УЛУЧШЕННЫЙ СПОСОБ СКРИНИНГА, ДИАГНОСТИКИ И/ИЛИ МОНИТОРИНГА КОЛОРЕКТАЛЬНОЙ НЕОПЛАЗИИ НА ПОЗДНЕЙ СТАДИИ, АДЕНОМЫ НА ПОЗДНЕЙ СТАДИИ И/ИЛИ КОЛОРЕКТАЛЬНОГО РАКА Российский патент 2025 года по МПК C12Q1/6883 C12Q1/6886 C12Q1/689 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к области диагностики злокачественных новообразований. В частности, оно относится к улучшенному способу скрининга, диагностики и/или мониторинга колоректальной неоплазии на поздней стадии (AN), аденомы на поздней стадии (AA) и/или колоректального рака (CRC), где AN включает CRC и AA. В частности, указанный способ обеспечивает повышение специфичности из-за снижения ложноположительных результатов анализа кала на скрытую кровь (FOBT) с использованием сигнатуры на основе бактериальных маркеров. Изобретение дополнительно относится к применению указанного способа в выборе индивидуумов для осуществления поискового исследования (например, колоноскопии) или лечения посредством противоопухолевой терапии.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

CRC является третьим по частоте злокачественным новообразованием у мужчин и вторым у женщин по всему миру и основной причиной смертности от злокачественных новообразований (Estimated Cancer Incidence, Mortality and Prevalence Worldwide in 2012, http://globocan.iarc.fr/Pages/fact_sheets_population.aspx.). Он поражает 6% индивидуумов до 75 лет, при этом его частота гораздо выше развитых странах, чем в развивающихся странах (Wilson, 2005). Хотя злокачественные новообразования демонстрируют выраженный наследственный компонент, большинство случаев CRC являются спорадическими, и их развитие является медленным (Brenner et al., 2014). У большинства пациентов отсутствует симптоматика до достижения заболеванием поздней стадии. Показано, что регулярный скрининг кишечника на злокачественные новообразования снижает риск гибели от CRC на 26%, если используют анализ кала, и до 50%, если используют сигмоидоскопию гибким эндоскопом (Zauber, 2015; Elmunzer et al., 2012). Однако программы скрининга CRC воплощены лишь в нескольких странах.

В руководствах рекомендуют рутинный скрининг CRC у взрослых без симптомов в возрасте 50 лет (Rex et al., 2017). Существующие программы скрининга основаны на двух стратегиях: инвазивные способы на основе эндоскопических исследований и неинвазивные способы на основе анализов кала (Quintero et al., 2012). Существуют разные эндоскопические способы для скрининга CRC, такие как сигмоидоскопия гибким эндоскопом и колоноскопия. Основным преимуществом колоноскопии является то, что она позволяет непосредственно визуализировать весь толстый кишечник, что позволяет осуществлять точную диагностику и, таким образом, профилактику CRC посредством ранней детекции предраковых очагов (Young & Womeldorph, 2013). Несмотря на это, для этого способа необходима подготовка кишечника и седация, есть риск перфорации кишечника и других нежелательных эффектов, и он является времязатратным и дорогостоящим (Rutter et al., 2012; Sieg et al., 2001). Сигмоидоскопия гибким эндоскопом является альтернативным подходом, позволяющим непосредственно визуализировать дистальные отделы толстого кишечника, т.е. прямую, сигмовидную и нисходящую ободочную кишку. Этот способ позволяет избегать седации и снижает риск перфорации кишечника (Gatto et al., 2003). Анализы кала становятся предпочтительным способом скрининга CRC в большинстве стран благодаря своей неинвазивности и меньшей стоимости по сравнению с эндоскопическими способами. Индивидуумов с положительным результатом любого альтернативного анализа кала, как правило, подвергают колоноскопии для точной диагностики. Таким образом, неинвазивные анализы зачастую используют в качестве предварительной стадии скрининга.

Одним из анализов кала, используемых в программах скрининга, является анализ кала на скрытую кровь, в котором используют способы гваяковой пробы (гваяковая проба на скрытую кровь, gFOBT), основанные на химической реакции окисления между гемом и альфа-гваяковой кислотой. Основным недостатком этого типа анализов является необходимость предписанной диеты во избежание ложноположительных результатов, которые могут возникать из-за потребления конкретных продуктов питания, алкоголя или нестероидных противовоспалительных лекарственных средств (Sanford, 2009). Несмотря на свою неинвазивность, показано, что эти способы имеют низкую чувствительность у CRC (25-38%) и предраковым очагам (16-31%) (Stracci, 2014). Для преодоления низкой чувствительности gFOBT разработан иммунохимический тест на скрытую кровь в кале (FIT). Этот тест является специфическим для гемоглобина крови человека, и для него не требуются пищевые ограничения. В нескольких исследованиях показана более высокая чувствительность скрининга FIT по сравнению с gFOBT (Brenner & Tao, 2013; Shapiro et al., 2017; Mousavinezhad et al, 2016; Goede et al., 2017). Хотя общая чувствительность FIT для CRC составляет приблизительно 61-91%, а для аденом на поздней стадии - 27-67% (Stracci et al., 2014), эти способы все равно имеют высокую долю ложноположительных результатов.

Недавно показано, что бактериальные сообщества в слизистой оболочке кишечника пациентов с CRC отличаются от сообществ у здоровых индивидуумов (Borges-Canha et al., 2015; Mira-Pascual et al., 2014). Результаты позволяют предполагать, что микробиота кишечника может играть важную роль в патогенезе CRC (Sobhani et al., 2011; Jun et al., 2010). К настоящему времени описано два возможных механизма, посредством которых микробиота кишечника может индуцировать образование опухоли. С одной стороны, микробиота кишечника может способствовать хроническому воспалению, которое, в свою очередь, приводит к образованию опухоли (Kostic et al., 2013; Zackular et al., 2014). С другой стороны, доказано, что некоторые пищевые компоненты, метаболизируемые микробиотой кишечника, такие как красное мясо, приводят к продукции канцерогенных соединений (Joshi et al., 2015). Кроме того, недавно проведен ряд исследований для определения того, существует ли CRC-специфический дисбиоз или любой конкретный вид, который может быть ассоциирован с развитием CRC (Dulal & Keku, 2014; Zeller et al., 2014; Marchesi et al., 2011).

В 2012 году в предварительном, проспективном исследовании, проведенном авторами настоящего изобретения на 60 индивидуумах (41 пациент с CRC и 19 пациентов с нормальной колоноскопией), определен бактериальный кластер в биоптатах слизистой оболочки, преобладание которого коррелировало с риском CRC (Mas de Xaxars Rivero, 2012). Из 55 проанализированных филотипов, для 6 наблюдали значимо более высокие частоты у пациентов с CRC, чем у контрольных индивидуумов. Пять из них имели сходство с последовательностями некультивируемых бактерий, выделенных из желудочно-кишечного тракта человека или фекалий человека, и один имел 97% сходства с Parabacteroides merdae. В отличие от этого, было два филотипа, B34 (99% сходства с Clostridium nexile) и B35 (97% сходства с Roseburia faecalis), больше преобладающих у здоровых индивидуумов, чем у пациентов CRC.

Затем авторы настоящего изобретения сконструировали системы для количественной полимеразной цепной реакции (qPCR), специфически нацеленные на эти бактериальные маркеры (Mas de Xaxars Rivero, 2012). Бактериальные сигнатуры позднее тестировали на образцах кала (7 от здоровых контролей и 9 пациентов с CRC), осуществляя поиск относительных количеств для проверки того, какие из них подходят для использования в качестве неинвазивного инструмента для скрининга CRC (WO 2015/132273). В ретроспективном клиническом исследовании, включающем 46 пациентов Hospital Universitari de Girona Dr. Josep Trueta (Girona, Spain), подтверждена пригодность некоторых бактериальных сигнатур в качестве маркеров CRC (WO 2015/132273).

Несмотря на недавний прогресс, все еще сохраняется потребность в новых инструментах для ранней детекции колоректальной неоплазии на поздней стадии посредством стратегий популяционного скрининга и наблюдения для снижения смертности от CRC. Идеальный способ должен быть неинвазивным, экономичным, воспроизводимым и таким, с помощью которого можно определять предраковые очаги с высоким риском развития опухоли, и имеющим высокие значения чувствительности и специфичности.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к новому неинвазивному анализу для скрининга, диагностики и/или мониторинга AA, CRC и/или AN на основе новой бактериальной сигнатуры, дополняющему анализ кала на скрытую кровь (например, FIT), и с помощью которого можно снижать долю ассоциированных с FOBT ложноположительных результатов и, таким образом, повышать его специфичность и прогностическую ценность положительного результата (PPV), в то же время сохраняя схожие уровни чувствительности.

Первый аспект изобретения относится к способу повышения специфичности или снижения доли ложноположительных результатов анализа кала на скрытую кровь (FOBT) для скрининга, диагностики и/или мониторинга колоректальной неоплазии на поздней стадии (AN), аденомы на поздней стадии (AA) и/или колоректального рака (CRC) у индивидуума, где указанный способ включает:

a) необязательно, осуществление FOBT на образце кала, выделенном из указанного индивидуума, где указанный FOBT включает определение наличия скрытой крови в указанном образце кала; и

b) количественный анализ в кишечном образце (предпочтительно, образце кала), выделенном из указанного индивидуума, по меньшей мере одного из следующих бактериальных маркеров или любой их комбинации:

- Gemella morbillorum (GMLL);

- Peptostreptococcus stomatis (PTST) и

- Bacteroides fragilis (BCTF).

В связанном аспекте изобретение относится к способу скрининга, диагностики и/или мониторинга AN, AA и/или CRC у индивидуума, включающему:

a) необязательно, осуществление FOBT на образце кала, выделенном из указанного индивидуума, где указанный FOBT включает определение наличия скрытой крови в указанном образце кала;

b) количественный анализ в кишечном образце (предпочтительно, образце кала), выделенном из указанного индивидуума, по меньшей мере одного из следующих бактериальных маркеров или любой их комбинации:

- Gemella morbillorum (GMLL);

- Peptostreptococcus stomatis (PTST) и

- Bacteroides fragilis (BCTF).

В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения индивидуума, имеющего AN, AA и/или CRC, где указанный индивидуум выбран способом скрининга, диагностики и/или мониторинга по другим аспектам изобретения, и где указанный способ дополнительно включает введение индивидууму противоопухолевого терапевтического средства.

В связанном аспекте настоящее изобретение также относится к любым способам, описанным в других аспектах, дополнительно включающим стадию введения указанному пациенту терапевтически эффективного количества противоопухолевого терапевтического средства.

В другом аспекте изобретение относится к противоопухолевому терапевтическому средству для применения в способе лечения пациента со злокачественным новообразованием, где указанный пациент со злокачественным новообразованием выбран способом скрининга, диагностики и/или мониторинга по другим аспектам изобретения.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение также относится к способу выбора индивидуума для осуществления поискового исследования, выбранного из группы, состоящей из колоноскопии, сигмоидоскопии гибким эндоскопом, ирригоскопии с двойным контрастированием и компьютерной (КТ) колонографии, предпочтительно, для осуществления колоноскопии, где указанный индивидуум выбран способом скрининга, диагностики или мониторинга по другим аспектам изобретения.

В еще одном дополнительном аспекте изобретение относится к способу осуществления поискового исследования в отношении индивидуума, где указанный индивидуум выбран способом скрининга, диагностики или мониторинга по другим аспектам изобретения, где указанный способ дополнительно включает осуществление поискового исследования в отношении индивидуума, где исследование выбрано из группы, состоящей из колоноскопии, сигмоидоскопии гибким эндоскопом, ирригоскопии с двойным контрастированием и компьютерной (КТ) колонографии, предпочтительно, колоноскопии.

В другом аспекте изобретение относится к набору, подходящему для количественного анализа любого из GMLL, PTST, BCTF или BCTT, где указанный набор содержит один или более из следующих реагентов:

i. олигонуклеотида, специфического для генома GMLL, предпочтительно - олигонуклеотида, специфического для SEQ ID NO: 1;

ii. олигонуклеотида, специфического для генома PTST, предпочтительно - олигонуклеотида, специфического для SEQ ID NO: 2;

iii. олигонуклеотида, специфического для генома BCTF, предпочтительно - олигонуклеотида, специфического для SEQ ID NO: 3;

iv. олигонуклеотида, специфического для генома BCTT, предпочтительно - олигонуклеотида, специфического для SEQ ID NO: 4; и

v. необязательно, олигонуклеотида, подходящего для количественного анализа эубактерий, как определено в настоящем описании выше.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение также относится к набору, представленному в настоящем описании, для применения в способе скрининга, диагностики и/или мониторинга AN, AA и/или CRC, как представлено в настоящем описании.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг. 1: Относительный избыток процентной доли анализируемых биологических маркеров (B10 (лучшее совпадение в BLAST для Faecalibacterium prausnitzii, B46 (лучшее совпадение в BLAST для Faecalibacterium prausnitzii, Subdoligranulum variabil), B48 (лучшее совпадение в BLAST для Ruminococcus, Roseburia, Coprococcus), Gemella morbillorum (GMLL), Peptostreptococcus stomatis (PTST), Bacteroides fragilis (BCTF), Collinsella intestinalis (CINT), Bacteroides thetaiotaomicron (BCTT) и Roseburia intestinalis (RSBI)); у индивидуумов с нормальной колоноскопией (NC), аденомой на ранней стадии (NAA), аденомой на поздней стадии (AA) и колоректальным раком (CRC).

Фиг. 2: Сравнение относительного количества биомаркеров при разной диагностике. NC, нормальная колоноскопии; неоплазия, аденома на ранней стадии+аденома на поздней стадии+колоректальный рак; неоплазия на поздней стадии, аденома на поздней стадии+колоректальный рак; CRC, колоректальный рак. Уровень значимости: * если значение p<0,05, ** если значение p<0,01 и *** если значение p<0,001.

Фиг. 3: Относительный избыток процентной доли анализируемых биологических маркеров (бутират-продуцирующие виды: B10, B46, B48, и Roseburia intestinalis (RSBI); условно-патогенные микроорганизмы: Gemella morbillorum (GMLL), Peptostreptococcus stomatis (PTST) и Bacteroides fragilis (BCTF); продуценты H₂ и O₂: Collinsella intestinalis (CINT); и сахаролитические бактерии: Bacteroides thetaiotaomicron (BCTT)) у индивидуумов с нормальной колоноскопией (NC), аденомой на ранней стадии (NAA), аденомой на поздней стадии (AA) и колоректальным раком (CRC).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Определения

Термин "индивидуум" используют в настоящем описании для обозначения всех животных, классифицируемых как млекопитающие, и он включает, в качестве неограничивающих примеров, домашних и сельскохозяйственных животных, приматов и людей, например, людей, не являющихся человеком приматов, коров, лошадей, свиней, овец, коз, собак, кошек или грызунов. Предпочтительно, индивидуум является мужчиной или женщиной любого возраста или расы.

В рамках изобретения термин "чувствительность" относится к доле индивидуумов, имеющих целевое состояние (референсный положительный стандарт) и дающих положительные результаты анализа (TP/(TP+FN)). Это показывает, насколько хорош анализ для детекции заболевания. Чувствительность ("чувст.") может находиться в диапазоне 0 (0%)<чувст.<1 (100%), и в идеале количество ложноотрицательных результатов должно быть равно нулю или приблизительно нулю, а чувствительность должна быть равна единице (100%) или приблизительно единице (100%).

В рамках изобретения термин "специфичности" в отношении анализа относится к доле индивидуумов без целевого состояния (референсный отрицательный стандарт) и дающих отрицательные результаты анализа (TN/(TN+FP)). Это показывает, насколько хорош анализ для идентификации нормального (отрицательного) состояния. Специфичность ("специф.") может находиться в диапазоне 0 (0%)<специф.<1 (100%), и в идеале количество ложноположительных результатов должно быть равно нулю или приблизительно нулю, а специфичность должна быть равна единице (100%) или приблизительно единице (100%).

В рамках изобретения термин "точность" относится к доле истинных результатов - истинно положительных или истинно отрицательных - в популяции. Она является мерой степени достоверности скрининга состояния, т.е. того, насколько точным является определение и исключение указанного состояния (TN+TP)/(TN+TP+FN+FP). Точность ("точн.") может находиться в диапазоне 0 (0%)<точн.<1 (100%) и в идеале количество ложноположительных результатов и ложноотрицательных результатов должно быть равно нулю или приблизительно нулю, и точность должна быть равна единице (100%) или приблизительно единице (100%).

В рамках изобретения термин "кривые операционных характеристик приемника (ROC)" относится к графику, на котором показано функционирование системы бинарного классификатора, т.к. его порог дискриминации варьируется. Кривую получают, строя график доли истинно положительных результатов относительно доли ложноположительных результатов в условиях различных пороговых значений. Доля истинно положительных результатов также известна как чувствительность. Долю ложноположительных результатов вычисляют как 1-специфичность. Таким образом, кривая ROC представляет собой способ графического отображения доли истинно положительных результатов относительно доли ложноположительных результатов (чувствительность относительно (1-специфичность)) в диапазоне пороговых значений и выбора оптимального порогового значения для клинического использования. Точность, выраженная как площадь под кривой ROC (AUC), представляет собой полезный параметр для сравнения характеристик анализа. AUC, приближающаяся к 1, свидетельствует о том, что анализ является высокочувствительным, а также высокоспецифическим, в то время как AUC, приближающаяся к 0,5, свидетельствует о том, что анализ не является ни чувствительным, ни специфическим. В основном, анализ считают подходящим дискриминатором, если AUC составляет от 0,6 до 0,75, хорошим дискриминатором, если AUC составляет от 0,75 до 0,9, и исключительным дискриминатором, если AUC составляет от 0,9 до 1. Более подробно см., например, в Zweig MH and Campbell G, Clinical Chemistry 1993; 39:561-577 или Greiner et al. Preventive Veterinary Medicine 2000; 45:23-41.

В рамках изобретения термин "зонд" относится к синтетическим или биологически продуцируемым нуклеиновым кислотам длиной от 10 до 285 пар оснований, содержащим специфические нуклеотидные последовательности, делающие возможной специфическую и преференциальную гибридизацию в заранее определенных условиях с целевыми последовательностями нуклеиновой кислоты, и необязательно содержит остаток для детекции или для усиления характеристик анализа. По меньшей мере десять нуклеотидов, как правило, необходимо для статистического достижения специфичности и для образования стабильных продуктов гибридизации, и по большей мере 285 нуклеотидов, как правило, представляют собой верхний предел длины, при которой параметры реакции легко можно корректировать для определения ошибочно спаренных последовательностей и преференциальной гибридизации. Зонды, необязательно, могут содержать некоторые компоненты, вносящие вклад в правильное или оптимальное функционирование в некоторых условиях анализа. Например, зонды можно модифицировать для улучшения их резистентности к деградации нуклеазами (например, посредством кэпирования концов), возможности прикрепления детекторных лигандов (например, флуоресцеина), возможности прикрепления лигандов для очистки или обогащения (например, биотина) или облегчения их захвата на твердой подложке (например, поли-дезоксиаденозиновые "хвосты").

В рамках изобретения термин "праймеры" относится к олигонуклеотидам, которые можно использовать в способе амплификации, таком как полимеразная цепная реакция ("ПЦР"), для амплификации нуклеотидной последовательности. Праймеры конструируют с учетом полинуклеотидной последовательности конкретной целевой последовательности, например, одной специфической последовательности рДНК 16S.

В рамках изобретения термин "специфический" в отношении нуклеотидной последовательности означает, что нуклеотидная последовательность будет гибридизоваться/амплифицировать заранее определенную последовательность-мишень и не будет, по существу, гибридизоваться/амплифицировать нецелевую последовательность в условиях анализа, как правило, используют строгие условия.

В рамках изобретения термин "гибридизация" относится к способу, в котором в заранее определенных условиях реакции две частично или полностью комплементарные цепи нуклеиновой кислоты могут сближаться антипараллельно с образованием двухцепочечной нуклеиновой кислоты со специфическими и стабильными водородными связями, следуя определенным правилам, относящимся к тому, какие основания нуклеиновых кислот могут спариваться друг с другом.

Термин "существенная гибридизация" означает, что наблюдаемая степень гибридизации будет такой, что специалист, оценивающий результаты, может считать их положительными в контексте данных о гибридизации в положительных и отрицательных контролях. Данные, которые считают "фоновым шумом", не являются существенной гибридизацией.

Термин "строгие условия гибридизации" означает температуру приблизительно от 35°C до 65°C в солевом растворе приблизительно 0,9 моль NaCl. Строгость также можно регулировать с помощью таких параметров реакции, как концентрация и тип ионов, присутствующих в гибридизационном растворе, типы и концентрации денатурирующих средств и температура гибридизации. Как правило, если условия гибридизации становятся более строгими, более длинные зонды являются предпочтительными, если необходимо образование стабильных гибридов. Как правило, строгость условий, в которых будет проходить гибридизация, будет определять некоторые характеристики предпочтительных зондов, которые будут использовать.

В рамках изобретения термин "терапевтически эффективное количество" относится к количеству, являющемуся эффективным после введения однократной или многократных доз индивидууму (такому как пациент-человек) при профилактическом или терапевтическом лечении заболевания, нарушения или патологического состояния.

В рамках изобретения термин "противоопухолевая терапия" относится к терапии, которую можно использовать в лечении злокачественных новообразований. Неограничивающие примеры противоопухолевой терапии включают хирургическое вмешательство, химиотерапевтические средства, ингибирующие рост средства, цитотоксические средства, противогормональные средства, средства, используемые в лучевой терапии, антиангиогенные средства, апоптотические средства, антитубулиновые средства и другие средства для лечения злокачественных новообразований, такие как антитела против HER-2 (например, Herceptin®), антитела против CD20, антагонист рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) (например, ингибитор тирозинкиназ), ингибитор HER1/EGFR (например, эрлотиниб (Tarceva®)), ингибиторы фактора роста тромбоцитов (например, Gleevec™ (иматиниба мезилат)), ингибитор COX-2 (например, целекоксиб), интерфероны, цитокины, антагонисты (например, нейтрализующие антитела), связывающиеся с одной или более из следующих мишеней: ErbB2, ErbB3, ErbB4, PDGFR-бета, BlyS, APRIL, BCMA или рецептором VEGF, TRAIL/Apo2, и другие биоактивные и органические химические средства и т.д. Их комбинации также включены в настоящее изобретение.

В рамках изобретения термин "цитотоксическое средство" относится к веществу, ингибирующему или предотвращающему функционирование клеток и/или вызывающему разрушение клеток. Термин предназначен для включения радиоактивных изотопов (например, At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³² и радиоактивные изотопы Lu), химиотерапевтических средств и токсинов, таких как низкомолекулярные токсины или ферментативно активные токсины бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения, включая их фрагменты и/или варианты.

В рамках изобретения термин "химиотерапевтическое средство" относится к химическому соединению, которое можно использовать в лечении злокачественных новообразований. Примеры химиотерапевтических средств включают алкилирующие средства, такие как тиотепа и циклофосфамид CYTOXAN®; алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбоквон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метилмеламины, включая алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилоломеламин; ацетогенины (в частности, буллатацин и буллатацинон); камптотецин (включая синтетический аналог топотекана); бриостатин; каллистатин; CC-1065 (включая его синтетические аналоги адозелесин, карзелесин и бизелесин); криптофицины (в частности, криптофицин 1 и криптофицин 8); доластатин; дуокармицин (включая синтетические аналоги, KW-2189 и CB1-TM1); элеутеробин; панкратистатин; саркодиктин; спонгистатин; азотистые иприты, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, холофосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлоретамин, гидрохлорид мехлоретамина оксида, мелфалан, новэмбихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урацилиприт; нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин и ранимнустин; антибиотики, такие как енединовые антибиотики (например, калихимицин, в частности, калихимицин гамма 1 и калихимицин омега I1; динемицин, включая динемицин A; бисфосфонаты, такие как клодронат; эсперамицин; а также неокарзиносиатин хромофор и родственные хромопротеиновые хромофоры енединовых антибиотиков), аклациномизины, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, арабицин, карминомицин, карзинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, ADRIAMYCIN® доксорубицин (включая морфолино-доксорубицин, цианоморфолино-доксорубицин, 2-пирролино-доксорубицин и дезоксидоксорубицин), эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марселломицин, митомицины, такие как митомицин C, микофеноловая кислота, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, порфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат и 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги пурина, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; аналоги пиримидина, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидеоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин; андрогены, такие как калустерон, пропионат дромостанолона, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; ингибиторы коры надпочечников, такие как аминоглутетимид, митотан, трилостан; средства для восполнения фолиевой кислоты, такие как фолиниевая кислота; ацеглатон; альдофосфамид гликозид; аминолевулиновая кислота; энилурацил; амсакрин; бестрабуцил; бисантрен; эдатрексат; дефофамин; демеколцин; диазиквон; элфорнитин; ацетат эллиптиния; эпотилон; этоглуцид; нитрат галлия; гидроксимочевину; лентинан; лонидамин; майтанзиноиды, такие как майтанзин и ансамитоцины; митогуазон; митоксантрон; мопиданмол; нитраерин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; лосоксантрон; подофиллиновую кислоту; 2-этилгидразид; прокарбазин; полисахаридный комплекс PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR); разоксан; ризоксин; сизофиран; спирогерманий; тенуазоновую кислоту; триазиквон; 2,2',2"-трихлортриэтиламин; трихотецены (в частности, токсин T-2, верраккурин A, роридин A и ангуидин); уретан; виндезин; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гaцитозин; арабинозид ("Ara-C"); циклофосфамид; тиотепа; таксоиды, например, паклитаксел TAXOL®, ABRAXANE® без кремофора, состав наночастиц паклитаксела на основе альбумина, и доксетаксел TAXOTERE®; хлорамбуцил; гемцитабин GEMZAR®; 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платины, такие как цисплатин, оксалиплатин и карбоплатин; винбластин; платину; этопозид (VP-16); ифосфамид; митоксантрон; винкристин; винорелбин NAVELBINE®; новантрон; тенипозид; эдатрексат; дауномицин; аминоптерин; кселода; ибандронат; иринотекан (камптосар, CPT-11) (включая схему лечения иринотеканом с 5-FU и лейковорином); ингибитор топоизомераз RFS 2000; дифторметилорнитин (DMFO); ретиноиды, такие как ретиноевая кислота; капецитабин; комбретастатин; лейковорин (LV); оксалиплатин, включая, схему лечения оксалиплатина (FOLFOX); лапатиниб (Tykerb®); ингибиторы PKC-альфа, Raf, H-Ras, EGFR (например, эрлотиниб (Tarceva®)) и VEGF-A, снижающие пролиферацию клеток и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любых из указанных выше соединений.

В рамках изобретения термин "противогормональные средства" относится к средствам, регулирующим или ингибирующим действие гормонов на опухоли, таким как антиэстрогеновые средства и селективные модуляторы эстрогеновых рецепторов (SERM), включая, например, тамоксифен (включая тамоксифен NOLVADEX®), ралоксифен, дролоксифен, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY 117018, онапристон и торемифен фарестон; ингибиторы ароматазы, ингибирующие фермент ароматазу, регулирующую продукцию эстрогенов в надпочечниках, такие как, например, 4(5)-имидазолы, аминоглутетимид, мегестрол ацетат MEGASE®, экземестан АРОМАЗИН®, форместанин, фадрозол, ворозол RIVISOR®, летрозол FEMARA®, и анастрозол ARIMIDEX®; и антиандрогеновые средства, такие как флутамид, нилутамид, бикалутамид, лейпролид и гозерелин; а также троксацитабин (аналог нуклеозида цитозина 1,3-диоксолан); антисмысловые олигонуклеотиды, в частности, ингибирующие экспрессию генов в путях передачи сигнала, участвующих в аномальной пролиферации клеток, таких как, например, PKC-альфа, Ralf и H-Ras; рибозимы, такие как ингибитор экспрессии VEGF (например, рибозим ANGIOZYME®) и ингибитор экспрессии HER2; вакцины, такие как генотерапевтические вакцины, например, вакцина ALLOVECTIN®, вакцина LEUVECTIN® и вакцина VAXID®; rIL-2 PROLEUKIN®; ингибитор топоизомеразы 1 LURTOTECAN®; rmRH ABARELIX®; и их фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любых из указанных выше соединений.

Термин "цитокин" является общим термином для белков, высвобождаемых одной популяцией клеток, действующих на другие клетки в качестве межклеточных медиаторов. Примерами таких цитокинов являются лимфокины, монокины и общепринятые полипептидные гормоны. Цитокины включают гормоны роста, такие как гормон роста человека, N-метиониловый гормон роста человека и бычий гормон роста; паратиреоидный гормон; тироксин; инсулин; проинсулин; релаксин; прорелаксин; гликопротеиновые гормоны, такие как фолликулостимулирующий гормон (FSH), тиреотропный гормон (TSH) и лютеинизирующий гормон (LH); эпидермальный фактор роста; фактор роста гепатоцитов; фактор роста фибробластов; пролактин; плацентарный лактоген; фактор некроза опухоли-альфа и -бета; мюллерова ингибирующая субстанция; гонадотропин-ассоциированный пептид мыши; ингибин; активин; фактор роста эндотелия сосудов; интегрин; тромбопоэтин (TPO); факторы роста нервов, такие как NGF-альфа; фактор роста тромбоцитов; трансформирующие факторы роста (TGF), такие как TGF-альфа и TGF-бета; инсулиноподобный фактор роста-I и -II; эритропоэтин (EPO); остеоиндуктивные факторы; интерфероны, такие как интерферон-альфа, -бета и -гамма колониестимулирующие факторы (КСФ), такие как макрофагальный КСФ (М-КСФ); гранулоцитарно-макрофагальный КСФ (ГМ-КСФ); и гранулоцитарный КСФ (Г-КСФ); интерлейкины (ИЛ), такие как ИЛ-1, ИЛ-1 альфа, ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-8, ИЛ-9, ИЛ-10, ИЛ-11, ИЛ-12; фактор некроза опухоли, такой как ФНО альфа или ФНО бета; и другие полипептидные факторы включая LIF и лиганд kit (KL). В рамках изобретения термин "цитокин" включает белки из природных источников или культуры рекомбинантных клеток и биологически активные эквиваленты цитокинов с нативной последовательностью.

В рамках изобретения термин "ингибирующее рост средство" относится к соединению или композиции, ингибирующей рост клетки in vitro и/или in vivo. Таким образом, ингибирующее рост средство может являться средством, значимо снижающим процент клеток, находящихся в S-фазе. Примеры ингибирующих рост средств включают средства, блокирующие прохождение клеточного цикла (в иной точке, чем S-фаза), такие как средства, индуцирующие арест клеточного цикла в G1 и арест клеточного цикла в M-фазе. Классические блокаторы M-фазы включают алкалоиды барвинка (винкристин и винбластин), TAXOL® и ингибиторы топоизомеразы II, такие как доксорубицин, эпирубицин, даунорубицин, этопозид и блеомицин. Эти средства, приводящие к аресту G1, также действуют на арест S-фазы, например, ДНК-алкилирующие средства, такие как тамоксифен, преднизон, дакарбазин, мехлоретамин, цисплатин, метотрексат, 5-фторурацил и ara-C. Дополнительную информацию можно найти в The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" by Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), p. 13.

В рамках изобретения термин "лучевая терапия" относится к использованию направленных гамма-лучей или бета-лучей для индуцирования значительного повреждения клеток для ограничения их способности нормально функционировать или разрушения клеток. Следует понимать, что в этой области существует множество известных способов определения дозы и длительности лечения. Типичное лечение проводят за один раз, и типичные дозы находятся в диапазоне от 10 до 200 единиц (Грей) в сутки.

В рамках изобретения термин "заболевание кишечника" относится к заболеваниям или нарушениям, поражающим тонкий кишечник, толстый кишечник и/или прямую кишку.

Способы по изобретению

В первом аспекте настоящее изобретение относится к способу повышения специфичности или снижения доли ложноположительных результатов анализа кала на скрытую кровь (FOBT) для скрининга, диагностики и/или мониторинга колоректальной неоплазии на поздней стадии (AN), аденомы на поздней стадии (AA) и/или колоректального рака (CRC) у индивидуума, включающему:

a) необязательно, осуществление FOBT на образце кала, выделенном из указанного индивидуума, где указанный FOBT включает определение наличия скрытой крови в указанном образце кала; и

b) количественный анализ в кишечном образце (предпочтительно, образце кала), выделенном из указанного индивидуума, по меньшей мере одного из следующих бактериальных маркеров или любой их комбинации:

- Gemella morbillorum (GMLL);

- Peptostreptococcus stomatis (PTST) и

- Bacteroides fragilis (BCTF).

В связанном аспекте изобретение относится к способу скрининга, диагностики и/или мониторинга AN, AA и/или CRC у индивидуума, включающему:

a) необязательно, осуществление FOBT на образце кала, выделенном из указанного индивидуума, где указанный FOBT включает определение наличия скрытой крови в указанном образце кала;

b) количественный анализ в кишечном образце (предпочтительно, образце кала), выделенном из указанного индивидуума, по меньшей мере одного из следующих бактериальных маркеров или любой их комбинации:

- Gemella morbillorum (GMLL);

- Peptostreptococcus stomatis (PTST) и

- Bacteroides fragilis (BCTF).

В предпочтительных вариантах осуществления FOBT в a) и количественный анализ бактериальных маркеров в b) осуществляют на образце кала, предпочтительно, на том же образце кала.

Референсным штаммом GMLL является штамм Gemella morbillorum NCTC11323 (бактерии; фирмикуты; бациллы; Bacillales; семейство Bacillales XI. неопределенное положение; Gemella), и его геномная последовательность имеет регистрационный номер GenBank: LS483440.1. В конкретных вариантах осуществления для количественного анализа GMLL можно использовать олигонуклеотиды, специфические для SEQ ID NO: 1. SEQ ID NO: 1 соответствует регистрационному номеру GenBank: LS483440.1 ОБЛАСТЬ: 827110.827892.

Референсным штаммом PTST является штамм Peptostreptococcus stomatis DSM 17678 (бактерии; фирмикуты; Clostridia; Clostridiales; Peptostreptococcaceae; Peptostreptococcus), и его геномная последовательность имеет регистрационный номер GenBank: ADGQ01000060.1. В конкретных вариантах осуществления для количественного анализа PTST можно использовать олигонуклеотиды, специфические для SEQ ID NO: 2. SEQ ID NO: 2 соответствует регистрационному номеру GenBank: ADGQ01000060.1 ОБЛАСТЬ: комплементарная (142796.143362).

Референсным штаммом BCTF является штамм Bacteroides fragilis NCTC 9343 (бактерии; Bacteroidetes; Bacteroidia; Bacteroidales; Bacteroidaceae; Bacteroides), и его геномная последовательность имеет регистрационный номер GenBank: CR626927.1. В конкретных вариантах осуществления для количественного анализа BCTF можно использовать олигонуклеотиды, специфические для SEQ ID NO: 3. SEQ ID NO: 3 соответствует регистрационному номеру GenBank: CR626927.1 ОБЛАСТЬ: 417101.417817.

В предпочтительных вариантах осуществления эти специфические олигонуклеотиды являются любыми из олигонуклеотидов, перечисленных в таблице 3 для GMLL, PTST и BCTF, соответственно, и последовательности с по меньшей мере 80% идентичности в отношении любых из них.

Как показано в примере 3, обнаружено, что PTST сильно коррелирует с очагами неоплазии (аденома на ранней стадии+аденома на поздней стадии+CRC; p<0,001). Кроме того, каждый из GMLL, PTST и BCTF идентифицировали в качестве потенциальных биомаркеров для детекции очагов неоплазии на поздней стадии (AN) (p=0,006, p<0,001 и p=0,030, соответственно). Кроме того, обнаружено, что GMLL и PTST значимо больше преобладали у индивидуумов с CRC, чем у здоровых индивидуумов (p=0,004, и p<0,001, соответственно).

В рамках изобретения термин "колоректальный рак", "CRC" относится к злокачественному новообразованию, возникающуму в толстом кишечнике или прямой кишке. Эти злокачественные новообразования также можно раздельно обозначать как рак толстого кишечника или рак прямой кишки, в зависимости от их происхождения. Рак толстого кишечника и рак прямой кишки обладают множеством общих признаков. В соответствии с ACS, несколько типов злокачественных новообразований могут начинаться в толстом кишечнике или прямой кишке. Более 95% случаев колоректального рака представляют собой тип злокачественного новообразования, известный как аденокарциномы. Эти злокачественные новообразования возникают в клетках, образующих железы, продуцирующие слизь для смазывания внутренней поверхности толстого кишечника и прямой кишки. В толстом кишечнике и прямой кишке также могут возникать другие, менее распространенные типы опухолей. Они включают: карциноидные опухоли, стромальные опухоли ЖКТ (GIST), лимфомы и саркомы. В предпочтительном варианте осуществления указанный колоректальный рак является аденокарциномой.

Аденома представляет собой незлокачественный рост аномальных железистых клеток на внутренней выстилке органа, такого как толстый кишечник. Аденомы, соответствующие одной или более из следующих характеристик: диаметр 10 мм или более, с ворсинчатой архитектурой, дисплазия высокой степени или внутрислизистая карцинома, как правило, классифицируют как аденомы на поздней стадии (Quintero E., Castells A., et al., N Engl J Med. 2012, 366 (8): 697-706; Cubiella J. et al., Cancer Epidemiol Биомаркеры Prev. 2014, 23 (9): 1884-92; Muto T, Bussey HJR MB., Cancer 1975; 36: 2251-70).

В рамках изобретения термин "колоректальная неоплазия на поздней стадии (AN)" включает CRC и аденому на поздней стадии (AA). В соответствии с ACS, анализы, имеющие наибольшие шансы нахождения AA и CRC, являются предпочтительными. Когортные исследования, включающие пациентов с аденомой, позволяют предполагать, что с помощью полипэктомии можно предотвращать приблизительно 80% случаев колоректального рака (Citarda F, et al., Gut 2001, 48:812-5; Winawer SJ, et al., N Engl J Med 1993, 329:1977-81).

В рамках изобретения термин "диагностика" относится к попыткам определения и/или идентификации возможного заболевания у индивидуума, т.е. диагностическому способу, и к заключению, полученному этим способом, т.е. диагностическому заключению. В связи с этим, его также можно рассматривать как попытку классификации состояния индивидуума на отдельные и отличающиеся категории, позволяющие принимать решение о лечении и прогнозе с медицинской точки зрения. Следует понимать, что в предпочтительном варианте осуществления способ является способом, осуществляемым in vitro, т.е. не осуществляемым на практике на организме человека или животного. В частности, диагностика для определения пациентов с CRC, AA и/или AN может относиться к возможности идентификации и классификации пациентов с CRC, AA и/ или AN.

В конкретном варианте осуществления способ диагностики по изобретению осуществляют на индивидууме, как предполагают, имеющим CRC. В рамках изобретения термин "индивидуум, как предполагают, имеющий CRC" относится к индивидууму, имеющему один или более признаков или симптомов, которые могут свидетельствовать о CRC. Термин "индивидуум, как предполагают, имеющий CRC" дополнительно включает индивидуума, получившего предварительный диагноз, но для которого еще не проведен контрольный тест (например, колоноскопия).

Признаки или симптомы, которые могут свидетельствовать о CRC, включают, например, один или более из следующих: необъяснимая потеря веса, боль в области живота, необъяснимое ректальное кровотечение, железодефицитная анемия, изменения частоты и характера стула и наличие скрытой крови в кале (см., например, Jellema et al, BMJ 2010, 340: c1269 или Adelstein et al. BMC Gastroenterology 2011, 11:65). В иллюстративных целях в настоящем описании ниже приведены случаи, когда предполагают CRC, по текущему руководству NICE (NG12); https://www.nice.org.uk/guidance/ng12/chapter/1-Recommendations-organised-by-site-of-cancer#lower-gastrointestinal-tract-cancers:

- Направление ко врачу взрослых с подозрением (например, для посещения в пределах 2 недель) на колоректальный рак, если:

их возраст составляет 40 лет и более, они имеют необъяснимую потерю веса и боль в области живота, или

их возраст составляет 50 лет и более, они имеют необъяснимое ректальное кровотечение, или

их возраст составляет 60 и лет и более, они имеют:

железодефицитную анемию или

изменения частоты и характера стула, или

при анализах определяют скрытую кровь в их кале.

- Рассматривают направление ко врачу по подозрению (например, для посещения в пределах 2 недель) на колоректальный рак у взрослых с ректальным образованием или образованием в брюшной полости.

- Рассматривают направление ко врачу по подозрению (например, для посещения в пределах 2 недель) на колоректальный рак у взрослых возрастом 50 лет, имеющих ректальное кровотечение и любой из следующих необъяснимых симптомов или показателей:

боль в области живота

изменения частоты и характера стула

потеря веса

железодефицитная анемия.

- Предлагают анализ на скрытую кровь в кале для анализа на колоректальный рак у взрослых без ректального кровотечения, имеющих:

возраст 50 лет и более, имеющих необъяснимую:

боль в области живота или

потерю веса, или

возраст менее 60, имеющих:

изменения частоты и характера стула или

железодефицитную анемию, или

возраст 60 и более и имеющих анемию даже в отсутствие дефицита железа.

Способ по изобретению также можно использовать для дифференциальной диагностики CRC, аденомы на поздней стадии и/или неоплазии на поздней стадии относительно аденомы на ранней стадии.

Наиболее эффективной и экономичной мерой для снижения частоты и смертности от CRC являются анализы для скрининга и мониторинга риска CRC. Скрининговые анализы группируют как анализы, с помощью которых, главным образом, определяют рак на ранних стадиях, и анализы, с помощью которых можно определять рак на ранних стадиях, а также аденому на поздней стадии, таким образом, обеспечивая больший потенциал для профилактики посредством полипэктомии a (т.е. удаления полипов), см. руководства по скринингу и наблюдению American Cancer Society (ACS) 2008 года, Levin et al. (CA Cancer J Clinicians, 2008; 58 (3) 130-160). Разные руководства по скринингу можно использовать в отношении людей со средним риском и людей с повышенным или высоким риском (http://www.cancer.org/cancer/colonandrectumcancer/moreinformation/colonandrectumcancerearlydetection/colorectal-cancer-early-detection-acs-recommendations).

Термин "скрининг" в настоящем описании следует понимать как исследование или тестирование группы индивидуумов без симптомов, относящихся к общей популяции, или группы индивидуумов, имеющих один или более факторов риска (например, индивидуумов с промежуточным или высоким риском развития заболевания) с целью различения здоровых индивидуумов и индивидуумов, имеющих или, как предполагают, имеющих заболевание. Способ скрининга, как правило, используют для "ранней детекции" заболевания. Выражение "ранняя детекция" относится к детекции до появления клинических признаков.

Целью скрининга злокачественного новообразования является снижение смертности посредством ранней детекции и лечения, что, таким образом, позволяет снижать частоту заболевания на поздней стадии, как правило, имеющего более плохой прогноз. В связи с этим, с помощью существующего скрининга CRC можно достигать этой цели посредством детекции аденокарцином (предпочтительно, аденокарцином на ранней стадии) и детекции и удаления аденомы на поздней стадии. Таким образом, обнаружено, что способ скрининга по изобретению является мощным инструментом для снижения смертности, ассоциированной с CRC, посредством детекции CRC и/или неоплазии на поздней стадии.

Способ скрининга по изобретению можно осуществлять в отношении индивидуумов, у которых отсутствуют признаки и/или симптомы CRC (обозначаемых в настоящем описании как "индивидуумы без симптомов"). Его также можно осуществлять в отношении индивидуумов с индивидуальным или семейным анамнезом неоплазии толстого кишечника или других факторов риска, CRC как описано ниже, или без него.

В конкретном варианте осуществления способ скрининга по изобретению осуществляют в отношении индивидуумов с промежуточным риском CRC. Они, как правило, являются индивидуумами возрастом 50 лет и более с индивидуальным или семейным фоном CRC. Мужчин и женщин возрастом 50 и более со средним риском убеждают следовать тестам для скрининга колоректального рака (см. таблицу 2 из Levin et al., CA Cancer J Clinicians, 2008; 58 (3) 130-160, включенной, таким образом, в настоящее описание в качестве ссылки).

В другом варианте осуществления способ скрининга по изобретению осуществляют в отношении индивидуумов с повышенным и/или высоким риском. В соответствии с ACS (см. таблицу 3 из Levin et al., CA Cancer J Clinicians, 2008; 58 (3) 130-160, включенной, таким образом, в настоящее описание в качестве ссылки), индивидуумы с повышенным и высоким риском могут включать следующие:

Повышенный риск

- индивидуумы с полипами при предыдущей колоноскопии в анамнезе;

- индивидуумы с колоректальным раком; и

- индивидуумы с колоректальным раком или аденоматозными полипами в семейном анамнезе, включая:

i. CRC или аденоматозные полипы у родственника первой степени до достижения возраста 60 лет или у 2 или более родственников первой степени любого возраста; и/или

ii. CRC или аденоматозные полипы у родственника первой степени возрастом ≥60 лет или у 2 родственников второй степени с CRC.

Высокий риск

- индивидуумы с семейным аденоматозным полипозом (FAP), диагностированным посредством генетического тестирования, или предполагаемым FAP без генетического тестирования;

- индивидуумы с наследственным неполипозным раком толстого кишечника (HNPCC или синдромом Линча) или с повышенным риском HNPCC на основе семейного анализа без генетического тестирования; и

- индивидуумы с воспалительным заболеванием кишечника, таким как хронический язвенный колит или болезнь Крона.

Другой целью настоящего изобретения может являться предоставление диагностического инструмента. В частности, способы по изобретению можно использовать для скрининга и/или идентификации индивидуумов с предрасположенностью или повышенным риском развития CRC, например, посредством детекции наличия аденомы на поздней стадии.

В рамках изобретения термин "мониторинг" относится к определению развития заболевания и/или эффективности хирургического и/или терапевтического лечения, например, определению того, присутствует ли ремиссия заболевания или, наоборот, прогрессирование или рецидивирование заболевания. Одной из целей способа мониторинга по изобретению является ранняя детекция рецидивов. В конкретном варианте осуществления способ по изобретению предназначен для мониторинга индивидуумов, страдающих злокачественными новообразованиями, направленных на хирургическую резекцию, необязательно, в комбинации с адъювантной и/или неоадъювантной терапией.

В предпочтительных вариантах осуществления способы по изобретению предназначены для скрининга, диагностики и/или мониторинга AN, AA и/или CRC.

В рамках изобретения термин "образец" или "биологический образец" относится к биологическому материалу, выделенному из индивидуума. Биологический образец может содержать любой биологический материал, подходящий для детекции желаемого биомаркера, и клеточный и/или неклеточный материал из индивидуума. В предпочтительном варианте осуществления образцы являются кишечными образцами. Они могут представлять собой, например, биоптат ткани слизистой оболочки толстого кишечника и/или прямой кишки. Предпочтительно, этот кишечный образец является образцом кала. Образцы кала общепринято используют в клинической практике, и специалисту в этой области будет известно, как определять наиболее подходящие способы их получения и сохранения. После получения образца, его можно использовать свежим, можно замораживать или сохранять подходящими способами.

Способы по изобретению, необязательно, включают на стадии a) осуществление FOBT на образце кала, выделенном из индивидуума, где указанный FOBT включает определение наличия скрытой крови в образце кала, выделенном из указанного индивидуума. Кровь в кале является неспецифическим показателем, который может являться результатом CRC или боле крупные (> 1 до 2 см) полипы. Т.к. небольшие аденоматозные полипы не имеют склонности к кровотечению, и кровотечение из злокачественных новообразований или крупных полипов может быть периодическим или просто не всегда детектируемым в отдельном образце кала, правильное использование анализов кала на кровь, как правило, требует ежегодного тестирования, состоящего из сбора образцов (2 или 3 в зависимости от результата) от последовательных дефекаций. Анализы кала на кровь общепринято известны как анализы кала на скрытую кровь (FOBT), т.к. они созданы для детекции наличия скрытой крови в кале. FOBT попадает в две основные категории с учетом определяемого аналита: gFOBT и FIT. С помощью гваяковых проб определяют кровь в кале по псевдопероксидазной активности гема или гемоглобина, в то время как в иммунохимических анализах используют реакцию с глобином человека (Levin et al. (CA Cancer J Clinicians, 2008; 58 (3) 130-160).

Типичный способ gFOBT состоит из сбора 2 образцов при каждой из 3 последовательных дефекаций. Т.к. gFOBT является качественным анализом, его, как правило, визуально оценивают квалифицированные техники-лаборанты невооруженным взглядом для интерпретации визуального результата. Перед тестированием с помощью чувствительной гваяковой пробы индивидуумов, как правило, будут инструктировать избегать аспирина и других нестероидных противовоспалительных лекарственных средств, витамина C, красного мяса, домашней птицы, рыбы и некоторых сырых овощей из-за взаимодействия пищи и компонентов анализа, которое может повышать риск ложноположительных и ложноотрицательных (в частности, витамин C) результатов. Примером коммерчески доступного gFOBT является Hemoccult SENSA (Beckman Coulter, US).

С помощью FIT определяют глобин человека, белок, который вместе с гемом составляет гемоглобин человека. Таким образом, FIT является более специфическим для крови человека, чем гваяковая проба, основанная на детекции пероксидазы крови человека и также реагирующая с пероксидазой, присутствующей в пище, такой как недожаренное красное мясо, крестоцветные овощи и некоторые фрукты. Кроме того, в отличие от gFOBT, FIT не склонен к ложноотрицательным результатам в присутствие добавок с высоким содержанием витамина C, блокирующим пероксидазную реакцию. Кроме того, т.к. глобин подвергается деградации пищеварительными ферментами в верхних отделах желудочно-кишечного тракта, FIT также является более специфическими для кровотечения в нижних отделах желудочно-кишечного тракта, что, таким образом, улучшает их специфичность в отношении CRC. И наконец, сбор образцов для некоторых вариантов FIT является менее затруднительным для пациентов, чем gFOBT, требуя меньшего количества образцов или меньшего прямого воздействия на кал. Существует множество FIT на основе разных технологий детекции (например, реакция непрямой пассивной гемагглютинации (RPHA), реакция латексной агглютинации, ELISA и иммунонефелометрия), и они включены в настоящее описание (Levin B et al., Gastroenterology 2008; 134: 1570-95). Предпочтительно, указанный иммунологический анализ основан на реакции латексной агглютинации, такой как анализ OC-SENSOR (Eiken Chemical Co., Japan), используемый в примерах.

Предпочтительно, указанный FOBT является иммунохимическим тестом на скрытую кровь в кале (FIT), в котором количественно анализируют гемоглобин человека (hHb). Индивидуума будут определять как FIT-положительного, если уровни hHb в образце кала превышают заранее определенное пороговое значение. Например, индивидуума можно определять как FIT-положительного, если уровни hHb равны или превышают 10 мкг hHb/г кала (или равны или превышают 50 нг гемоглобина на мл; пороговое значение FIT50) или если уровни hHb равны или превышают 20 мкг hHb/г кала (или равны или превышают 100 нг гемоглобина на мл; пороговое значение FIT100). Пороговое значение FIT100 является общеупотребительным в Каталонии и остальной части Испании в качестве порогового значения FIT для скрининга CRC. Как показано в таблице 5, улучшения специфичности достигают в способах по изобретению при использовании обоих пороговых значений только в отношении соответствующего FIT. В предпочтительных вариантах осуществления FIT-положительный индивидуум имеет уровни hHb, равные или превышающие 10 мкг hHb/г кала (пороговое значение FIT50), в случае чего достигают немного более высокой чувствительности.

Как указано выше, способы по изобретению могут включать на стадии b) количественный анализ любых из GMLL, PTST или BCTF, а также любой их комбинации, включая i) GMLL и PTST; ii) GMLL и BCTF; iii) PTST и BCTF; и/или iv) GMLL, PTST и BCTF. Необязательно, указанный способ, как определено в любом из этих вариантов осуществления, может дополнительно включать количественный анализ Bacteroides thetaiotaomicron (BCTT) в указанном кишечном образце (предпочтительно, образце кала). Референсным штаммом BCTT является штамм Bacteroides thetaiotaomicron VPI-5482 (бактерии; Bacteroidetes; Bacteroidia; Bacteroidales; Bacteroidaceae; Bacteroides), и его геномная последовательность имеет регистрационный номер GenBank: AE015928.1. В конкретных вариантах осуществления олигонуклеотиды, специфические для SEQ ID NO: 4 можно использовать для количественного анализа BCTT. SEQ ID NO: 4 соответствует регистрационному номеру GenBank: AE015928.1 ОБЛАСТЬ: 326008.326649. В предпочтительных вариантах осуществления эти специфические олигонуклеотиды являются любыми олигонуклеотидами, перечисленными в таблице 3 для BCTT, и последовательностями с по меньшей мере 80% идентичности в отношении любой из них.

Предпочтительно, стадия b) включает или состоит из количественного анализа PTST, BCTF и BCTT.

В этой области хорошо известны способы молекулярной биологии для измерения количеств целевых последовательностей нуклеиновой кислоты. Эти способы включают, в качестве неограничивающих примеров, ПЦР конечной точки, конкурентную ПЦР, количественную ПЦР (qPCR), ПЦР-пиросеквенирование, ПЦР-ELISA, ДНК-микрочипы, секвенирование нуклеиновых кислот, такое как способы секвенирования нового поколения, анализы гибридизации in situ, такие как дот-блот или флуоресцентная гибридизация in situ (FISH), масс-спектрометрию, гибридизацию ДНК с использованием разветвленных зондов (Nolte, Adv. Clin. Chem. 1998,33:201-235), мультиплексные версии указанных способов (см. например, Andoh et al., Current Pharmaceutical Design, 2009;15,2066-2073) и новое поколение любых из указанных способов и их комбинации, все из которых входят в объем настоящего изобретения.

Разнообразные способы секвенирования нового поколения описаны и хорошо известны специалисту в этой области. Они включают, например, секвенирование посредством синтеза с помощью подходов циклической обратимой терминации (например, Illumina, SEQLL, Qiagen), секвенирование посредством синтеза с помощью подхода присоединения отдельных нуклеотидов (например, Roche-454, Thermo Fisher-Ion Torrent), секвенирование посредством лигирования (например, Thermo Fisher SOLiD и BGI-Complete Genomics), секвенирование длинных ридов в реальном времени (например, Pacific Biosciences, Oxford Nanopore Technologies), синтетическое секвенирование длинных ридов (например, Illumina, 10X Genomics, iGenomeX), см., например, Goodwin S, et al., Nat Rev Genet. 2016, 17 (6): 333-51).

В некоторых вариантах осуществления указанные молекулярно-биологические способы количественного анализа основаны на специфической в отношении последовательности амплификации. Такой амплификационный анализ включает стадию амплификации, включающую приведение образца (предпочтительно, образца выделенной ДНК) в контакт с двумя или более олигонуклеотидами для амплификации, специфическими для целевой последовательности в целевой нуклеиновой кислоте, для получения продукта амплификации, если целевая последовательность нуклеиновой кислоты присутствует в образце. Продукт амплификации будет содержать последовательность кДНК, соответствующую целевой последовательности. Подходящие способы амплификации включают, например, репликаза-опосредованную амплификацию, лигазную цепную реакцию (LCR), амплификацию с замещением цепи (SDA), транскрипционно-попсредованную амплификацию (TMA) и полимеразную цепную реакцию (ПЦР), включающую количественную ПЦР.

Одним из особенно предпочтительных способов количественного анализа является количественная ПЦР (qPCR), также известная как ПЦР в реальном времени. Термин относится к типу ПЦР, в котором амплифицируют и одновременно количественно анализируют целевую молекулу ДНК. Его ключевым признаком является то, что амплифицированную ДНК определяют с прохождением реакции в реальном времени. Доступны различные устройства, такие как ABI Prism 7700 SDS, GeneAmp 5700 SDS, ABI Prism 7900 HT SDS от Applied Biosystems; iCycler iQ от Bio-Rad; Smart Cycler от Cepheid; Rotor-Gene от Corbett Research; LightCycler от Roche Molecular Biochemicals, AriaMx от Agilent и Mx4000 Multiplex от Stratagene. Способ qPCR делает возможным точный количественный анализ продукта ПЦР в реальном времени посредством измерения накопления продукта ПЦР на очень ранних стадиях экспоненциальной фазы реакции, таким образом, снижая смещение количественного анализа, связанное с эффективностью ПЦР-амплификации, возникающее при ПЦР конечной точки. ПЦР в реальном времени хорошо известна в этой области, и, таким образом, ее не описывают подробно в настоящем описании. Обзор технологии и способы qPCR доступны, например, у указанных выше поставщиков, например, http://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/sybr-green-qpcr.html или http://www.sigmaaldrich.com/life-science/molecular-biology/pcr/quantitative-pcr/qpcr-technical-guide.html. Обзор способов qPCR см. в Wong ML y Medrano JF, Biotechniques 2005, 39(1):75-85. В конкретном варианте осуществления способом количественного анализа является мультиплексная qPCR.

Доступны разные способы химической детекции при qPCR. Все из них можно использовать с указанными выше устройствами для qPCR. Термин "способ химической детекции" относится к способу регистрации амплификации специфического продукта ПЦР при ПЦР в реальном времени. Эти способы химической детекции можно классифицировать на две основные группы: первая группа содержит интеркалирующие с двухцепочечной ДНК молекулы, такие как SYBR Green I и EvaGreen, в то время как вторая группа включает меченые флуорофором олигонуклеотиды. Последние, в свою очередь, разделяют на три подгруппы в зависимости от типа флуоресцентных молекул, используемых в реакции ПЦР: (i) праймеры-зонды (Scorpions, Amplifluor®, LUX™, Cyclicons, Angler®); (ii) зонды; гидролизуемые (TaqMan, MGB-TaqMan, анализ Snake) и гибридизующиеся (Hybprobe или FRET, молекулярные маяки, HyBeacon™, MGB-Pleiades, MGB-Eclipse, ResonSense®, Yin-Yang или вытесняемый зонд); и (iii) аналоги нуклеиновых кислот (ПНК, LNA®, ZNA™, неприродные основания: праймер Plexor™, молекулярные микромаяки) см. E. Navarro eta l.,Clinica Chimica Acta, Volume 439, January 15 2015, Pages 231-250.

Указанные зонды могут являться олигонуклеотидами двойного мечения, такие как гидролизуемые зонды или молекулярные маяки. 5'-конец олигонуклеотида, как правило, метят флуоресцентной репортерной молекулой, в то время как 3'-конец метят молекулой гасителя. Последовательность зонда является специфической для интересующей области в амплифицируемой целевой молекуле. В более предпочтительном варианте осуществления указанный зонд является гидролизуемым зондом, сконструированным таким образом, что длина последовательности приводит к размещению 5'-флуорофора и 3'-гасителя в достаточной близости для супрессии флуоресценции. Несколько репортерных молекул и гасителей для использования в зондах для qPCR хорошо известны в этой области.

Как правило, для количественного анализа нуклеотидных последовательностей используют специфические олигонуклеотиды, такие как зонды и/или праймеры. Термин "праймер и/или зонд" конкретно включает "праймеры и/или зонды". Оба выражения используют в настоящем описании взаимозаменяемо, и они включают, например, праймер; зонд; праймер и зонд; пару праймеров; и пару праймеров и зонд. Дизайн и валидация праймеров и зондов хорошо известны в этой области. Дизайн праймеров и зондов в способах количественной ПЦР в реальном времени см., например, в Rodriguez A et al. (Methods Mol Biol., 2015, 1275: 31-56). Предпочтительные праймеры и/или зонды, которые можно использовать в способах по изобретению, представлены в настоящем описании ниже наборов по изобретению.

Предпочтительно, олигонуклеотиды, которые можно использовать в способах по изобретению, имеют длину от приблизительно 5 до приблизительно 50 нуклеотидов, от приблизительно 10 до приблизительно 30 нуклеотидов или от приблизительно 20 до приблизительно 25 нуклеотидов. В определенных вариантах осуществления олигонуклеотиды, специфически гибридизующиеся с целевой последовательностью, имеют длину от приблизительно 19 до приблизительно 21 нуклеотида. В конкретном варианте осуществления указанные олигонуклеотиды модифицированы с целью детекции или улучшения характеристик анализа, как представлено в настоящем описании.

Эти олигонуклеотиды могут являться рибонуклеотидами или дезоксирибонуклеотидами. В конкретных вариантах осуществления олигонуклеотиды могут иметь по меньшей мере одну химическую модификацию. Например, подходящие олигонуклеотиды могут состоять из одной или более "конформационно затрудненных" модификаций или модификаций нуклеозидов в бициклических сахарах, например, "замкнутые нуклеиновые кислоты". "Замкнутые нуклеиновые кислоты" (ЗНК) являются модифицированными рибонуклеотидами, содержащими дополнительный мостик между 2'- и 4'-атомов углерода остатка рибозного сахара, что приводит к "замкнутой" конформации, придающей повышенную термическую стабильность олигонуклеотидам, содержащим ЗНК. В других вариантах осуществления олигонуклеотиды могут содержать пептид-нуклеиновые кислоты (ПНК), содержащие остов на основе пептида, а не сахар-фосфатный остов. Другие химические модификации, которые олигонуклеотиды могут содержать, включают, в качестве неограничивающих примеров, модификации сахаров, такие как 2'-O-алкил- (например, 2'-O-метил-, 2'-O-метоксиэтил-), 2'-фтор- и 4'-тио-модификации, и модификации остова, такие как одна или более фосфотиоатных, морфолиновых или фосфонокарбоксилатных связей. Например, эти олигонуклеотиды, в частности более короткие (например, менее 15 нуклеотидов), могут содержать одну или более повышающих аффинность модификаций, в качестве неограничивающих примеров, таких как ЗНК, бициклические нуклеозиды, фосфоноформиаты, 2'-O-алкил и т.п. В некоторых вариантах осуществления олигонуклеотиды могут быть химически модифицированы, например, для улучшения их резистентности к деградации нуклеазами (например, посредством кэпирования концов), включения детекторных лигандов (например, флуоресцеина) или облегчения их захвата на твердой подложке (например, поли-дезоксиаденозиновые "хвосты").

Термин "количественные уровни" может означать концентрацию (количество ДНК на единицу объема), количество ДНК на количество клеток, значение порогового цикла (значение Ct) или любое их математическое преобразование. В предпочтительном варианте осуществления количественный анализ указанных бактериальных последовательностей осуществляют посредством qPCR и количественные уровни выражают как значение Ct. Значение Ct (порогового цикла) определяют как количество циклов qPCR, необходимое для того, чтобы флуоресцентный сигнал преодолел пороговое значение. Уровни Ct обратно пропорциональны количеству целевой нуклеиновой кислоты в образце (т.е. чем ниже уровень Ct, тем больше количество целевой нуклеиновой кислоты в образце).

Анализ относительного количества целевой последовательности нуклеиновой кислоты (например, SEQ ID NO: 1) в образце кала может являться абсолютным или относительным. Относительный количественный анализ основан на одном или более внутренних референсных генах, т.е. генах рРНК 16S из референсных штаммов, например, определении всех бактерий (эубактерий) с использованием универсальных праймеров и выражении относительного количества целевой последовательности нуклеиновой кислоты относительно эубактерий (например, соотношение SEQ ID NO: 1/эубактерии). С помощью абсолютного количественного анализа получают точное количество целевых молекул посредством сравнения со стандартами ДНК.

В конкретном варианте осуществления, необязательно, в комбинации с одним или более вариантами осуществления или признаками, представленными в настоящем описании, количественный анализ бактериальных маркеров на стадии b) является относительным к эубактериям, и его выражают как соотношение соответствующих количественных значений (например, соотношение значений Ct). Специфические олигонуклеотиды, которые можно использовать для количественного анализа эубактерий, являются любыми из олигонуклеотидов, перечисленных в таблице 3 для EUB, и последовательностями с по меньшей мере 80% идентичности в отношении любой из них. Альтернативно, также можно использовать любые из следующих олигонуклеотидов или последовательностей с по меньшей мере 80% идентичности отношении любой из них:

EUB2 прямой (SEQ ID NO: 5): ACTCCTACGGGAGGCAGCAGT

EUB2 обратный (SEQ ID NO: 6): GTATTACCGCGGCTGCTGGCAC

В конкретном варианте осуществления способов по изобретению перед количественным анализом указанных бактериальных последовательностей из образца кала выделяют ДНК. Известно несколько способов выделения ДНК из образцов кала, все эти способы основаны на химическом или механическом разрушении, лизисе с использованием детергентов или комбинации этих подходов (Kennedy A. et al., PLoS One, 2014; 9 (2):e88982). Способы выделения бактериальной ДНК из образцов кала описаны в M Corist et al., Journal of Microbiological Methods, 2002; 50 (2): 131-139, Whitney D et al., Journal of Molecular Diagnostics, American Society for Investigative Pathology, 2004; 6 (4): 386-395 и WO 2003/068788.

В предпочтительных способах используют комбинацию механического разрушения, такие как высокоскоростное выделение способом "bead beating", химического лизиса и конечной стадии очистки, предпочтительно, с использованием мембранной колонки с диоксидом кремния, например, включенные в коммерчески доступные наборы для выделения ДНК "способ выделения ДНК MobioPowerSoil®" (Mo-Bio Laboratories Inc.,), набор FastDNA® SPIN для выделения из почвы (MP biomedicals) и NucleoSpin® Soil (Macherey-Nagel Gmbh& Co. KG). Наличие ингибиторов ПЦР в экстрактах ДНК из образцов кала, таких как билирубины, соли желчных кислот и сложные углеводы, является одной из трудностей, возникающих при определении биомаркеров ДНК в экстрактах ДНК из кала (Fleckna et al., Mol Cell Probes, 2007; 21 (4): 282-7). Предпочтительными способами выделения ДНК являются способы, которыми получают экстракты кала с небольшим количеством ингибиторов ПЦР, например, менее 5%, предпочтительно - менее 2%, более предпочтительно - менее 1%, даже более предпочтительно - менее 0,5%, например, менее 0,25%, 0,1%, 0,05% или 0,01%.

В некоторых вариантах осуществления способы по изобретению дополнительно включают:

c) вычисление комбинированного показателя из уровней бактериальных маркеров, определенных на стадии b); и

d) классификацию FOBT-положительного индивидуума как имеющего AN, AA и/или CRC или имеющего повышенный риск развития AN, AA и/или CRC в соответствии с комбинированным показателем, полученным на стадии c).

Комбинированный показатель стадии c) представляет собой значение, полученное с помощью указанного математического алгоритма, например, где количественные значения каждого из бактериальных маркеров, определенных на стадии b), являются переменными указанного математического алгоритма. Предпочтительно, указанными бактериальными маркерами являются PTST, BCTF и BCTT.

В конкретных вариантах осуществления, при вычислении комбинированного показателя, он пропорционален абсолютному или относительному количеству любого из GMLL, PTST или BCTF в образце и обратно пропорционален абсолютному или относительному количеству BCTT; где чем выше показатель, тем выше вероятность развития CRC, AA и/или AN. Другими словами, высокий показатель является показателем наличия заболевания.

Например, указанный комбинированный показатель можно вычислять как сумму произведений стандартизированных бета-коэффициентов, полученных при регрессионном анализе для каждого маркера, и где значения бактериального маркера используют в качестве переменных. В конкретном варианте осуществления указанные бета-коэффициенты являются положительными для маркеров GMLL, PTST и/или BCTF и отрицательными для BCTT. Положительный знак является показателем того, что повышение количества отдельного маркера ассоциированного с развитием или более высокой вероятностью развития CRC, AA и/или AN, и отрицательный знак является показателем того, что снижение количества отдельного маркера ассоциировано с развитием или более высокой вероятностью развития CRC, AA и/или AN.

Как правило, на стадии d) указанный способ включает сравнение комбинированного показателя в образце индивидуума с референсным значением (например, референсным комбинированным показателем); и повышение комбинированного показателя в образце индивидуума относительно указанного референсного значения (например, референсного комбинированного показателя) является показателем AN, AA и/или CRC.

В рамках изобретения термин "референсный комбинированный показатель" означает референсное значение, полученное с помощью указанного математического алгоритма, где референсные значения экспрессии каждого из бактериальных маркеров, используемых в способе по изобретению, представляют собой переменные указанного математического алгоритма.

В рамках изобретения термин "референсное значение" относится к заранее определенному критерию, используемому в качестве референса для оценки значений или данных, полученных из образцов, полученных из индивидуума. Это "референсное значение" также можно обозначать как "пороговое значение".

Референсное значение или референсный уровень может являться абсолютным значением, относительным значением, значением, являющимся верхним или нижним пределом, диапазоном значений, усредненным значением, медианным значением, средним значением, значением z-оценки (например, средним значением+ или - 1SD), тертильным значением или значением по сравнению с конкретным контролем или исходным значением. В конкретном варианте осуществления, необязательно, в комбинации с одним или более вариантами осуществления или признаками, описанными выше или ниже, указанное референсное значение является средним значением или тертильным значением.

Кроме того, необходимо отметить, что на современном уровне техники известны различные статистические и математические способы определения порогового уровня экспрессии. Пороговый уровень экспрессии конкретного биомаркера можно выбирать, например, с учетом данных с кривых операционных характеристик приемника (ROC). Специалисту в этой области будет понятно, что эти пороговые уровни экспрессии можно варьировать, например, двигаясь по кривой ROC для конкретного биомаркера или их комбинации, для получения разных значений для чувствительности или специфичности, таким образом, влияющих на общие характеристики анализа.

Референсное значение может быть основано на значении для отдельного образца, но, как правило, оно основано на большом количестве образцов, включая или исключая тестируемый образец. Например, это референсное значение можно получать из одной из скрининговых популяций, как определено в настоящем описании вые (например, взрослых без симптомов из общей популяции, взрослых без симптомов возрастом более 50 лет или взрослых без симптомов, имеющих один или более факторов риска) или из популяции индивидуумов, имеющих связанные с CRC симптомы. Кроме того, это референсное значение можно получать с помощью коллекции образцов тканей референсной популяции пациентов с AN, AA и/или CRC, для которой доступны статистические данные, касающиеся конкретного клинического исхода для соответствующего пациента со злокачественным новообразованием.

Альтернативно, референсное значение в соответствии со способами по изобретению можно получать от одного или более индивидуумов, не имеющих CRC или аденому на поздней стадии, не имеющих желудочно-кишечное заболевание (т.е. здоровых контрольных индивидуумов), индивидуумов, страдающих аденомой на поздней стадии, индивидуумов, страдающих CRC на ранней стадии, такой как бессимптомная (доклиническая) стадия, или того же индивидуума, у которого диагностирован CRC и/или аденома на поздней стадии, но в более ранний момент времени.

В конкретном варианте осуществления способ по изобретению является способом скрининга или диагностики AN, AA и/или CRC, и референсное значение получают с помощью индивидуумов, не имеющих AN, AA и/или CRC, или индивидуумов, не имеющих желудочно-кишечное заболевание. В другом варианте осуществления способ по изобретению является способом скрининга, и указанное референсное значение получают с помощью скрининговой популяции, как определено в настоящем описании. В дополнительном варианте осуществления способ по изобретению является способом диагностики, и указанное референсное значение получают с помощью индивидуумов, имеющих связанные с CRC симптомы.

В еще одном дополнительном конкретном варианте осуществления способ по изобретению является способом скрининга или диагностики AN, AA и/или CRC, и референсное значение получают с помощью индивидуумов, страдающих аденомой на ранней стадии. Это может иметь место, например, если желательна дифференциальная диагностика между AN, AA и/или CRC и аденомой на ранней стадии (NAA).

В дополнительном конкретном варианте осуществления способ по изобретению является способом мониторинга AN, AA и/или CRC, и референсное значение получают с помощью того же индивидуума, у которого диагностирована AN, AA и/или CRC, но в более ранний момент времени.

В других вариантах осуществления способы по изобретению могут включать стадии a) и b), как представлено в настоящем описании выше, и дополнительно включают:

e) сравнение количества любого из GMLL, PTST, BCTF и/или BCTT в образце кала с соответствующими референсными значениями;

f) где повышенное количество GMLL, PTST и/или BCTF и сниженное количество BCTT в образце FOBT-положительного индивидуума относительно соответствующего референсного значения является показателем AN, AA и/ или CRC.

Предпочтительно, где повышенное количество PTST и BCTF и сниженное количество BCTT в образце FOBT-положительного индивидуума относительно соответствующего референсного значения является показателем AN, AA и/или CRC.

В способах по изобретению комбинированный показатель (или количество бактериального маркера) считают "сниженным", если указанный комбинированный показатель (или количество бактериального маркера) является более низким, чем референсный комбинированный показатель (или референсное значение). Предпочтительно, комбинированный показатель считают более низким, чем референсный комбинированный показатель (или референсное значение), если он является на по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 100%, по меньшей мере 110%, по меньшей мере 120%, по меньшей мере 130%, по меньшей мере 140%, по меньшей мере 150% или более низким, чем референсный комбинированный показатель (или референсное значение).

Аналогично, в контексте способов по изобретению комбинированный показатель (или количество бактериального маркера) считают "повышенным", если указанный комбинированный показатель является более высоким, чем референсный комбинированный показатель (или референсное значение). Предпочтительно, комбинированный показатель (или количество бактериального маркера) считают более высоким, чем референсный комбинированный показатель (или референсное значение), если он является на по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 100%, по меньшей мере 110%, по меньшей мере 120%, по меньшей мере 130%, по меньшей мере 140%, по меньшей мере 150% или более высоким, чем референсный комбинированный показатель (или референсное значение).

Альтернативно или дополнительно, индивидуумы, имеющие отклонение в более приблизительно 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 или 20 раз (т.е. повышение или снижение) относительно референсного комбинированного показателя (или референсного значения), как представлено в настоящем описании.

Способы по изобретению, как это понимает специалист в этой области, не претендуют на точность в 100% анализируемых образцов. Однако, необходимо, чтобы правильно классифицировали статистически значимое количество анализируемых образцов. Количество, являющееся статистически значимым, может устанавливать специалист в этой области с использованием разных мер статистической значимости, полученных с помощью статистических анализов; иллюстративные, неограничивающие примеры указанных мер статистической значимости включают определение доверительных интервалов, определение значения p и т.д. Предпочтительные доверительные интервалы составляют меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%. Значения p составляют, предпочтительно, менее 0,1, менее 0,05, менее 0,01, менее 0,005 или менее 0,0001. Идеи по настоящему изобретению, предпочтительно, позволяют предпочтительно классифицировать по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80% или по меньшей мере 90% индивидуумов в исследуемой группе или анализируемой популяции.

Исследования обоснованности касаются соответствия между предлагаемым (индексным) анализом и референсным стандартом для возможности идентификации целевого состояния (см. Florkowski M. C., Clin Biochem Rev. 2008, 29 (Suppl 1): S83-S87). Чувствительность, специфичность, точность, отношение правдоподобия положительного результата исследования, отношение правдоподобия отрицательного результата исследования, прогностическая ценность положительного результата и прогностическая ценность отрицательного результата представляют собой статистические значения, которые можно определять для оценки характеристик анализа. Определение сокращений и дополнительные подробности приведены в таблице 1 ниже.

Референсный стандарт Наличие заболевания Отсутствие заболевания Всего Положительные результаты анализа Истинно положительные (TP) Ложноположительные (FP) TP+FP Отрицательные результаты анализа Ложноотрицательные (FN) Истинно отрицательные (TN) TN+FN Всего TP+FN TN+FP Чувствительность=TP/(TP+FN)
Специфичность=TN/(TN+FP)
Прогностическая ценность положительного результата (PPV) = TP/(TP+FP)
Прогностическая ценность отрицательного результата (NPV) = TN/(TN+FN)
Отношение правдоподобия положительного результата=чувствительность/(1-специфичность)
Отношение правдоподобия отрицательного результата = (1-чувствительность)/специфичность

Анализ, как правило, калибруют в терминах желаемой специфичности и чувствительности в соответствии с целевым использованием анализа в клинической практике. Высокая чувствительность соответствует высокой прогностической ценности отрицательного результата, и ее, как правило, считают желаемым свойством для анализа для "исключения", такого как скрининговый анализ, как правило, после которого следует контрольный тест. Высокая специфичность соответствует высокой прогностической ценности положительного результата, и ее, как правило, считают желаемым свойством для анализа для "включения", такого как сопутствующий диагностический тест.

В предпочтительных вариантах осуществления способы по изобретению имеют значения чувствительности, специфичности и/или точности по меньшей мере приблизительно 60%, предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 70%, и они могут составлять, например, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% в по меньшей мере 60% исследуемой группы или популяции или, предпочтительно, в по меньшей мере 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% исследуемой группы или популяции.

Также необходимо отметить, что точность способа по изобретению можно дополнительно повышать посредством дополнительного рассмотрения других генов или бактериальных маркеров, биохимических параметров и/или клинических характеристик пациентов (например, возраста, пола, курения и/или других факторов риска). Определение этих других маркеров, параметров и/или характеристик может являться последовательным или одновременным с любой или всеми стадиями способов по изобретению, как представлено в настоящем описании.

В конкретном варианте осуществления, необязательно, в комбинации с одним или более из признаков или вариантов осуществления, представленных в настоящем описании, способы по изобретению дополнительно включают количественный анализ одного или более бактериальных маркеров, выбранных из группы, состоящей из B10, B46, B48, Roseburia intestinalis (RSBI), Collinsella intestinalis (CINT), Faecalibacterium prausnitzii (Duncan et al., Int. J. Syst. Evol. Microbiol 2002, 52:2141-2146) и/или любой из филогрупп (см.; WO2017/025617 A1 и Lopez-Siles et al. Appl Environ Microbiol. 2012, 78:420-428) и Escherichia coli.

B10 имеет последовательность SEQ ID NO: 7 (приведена ниже) соответствующий полосе в электрофорезном геле Eub_10 гена рибосомальной РНК 16S некультивированного изолята бактерий DGGE, частичной последовательности (GenBank: GQ411118.1). В конкретных вариантах осуществления олигонуклеотиды, специфические для SEQ ID NO: 7, можно использовать для количественного анализа B10.

B46 имеет последовательность SEQ ID NO: 8 (приведена ниже) соответствующий полосе в электрофорезном геле Eub_46 гена рибосомальной РНК 16S некультивированного изолята бактерий DGGE, частичной последовательности (GenBank: GQ411150.1). В конкретных вариантах осуществления олигонуклеотиды, специфические для SEQ ID NO: 8, можно использовать для количественного анализа B46.

B48 имеет последовательность SEQ ID NO: 9 (приведена ниже) соответствующий полосе в электрофорезном геле Eub_48 гена рибосомальной РНК 16S некультивированного изолята бактерий DGGE, частичной последовательности (GenBank: GQ411152.1). В конкретных вариантах осуществления олигонуклеотиды, специфические для SEQ ID NO: 9, можно использовать для количественного анализа B48.

Референсным штаммом RSBI является штамм Roseburia intestinalis L1-82 (бактерии; фирмикуты; Clostridia; Clostridiales; Lachnospiraceae; Roseburia), и его геномная последовательность показана в GenBank под регистрационным номером: LR027880.1. В конкретных вариантах осуществления олигонуклеотиды, специфические для SEQ ID NO: 10, можно использовать для количественного анализа RSBI. SEQ ID NO: 10 соответствует регистрационному номеру GenBank LR027880.1 ОБЛАСТЬ: 599208.600101.

Референсным штаммом CINT (бактерии; Actinobacteria; Coriobacteriia; Coriobacteriales; Coriobacteriaceae; Collinsella) является штамм Collinsella intestinalis DSM 13280, и его геномная последовательность показана в NCBI под регистрационным номером: GG692711.1. В конкретных вариантах осуществления олигонуклеотиды, специфические для SEQ ID NO: 11, можно использовать для количественного анализа CINT. SEQ ID NO: 11 соответствует референсной последовательности NCBI: GG692711.1 ОБЛАСТЬ: 297314.298120.

Референсным штаммом Faecalibacterium prausnitzii (бактерии; фирмикуты; Clostridia; Clostridiales; Ruminococcaceae; Faecalibacterium) является штамм Faecalibacterium prausnitzii A2-165 (регистрационный номер GenBank: AJ270469.2), также являющийся типичным штаммом филогруппы II (PHGII). Faecalibacterium prausnitzii M21/2 (регистрационный номер GenBank: DS483503.1) является типичным штаммом филогруппы I (PHGI). В конкретных вариантах осуществления олигонуклеотиды, специфические для SEQ ID NO: 12, можно использовать для количественного анализа Faecalibacterium prausnitzii, SEQ ID NO: 12 (приведена ниже) соответствует регистрационному номеру GenBank: AJ270469,2.

Референсным штаммом Escherichia coli (бактерии; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Enterobacterales; Enterobacteriaceae; Escherichia) является штамм Escherichia coli K-12 подштамм MG1655, и его геномная последовательность имеет регистрационный номер GenBank: CP032667.1. В конкретных вариантах осуществления олигонуклеотиды, специфические для SEQ ID NO: 13 (приведена ниже), можно использовать для количественного анализа Escherichia coli.

В предпочтительных вариантах осуществления любые из специфических олигонуклеотидов, перечисленных в таблице 3, и последовательности с по меньшей мере 80% идентичности в отношении любых из них можно использовать для количественного анализа B10, B46, B48, CINT или RSBI, соответственно. Кроме того, в предпочтительных вариантах осуществления любые из специфических олигонуклеотидов, перечисленных в таблице 2 WO 2017/025617 A1, и последовательности с по меньшей мере 80% идентичности в отношении любых из них можно использовать для количественного анализа Faecalibacterium prausnitzii, его филогрупп (т.е. PHGI и PHGII) и Escherichia coli.

Способы по настоящему изобретению или любые из их стадий можно реализовать в компьютерном виде. В рамках изобретения термин "компьютер" может означать любое программируемое устройство или систему. В конкретном варианте осуществления, необязательно, в комбинации с любым из признаков или вариантов осуществления, как представлено в настоящем описании, комбинированный показатель на стадии c) вычисляют с использованием компьютера и/или выбор, классификацию и/или определение на стадии d) осуществляют с использованием компьютера.

Таким образом, дополнительный аспект изобретения относится к компьютеризованному способу, где способ является любым из способов, представленных в настоящем описании, или любой их комбинацией.

Необходимо отметить, что любая компьютерная программа, способная выполнять любые из способов по настоящему изобретению или используемая для выполнения любых из этих способов или любой их комбинации, также образует часть настоящего изобретения.

Эту компьютерную программу, как правило, напрямую загружают во внутреннюю память цифровой вычислительной машины, содержащую части кода программного обеспечения для осуществления стадий сравнения комбинированного показателя (например, полученного из уровня одного или более из целевых маркеров, как представлено в настоящем описании) из одного или более биологических образцов индивидуума с референсным значением (например, референсным комбинированным значением) и определение диагноза у указанного индивидуума, когда указанный продукт запускают на компьютере.

Также необходимо отметить, что любое устройство, содержащее средства для осуществления стадий любых из способов по настоящему изобретению или любой их комбинации или осуществления компьютерной программы, способной выполнять любые из способов по настоящему изобретению или любую их комбинацию, включено как часть настоящего описания.

Способы по изобретению также могут включать хранение результатов способа на носителе данных, предпочтительно, где указанный носитель данных является машиночитаемым носителем. Настоящее изобретение дополнительно относится к машиночитаемому носителю данных, содержащемуся хранящуюся на нем компьютерную программу по изобретению или результаты любых способов по изобретению.

В рамках изобретения "машиночитаемый носитель" может являться любым устройством, которое может включать, хранить, передавать, размножать или переносить результаты определения способом по изобретению. Носитель может являться электронной, магнитной, оптической, электромагнитной, инфракрасной или полупроводниковой системой (или устройством) или средой распространения.

Способы лечения и соответствующее медицинское применение

В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения индивидуума, имеющего AN, AA и/или CRC, где указанный индивидуум выбран способом скрининга, диагностики и/или мониторинга, как представлено в настоящем описании выше, и где указанный способ дополнительно включает введение индивидууму противоопухолевого терапевтического средства.

В связанном аспекте настоящее изобретение также относится к любым из способов, как представлено в настоящем описании выше, дополнительно включающим стадию введения указанному пациенту терапевтически эффективного количества противоопухолевого терапевтического средства.

В другом аспекте изобретение относится к противоопухолевому терапевтическому средству для применения в способе лечения пациента со злокачественным новообразованием, где указанный пациент со злокачественным новообразованием выбран способом скрининга, диагностики и/или мониторинга, как представлено в настоящем описании.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение также относится к способу выбора индивидуума для осуществления поискового исследования, выбранного из группы, состоящей из колоноскопии, сигмоидоскопии гибким эндоскопом, ирригоскопии с двойным контрастированием и компьютерной (КТ) колонографии, предпочтительно, для осуществления колоноскопии, где указанный индивидуум выбран способом скрининга, диагностики или мониторинга, как представлено в настоящем описании.

В еще одном дополнительном аспекте изобретение относится к способу осуществления поискового исследования в отношении индивидуума, где указанный индивидуум выбран способом скрининга, диагностики или мониторинга, как представлено в настоящем описании, где указанный способ дополнительно включает осуществление поискового исследования индивидууму, где исследование выбрано из группы, состоящей из колоноскопии, сигмоидоскопии гибким эндоскопом, ирригоскопии с двойным контрастированием и компьютерной (КТ) колонографии, предпочтительно, колоноскопии.

Набор и применение набора в способах по изобретению

В другом аспекте изобретение относится к набору, подходящему для количественного анализа любого из GMLL, PTST, BCTF или BCTT, где указанный набор содержит один или более из следующих реагентов:

i. олигонуклеотида, специфического для генома GMLL, предпочтительно - олигонуклеотида, специфического для SEQ ID NO: 1;

ii. олигонуклеотида, специфического для генома PTST, предпочтительно - олигонуклеотида, специфического для SEQ ID NO: 2;

iii. олигонуклеотида, специфического для генома BCTF, предпочтительно - олигонуклеотида, специфического для SEQ ID NO: 3;

iv. олигонуклеотида, специфического для генома BCTT, предпочтительно - олигонуклеотида, специфического для SEQ ID NO: 4; и

v. необязательно, олигонуклеотида, подходящего для количественного анализа эубактерий, как определено в настоящем описании выше.

Необязательно, дополнительно содержащий инструкции по использованию указанных реагентов в определении уровней указанных бактериальных маркеров в образце кала, выделенном из индивидуума.

Термин "набор" или "набор для тестирования" означает комбинации реагентов и вспомогательных веществ, необходимых для анализа. Хотя набор для тестирования в большинстве случаев состоит из нескольких единиц, также доступны монолитные элементы для анализа, которые аналогичным образом необходимо рассматривать в качестве наборов для тестирования.

В предпочтительных вариантах осуществления указанный набор подходит для количественного анализа PTST, BCTF и BCTT, и указанный набор содержит реагенты ii), iii) и iv), как определено в настоящем описании выше. Предпочтительно, он дополнительно содержит реагент v), как определено выше.

В конкретных вариантах осуществления, необязательно, в комбинации с одним или более из признаков или вариантов осуществления, как представлено в настоящем описании,

- олигонуклеотид, специфический для SEQ ID NO: 1, является олигонуклеотидом, содержащим или состоящим из любой из SEQ ID NO: 22, или SEQ ID NO: 23, или последовательностей с по меньшей мере 80% идентичности в отношении любой из них; и/или

- олигонуклеотид, специфический для SEQ ID NO: 2, является олигонуклеотидом, содержащим или состоящим из любой из SEQ ID NO: 24, или SEQ ID NO: 25, или последовательностей с по меньшей мере 80% идентичности в отношении любой из них; и/или

- олигонуклеотид, специфический для SEQ ID NO: 3,является олигонуклеотидом, содержащим или состоящим из любой из SEQ ID NO: 26, или SEQ ID NO: 27, или последовательностей с по меньшей мере 80% идентичности в отношении любой из них; и/или

- олигонуклеотид, специфический для SEQ ID NO: 4, является олигонуклеотидом, содержащим или состоящим из любой из SEQ ID NO: 30, или SEQ ID NO: 31, или последовательностей с по меньшей мере 80% идентичности в отношении любой из них; и/или

- олигонуклеотид подходящий для количественного анализа эубактерий, является олигонуклеотидом, содержащим или состоящим из любой из SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 14, или SEQ ID NO: 15, или последовательностей с по меньшей мере 80% идентичности в отношении любой из них.

Предпочтительные варианты осуществления относятся к набору, подходящему для количественного анализа PTST, BCTF и BCTT, где указанный набор содержит следующие реагенты:

- олигонуклеотид, содержащий или состоящий из любой из SEQ ID NO: 24, или SEQ ID NO: 25, или последовательностей с по меньшей мере 80% идентичности в отношении любой из них;

- олигонуклеотид, содержащий или состоящий из любой из SEQ ID NO: 26, или SEQ ID NO: 27, или последовательностей с по меньшей мере 80% идентичности в отношении любой из них; и

- олигонуклеотид, содержащий или состоящий из любой из SEQ ID NO: 30, или SEQ ID NO: 31, или последовательностей с по меньшей мере 80% идентичности в отношении любой из них; и

- необязательно, олигонуклеотид, подходящий для количественного анализа эубактерий (предпочтительно, олигонуклеотид, содержащий или состоящий из любой из SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 14, или SEQ ID NO: 15, или последовательностей с по меньшей мере 80% идентичности в отношении любой из них);

- необязательно, дополнительно содержащий инструкции по использованию указанных реагентов в определении уровней указанных бактериальных маркеров в образце кала, выделенном из индивидуума.

Указанные специфические олигонуклеотиды являются такими, как представлено в настоящем описании выше. Предпочтительно, указанный олигонуклеотид является праймером и/или зондом.

Дополнительные предпочтительные варианты осуществления относятся к набору, подходящему для количественного анализа PTST, BCTF и BCTT, где указанный набор содержит следующие реагенты:

- праймер, содержащий или состоящий из SEQ ID NO: 24, праймер, содержащий или состоящий из SEQ ID NO: 25, или последовательностей с по меньшей мере 80% идентичности в отношении любой из них;

- праймер, содержащий или состоящий из SEQ ID NO: 26, праймер, содержащий или состоящий из SEQ ID NO: 27, или последовательностей с по меньшей мере 80% идентичности в отношении любой из них; и

- праймер, содержащий или состоящий из SEQ ID NO: 30, праймер, содержащий или состоящий из SEQ ID NO: 31, или последовательностей с по меньшей мере 80% идентичности в отношении любой из них; и

- необязательно, олигонуклеотид, подходящий для количественного анализа эубактерий (предпочтительно, праймер, содержащий или состоящий из SEQ ID NO: 5, праймер, содержащий или состоящий из SEQ ID NO: 6, праймер, содержащий или состоящий из SEQ ID NO: 14, или праймер, содержащий или состоящий из SEQ ID NO: 15, или последовательности с по меньшей мере 80% идентичности в отношении любой из них);

- необязательно, дополнительно содержащий инструкции по использованию указанных реагентов в определении уровней указанных бактериальных маркеров в образце кала, выделенном из индивидуума.

В предпочтительных вариантах осуществления указанная последовательность с по меньшей мере 80% идентичности является последовательностью, на по меньшей мере приблизительно 85%, предпочтительно - по меньшей мере приблизительно 90%, более предпочтительно - по меньшей мере приблизительно 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной референсной последовательности. Процент идентичности между двумя последовательностями можно определять любыми известными в этой области способами, например, с помощью алгоритма глобального выравнивания Needleman и Wunsch.

Кроме того, указанный набор может дополнительно содержать олигонуклеотиды, специфические для других генов или бактериальных маркеров, как представлено в настоящем описании выше. Например, где указанные другие бактериальные маркеры выбраны из группы, состоящей из B10, B46, B48, CINT, RSBI, Faecalibacterium prausnitzii, F. prausnitzii PHGI, F. prausnitzii PHGII и E. coli.

Указанный набор может содержать дополнительные реагенты. В конкретном варианте осуществления указанный набор содержит реагенты для осуществления реакции ПЦР в реальном времени, как правило, содержащие ДНК-полимеразу, такую как ДНК-полимераза Taq (например, ДНК-полимераза Taq с горячим стартом), буфер, магний, dNTP и, необязательно, другие средства (например, стабилизирующие средства, такие как желатин и бычий сывороточный альбумин). Кроме того, реакционные смеси для ПЦР в реальном времени также содержат реагенты для детекции в реальном времени и количественного анализа продуктов амплификации как представлено выше в настоящем описании.

Необязательно, набор также может включать подходящие пробирки и растворители для выделения ДНК, например, раствор хлороформ/метанол. Кроме того, набор также может содержать резервуар для сбора образца кала и, необязательно, любой буфер и/или добавки, подходящие для сохранения образца, например трубчатый коллектор для FIT, используемый в примерах. Другие предпочтительные признаки и варианты осуществления набора по изобретению являются такими, как представлено на всем протяжении настоящего описания.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение также относится к набору, как представлено в настоящем описании, для применения в способе скрининга, диагностики и/или мониторинга AN, AA и/или CRC, как представлено в настоящем описании.

Предполагают, что любые признаки, представленные в настоящем описании, необязательно, можно комбинировать с любыми вариантами осуществления любого способа, медицинского применения, набора и применения набора по изобретению; и любой вариант осуществления, обсуждаемый в настоящем описании, можно осуществлять с учетом любого из них. Следует понимать, что конкретные варианты осуществления, представленные в настоящем описании, приведены в иллюстративных целях, а не для ограничения изобретения.

Все публикации и патентные заявки включены в настоящее описание в качестве ссылки в той степени, как если бы каждая отдельная публикация или патентная заявка была конкретно и отдельно указана как включенная в качестве ссылки.

Использование термина в единственном числе может означать "один", но также соответствует значению "один или более", "по меньшей мере один" и "один или более". Использование термина "другой" также может относиться к одному или более. Использование термина "или" в формуле изобретения используют для обозначения "и/или", если конкретно не указано для обозначения только альтернатив или альтернативы не являются взаимоисключающими.

Как используют в настоящем описании и формуле изобретения, термины "содержащий" (и любая его форма, такая как "содержат" и "содержит"), "имеющий" (и любая его форма, такая как "имеют" и "имеет"), "включающий" (и любая его форма, такая как "включает" и "включают") являются включительными или неограничивающими и не исключают дополнительные, неперечисленные элементы или стадии способа. Термин "содержит" также включает и конкретно означает термины "состоит из" и "состоит, по существу, из". В рамках изобретения фраза "состоящий, по существу, из" ограничивает объем формулы изобретения определенными материалами или стадиями и материалами или стадиями, которые не влияют существенно на основные и новые характеристики описываемого в заявке изобретения. В рамках изобретения фраза "состоящий из" исключает любой элемент, стадию или ингредиент, не определенный в формуле изобретения, за исключением, например, включений, как правило, ассоциированных с элементом или ограничением.

В рамках изобретения термин "или их комбинации" относится ко всем пермутациям и комбинациям указанных пунктов, предшествующих термину. Например, выражение "A, B, C или их комбинации" предназначено для включения по меньшей мере одного из: A, B, C, AB, AC, BC или ABC, а также, если порядок важен в определенном контексте, BA, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC или CAB. Продолжая с этим примером, конкретно включены комбинации, содержащие повторы одного или более пунктов или терминов, таких как BB, AAA, AB, BBC, AAABCCCC, CBBAAA, CABABB и т.д. Специалистам в этой области будет понятно, что, как правило, нет ограничений количества пунктов или терминов в любой комбинации, если иное очевидно из контекста.

В рамках изобретения термины приближения, такие как, в качестве неограничивающих примеров, "приблизительно", относятся к состоянию, которое, когда его модифицируют таким образом, понимают как не являющееся обязательно абсолютным или идеальным, но считающееся достаточно близким специалистами в этой области, чтобы гарантировать обозначение состояния как имеющего место. Степень, с которой можно варьировать описание, будут зависеть от того, насколько большое изменение можно вносить притом, что специалист в этой области все равно будет понимать модифицированный признак, как имеющий необходимые характеристики и возможности немодифицированного признака. В основном, но это является предметом предшествующего обсуждения, числовое значение в настоящем описании, модифицированное с помощью термина приближения, такого как "приблизительно", может варьироваться относительно указанного значения на ±1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10%. Таким образом, термин "приблизительно" может означать указанное значение ±5% от этого значения, предпочтительно - указанное значение ±2% от этого значения, наиболее предпочтительно - термин "приблизительно" означает точно указанное значение (±0%).

Следующие примеры предназначены для иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует истолковывать как ограничение его объема.

ЧАСТЬ ФОРМУЛЫ ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ повышения специфичности или снижения доли ложноположительных результатов анализа кала на скрытую кровь (FOBT) для скрининга, диагностики и/или мониторинга колоректальной неоплазии на поздней стадии (AN), аденомы на поздней стадии (AA) и/ или колоректального рака (CRC) у индивидуума, где указанный FOBT включает определение наличия скрытой крови в образце кала, выделенном из индивидуума; и где указанный способ дополнительно включает количественный анализ в образце кала, выделенном из указанного индивидуума, по меньшей мере следующих бактериальных маркеров:

- Peptostreptococcus stomatis (PTST),

- Bacteroides fragilis (BCTF) и

- Bacteroides thetaiotaomicron (BCTT);

где термин "колоректальная неоплазия на поздней стадии (AN)" включает CRC и аденому на поздней стадии (AA).

2. Способ скрининга, диагностики и/или мониторинга AN, AA и/или CRC у индивидуума-человека, включающий:

a) осуществление FOBT на образце кала, выделенном из указанного индивидуума, где FOBT включает определение наличия скрытой крови в указанном образце кала;

b) количественный анализ по меньшей мере бактериальных маркеров, состоящих из Peptostreptococcus stomatis (PTST), Bacteroides fragilis (BCTF) и Bacteroides thetaiotaomicron (BCTT), в образце кала, выделенном из указанного индивидуума;

c) вычисление комбинированного показателя из уровней бактериальных маркеров, определенных на стадии b); и

d) классификацию FOBT-положительного индивидуума как имеющего повышенный риск развития AN, AA и/или CRC в соответствии с комбинированным показателем, полученным на стадии c).

3. Способ по п. 1, где комбинированный показатель, вычисленный на стадии c), пропорционален количеству PTST и BCTF и обратно пропорционален количеству BCTT; где чем выше показатель, тем выше вероятность развития AN, AA и/или CRC.

4. Способ по любому из пп. 2 или 3, где на стадии d) указанный способ включает сравнение комбинированного показателя в образце индивидуума с референсным комбинированным показателем; и где повышение комбинированного показателя в образце индивидуума относительно указанного референсного комбинированного показателя является показателем AN, AA и/или CRC.

5. Способ скрининга, диагностики и/или мониторинга AN, AA и/или CRC у индивидуума-человека, включающий стадии a) и b) по п. 2, где указанный способ дополнительно включает:

e) сравнение количества PTST, BCTF и BCTT в образце кала с соответствующими референсными значениями;

f) где повышенное количество PTST и BCTF и сниженное количество BCTT в образце FOBT-положительного индивидуума относительно соответствующего референсного значения является показателем AN, AA и/или CRC.

6. Способ по любому из пп. 1-5, где указанный индивидуум является индивидуумом, как предполагают, имеющим CRC.

7. Способ по любому из пп. 1-5, где указанный индивидуум является индивидуумом без симптомов.

8. Способ по п. 7, где указанный индивидуум является индивидуумом с промежуточным или высоким риском CRC; где индивидуум с промежуточным риском CRC является индивидуумом возрастом 50 лет или более без индивидуального или семейного фона CRC; и где индивидуум имеет повышенный и/или высокий риск CRC.

9. Способ по любому из пп. 1-8, где указанный CRC является аденокарциномой.

10. Способ по любому из пп. 1-9, где указанный FOBT является FOBT с гваяковой пробой или иммунохимическим тестом на скрытую кровь в кале (FIT), с помощью которого количественно определяют гемоглобин человека (hHb).

11. Способ по любому из пп. 1-10, где указанный FOBT является иммунохимическим тестом на скрытую кровь в кале (FIT), с помощью которого количественно определяют гемоглобин человека (hHb).

12. Способ по п. 11, где FIT-положительный индивидуум имеет уровни hHb, равные или превышающие 10 мкг hHb/г кала (пороговое значение FIT50) или равные или превышающие 20 мкг hHb/г кала (пороговое значение FIT100), предпочтительно, где FIT-положительный индивидуум имеет уровни hHb, равные или превышающие 10 мкг hHb/г кала (пороговое значение FIT50).

13. Способ по любому из пп. 1-12, где указанный способ дополнительно включает количественный анализ одного или более бактериальных маркеров, выбранных из группы, состоящей из B10 (SEQ ID NO: 7), B46 (SEQ ID NO: 8), B48 (SEQ ID NO: 9), Gemella morbillorum (GMLL), Roseburia intestinalis (RSBI), Collinsella intestinalis (CINT), Faecalibacterium prausnitzii и/или любой из его филогрупп и Escherichia coli (ECO).

14. Способ по любому из пп. 1-13, где определение уровней PTST, BCTF и BCTT и, необязательно, бактериальных маркеров по п. 13 осуществляют способом молекулярной биологии, выбранным из группы, состоящей из секвенирования нового поколения, количественной ПЦР (qPCR), ПЦР-пиросеквенирования, ПЦР-ELISA, ДНК-микрочипов, гибридизации ДНК с использованием разветвленных зондов, дот-блота, флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) и мультиплексных версий указанных способов.

15. Способ по п. 14, где указанный способ молекулярной биологии является qPCR, предпочтительно, где количественные уровни выражают как значение Ct.

16. Способ по любому из пп. 1-15, где уровни PTST, BCTF и BCTT и, необязательно, уровни бактериальных маркеров по п. 12 выражают как относительное количество, предпочтительно, в отношении уровней эубактерий (EUB).

17. Способ по любому из пп. 1-16, где перед количественным анализом PTST, BCTF и BCTT и, необязательно, бактериальных маркеров по п. 12 ДНК выделяют из образца кала.

18. Способ по любому из пп. 1-17, где FOBT и количественный анализ PTST, BCTF и BCTT и, необязательно, бактериальных маркеров по п. 12 осуществляют на том же образце кала.

19. Способ по любому из пп. 1-18, где указанный способ дополнительно включает хранение результатов способа на носителе данных, предпочтительно, где указанный носитель данных является машиночитаемым носителем.

20. Компьютеризованный способ, где способ является таким, как определено в любых из пп. 1-19.

21. Устройство для обработки данных, содержащее средства для осуществления стадий способа по п. 20.

22. Набор, подходящий для количественного анализа PTST, BCTF и BCTT, где указанный набор содержит следующие реагенты:

- олигонуклеотид, специфический для SEQ ID NO: 2;

- олигонуклеотид, специфический для SEQ ID NO: 3; и

- олигонуклеотид, специфический для SEQ ID NO: 4;

- необязательно, олигонуклеотид, подходящий для количественного анализа эубактерий;

необязательно, дополнительно содержащий инструкции по использованию указанных реагентов в определении уровней указанных бактериальных маркеров в образце кала, выделенном из индивидуума.

23. Набор по п. 22, где:

- олигонуклеотид, специфический для SEQ ID NO: 2, является олигонуклеотидом, содержащим или состоящим из любой из SEQ ID NO: 24, или SEQ ID NO: 25, или последовательностей с по меньшей мере 80% идентичности в отношении любой из них; и/или

- олигонуклеотид, специфический для SEQ ID NO: 3, является олигонуклеотидом, содержащим или состоящим из любой из SEQ ID NO: 26, или SEQ ID NO: 27, или последовательностей с по меньшей мере 80% идентичности в отношении любой из них; и/или

- олигонуклеотид, специфический для SEQ ID NO: 4, является олигонуклеотидом, содержащим или состоящим из любой из SEQ ID NO: 30, или SEQ ID NO: 31, или последовательностей с по меньшей мере 80% идентичности в отношении любой из них; и/или

- олигонуклеотид подходящий для количественного анализа эубактерий является олигонуклеотидом, содержащим или состоящим из любой из SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 14, или SEQ ID NO: 15, или последовательностей с по меньшей мере 80% идентичности в отношении любой из них.

24. Применение набора по любому из пп. 22 или 23 в способе скрининга, диагностики и/или мониторинга AN, AA и/или CRC по любому из пп. 1-20.

25. Способ лечения индивидуума, имеющего AN, AA и/или CRC, где указанный индивидуум выбран способом скрининга, диагностики и/или мониторинга по любому из пп. 1-20, и где указанный способ дополнительно включает введение индивидууму противоопухолевого терапевтического средства.

26. Способ выбора индивидуума для осуществления поискового исследования, выбранного из группы, состоящей из колоноскопии, сигмоидоскопии гибким эндоскопом, ирригоскопии с двойным контрастированием и компьютерной (КТ) колонографии, предпочтительно, для осуществления колоноскопии, где указанный индивидуум выбран способом скрининга, диагностики или мониторинга по любому из пп. 1-20.

ПРИМЕРЫ

Пример 1 - Материал и способы

Исследуемая популяция

Набирали когорту, состоящую из 333 последовательных пациентов со связанными с CRC симптомами, направленными на диагностическую колоноскопию в рамках первичной и вторичной медицинской помощи в Complexo Hospitalario de Ourense (Ourense, Spain), (таблица 1). Критерии исключения представляли собой: (1) индивидуумы без симптомов, подвергаемые колоноскопии для скрининга CRC, (2) пациенты с заболеванием толстого кишечника в анамнезе, подвергаемые колоноскопии для наблюдения, (3) пациенты, которым требуется госпитализация, (4) пациенты, симптомы которых прекратились в пределах 3 месяцев до оценки, и (5) пациенты, подвергнутые лечению антибиотиками в пределах последнего месяца перед включением. Протокол исследования одобрен Biobanco del Complexo Hospitalario Universitario de Vigo (Vigo, Spain). Письменное информированное согласие получали от всех пациентов в исследовании.

Таблица 1. Характеристики пациентов, классифицируемые по диагностической колоноскопии. Hb, гемоглобин; FIT100 (20 мкг Hb/г кала); CRC, колоректальный рак; AA, аденома на поздней стадии; NAA, аденома на ранней стадии; NC, нормальная колоноскопия

Характеристика CRC AA NAA NC n (%) 48 (14,4) 30 (9) 88 (26,4) 167 (50,2) Возраст (среднее, диапазон) 73 (53-91) 65 (44-83) 67 (37-89) 61 (20-87) Пол, женский (%) 17 (10) 15 (8,8) 32 (18,8) 106 (62,4) FIT100 (%) 47 (97,9) 18 (60) 30 (34,1) 21 (12,6)

Всех индивидуумов подвергали колоноскопии для определения статуса толстой и прямой кишки. Основываясь на результатах эндоскопического исследования и патологического анализа, диагноз классифицировали по четырем группам: нормальная колоноскопия (колоноскопия без признаков или с гиперпластическими полипами сигмовидной и/или прямой кишки <10 мм), аденомы на ранней стадии (тубулярные аденомы <10 мм с дисплазией низкой степени и зубчатые полипы <10 мм без дисплазии), аденомы на поздней стадии (аденомы >10 мм или с ворсинчатым компонентом или дисплазией высокой степени, зубчатые полипы >10 мм или с дисплазией, и аденокарцинома pTis) и инвазивный CRC. Пациентов, у которых диагностирован CRC, также классифицировали по стадии опухоли (таблица 2). Индивидуумов также просили заполнить опросник для регистрации клинических и эпидемиологических данных.

Таблица 2. Пациенты с колоректальным раком по стадии TNM опухоли. CRC, колоректальный рак

Стадия CRC n (%) 0 3 I 6 II 10 III 21 IV 8

Сбор образцов кала

Участников просили собирать образец кала от одной дефекации в стерильный контейнер для кала перед колоноскопией и перед очищением кишечника. Образцы незамедлительно замораживали после получения. Затем индивидуумы приносили образцы в клинику, где их хранили замороженными при -20°C в случае кратковременного хранения и хранили при -80°C после прибытия в GoodGut S.L. в Girona (Spain). Всего 11 индивидуумов исключали из исследования из-за неправильного сбора образцов кала.

Выделение ДНК из образцов кала

Геномную ДНК выделяли из замороженных образцов кала после гомогенизации с использованием набора NucleoSpin Soil (Macherey-Nagel GMbH & Co., Duren, Germany). Следуя инструкциям производителя, ДНК в конечном итоге элюировали в 100 мкл конечного объема элюирующего буфера SE и хранили при -20°C до использования. Концентрацию ДНК определяли с помощью флуориметрического количественного анализа Qubit (ThermoFisher Scientific, Waltham, USA). Все образцы доводили до конечной концентрации 8 нг/мкл и снова количественно анализировали.

Анализ qPCR биомаркеров CRC

Использовали десять целевых специфических бактериальных последовательностей: Eubacteria (EUB), B10 (лучшее совпадение BLAST Faecalibacterium prausnitzii), B46 (лучшее совпадение BLAST Subdoligranulum variabile), B48 (лучшее совпадение BLAST Ruminococcus sp., Roseburia sp., Coprococcus sp.), Roseburia intestinalis (RSBI); Gemella morbillorum (GMLL), Peptostreptococcus stomatis (PTST), Bacteroides fragilis (BCTF), Collinsella intestinalis (CINT) и Bacteroides thetaiotaomicron (BCTT).

Количественный анализ разных биомаркеров осуществляли, подготавливая отдельную реакцию для каждого биомаркера с использованием мастер-микса SYBR Green (Promega, Madison, USA). Каждая реакционная смесь состояла из 20 мкл, содержащих 1-кратный мастер-микс GoTaq qPCR, от 150 нМ до 300 нМ каждого праймера и до 20 нг матрицы геномной ДНК. Видоспецифические праймеры, используемые в этом исследовании, приведены в таблице 3 и приобретены в Macrogen (Macrogen, Seoul, South Korea).

Таблица 3. Прямые и обратные праймеры, используемые в настоящем исследовании. EUB, эубактерии; B10, B46, B48, GMLL, Gemella morbillorum; PTST, Peptostreptococcus stomatis; BCTF, Bacteroides fragilis; CINT, Colinsella intestinalis; BCTT, Bacteroides thetaiotaomicron; RSBI, Roseburia intestinalis

Мишень Праймеры SEQ ID NO: Последовательность 5'→3' Концентрация праймера Ссылки EUB EUB_F SEQ ID NO: 14 ACT CCT ACG GGA GGC AGC AGT 200 нМ Модифицированный
(Matsuda et a.l, 2011) EUB_R SEQ ID NO: 15 GTA TTA CCG CGG CTG CTG GCA C B10 B10_F SEQ ID NO: 16 CAA CAA GGT AAG TGA CGG C 300 нМ (Mas de Xaxars Rivero, 2012; Serra-Pagès et al., 2015) B10_R SEQ ID NO: 17 CGC CTA CCT GTG CAC TAC TC B46 B46_F SEQ ID NO: 18 TCC ACG TAA GTC ACA AGC G 300 нМ (Mas de Xaxars Rivero, 2012; Serra-Pagès et al., 2015) B46_R SEQ ID NO: 19 CGC CTA CCT GTG CAC TAC TC B48 B48_F SEQ ID NO: 20 GTA CGG GGA GCA GCA GTG 300 нМ (Mas de Xaxars Rivero, 2012; Serra-Pagès et al., 2015) B48_R SEQ ID NO: 21 GAC ACT CTA GAT GCA CAG TTT CC GMLL GMLL_F SEQ ID NO: 22 AAG AGT TCC AAG GCG TTC TC 150 нМ Настоящее исследование GMLL_R SEQ ID NO: 23 CCA TTT CAA GAT CCG CTT TCT ATT T PTST PTST_F SEQ ID NO: 24 AGG TTG ATG CTC TGA GTA GTA G 150 нМ Настоящее исследование PTST_R SEQ ID NO: 25 ATG AAT ACT AGC CTC TCC TCT TT BCTF BCTF_F SEQ ID NO: 26 TGA AAG CGT GCT CTT ACT ATT G 150 нМ Настоящее исследование BCFT_R SEQ ID NO: 27 TAT TGG CTG TTG TGC TTT GT CINT CINT_F SEQ ID NO: 28 GAC CAT CAT GAA CTC TTC CTC 150 нМ Настоящее исследование CINT_R SEQ ID NO: 29 CCG TTG CCT TCC AGT TC BCTT BCTT_F SEQ ID NO: 30 AGT GAC CTG AAA GAA TCC TAA T 150 нМ Настоящее исследование BCTT_R SEQ ID NO: 31 GAC CGT CAA TAC CGA GAA AC RSBI RSBI_F SEQ ID NO: 32 GTG CCA GTA ACA GTC CAT ATT 150 нМ Настоящее исследование RSBI_R SEQ ID NO: 33 TAG CAA AGC AGA GTG GAA AG

Все реакции количественной ПЦР проводили с помощью системы для ПЦР в реальном времени AriaMx (Agilent Technologies, Santa Clara, USA). Термические профили отличались в соответствии с анализируемым биомаркером (таблица 4). Стадию кривой плавления добавляли в конце каждой qPCR для проверки наличия ожидаемого размера ампликона, а также для контроля образования димеров праймеров. Данные собирали и анализировали с помощью программного обеспечения Aria версии 1.3 (Agilent Technologies, Santa Clara, USA). Все образцы амплифицировали в двух параллелях, считающихся достоверными, если различие между пороговыми циклами (Ct) составляло менее 0,6. Динамический диапазон, состоящий из 8 логарифмов от 10 до 10⁸ единиц генома/мкл, определяли для каждого биомаркера и использовали для вычисления относительного количества. В каждый эксперимент ПЦР включали контрольную реакционную смесь без матрицы.

Таблица 4. Условия qPCR для EUB, эубактерий; B10, B46, B48, GMLL, Gemella morbillorum; PTST, Peptostreptococcus stomatis; BCTF, Bacteroides fragilis; CINT, Colinsella intestinalis; BCTT, Bacteroides thetaiotaomicron; RSBI, Roseburia intestinalis

Бактериальные маркеры Общее количество циклов Денатурация Отжиг и элонгация Кривая плавления Tª (°C) Время (мин:
сек) Tª (°C) Время (мин:
сек) Tª (°C) Время (мин:
сек) EUB 40 95 10:00 95
54 00:15
01:00 95
55
95 01:00
00:30
00:30 B10, B46, B48 40 95 10:00 95
62 00:15
00:45 95
55
95 01:00
00:30
00:30 GMLL, PTST, CINT, BCTT, RSBI 40 95 10:00 95
60 00:15
01:00 95
55
95 01:00
00:30
00:30 BCTF 40 95 10:00 95
55
72 00:15
00:30
01:00 95
55
95 01:00
00:30
00:30

Анализ FIT

Анализ FIT осуществляли в Complexo Universitario de Ourense, используя тот же образец, который использовали в анализе CRC-специфических биомаркеров. Образцы кала для определения гемоглобина в кале анализировали с использованием трубчатого коллектора OC-Sensor и анализ осуществляли с использованием автоматизированного OC-Sensor, с помощью которого определяют желудочно-кишечное кровотечение, ассоциированное с нарушениями, такими как CRC, полипы и дивертикулит (Eiken Chemical Co., Tokyo, Japan), как описано ранее в Cubiella, J. et al., 2016. Буфер для образцов в пробирках для образцов OC-Sensor обеспечивает оптимальную стабильность и безопасную транспортировку образцов от сбора до анализа. Положительными были анализы с концентрацией гемоглобина в кале, равной или превышающей 100 нг/мл (20 мкг Hb/г кала; FIT100).

Статистический анализ

В терминах качественного анализа отсутствие биомаркера рассматривали, если полученное значение Ct не входило в динамический диапазон. Все статистические анализы осуществляли с использованием статистического пакета SPSS 23.0 (IBM, NYC, USA). Уровни значимости задавали как значения P ≤0,05.

Нормальность данных оценивали с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. Непараметрический критерий Краскела-Уоллиса использовали для тестирования различий переменных в более чем двух категориях. Попарное сравнение подкатегорий этих переменных анализировали с использованием критерия Манна-Уитни. Поправку Бонферрони использовали в качестве поправки на множественные сравнения. Все сравнения с использованием бактериальных маркеров осуществляли между относительными количествами, нормализуемыми по динамическому диапазону каждого бактериального маркера.

Анализ кривой операционных характеристик приемника (ROC) использовали для определения пригодности каждого биомаркера для различения разных статусов неоплазии толстого кишечника. Точность дискриминации измеряли с помощью площади под кривой ROC (AUC).

Машинное обучение использовали для определения, с помощью каких из исследуемых переменных (пол, возраст, BMI, курение, бактериальные маркеры, FIT) в комбинации можно различать индивидуумов с очагами неоплазии на поздней стадии и индивидуумов с нормальной колоноскопией или аденомами на ранней стадии. Конкретная методология состояла из итерации исходного обучения на 100 случайных разбиениях массива данных и дальнейшей валидации прогностических моделей, полученных с использованием 4 разных алгоритмов машинного обучения (нейронная сеть, логистическая регрессия, дерево градиентного бустинга, алгоритм случайного леса). В конечном счете конструировали RAID-CRC с использованием комбинации четырех бактериальных маркеров, анализируемых совместно с результатами FIT.

Пример 2 - Биомаркеры кала при прогрессировании неоплазии

Относительное количество каждого бактериального маркера определяли для каждого диагноза (нормальная колоноскопия, аденома на ранней стадии, аденома на поздней стадии, CRC) (фиг. 1). Независимо от диагноза при колоноскопии, три разных бутират-продуцирующих вида (B10, B46 и B48) являлись преобладающими биомаркерами со значениями относительного количества 20,4%, 19,0% и 20,0%, соответственно. GMLL и PTST находились в значимо большем избытке в популяции с CRC, чем у индивидуумов с нормальной колоноскопией (p=0,006 и p<0,001, соответственно) или индивидуумов с аденомой на ранней стадии (p=0,047 и p<0,001, соответственно). Хотя и без значимых различий, можно наблюдать тенденцию B46, больше преобладающего у пациентов с CRC, чем у индивидуумов с аденомами на поздней стадии (p=0,087). Примечательно, что относительное количество EUB оставалось постоянным, независимо от статуса неоплазии. Сравнение разных стадий CRC (0, I, II, III и IV) не показало значимых различий относительного количества любого бактериального маркера.

Пример 3 - С помощью GMLL, PTST и BCTF можно определять очаги неоплазии на поздней стадии

Относительное количество бактериальных маркеров сравнивали после группирования индивидуумов следующим образом: (1) нормальная колоноскопия, (2) неоплазия (аденома на ранней стадии+аденома на поздней стадии+CRC), (3) неоплазия на поздней стадии (аденома на поздней стадии+CRC) и (4) CRC (фиг. 2). Обнаруживали, что PTST сильно коррелировали с очагами неоплазии (p<0,001). В отношении очагов неоплазии на поздней стадии GMLL, PTST и BCTF являлись потенциальными биомаркерами для их детекции (p=0,006, p<0,001 и p=0,030, соответственно). В терминах преобладания, эти три условно-патогенных микроорганизма чаще обнаруживали у пациентов с неоплазией на поздней стадии (GMLL, 64,9%; PTST, 58,4%; и BCTF, 44,7%), чем у здоровых индивидуумов (GMLL, 53,5%; PTST, 26,1%; и BCTF, 29,8%).

Результаты, полученные авторами настоящего изобретения, четко свидетельствуют о наличии бактериального дисбиоза у пациентов с CRC. Исследуемые бактериальные маркеры классифицировали по связанными со здоровьем кишечника фенотипами: продуценты бутирата (B10, B46, B48, RSBI), условно-патогенные микроорганизмы (GMLL, PTST, BCTF), продуценты водорода и кислорода (CINT), и сахаролитические виды (BCTT) (фиг. 3). Обнаруживали, что относительное количество этих фенотипов изменяется прогрессивно с прогрессированием статуса заболевания. В частности, сравнивая индивидуумов с нормальной колоноскопией и индивидуумов с CRC, обнаруживали снижение относительного количества продуцентов бутирата, замещенных группой патогенных бактерий, больше преобладающих у индивидуумов с CRC и аденомой на поздней стадии, чем у индивидуумов с нормальной колоноскопией.

Результаты, полученные авторами настоящего изобретения, свидетельствуют о том, что высокие относительные количества PTST и BCTF коррелируют с неоплазией на поздней стадии, в то время как относительное количество BCTT коррелирует со здоровыми индивидуумами. BCTT является комменсальной бактерией, часто обнаруживаемой в микробиоте кишечника здоровых индивидуумов. Обнаружено, что комменсальные бактерии снижают воспаление в кишечнике и участвуют в резистентности к колонизации (Macfarlane & Macfarlane, 2012; Baümler & Sperandio, 2016). Таким образом, высокие относительные количества BCTT коррелируют с хорошим состоянием кишечника.

Пример 4 - Комбинация бактериальных маркеров CRC и FIT позволяет значительно снижать ложноположительные результаты

С одной стороны, когда использовали FIT100 (20 мкг Hb/г кала), наблюдали значимые различия между индивидуумами с нормальной колоноскопией или аденомами на ранней стадии и неоплазией на поздней стадии (p<0,001). У 17,1% (19) индивидуумов, у которых была нормальная колоноскопия, и 24,3% (27) индивидуумов, имевших аденомы на ранней стадии, определяли FIT-положительные значения. Эти результаты приводили к получению чувствительности и специфичности 84,0% и 81,0%, соответственно, и прогностической ценности положительного и отрицательного результата 58,0% и 94,0%, соответственно (AUC=0,828, 95,0% CI (0,773-0,883)), для детекции неоплазии на поздней стадии. С другой стороны, когда использовали FIT50 (10 мкг Hb/г кала), у 21,1% (27) индивидуумов, у которых была нормальная колоноскопия, и 24,2% (31) индивидуумов, имевших аденомы на ранней стадии, определяли ложноположительный результат. FIT50 приводило к получению чувствительности и специфичности 91,0% и 76,0%, соответственно, и прогностической ценности положительного и отрицательного результата 55,0% и 96,0%, соответственно (AUC=0,836, 95,0% CI (0,787-0,886)), при детекции неоплазии на поздней стадии. Значения чувствительности для бактериальных маркеров в отдельности были гораздо ниже, составляя 39,0% для GMLL (AUC=0,622, 95,0% CI (0,541-0,694)), 53,0% для PTST (AUC=0,710, 95,0% CI (0,628-0,776) и 33,0% для BCTF (AUC=0,571, 95,0% CI (0,499-0,656)), в то время как значения специфичности были сравнимыми.

Результаты FIT с использованием FIT100 и FIT50 комбинировали с бактериальными маркерами кала для определения того, что обеспечивает более высокие характеристики в терминах значений чувствительности и специфичности для детекции очагов неоплазии на поздней стадии. Комбинация бактериальных маркеров и FIT100 (RAID CRC - FIT 100) приводила к достижению чувствительности 76,0% и специфичности 91,0% (таблица 5). Несмотря на это, результаты немного улучшали с использованием FIT50 (RAID CRC - FIT50), т.к. наблюдали на 4,0% более высокую чувствительность (80,0%) со схожими значениями специфичности при детекции неоплазии на поздней стадии, являющуюся таким образом, выбранным пороговым значением. Таким образом, предпочтительный анализ смещен по комбинации EUB, PTST, BCTF и BCTT, при этом концентрация гемоглобина в кале равна или превышает 50 нг/мкл (10 мкг Hb/г кала). Хотя BCTT не демонстрировала значимых различий между индивидуумами с нормальной колоноскопией или аденомами на ранней стадии и индивидуумами с неоплазией на поздней стадии, при комбинировании с EUB, PTST и BCTF можно было повышать специфичности анализа.

Таблица 5. Диагностические характеристики RAID-CRC (с использованием FIT100 и FIT50), FIT100 и FIT50 исследуемой популяции без симптомов по сравнению с FIT100 скрининговой популяции. FIT100 (20 мкг гемоглобин/г кала); FIT50 (10 мкг гемоглобин/г кала); PPV, прогностическая ценность положительного результата; NPV, прогностическая ценность отрицательного результата

Чувствительность (%) Специфичность (%) PPV
(%) NPV
(%) RAID-CRC
(с использованием FIT100) Аденома на поздней стадии 50 91 40 94 Колоректальный рак 93 87 55 99 Неоплазия на поздней стадии 76 91 72 92 RAID-CRC
(с использованием FIT50) Аденома на поздней стадии 59 90 43 95 Колоректальный рак 94 85 51 99 Неоплазия на поздней стадии 80 90 70 94 FIT100
(настоящее исследование) Аденома на поздней стадии 62 81 28 95 Колоректальный рак 98 75 42 99 Неоплазия на поздней стадии 84 81 58 94 FIT50
(настоящее исследование) Аденома на поздней стадии 76 76 28 96 Колоректальный рак 100 71 38 100 Неоплазия на поздней стадии 91 76 55 96 FIT100
(Chiu, et al 2016; Bailey et al, 2016) Аденома на поздней стадии 28 93 13 97 Колоректальный рак 78 92 2 99 Неоплазия на поздней стадии 30 93 15 97

Конечный анализ (анализ RAID CRC - FIT50) включает комбинацию FIT50 и количественные уровни трех бактериальных маркеров, нормализованных по эубактериям (PTST/EUB, BCTF/EUB, BCTT/EUB), где количественные уровни выражают как значение Ct.

Использование соотношений делало возможной нормализацию данных, являющуюся критической для контроля qPCR-ассоциированных переменных для дифференциации истинных биологических изменений и экспериментально индуцированных вариаций (Vandesompele et al, 2002). Снижение порогового значения концентрации гемоглобина в кале с 100 нг/мкл до 50 нг/мкл в анализе RAID CRC - FIT 50 позволяло фиксировать положительных индивидуумов, которых в ином случае посчитали бы ложноотрицательными при использовании порогового значения 100 нг/мкл, за счет повышения доли ложноположительных результатов. Однако, этот эффект размывался при комбинировании с бактериальными маркерами, т.к. анализ RAID CRC - FIT 50 приводил к важному снижению ложноположительных результатов из-за повышения специфичности в случае детекции неоплазии на поздней стадии в отношении FIT50 и FIT100 (таблица 5).

Использование анализа RAID CRC - FIT50 для детекции неоплазии на поздней стадии приводило к снижению количества ложноположительных результатов в отношении FIT100, при этом 9,7% индивидуумов имели нормальную колоноскопию, и 11,7% индивидуумов имели аденомы на ранней стадии. В совокупности, показано, что анализ RAID-CRC - FIT50 обеспечивал чувствительность и специфичность 80,0% и 90,0% (AUC=0,837, 95,0% CI (0,730-0,944)), соответственно, и прогностическую ценность положительного и отрицательного результата 70,0% и 94,0%, соответственно. Что более важно, доля ложноположительных результатом снижалась на 50,0%, при этом 46 индивидуумов имели ложноположительные результаты в случае FIT100 и 23 индивидуумов - в случае анализа RAID-CRC - FIT50. Примечательно, что анализы RAID CRC - FIT 50 и RAID-CRC - FIT 100 позволяли достигать схожей чувствительности для CRC и AN со способом FIT100, но с более высокой специфичностью и прогностической ценностью положительного результата (PPV).

В настоящей работе авторы настоящего изобретения разрабатывали новую методологию, подходящую для использования в национальных программах скрининга CRC с использованием образцов кала. Бактериальные сигнатуры, используемые в настоящей работе, исходно выделяли из образцов слизистой оболочки. Таким образом, их наличие в кале не подвержено выраженной вариабельности, вызванной питанием и некоторыми внешними факторами (Conlon & Bird, 2015; Vandeputte et al, 2015), но является мерой реального относительного количества в слизистой оболочке толстого кишечника. Это позволяет преодолеть значительный фоновый шум, присутствующий в кале, и обеспечивает физиологическую значимость биомаркеров.

В массиве данных, полученных авторами настоящего изобретения, не было метаданных об индексе массы тела (BMI), курении или пищевых привычках. Хотя показано, что эти параметры влияют на состав микробиоты образцов кала (Davis et al, 2017; Yun et al, 2017; Rogers et al, 2012; Capurso & Lahner, 2017; Baothman et al, 2016), как указано выше, биомаркеры получали из образцов слизистой оболочки, которые не так зависят от внешних факторов (Watt et al, 2016; Durbán et al, 2011). Biedermann et al описывали, что отказ от курения повышает разнообразие микроорганизмов (Biedermann et al, 2013). В других исследованиях наблюдали, что хроническое потребление алкоголя приводит к повышению Proteobacteria и снижению Bacteroidetes (Kakiyama et al, 2013; Rao et al, 2004). Что касается BMI, его эффект в отношении микробиоты является противоречивым (Turnbaugh et al, 2006; Schwiertz et al, 2010; Santacruz et al, 2009). Т.к. анализ RAID-CRC, представленный в настоящем описании, вероятно, будут использовать в условиях скрининга, где на скрининговую популяцию могут влиять различные состояния и привычки, обнаружили, что стратегия без стратификации является хорошим способом воспроизведения с наибольшей надежностью в условиях скрининга CRC.

Рентабельность также является критической проблемой в популяционном скрининге (Sonnenberg et al, 2000; McGrath et al, 2002; Telford et al, 2010). Wong и соавт. проводили сравнение FIT и колоноскопии в этих условиях, показавшее, что FIT был экономически выгодным при скрининге среднего риска, в то время как колоноскопия была экономически выгодной среди индивидуумов с более высоким риском (Wong, 2015). Таким образом, комбинация FIT с бактериальными маркерами кала может быть лучшей в терминах рентабельности, т.к. использование RAID-CRC позволит сэкономить до 30% необязательных колоноскопий. Более конкретно, воплощение RAID-CRC в программе скрининга CRC будет приводить к снижению на 33000 колоноскопий из-за ложноположительных результатов по сравнению с программой скрининга на основе FOBT (55000 относительно 22000 ложноположительных результатов, соответственно) (García et al, 2012). Учитывая, что стоимость RAID-CRC сравнима со стоимостью FOBT, приблизительная экономия на колоноскопиях для последующего наблюдения после положительных результатов скрининга будет составлять €77 миллионов на 100000 участников программы скрининга (таблица 6). Кроме того, используя биомаркеры CRC, представленные в настоящей работе, можно достигать в развитых регионах и регионах с ограниченными ресурсами, где учреждения, в которых можно проводить колоноскопию, ограничены, т.к. RAID-CRC представляет собой потенциально конкурентный, экономичный инструмент в условиях скрининга CRC.

В заключение, RAID-CRC является перспективным инструментов для скрининга CRC из-за его неинвазивности, низкой стоимости и возможности снижения количества ложноположительных результатов, ассоциированных с использованием FOBT (например, FIT).

Таблица 6. Сравнение затрат, ассоциированных с колоноскопией для последующего наблюдения в разных программах скрининга CRC

Фактор Скрининг CRC на основе FIT (Garcia, M. et al., 2012). Скрининг CRC с использованием комбинации gFOBT и профилирования микробиоты (Zeller, G. et al,. 2014) Скрининг CRC с использованием комбинации FIT и бактериальной сигнатуры в кале (RAID-CRC FIT-50) Количество колоноскопий из-за ложноположительных результатов (на 100000 участников скрининга) 47600 24750* 22000 (настоящее исследование) Затраты, ассоциированные с колоноскопией для последующего наблюдения после положительного результата скрининга 111 M €** 70 M €** 51 M €***

*Экономию вычисляли с учетом того, что комбинация FOBT с профилированием микробиоты может повышать чувствительность скрининга на более чем 45% относительно FOBT в отдельности.

**Ассоциированные затраты вычисляли с учетом того, что затраты на анализ составляют €25.

***Ассоциированные затраты вычисляли с учетом того, что затраты на анализ составляют €10.

Ссылки

1. International Agengy for Research on Cancer. GLOBOCAN 2012: Estimated Cancer Incidence, Mortality and Prevalence Worldwide in 2012. Available at: http://globocan.iarc.fr/Pages/fact_sheets_population.aspx. (Accessed: 7th November 2017).

2. Wilson, M. Microbial Inhabitants of Humans: Their Ecology and Role in Health and Disease. (Cambridge, 2005).

3. Brenner, H., Kloor, M. & Pox, C.P. Colorectal cancer. Lancet 383, 1490-1502 (2014).

4. Zauber, A.G. The Impact of Screening on Colorectal Cancer Mortality and Incidence - Has It Really Made a Difference? Dig. Dis. Sci. 60, 681-691 (2015).

5. Elmunzer, B.J. et al. Effect of Flexible Sigmoidoscopy-Based Screening on Incidence and Mortality of Colorectal Cancer: A Systematic Review and Meta-Analysis of Randomized Controlled Trials. PLOS Med. 9, (2012).

6. Rex, D.K. et al. Colorectal Cancer Screening: Recommendations for Physicians and Patients from the U.S. Multi-Society Task Force on Colorectal Cancer. Am. J. Gastroenterol. (2017). doi:10.1038/ajg.2017.174

7. Quintero, E. et al. Colonoscopy versus Fecal Immunochemical Testing in Colorectal-Cancer Screening. N Engl J Med 366, 697-706 (2012).

8. Young, P.E. & Womeldorph, C. M. Colonoscopy for Colorectal Cancer Screening. J. Cancer 4, 217-226 (2013).

9. Rutter, C.M. et al. Adverse Events after Screening and Follow-up Colonoscopy. Cancer Causes Control 23, 289-296 (2012).

10. Sieg, A., Hachmoeller-Eisenbach, U. & Eisenbach, T. Prospective evaluation of complications in outpatient GI endoscopy: A survey among German gastroenterologists. Gastrointest. Endosc. 53, 620-627 (2001).

11. Gatto, N.M. et al. Risk of perforation after colonoscopy and sigmoidoscopy: a population-based study. J. Natl. Cancer Inst. 95, 230-6 (2003).

12. Sanford, K.W. & McPherson, R. A. Fecal Occult Blood Testing. Clin. Lab. Med. 29, 523-541 (2009).

13. Stracci, F., Zorzi, M., Grazzini, G. & Efird, J. T. Colorectal cancer screening: tests, strategies, and perspectives. (2014). doi:10.3389/fpubh.2014.00210

14. Brenner, H. & Tao, S. Superior diagnostic performance of faecal immunochemical tests for haemoglobin in a head-to-head comparison with guaiac based faecal occult blood test among 2235 participants of screening colonoscopy. Eur. J. Cancer 49, 3049-3054 (2013).

15. Shapiro, J.A. et al. A Comparison of Fecal Immunochemical and High-Sensitivity Guaiac Tests for Colorectal Cancer Screening. Nat. Publ. Gr. (2017). doi:10.1038/ajg.2017.285

16. Mousavinezhad, M., Majdzadeh, R., Akbari Sari, A., Delavari, A. & Mohtasham, F. The effectiveness of FOBT vs. FIT: A meta-analysis on colorectal cancer screening test. Med. J. Islam. Repub. Iran 30 (2016).

17. Goede, S.L. et al. Harms, benefits and costs of fecal immunochemical testing versus guaiac fecal occult blood testing for colorectal cancer screening. doi:10.1371/journal.pone.0172864 (2017).

18. Borges-Canha, M., Portela-Cidade, J.P., Dinis-Ribeiro, M., Leite-Moreira, A.F. & Pimentel-Nunes, P. Role of colonic microbiota in colorectal carcinogenesis: A systematic review. Rev esp enfeRm dig 107, 659-671 (2015).

19. Mira-Pascual, L. et al. Microbial mucosal colonic shifts associated with the development of colorectal cancer reveal the presence of different bacterial and archaeal biomarkers. J. Gastroenterol. 50, 167-179 (2014).

20. Sobhani, I. et al. Microbial Dysbiosis in Colorectal Cancer (CRC) Patients. PLoS One 6, (2011).

21. Jun, X. et al. Molecular characterization of mucosal adherent bacteria and associations with colorectal adenomas. Gut Microbes 138-147 (2010). doi:10.1080/19490976.2016.1241933

22. Kostic, A.D. et al. Fusobacterium nucleatum Potentiates Intestinal Tumorigenesis and Modulates the Tumor-Immune Microenvironment. Cell Host Microbe 14, 207-215 (2013).

23. Zackular, J.P., Rogers, M.A.M., Ruffin, M.T. & Schloss, P.D. The human gut microbiome as a screening tool for colorectal cancer. Cancer Prev. Res. (Phila). 7, 1112-21 (2014).

24. Joshi, A.D. et al. Meat intake, cooking methods, dietary carcinogens, and colorectal cancer risk: findings from the Colorectal Cancer Family Registry (2015).

25. Dulal, S. & Keku, T.O. Gut Microbiome and Colorectal Adenomas. Cancer J. 20, 225-231 (2014).

26. Zeller, G. et al. Potential of fecal microbiota for early-stage detection of colorectal cancer. Mol. Syst. Biol. 10, 766-766 (2014).

27. Marchesi, J.R. et al. Towards the Human Colorectal Cancer Microbiome. PLoS One 6, e20447 (2011).

28. Mas de Xaxars Rivero, T. Descripció i quantificació de la microbiota intestinal associada al càncer colorectal. (2012).

29. Serra-Pagès, M., García-Gil, J., Mas de Xarxars, T. & Aldeguer, X. PCT/EP2015/054451. Biomarkers for early detection, risk screening and monitoring of colorectal cancer and adenomatous polyps. (2015).

30. Cubiella, J. et al. Development and external validation of a faecal immunochemical test-based prediction model for colorectal cancer detection in symptomatic patients. BMC Med. 14, 128 (2016).

31. Levin, B. et al. Screening and Surveillance for the Early Detection of Colorectal Cancer and Adenomatous Polyps, 2008: A Joint Guideline from the American Cancer Society, the US Multi-Society Task Force on Colorectal Cancer, and the American College of Radiology. CA. Cancer J. Clin. 58, 130-160 (2008).

32. Brenner, H., Altenhofen, L., Stock, C. & Hoffmeister, M. Prevention, Early Detection, and Overdiagnosis of Colorectal Cancer Within 10 Years of Screening Colonoscopy in Germany. Clin. Gastroenterol. Hepatol. 13, 717-723 (2015).

33. Shah, R. et al. Biomarkers for Early Detection of Colorectal Cancer and Polyps: Systematic Review. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 23, 1712-1728 (2014).

34. Wang, T. et al. Structural segregation of gut microbiota between colorectal cancer patients and healthy volunteers. ISME J. 6, 320-329 (2011).

35. Garrett, W. S. Cancer and the microbiota. Science (80-). 348, 80-86 (2015).

36. Kelly, D. & Mulder, I.E. Microbiome and immunological interactions. Nutr. Rev. (2012). doi:10.1111/j.1753-4887.2012.00498.x

37. Feng, Q. et al. Gut microbiome development along the colorectal adenoma-carcinoma sequence. Nat. Commun. 6, (2015).

38. Gao, Z. et al. Microbiota disbiosis is associated with colorectal cancer. (2015). doi:10.3389/fmicb.2015.00020

39. Zhao, L., Zhang, X., Zuo, T. & Yu, J. The Composition of Colonic Commensal Bacteria According to Anatomical Localization in Colorectal Cancer. Engineering 3, 90-97 (2017).

40. Louis, P., Hold, G.L. & Flint, H.J. The gut microbiota, bacterial metabolites and colorectal cancer. Nat. Rev. Microbiol. 12, 661-672 (2014).

41. L. Sears, C. & S. Garrett, W. Microbes, Microbiota and Colon Cancer. Cell Host Microbe 15, 317-328 (2015).

42. Narayanan, V., Peppelenbosch, M.P. & Konstantinov, S.R. Human fecal microbiome-based biomarkers for colorectal cancer. Cancer Prev. Res. (2014). doi:10.1158/1940-6207.CAPR-14-0273

43. Macfarlane, G.T. & Macfarlane, S. Bacteria, Colonic Fermentation, and Gastrointestinal Health. J. AOAC Int. 95, 50-60 (2012).

44. Baümler, A.J. & Sperandio, V. Interactions between the microbiota and pathogenic bacteria in the gut. Nature 535, 85-93 (2016).

45. Vandesompele, J. et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biol. 3, 34-1 (2002).

46. Chiu, H. M. et al. Association between early stage colon neoplasms and false-negative results from the fecal immunochemical test. Clin. Gastroenterol. Hepatol. 11, 832-838 (2013).

47. Song, L.-L. & Li, Y.-M. Current noninvasive tests for colorectal cancer screening: An overview of colorectal cancer screening tests. World J. Gastrointest. Oncol. 8, 793 (2016).

48. Bailey, J.R., Aggarwal, A. & Imperiale, T.F. Colorectal Cancer Screening: Stool DNA and Other Noninvasive Modalities. Gut Liver 10, 204-211 (2016).

49. Conlon, M.A. & Bird, A.R. The Impact of Diet and Lifestyle on Gut Microbiota and Human Health. Nutrients 7, 17-44 (2015).

50. Vandeputte, D. et al. Stool consistency is strongly associated with gut microbiota richness and composition, enterotypes and bacterial growth rates. Gut 65, 57-62 (2015).

51. Davis, S.C., Yadav, J.S., Barrow, S.D. & Robertson, B.K. Gut microbiome diversity influenced more by the Westernized dietary regime than the body mass index as assessed using effect size statistic. Microbiologyopen 6, 1-17 (2017).

52. Yun, Y. et al. Comparative analysis of gut microbiota associated with body mass index in a large Korean cohort. BMC Microbiol. 17, (2017).

53. Rogers, M.A.M. et al. Higher Rates of Clostridium difficile Infection among Smokers. (2012). doi:10.1371/journal.pone.0042091

54. Capurso, G. & Lahner, E. The interaction between smoking, alcohol and the gut microbiome. Best Pract. Res. Clin. Gastroenterol. 31, 579-588 (2017).

55. Baothman, O.A., Zamzami, M.A., Taher, I., Abubaker, J. & Abu-Farha, M. The role of Gut Microbiota in the development of obesity and Diabetes. Lipids Health Dis. 15, (2016).

56. Watt, E. et al. Extending colonic mucosal microbiome analysis-assessment of colonic lavage as a proxy for endoscopic colonic biopsies. Microbiome 4, (2016).

57. Durbán, A. et al. Assessing Gut Microbial Diversity from Feces and Rectal Mucosa. Microb. Ecol. 61, 123-133 (2011).

58. Biedermann, L. et al. Smoking Cessation Induces Profound Changes in the Composition of the Intestinal Microbiota in Humans. PLoS One 8, (2013).

59. Kakiyama, G. et al. Modulation of the Fecal Bile Acid Profile by Gut Microbiota in Cirrhosis. J. Hepatol. 58, 949-955 (2013).

60. Rao, R.K., Seth, A. & Sheth, P. Recent Advances in Alcoholic Liver Disease I. Role of intestinal permeability and endotoxemia in alcoholic liver disease. Am. J. Physiol. 286, 881-884 (2004).

61. Turnbaugh, P.J. et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature 444, 1027-1031 (2006).

62. Schwiertz, A. et al. Microbiota and SCFA in lean and overweight healthy subjects. Obesity 18, 190-195 (2010).

63. Santacruz, A. et al. Interplay between weight loss and gut microbiota composition in overweight adolescents. Obesity 17, 1906-1915 (2009).

64. Sonnenberg, A., Delcò, F. & Inadomi, J. M. Cost-Effectiveness of Colonoscopy in Screening for Colorectal Cancer. Ann. Intern. Med. 133, 573 (2000).

65. McGrath, J.S., Ponich, T.P. & Gregor, J.C. Screening for colorectal cancer: the cost to find an advanced adenoma. Am. J. Gastroenterol. 97, 2902-2907 (2002).

66. Telford, J.J., Levy, A.R., Sambrook, J.C., Zou, D. & Enns, R.A. The cost-effectiveness of screening for colorectal cancer. Can. Med. Assoc. J. 182, 1307-1313 (2010).

67. Wong, M.C., Ching, J.Y., Chan, V.C. & Sung, J.J. The comparative cost-effectiveness of colorectal cancer screening using faecal immunochemical test vs. colonoscopy. (2015). doi:10.1038/srep13568

68. Garcia, M. et al. False-positive results from colorectal cancer screening in Catalonia (Spain), 2000-2010. J. Med. Screen. 19, 77-82 (2012).

69. Matsuda, K. et al. Bacterial Identification by 16S rRNA Gene PCR-Hybridization as a Supplement to Negative Culture Results. J. Clin. Microbiol. 49, 2031-2034 (2011).

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> GOODGUT S.L.

Fundacio Institut d'Investigació Biomèdica de Girona Dr.

Josep Trueta

Universitat de Girona

<120> УЛУЧШЕННЫЙ СПОСОБ СКРИНИНГА, ДИАГНОСТИКИ И/ИЛИ МОНИТОРИНГА КОЛОРЕКТАЛЬНОЙ

НЕОПЛАЗИИ НА ПОЗДНЕЙ СТАДИИ, АДЕНОМЫ НА ПОЗДНЕЙ СТАДИИ И/ИЛИ

КОЛОРЕКТАЛЬНОГО РАКА

<130> 905 028

<160> 33

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 783

<212> ДНК

<213> Gemella morbillorum

<220>

<221> прочий_признак

<222> (1)..(783)

<223> Регистрационный номер GenBank: LS483440.1 ОБЛАСТЬ: 827110..827892

<400> 1

atggcgagtt tattacaaaa aacaagaaaa ataagtacaa ttttacaaga aggacgtcat 60

gataatgtcg attttgaagc aatggcaatg cgcttaagtc ctattttaga ttctgttgtc 120

tatattttag atgtagaagg taatattctt gggtatgatt ctattgtaga ttattctaac 180

gaacgtatgg aagaaattat tcgtgcgagg aaagtgccta aagcttattt agatgcaaca 240

ttaaaagtat atgctacgaa ggttaatatt ccatttcaag atccgctttc tattttccca 300

gatgaagaga aagaaagatt tgatgggaat acctatactg taattttacc aataagaggc 360

gggggagaac gccttggaac tcttgttata ggaagaatgg ataatgactt tcaagatgat 420

gatttggtgt tagcagaata tgcgtcaaca gtagtaggaa ttgaaattct tcacgaaaaa 480

caagataaag aaaaaaatct agctagagac aaagatatgg tgaatatggc tcttaattcg 540

ttatcatatt cagaaaaaga agcaattgaa catattttca gagaattaga tgggacagaa 600

ggactactta tcgcaagtaa aattgcagat agagtaggaa ttactcgctc agttattgtt 660

aatgcactta gaaaattaga aagtgcaggt attatagagt caaaatcatt aggtatgaaa 720

ggtacttata taaaagtact taaagaatat tttttagaat taatgttttc taatgaattt 780

taa 783

<210> 2

<211> 567

<212> ДНК

<213> Штамм Peptostreptococcus stomatis DSM 17678

<220>

<221> прочий_признак

<222> (1)..(567)

<223> Регистрационный номер GenBank: ADGQ01000060.1 ОБЛАСТЬ: комплементарная

последовательность (142796..143362)

<400> 2

atggatatta ttcaacttag caacagactt atagaataca gaaaaagtaa caacttaact 60

attaaagatt tctctgacat gtccggaatt agtactgctc tgcttagtca attagaaaga 120

ggtgttggaa accctagcct gagtgtattg aactctatag cagataccat gaatactagc 180

ctctcctctt tattagaaga acctgttgtt ttagaaaacc tggttagaag gtctgacacc 240

ctatccacta ttgtctaccc atgtaggaac aaccttgaat ttcagttgct cacaactagg 300

tctactactc agagcatcaa ccttgtaaga ataatatttc atgctcattc agaaactaat 360

taccagccac ttggaaaaac cgtttctgat gatataatcc acattgaaaa gggcagtatt 420

attgttcaaa ctgatgatgg taagtctatt caactaaaaa aaggtgatac tatgaggata 480

ccacctgacc ttaggtataa attcaagaat atttctgtac acaaggcaca tatgatttgt 540

gccactaata aacttgaagt aagataa 567

<210> 3

<211> 717

<212> ДНК

<213> Bacteroides fragilis

<220>

<221> прочий_признак

<222> (1)..(717)

<223> Регистрационный номер GenBank: CR626927.1 ОБЛАСТЬ: 417101..417817

<400> 3

atggcaaata ctaatatgga acacggagaa ataatactat accaaccaga caatactata 60

aaactggaag tgcgaataga gaatgaaacc gtttggttga cacaagcaca aattgttaac 120

ttattccagt caagtaaagc caatatcagt gagcatataa gaaatatata tgactcagat 180

gaattatctg ctgaatcaac tgttcggaaa ttccgaacag ttcgaatgga aggtaataga 240

aaggttaccc gcattcttga atattataat ctggatatga ttatttccgt aggttatcgt 300

gtgaattcca agcgaggagt ccagttccgc caatggtcaa caggagtact taaagaatat 360

ctattaaaag gctacgcaat caatcagcgc gtggagcagt tggaaaacaa agcaaacacc 420

catgaccggc aactggaaga gttaacaaac aaagtcgact ttttcgtccg gacttcatta 480

cctcctattg aaggtgtctt tttcaacgga cagattttcg atgcctatgt cttttccgct 540

cagttgataa agtctgcaaa gtcatcttta gtattgattg acaactttgt cgatgaaagc 600

gtgctcttac tattgagtaa acgtttgccc ggagtgactt ctatcatata taccaagcaa 660

gtaactccac agttagaatt agatttgaca aagcacaaca gtcaataccc ccaatag 717

<210> 4

<211> 642

<212> ДНК

<213> Bacteroides thetaiotaomicron

<220>

<221> прочий_признак

<222> (1)..(642)

<223> Регистрационный номер GenBank: AE015928.1 ОБЛАСТЬ: 326008..326649

<400> 4

atggcagtac aatttgaatt atataagact ccgatgccaa aggagaaaaa gaacaagacg 60

cgttatcatg cccgtccggt aagttttgag accgtcaata ccgagaaact ggcttatcgc 120

atccatgatc gctccacatt aagagtatcg gacattattt caaccttgga agaactgaaa 180

aatgaagtag ctcagtgcct cctggaaggt aaaaaggtgc atgtcgatgg attaggattc 240

tttcaggtca ctctttcctg cgaagaagaa atacgtaacc cgaaagacaa acgtgtgcac 300

cgggtaaaat tgaaagctat aaagtttaaa gctgataaag aattgaaagg ggaattgtgt 360

cacatgaaat tccagcgttc taaaatcaga ccgcactccg ccaatttatc agaagtagaa 420

atagacatga aactaactga atattttgct gaaaatcaga ttatcacccg gaaagatttt 480

caatatctct gcggaatgac acaaatcact gcatatcgcc atatcaagag gttaatggca 540

gaaaagaaat tgcaaaataa agggacgatc tatcaaccga tatatactcc ggttccgggt 600

aattacaggg tatcggtgga tttaaaatat aaagaacaat ga 642

<210> 5

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер EUB2

<220>

<221> прочий_признак

<222> (1)..(21)

<400> 5

actcctacgg gaggcagcag t 21

<210> 6

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер EUB2

<220>

<221> прочий_признак

<222> (1)..(22)

<400> 6

gtattaccgc ggctgctggc ac 22

<210> 7

<211> 485

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> B10; полосе в электрофорезном геле Eub_10 гена рибосомальной РНК 16S

некультивированного изолята бактерий DGGE

<220>

<221> прочий_признак

<222> (1)..(485)

<400> 7

cttcggattg taaactcctg ttgttgagga gataatgacg gtactcaaca aggtaagtga 60

cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa aacgtaggtc acaagcgttg tccggaatta 120

ctgggtgtaa agggagcgca ggcgggaaga caagttggaa gtgaaatcca tgggctcaac 180

ccatgaactg ctttcaaaac tgtttttctt gagtagtgca caggtaggcg gaattcccgg 240

tgtagcggtg gaatgcgtag atatcgggag gaacaccagt ggcgaaggcg gcctactggg 300

caccaactga cgctgaggct cgaaagtgtg ggtagcaaac aggattagat accctggtag 360

tccacactgt aaacgatgat tactaggtgt tggaggattg accccttcag tgccgcagtt 420

aacacaataa gtaatccacc tggggagtac gaccgcaagg ttgaaactca aaggaattga 480

cggac 485

<210> 8

<211> 474

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> B46; полосе в электрофорезном геле Eub_46 гена рибосомальной РНК 16S

некультивированного изолята бактерий DGGE

<220>

<221> прочий_признак

<222> (1)..(474)

<400> 8

gtaacatttc tgtaacaaga catacagcag tttctcagag ttcccaaact caaaggaatt 60

gacggaagcc gcggttccac gtaagtcaca agcgttgtcc ggaattactg ggtgtaaagg 120

gagcgcaggc gggaagacaa gttggaagtg aaatccatgg gctcaaccca taaactgctt 180

tcctaactgt ttttcttgag tagtgcacag gtaggcggaa ttcccggtgt agcggtggaa 240

tgcctagata tcgggaggaa caccattggc gaaggcggcc tactggactg caactgacgc 300

tgaggctcga aagtgtgggt agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc actccgtaaa 360

ccatgattac tacgtgttgg aggattgacc ccttctgtgc cgcagataac acaataagta 420

atccacctgg ggagtacgac cgcccggttg agactcacag gaattgacgg actc 474

<210> 9

<211> 566

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> B48; полосе в электрофорезном геле Eub_48 гена рибосомальной РНК 16S

некультивированного изолята бактерий DGGE

<400> 9

tctcttacgg ggagcagcag tggggaatat tgcacaatgg gggaaaccct gatgcagcga 60

cgccgcgtga gcgatgaagt atttcggtat gtaaagctct atcagcaggg aagaaaatga 120

cggtacctga ctaagaagcc ccggctaaat acgtgccagc agccgcggta atacgtatgg 180

tgcaagcgtt atccggattt actgggtgta aagggagcgt agacggagtg gcaagtctga 240

tgtgaaaacc cggggctcaa ccccgggact gcattggaaa ctgtgcatct agagtgtcgg 300

agaggtaagc ggaattccta gtgtagcggt gaaatgcgta gatattagga ggaacaccag 360

tggcgaaggc ggcttactgg acgataactg acgctgaggc tcgaaagcgt ggggagcaaa 420

caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacgatga ctactaggtg tcggggagca 480

cagctcttcg gtgccgcagc aaacgcaata agtattccac ctggggagta cgttcgcaag 540

aatgaaactc acagaatttg acggag 566

<210> 10

<211> 894

<212> ДНК

<213> Штамм Rosburia intestinalis L1-82

<220>

<221> прочий_признак

<222> (1)..(894)

<223> Регистрационный номер GenBank LR027880.1 ОБЛАСТЬ: 599208..600101

<400> 10

atgtcttttt caagtgaagt gaaacaggag ttagcaaagc agagtggaaa gagcagacat 60

tgtcagatcg ctgaacttgc ggcgttagtt gcttttgacg gaaagcgtca gcagctgatc 120

ggggatgcgg gagatgtgct ggattcggaa aatccgcttc tgcaggaaaa atatggactg 180

ttactggcac agctgttcca tgttaatata gaagagatag atacattgcc accggaacgc 240

attcttgaga caatcaagat gtggaatcag tctttaaggt gtgcagatat cacagagacg 300

gtaaatggta ttttactgca gcagacatgt tgcaggcggg catatatccg gggagcattt 360

ttagcaggtg gatcgatcag tgatccgaat aagtcttatc attttgagat tgtctgccgg 420

gaaattgcgc aggcgaaaca gcttcaggat gcaatcaaca gttttgagat ggaagcaaag 480

atcgtagaac gaaagaaaca ccaggtcgta tatttaaagg aaggtgccca gatcgtggat 540

atgttaaata tcatggaagc acatgtggca ctgatgaatc ttgaaaatgt gcgtatctta 600

aaagaaatga gaaattctgt caaccgaaag gtaaattgtg agacggcaaa tatcagcaag 660

actgtggcgg cagccgtaaa acagcttggc gatattgaat atattaaaca gaatgcaggc 720

ttagacagtc tgcctgaaaa cctaaaagaa atggcgttgc tgcggttaga gtatccggat 780

acaccgctta aggaactggg aacatatctc gatcctccgg tcggaaaatc gggagtgaac 840

cacaggctgc gcaggatcag tgagattgca gatgagctgc gtgaaaaaga ataa 894

<210> 11

<211> 807

<212> ДНК

<213> Штамм Collinsella intestinalis DSM 13280

<220>

<221> прочий_признак

<222> (1)..(807)

<223> Референсная последовательность NCBI: GG692711.1 ОБЛАСТЬ: 297314..298120

<400> 11

atgtccggac actctaaatg ggcaactacc aagcaccgca agggtgcgca ggacgctaag 60

cgttccgccc tgttctccaa gctgagccgt aacatcaccg tcgcggcccg tcttggcaac 120

gaccccaacc cggacaacaa cgcctccctc gccgctgccg tggccaaggc caaggctcag 180

tccatgccca aggacaagat caaggccgcc atcgacaagg ccttcggttc cggcgccgac 240

gccgccgtgt acgagaacat cgtgtacgag ggctacggcc cggccggtgt tgccgtgtac 300

gtcgagtgcc tgaccgacaa ccgcaaccgc accgccgccg atgtccgctc cgccttctcc 360

cacgctggcg gcaacctggg caccaccggc tccgttgcct tccagttcga gcgcaagggc 420

caggtcgtgg tctccaagca gatcgtcgac ccgaacgaca agaaggagaa cctcatggcc 480

aacggcgctg ccggcgatga ggaagagttc atgatggtca tcgccgaggc cggtggcgac 540

gactacgagg acgccggtga cgagtgggtc gtgtggaccg ccgcgggcga cctcatggcc 600

gtgtccaagg gcatcgaggc tcagggcatc gaggtcaagg gtgccgagct caccatggtc 660

ccgaccaccc cgacggccgt ctccggcgcc gacgccaaga aggtccagcg cctcatcgac 720

cgcctcgagg acctggacga cgtccaggac gtgtactcca ccatggacat gaccgacgag 780

gtcatcgctg ccctcgaaga ggagtaa 807

<210> 12

<211> 1466

<212> ДНК

<213> Faecalibacterium prausnitzii

<220>

<221> прочий_признак

<222> (1)..(1466)

<223> Регистрационный номер GenBank: AJ270469.2

<400> 12

gttgatcctg gctcaggacg aacgctggcg gcgcgcctaa cacatgcaag tcgaacgagc 60

gagagagagc ttgctttctc gagcgagtgg cgaacgggtg agtaacgcgt gaggaacctg 120

cctcaaagag ggggacaaca gttggaaacg actgctaata ccgcataagc ccacagctcg 180

gcatcgagca gagggaaaag gagcaatccg ctttgagatg gcctcgcgtc cgattagcta 240

gttggtgagg taatggccca ccaaggcaac gatcggtagc cggactgaga ggttgaacgg 300

ccacattggg actgagacac ggcccagact cctacgggag gcagcagtgg ggaatattgc 360

acaatggggg aaaccctgat gcagcgacgc cgcgtggagg aagaaggtct tcggattgta 420

aactcctgtt gttgaggaag ataatgacgg tactcaacaa ggaagtgacg gctaactacg 480

tgccagcagc cgcggtaaaa cgtaggtcac aagcgttgtc cggaattact gggtgtaaag 540

ggagcgcagg cgggaagaca agttggaagt gaaatctatg ggctcaaccc ataaactgct 600

ttcaaaactg tttttcttga gtagtgcaga ggtaggcgga attcccggtg tagcggtgga 660

atgcgtagat atcgggagga acaccagtgg cgaaggcggc ctactgggca ccaactgacg 720

ctgaggctcg aaagtgtggg tagcaaacag gattagatac cctggtagtc cacaccgtaa 780

acgatgatta ctaggtgttg gaggattgac cccttcagtg ccgcagttaa cacaataagt 840

aatccacctg gggagtacga ccgcaaggtt gaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca 900

caagcagtgg agtatgtggt ttaattcgac gcaacgcgaa gaaccttacc aagtcttgac 960

atcctgcgac gatgctggaa acagtatttt ccttcgggac gcagagacag gtggtgcatg 1020

gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctta 1080

ctgtcagtta ctacgcaaga ggactctggc aggactgccg ttgacaaaac ggaggaaggt 1140

ggggatgacg tcaaatcatc atgcccttta tgacttgggc tacacacgta ctacaatggc 1200

gttaaacaaa gagaagcaag accgcgaggt ggagcaaaac tcagaaacaa cgtcccagtt 1260

cggactgcag gctgcaactc gcctgcacga agtcggaatt gctagtaatc gtggatcagc 1320

atgccacggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc atgagagccg 1380

gggggacccg aagtcggtag tctaaccgca aggaggacgc cgccgaaggt aaaactggtg 1440

attggggtga agtcgtaaca aggtac 1466

<210> 13

<211> 1452

<212> ДНК

<213> Escherichia coli

<220>

<221> прочий_признак

<222> (1)..(1452)

<400> 13

cgccctcccg aaggttaagc tacctacttc ttttgcaacc cactcccatg gtgtgacggg 60

cggtgtgtac aaggcccggg aacgtattca ccgtggcatt ctgatccacg attactagcg 120

attccgactt catggagtcg agttgcagac tccaatccgg actacgacgc actttatgag 180

gtccgcttgc tctcgcgagg tcgcttctct ttgtatgcgc cattgtagca cgtgtgtagc 240

cctggtcgta agggccatga tgacttgacg tcatccccac cttcctccag tttatcactg 300

gcagtctcct ttgagttccc ggccggaccg ctggcaacaa aggataaggg ttgcgctcgt 360

tgcgggactt aacccaacat ttcacaacac gagctgacga cagccatgca gcacctgtct 420

cacggttccc gaaggcacat tctcatctct gaaaacttcc gtggatgtca agaccaggta 480

aggttcttcg cgttgcatcg aattaaacca catgctccac cgcttgtgcg ggcccccgtc 540

aattcatttg agttttaacc ttgcggccgt actccccagg cggtcgactt aacgcgttag 600

ctccggaagc cacgcctcaa gggcacaacc tccaagtcga catcgtttac ggcgtggact 660

accagggtat ctaatcctgt ttgctcccca cgctttcgca cctgagcgtc agtcttcgtc 720

cagggggccg ccttcgccac cggtattcct ccagatctct acgcatttca ccgctacacc 780

tggaattcta cccccctcta cgagactcaa gcttgccagt atcagatgca gttcccaggt 840

tgagcccggg gatttcacat ctgacttaac aaaccgcctg cgtgcgcttt acgcccagta 900

attccgatta acgcttgcac cctccgtatt accgcggctg ctggcacgga gttagccggt 960

gcttcttctg cgggtaacgt caatgagcaa aggtattaac tttactccct tcctccccgc 1020

tgaaagtact ttacaacccg aaggccttct tcatacacgc ggcatggctg catcaggctt 1080

gcgcccattg tgcaatattc cccactgctg cctcccgtag gagtctggac cgtgtctcag 1140

ttccagtgtg gctggtcatc ctctcagacc agctagggat cgtcgcctag gtgagccgtt 1200

accccaccta ctagctaatc ccatctgggc acatccgatg gcaagaggcc cgaaggtccc 1260

cctctttggt cttgcgacgt tatgcggtat tagctaccgt ttccagtagt tatccccctc 1320

catcaggcag tttcccagac attactcacc cgtccgccac tcgtcagcaa agaagcaagc 1380

ttcttcctgt taccgttcga cttgcatgtg ttaggcctgc cgccagcgtt caatctgagc 1440

catgatcaaa ct 1452

<210> 14

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер EUB_F

<220>

<221> прочий_признак

<222> (1)..(21)

<400> 14

actcctacgg gaggcagcag t 21

<210> 15

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер EUB_R

<220>

<221> прочий_признак

<222> (1)..(22)

<400> 15

gtattaccgc ggctgctggc ac 22

<210> 16

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер B10_F

<220>

<221> прочий_признак

<222> (1)..(19)

<400> 16

caacaaggta agtgacggc 19

<210> 17

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер B10_R

<220>

<221> прочий_признак

<222> (1)..(20)

<400> 17

cgcctacctg tgcactactc 20

<210> 18

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер B46_F

<220>

<221> прочий_признак

<222> (1)..(19)

<400> 18

tccacgtaag tcacaagcg 19

<210> 19

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер B46_R

<220>

<221> прочий_признак

<222> (1)..(20)

<400> 19

cgcctacctg tgcactactc 20

<210> 20

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер B48_F

<400> 20

gtacggggag cagcagtg 18

<210> 21

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер B48_R

<220>

<221> прочий_признак

<222> (1)..(23)

<400> 21

gacactctag atgcacagtt tcc 23

<210> 22

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер GMLL_F

<400> 22

aagagttcca aggcgttctc 20

<210> 23

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер GMLL_R

<220>

<221> прочий_признак

<222> (1)..(25)

<400> 23

ccatttcaag atccgctttc tattt 25

<210> 24

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер PTST_F

<220>

<221> прочий_признак

<222> (1)..(22)

<400> 24

aggttgatgc tctgagtagt ag 22

<210> 25

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер PTST_R

<220>

<221> прочий_признак

<222> (1)..(23)

<400> 25

atgaatacta gcctctcctc ttt 23

<210> 26

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер BCTF_F

<220>

<221> прочий_признак

<222> (1)..(22)

<400> 26

tgaaagcgtg ctcttactat tg 22

<210> 27

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер BCFT_R

<220>

<221> прочий_признак

<222> (1)..(20)

<400> 27

tattggctgt tgtgctttgt 20

<210> 28

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер CINT_F

<220>

<221> прочий_признак

<222> (1)..(21)

<400> 28

gaccatcatg aactcttcct c 21

<210> 29

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер CINT_R

<220>

<221> прочий_признак

<222> (1)..(17)

<400> 29

ccgttgcctt ccagttc 17

<210> 30

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер BCTT_F

<220>

<221> прочий_признак

<222> (1)..(22)

<400> 30

agtgacctga aagaatccta at 22

<210> 31

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер BCTT_R

<220>

<221> прочий_признак

<222> (1)..(20)

<400> 31

gaccgtcaat accgagaaac 20

<210> 32

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер RSBI_F

<220>

<221> прочий_признак

<222> (1)..(21)

<400> 32

gtgccagtaa cagtccatat t 21

<210> 33

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер RSBI_R

<220>

<221> прочий_признак

<222> (1)..(20)

<400> 33

tagcaaagca gagtggaaag 20

<---

Изобретение относится к биотехнологии и медицине, в частности к улучшенному способу скрининга, диагностики и/или мониторинга колоректальной неоплазии на поздней стадии (AN), аденомы на поздней стадии (AA) и/или колоректального рака (CRC), где AN включает CRC и AA. Изобретение дополнительно относится к применению указанного способа в выборе индивидуумов для осуществления поискового исследования (например, колоноскопии) или лечения посредством противоопухолевой терапии. Способ обеспечивает повышение специфичности благодаря снижению ложноположительных результатов в анализе кала на скрытую кровь (FOBT) с использованием сигнатуры, основанной на бактериальных маркерах. 4 н. и 9 з.п. ф-лы, 3 ил., 6 табл., 4 пр.

1. Способ повышения специфичности или снижения доли ложноположительных результатов анализа кала на скрытую кровь (FOBT) для скрининга, диагностики или мониторинга колоректальной неоплазии на поздней стадии (AN) у индивидуума, где указанный способ включает:

a) осуществление FOBT на образце кала, выделенном из указанного индивидуума, где FOBT включает определение наличия скрытой крови в указанном образце кала;

b) количественный анализ в образце кала, выделенном из указанного индивидуума, по меньшей мере следующих бактериальных маркеров:

- Peptostreptococcus stomatis (PTST),

- Bacteroides fragilis (BCTF) и

- Bacteroides thetaiotaomicron (BCTT);

c) вычисление комбинированного показателя из уровней бактериальных маркеров, определенных на стадии b); и

d) сравнение комбинированного показателя в образце индивидуума с референсным значением; и

e) классификацию FOBT-положительного индивидуума как имеющего AN в соответствии с комбинированным показателем, полученным на стадии c);

где термин "колоректальная неоплазия на поздней стадии (AN)" включает CRC и аденому на поздней стадии (AA),

где комбинированный показатель стадии c) получен в соответствии с математическим алгоритмом, где количественные значения каждого из бактериальных маркеров, определенные на стадии b), являются переменными указанного математического алгоритма, и где комбинированный показатель, вычисленный в c), пропорционален количеству PTST и BCTF; и обратно пропорционален количеству BCTT;

где повышение комбинированного показателя относительно указанного референсного значения является показателем AN, и где указанное референсное значение получают от индивидуумов, не имеющих AN, AA и/или CRC, или от индивидуумов, не имеющих желудочно-кишечного заболевания.

2. Способ скрининга, диагностики или мониторинга колоректальной неоплазии на поздней стадии (AN) у индивидуума, где указанный способ включает:

a) осуществление FOBT на образце кала, выделенном из указанного индивидуума, где FOBT включает определение наличия скрытой крови в указанном образце кала; и

b) количественный анализ в образце кала, выделенном из указанного индивидуума, по меньшей мере следующих бактериальных маркеров:

- Peptostreptococcus stomatis (PTST),

- Bacteroides fragilis (BCTF) и

- Bacteroides thetaiotaomicron (BCTT);

c) вычисление комбинированного показателя из уровней бактериальных маркеров, определенных на стадии b); и

d) сравнение комбинированного показателя в образце индивидуума с референсным значением; и

e) классификацию FOBT-положительного индивидуума как имеющего AN в соответствии с комбинированным показателем, полученным на стадии c);

где термин "колоректальная неоплазия на поздней стадии (AN)" включает CRC и аденому на поздней стадии (AA),

где комбинированный показатель стадии c) получен в соответствии с математическим алгоритмом, где количественные значения каждого из бактериальных маркеров, определенные на стадии b), являются переменными указанного математического алгоритма, и где комбинированный показатель, вычисленный в c), пропорционален количеству PTST и BCTF; и обратно пропорционален количеству BCTT;

где повышение комбинированного показателя относительно указанного референсного значения является показателем AN, и где указанное референсное значение получают от индивидуумов, не имеющих AN, AA и/или CRC, или от индивидуумов, не имеющих желудочно-кишечного заболевания.

3. Способ скрининга, диагностики или мониторинга AN у индивидуума-человека по п. 2, где указанный способ дополнительно включает:

i. сравнение количества BCTF, PTST и BCTT в образце кала с соответствующими референсными значениями;

ii. где повышенное количество BCTF и PTST и сниженное количество BCTT в образце FOBT-положительного индивидуума относительно соответствующего референсного значения является показателем AN.

4. Способ по любому из пп. 1-3, где указанный индивидуум является индивидуумом, как предполагают, имеющим CRC, или индивидуумом без симптомов.

5. Способ по любому из пп. 1-4, где указанный FOBT является иммунохимическим тестом на скрытую кровь в кале (FIT), с помощью которого количественно определяют гемоглобин человека (hHb).

6. Способ по п. 5, где FIT-положительный индивидуум имеет уровни hHb, равные или превышающие 10 мкг hHb/г кала или равные или превышающие 20 мкг hHb/г кала, предпочтительно, где FIT-положительный индивидуум имеет уровни hHb, равные или превышающие 10 мкг hHb/г кала.

7. Способ по любому из пп. 1-6, где указанный способ дополнительно включает количественный анализ одного или более бактериальных маркеров, выбранных из группы, состоящей из B10 (SEQ ID NO: 7), B46 (SEQ ID NO: 8), B48 (SEQ ID NO: 9), Gemella morbillorum (GMLL), Roseburia intestinalis (RSBI), Collinsella intestinalis (CINT), Faecalibacterium prausnitzii и/или любой из этих филогрупп и Escherichia coli (ECO).

8. Способ по любому из пп. 1-7, где определение уровней PTST, BCTF и BCTT и, необязательно, бактериальных маркеров по п. 7 осуществляют посредством qPCR, предпочтительно, где уровни в количественном анализе выражают как значение Ct.

9. Способ по любому из пп. 1-8, где уровни PTST, BCTF и BCTT, и, необязательно, уровни бактериальных маркеров по п. 7, выражают как относительное количество, предпочтительно, относительно уровней эубактерий (EUB).

10. Способ по любому из пп. 1-9, где указанный способ дополнительно включает хранение результатов способа на носителе данных, предпочтительно, где указанный носитель данных является машиночитаемым носителем.

11. Способ по любому из пп. 1-10, отличающийся тем, что способ является компьютеризованным.

12. Набор для количественного анализа PTST, BCTF и BCTT в способе скрининга, диагностики или мониторинга AN по любому из пп. 1-11, где указанный набор содержит следующие реагенты:

- олигонуклеотид, специфический для SEQ ID NO: 2, содержащий или состоящий из любой из SEQ ID NO: 24, или SEQ ID NO: 25, или последовательности с по меньшей мере 90% идентичности в отношении любой из них;

- олигонуклеотид, специфический для SEQ ID NO: 3, содержащий или состоящий из любой из SEQ ID NO: 26, или SEQ ID NO: 27, или последовательности с по меньшей мере 90% идентичности в отношении любой из них; и

- олигонуклеотид, специфический для SEQ ID NO: 4, содержащий или состоящий из любой из SEQ ID NO: 30, или SEQ ID NO: 31, или последовательности с по меньшей мере 90% идентичности в отношении любой из них; и

- необязательно, олигонуклеотид, подходящий для количественного анализа эубактерий, предпочтительно - олигонуклеотид, содержащий или состоящий из любой из SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 14, или SEQ ID NO: 15, или последовательности с по меньшей мере 80% идентичности в отношении любой из них;

- необязательно, дополнительно содержащий инструкции по использованию указанных реагентов в определении уровней указанных бактериальных маркеров в образце кала, выделенном из индивидуума.

13. Применение набора по п. 12 в способе скрининга, диагностики или мониторинга AN по любому из пп. 2-11.