биомаркеров, поддерживающая AREG+CYFRA21-1 AUC (95%CI) Чувствительность Специфичность PPV NPV AREG, CYFRA21-1 0,722 (0,594,0,85) 0,844 0,625 0,692 0,8 AREG, CLEC2C 0,738 (0,613,0,864) 0,781 0,688 0,714 0,759 AREG, HGFR 0,746 (0,621,0,871) 0,531 0,938 0,895 0,667 AREG, CD147 0,755 (0,633,0,877) 0,656 0,844 0,808 0,711 AREG, CYFRA21-1, Flt3L 0,72 (0,591,0,848) 0,812 0,625 0,684 0,769 AREG, CYFRA21-1, CLEC2C 0,728 (0,601,0,854) 0,812 0,625 0,684 0,769 AREG, CYFRA21-1, ErbB4 0,71 (0,582,0,838) 0,656 0,75 0,724 0,686 AREG, CYFRA21-1, FasL 0,711 (0,581,0,84) 0,774 0,625 0,667 0,741 AREG, CYFRA21-1, CD147 0,762 (0,642,0,882) 0,844 0,656 0,711 0,808 AREG, CYFRA21-1, HGFR 0,761 (0,634,0,887) 0,75 0,75 0,75 0,75 AREG, CD147, HGFR 0,754 (0,632,0,876) 0,562 0,906 0,857 0,674 AREG, CYFRA21-1, Flt3L, ErbB4, 0,707 (0,578,0,836) 0,656 0,75 0,724 0,686 AREG, CYFRA21-1, Flt3L, CLEC2C 0,727 (0,6,0,853) 0,812 0,625 0,684 0,769 AREG, CYFRA21-1, CD147, HGFR 0,769 (0,65,0,888) 0,781 0,719 0,735 0,767

Наконец, табл. 12 и 12-2 были разработаны, чтобы показать перекрытие наиболее важных сигнатур, заявленных в настоящем изобретении. Ясно показано, что все наилучшие сигнатуры включают [Flt3L и CYFRA21-1] и [AREG и CYFRA21-1].

Таблица 12 AREG CLEC2C CYFRA21-1 Flt3L ErbB4 CRC против CTL AA против CTL X X X X 0,931 0,707 X X X X 0,915 0,727 X X X 0,899 0,720 X X 0,865 0,606

Таблица 12-2 CD147 FasL CLEC2C AREG CYFRA21-1 Flt3L ErbB4 HGFR CRC AA X X X X 0,931 0,707 X X X X 0,915 0,727 X X X 0,899 0,720 X X X 0,896 0,728 X X X 0,896 0,710 X X X 0,893 0,711 X X X X 0,888 0,769 X X X 0,886 0,762 X X 0,878 0,722 X X X 0,876 0,761 X X X 0,843 0,754 X X 0,842 0,755 X X 0,835 0,738 X X 0,763 0,746

Предложенная группа изобретений относится к медицине, а именно к онкологии. Предложены способы диагностики in vitro колоректального рака или его предраковой стадии. Предложено применение комбинаций Flt3L и CYFRA21-1, или Flt3L и CYFRA21-1 и AREG, или Flt3L и CYFRA21-1 и AREG и ErbB4, или Flt3L и CYFRA21-1 и AREG и CLEC2C in vitro в биологическом образце, полученном от пациента, для диагностики колоректального рака или его предраковой стадии и соответствующий набор элементов и его применение для диагностики колоректального рака или его предраковой стадии. Предложенная группа изобретений обеспечивает высокую чувствительность и специфичность диагностики колоректального рака или его предраковой стадии за счет выявления комбинации Flt3L и CYFRA21-1, или Flt3L и CYFRA21-1 и AREG, или Flt3L и CYFRA21-1 и AREG и ErbB4, или Flt3L и CYFRA21-1 и AREG и CLEC2C в биологическом образце, полученном от субъекта. 6 н. и 3 з.п. ф-лы, 8 ил., 12 табл., 2 пр.

1. Способ диагностики in vitro колоректального рака или его предраковой стадии, который включает: a) измерение уровня концентрации комбинации Flt3L и CYFRA21-1 в биологическом образце, полученном от субъекта, и b) где, если обнаружено отклонение или изменение уровня концентрации, по меньшей мере, комбинации Flt3L и CYFRA21-1 по сравнению с референсным уровнем концентрации, измеренным у здоровых контрольных субъектов, то это указывает на то, что субъект страдает колоректальным раком или предраковой стадией.

2. Способ по п. 1, где предраковая стадия колоректального рака представляет собой прогрессирующую колоректальную аденому.

3. Способ диагностики in vitro колоректального рака или его предраковой стадии, который включает: a) измерение уровня концентрации, по меньшей мере, комбинации Flt3L и CYFRA21-1 и AREG, или комбинации Flt3L и CYFRA21-1 и AREG и ErbB4, или комбинации Flt3L и CYFRA21-1 и AREG и CLEC2C в биологическом образце, полученном от субъекта, и b) где, если обнаружено отклонение или изменение уровня концентрации, по меньшей мере, одной комбинации, указанной на стадии а), по сравнению с референсным уровнем концентрации, измеренным у здоровых контрольных субъектов, то это указывает на то, что субъект страдает колоректальным раком или предраковой стадией.

4. Способ по п. 3, где предраковая стадия колоректального рака представляет собой прогрессирующую колоректальную аденому.

5. Применение комбинации Flt3L и CYFRA21-1 in vitro в биологическом образце, полученном от пациента, для диагностики колоректального рака или его предраковой стадии.

6. Применение in vitro комбинации Flt3L и CYFRA21-1 и AREG, или Flt3L и CYFRA21-1 и AREG и ErbB4, или Flt3L и CYFRA21-1 и AREG и CLEC2C в биологическом образце, полученном от пациента, для диагностики колоректального рака или его предраковой стадии.

7. Набор элементов для диагностики колоректального рака или его предраковой стадии, содержащий реагенты для определения уровня концентрации, по меньшей мере, комбинации, выбранной из списка: Flt3L и CYFRA21-1, или Flt3L и CYFRA21-1 и AREG, или Flt3L и CYFRA21-1 и AREG и ErbB4, или Flt3L и CYFRA21-1 и AREG и CLEC2C.

8. Применение набора по п. 7 для диагностики колоректального рака или его предраковой стадии.

9. Применение по п. 8, где предраковая стадия колоректального рака представляет собой прогрессирующую колоректальную аденому.