СПОСОБ IN VITRO ДИАГНОСТИКИ ИЛИ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ КОЛОРЕКТАЛЬНОГО РАКА ИЛИ ЕГО ПРЕДРАКОВОЙ СТАДИИ Российский патент 2024 года по МПК C12Q1/68 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к области медицины. В частности, настоящее изобретение относится к способу in vitro диагностики и/или прогнозирования колоректального рака (CRC) и/или его предраковой стадии. Способ по настоящему изобретению включает определение статуса метилирования гена LINC00473, предпочтительно, в жидком биоптате, полученном от пациента, где более высокий уровень метилирования гена LINC00473, по отношению к установленному эталонному контрольному уровню, является показателем присутствия колоректального рака, его предраковой стадии и/или плохого прогноза заболевания.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ДЛЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

CRC, также известный как рак ободочной кишки, рак прямой кишки, или колоректальный рак, представляет собой развитие злокачественной опухоли в ободочной кишке или прямой кишке (частях толстого кишечника). Подавляющее большинство видов колоректального рака представляют собой аденокарциномы. Это происходит, поскольку ободочная кишка имеет многочисленные железы внутри ткани. Когда эти железы подвергаются ряду изменений на генетическом уровне, они прогнозируемым образом продолжают свое продвижение от доброкачественной до инвазивной, злокачественной опухоли ободочной кишки. Аденомы ободочной кишки, в частности, колоректальная аденома на поздних стадиях (AA), представляют собой доброкачественный вариант злокачественных аденокарцином, но все еще с злокачественным потенциалом, если их не удалять (их обычно удаляют из-за их тенденции становиться злокачественными и приводить к раку ободочной кишки).

Скрининг является эффективным способом предотвращения и уменьшения смертей от колоректального рака и рекомендован, начиная с возраста 50 до 75 лет. Наиболее известный и наиболее часто используемый тест скрининга для колоректального рака называют иммунохимический анализ кала (FIT). FIT детектирует кровь в образцах стула, что может являться признаком предракового состояния или злокачественной опухоли. Если получены аномальные результаты, обычно рекомендуют колоноскопию, которая позволяет терапевту посмотреть внутрь ободочной кишки и прямой кишки для постановки диагноза. Во время колоноскопии, небольшие полипы можно удалять при обнаружении. При обнаружении большого полипа или опухоли, можно проводить биопсию для проверки, являются ли они злокачественными. Гастроэнтеролог использует колоноскопию для обнаружения и удаления этих аденом и полипов для предотвращения приобретения ими генетических изменений, которые могут приводить к инвазивной аденокарциноме.

Хотя, как объяснено выше, FIT в настоящее время используют для скригнинга колоректального рака, важно отметить, что FIT обеспечивает низкую чувствительность для AA, которая означает, что большинство из указанного вида пациентов могут быть ложно классифицированы как не имеющие заболевания. Следовательно, FIT не является способным идентифицировать аденомы из-за своей низкой чувствительности. Кроме того, поскольку в FIT используют образцы кала, то обеспечивает низкое соблюдение режима анализа. С другой стороны, колоноскопия является инвазивным способом, где наиболее тяжелым осложнением, как правило, является желудочно-кишечная перфорация. Кроме того, колоноскопия в настоящее время является способом, включающим анестезию, и слабительные средства, которые обычно вводят в ходе подготовки кишечника для колоноскопии, являются ассоциированными с серьезными проблемами с пищеварением.

Важно отметить, что способы, используемые в настоящее время для скрининга общей популяции, подверженной риску страдать CRC или AA, ассоциированы с высокой частотой ложноположительных результатов. Следовательно, в настоящее время осуществляют большое количество не являющихся необходимыми отслеживающих колоноскопий.

Настоящее изобретение предлагает ясное решение проблем, перечисленных выше, поскольку оно сфокусировано на способе in vitro для идентификации или скрининга субъектов-людей, подверженных риску страдать колоректальным раком или колоректальными аденомами (в частности, колоректальными аденомами на поздних стадиях). Поскольку способ по изобретению, предпочтительно, основан на жидком биоптате, полученном от пациента (например, плазмы, крови или сыворотки), ожидают улучшенного соблюдения режима скрининга колоректального рака. Кроме того, способ по изобретению обеспечивает высокую чувствительность и специфичность, что означает, что он представляет собой мощный и экономически эффективный способ детекции как колоректального рака, так и колоректальных аденом.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение относится к способу in vitro (далее в настоящем описании «способ по изобретению») диагностики или прогнозирования колоректального рака и/или его предраковой стадии. Его предпочтительно осуществляют в жидком биоптате, полученном от пациента, который представляет собой минимально инвазивный биологический образец. Способ по изобретению обеспечивает высокую чувствительность и специфичность, что означает, что он представляет собой мощный и экономически эффективный способ детекции колоректального рака и/или его предраковой стадии.

Поскольку способ по изобретению имеет более высокую чувствительность и специфичность по сравнению с способом, используемым в настоящее время (FIT) для скрининга общей популяции, подверженной риску страдать CRC или AA, он ассоциирован с более низким процентом ложноположительных результатов. Следовательно, способ, описанный по настоящему изобретению, явно способствует уменьшению количества отслеживающих колоноскопий, таким образом, улучшая способ, которым в настоящее время пациентов подвергают скринингу или диагностике. После осуществления способа по изобретению, если он определяет, что пациенты могут страдать колоректальным раком и/или предраковой стадией, результат подтверждают посредством колоноскопии. Однако, если он не определяет, что пациент может страдать колоректальным раком и/или предраковой стадией, нет необходимости проводить колоноскопию, и рекомендовано обычное тестирование способом по изобретению.

В частности, первый вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу in vitro диагностики колоректального рака и/или его предраковой стадии, включающему определение статуса метилирования по меньшей мере гена LINC00473 в жидком биоптате, полученном от пациента, где более высокий уровень метилирования гена LINC00473, по сравнению с эталонным уровнем метилирования гена LINC00473, измеренным у здоровых субъектов, является показателем того, что субъект страдает колоректальным раком и/или предраковой стадией.

Второй вариант осуществления изобретения относится к способу in vitro прогнозирования колоректального рака и/или его предраковой стадии, включающему определение статуса метилирования по меньшей мере гена LINC00473 в жидком биоптате, полученном от пациента, где более высокий уровень метилирования гена LINC00473, по сравнению с эталонным уровнем метилирования гена LINC00473, измеренным у пациента, является показателем того, что пациент имеет плохой прогноз.

Третий вариант осуществления настоящего изобретения относится к использованию in vitro по меньшей мере статуса метилирования гена LINC00473 для диагностики и/или прогнозирования колоректального рака и/или его предраковой стадии.

Четвертый вариант осуществления настоящего изобретения относится к использованию in vitro набора, содержащего реагенты для определения по меньшей мере статуса метилирования гена LINC00473 для диагностики и/или прогнозирования колоректального рака и/или его предраковой стадии.

В предпочтительном варианте осуществления, жидкий биоптат представляет собой образец плазмы, крови или сыворотки. Плазма является особенно предпочтительной.

В предпочтительном варианте осуществления, предраковая стадия представляет собой колоректальную аденому, предпочтительно, AA.

В предпочтительном варианте осуществления, статус метилирования гена LINC00473 определяют по меньшей мере в CpG из промоторной области.

В предпочтительном варианте осуществления, статус метилирования гена LINC00473 определяют по меньшей мере в CpG из промоторной области, которая составляет 3000 п.о. вокруг участка старта транскрипции (TSS). Это означает 1500 п.о. выше или 1500 п.о. ниже TSS.

В предпочтительном варианте осуществления, статус метилирования гена LINC00473 определяют по меньшей мере в CpG из промоторной области, локализованном между хромосомными положениями Chr6: 166402081 и Chr6: 166402638.

В предпочтительном варианте осуществления, статус метилирования гена LINC00473 определяют по меньшей мере в CpG из промоторной области, локализованном в хромосомном положении, выбранном из группы, содержащей: Chr6: 166402638 и/или Chr6: 166402474, и/или Chr6: 166402463, и/или Chr6: 166402457, и/или Chr6: 166402416, и/или Chr6: 166402379, и/или Chr6: 166402375, и/или Chr6: 166402364, и/или Chr6: 166402081, предпочтительно, CpG, выбранном из группы, содержащей: cg06545143 и/или cg08886973 и/или cg21306006.

В предпочтительном варианте осуществления, диагноз колоректального рака и/или его предраковой стадии подтверждают посредством способа визуализации, предпочтительно, колоноскопии.

В соответствии со способом по изобретению, после измерения статуса метилирования гена LINC00473, получают значение показателя, и это значение показателя сравнивают с пороговым значением, определяющим диагностическое правило. Если это значение показателя выше, чем порог, тогда соответствующий образец классифицируют как положительный образец, который является показателем того, что пациент может страдать колоректальным раком и/или его предраковой стадией. Пороговое значение определено, чтобы оптимизировать значения чувствительности и специфичности. Следовательно, в предпочтительном варианте осуществления, способ по изобретению включает: a) измерение статуса метилирования гена LINC00473, в жидком биоптате, полученном от субъекта, b) обработку значений метилирования для получения показателя риска и c), где если идентифицируют отклонение или изменчивость полученного значения показателя риска, по сравнению с эталонным значением, это является показателем того, что субъект страдает колоректальным раком и/или предраковой стадией.

Последний вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу диагностики и лечения колоректального рака или его предраковой стадии, включающему: a) получение жидкого биоптата от субъекта-человека; b) детекцию статуса метилирования гена LINC00473 и c) диагностику у пациента колоректального рака или его предраковой стадии, когда идентифицирован более высокий уровень метилирования гена LINC00473, по сравнению с эталонным уровнем метилирования гена LINC00473, измеренным у здоровых субъектов, и подвергание пациента колоноскопии. Колоноскопия может включать удаление колоректального рака или полипов.

Для целей по настоящему изобретению определены следующие термины:

• LINC00473 (длинная межгенная не кодирующая белок РНК 473) представляет собой РНК-ген и входит в состав класса некодирующих РНК. Она может быть идентифицирована в публичных базах данных следующим образом: HGNC: 21160. Entrez Gene: 90632. Ensambl ID: ENSG00000223414. UniProtKB: A8K010.

• Термин «колоректальный рак» представляет собой медицинское состояние, характеризуемое злокачественной опухолью из клеток кишечного тракта ниже тонкого кишечника (т.е., толстого кишечника (ободочной кишки), включая слепую кишку, восходящую ободочную кишку, поперечную ободочную кишку, нисходящую ободочную кишку, сигмовидную ободочную кишку и прямую кишку).

• Выражение «колоректальная аденома» относится к аденомам ободочной кишки, также называемым аденоматозными полипами, которые представляют собой доброкачественную и предраковую стадию колоректального рака, но все еще с высоким риском прогрессирования до колоректального рака.

• Выражение «колоректальная аденома на поздних стадиях» относится к аденомам, имеющим размер по меньшей мере 10 мм или гистологически имеющим высокую степень дисплазии или ворсинчатый компонент выше чем 20%; или зубчатые очаги, имеющие размер по меньшей мере 10 мм или дисплазию. Более подробное объяснение концепции «колоректальная аденома на поздних стадиях» смотри в следующих научных статьях, которые принадлежат к общим знаниям в области, к которой относится настоящее изобретение: [Rex DK, Boland CR, Dominitz JA, Giardiello FM, Johnson DA, Kaltenbach T, Levin TR, Lieberman D, Robertson DJ. Colorectal Cancer Screening: Recommendations for Physicians and Patients From the U.S. Multi-Society Task Force on Colorectal Cancer. Gastroenterology. 2017 Jul;153(1):307-323. doi: 10.1053/j.gastro.2017.05.013. Epub 2017 Jun 9. PMID: 28600072][East JE, Atkin WS, Bateman AC, Clark SK, Dolwani S, Ket SN, Leedham SJ, Phull PS, Rutter MD, Shepherd NA, Tomlinson I, Rees CJ. British Society of Gastroenterology position statement on serrated polyps in the colon and rectum. Gut. 2017 Jul;66(7):1181-1196. doi: 10.1136/gutjnl-2017-314005. Epub 2017 Apr 27. Review. PMID: 28450390].

• Выражение «жидкий биоптат» относится к любому образцу биологических жидкостей, которые могут содержать происходящий из опухоли материал. В частности, жидкий биоптат представляет собой любой образец биологических жидкостей (например: плазмы, сыворотки, крови, слюны, спинномозговой жидкости или мочи), который может содержать происходящий из опухоли материал, такой как циркулирующая ДНК опухоли.

• Выражение «минимально инвазивный биологический образец» относится к любому образцу, полученному из организма пациента без необходимости использования опасных инструментов, отличных от тонких игл, используемых для отбора крови у пациента, и следовательно без опасности для пациента. Конкретно, минимально инвазивный биологический образец относится, по настоящему изобретению, к образцам: крови, сыворотки или плазмы.

• В рамках изобретения, термин «метилирование» можно понимать как обозначающий присутствие метильной группы, добавленной посредством действия фермента ДНК-метилтрансферазы к основанию или основаниям цитозина в области нуклеиновой кислоты, например, ДНК.

• Соответственно, термин, «статус метилирования», в рамках изобретения, относится к уровню метилирования, измеренному у пациента, подвергаемого анализу. «Статус метилирования» может представлять собой более высокий/более низкий уровень метилирования, по сравнению с эталонным или контрольным уровнем.

• В рамках изобретения, «CpG-динуклеотид», «участок CpG-метилирования» или эквивалент, следует принимать для обозначения цитозина, связанного с гуанином посредством фосфодиэфирной связи. CpG-динуклеотиды являются мишенями для метилирования остатка цитозина и могут находиться внутри кодирующих или некодирующих нуклеиновых кислот. Некодирующие нуклеиновые кислоты понимают в данной области как включающие интроны, 5'-нетранслируемые области, 3'-нетранслируемые области, промоторные области геномного гена, или межгенные области.

• Выражение «CpG-мишень» относится к специфическому CpG, как обнаружено, дифференциально метилированному по настоящему изобретению.

• Выражение «непрерывные CpG» относится к CpG, которые могут являться дифференциально метилированными, и они могут быть обнаружены вплоть до 1500 п.о. выше или ниже участка старта транскрипции (TSS) (3000 п.о. вокруг TSS).

• В рамках изобретения, «определение статуса метилирования гена» означает, что способ по изобретению осуществляют посредством измерения статуса метилирования любой области гена, также содержащей любую регуляторную последовательность, способную увеличивать или уменьшать экспрессию указанных генов. В частности, указанная регуляторная последовательность включает промотор, который представляет собой область ДНК, инициирующую транскрипцию гена. Промоторы локализованы около участков старта транскрипции генов, на той же цепи, выше или ниже ДНК (по направлению к 5'-области смысловой цепи).

• В рамках изобретения «контрольный, эталонный или исходный уровень метилирования» следует понимать как обозначающий уровень метилирования, детектированный в соответствующей нуклеиновой кислоте от здорового пациента. Таким образом, пациент, вероятно, страдает CRC или AA, с данной чувствительностью и специфичностью, если «более высокий уровень метилирования» измерен у этого пациента, по сравнению с «контрольным, эталонным или исходным уровнем метилирования», измеренным у здорового пациента. «Эталонное значение» может представлять собой пороговое значение или значение порога отсечения. Как правило, «пороговое значение» или «значение порога отсечения» можно определять экспериментально, эмпирически или теоретически. Пороговое значение можно также выбирать произвольно, на основании существующих экспериментальных и/или клинических условий, как понятно специалисту в данной области. Пороговое значение необходимо определять, чтобы получать оптимальную чувствительность и специфичность, в соответствии с функцией теста и отношением польза/риск (клиническими последствиями ложноположительных и ложноотрицательных результатов). Предпочтительно, специалист в данной области может сравнивать уровни (или показатели) биомаркера, полученные в соответствии со способом по изобретению с использованием определенного порогового значения. Как правило, оптимальную чувствительность и специфичность (и таким образом, пороговое значение) можно определять с использованием кривой рабочих характеристик приемника (ROC), на основании экспериментальных данных. Например, после определения уровня метилирования биомаркеров в эталонной группе, можно использовать алгоритмический анализ для статистической обработки измеренного уровня метилирования биомаркеров в биологических образцах, подлежащих тестированию, и таким образом, получения классификационного стандарта, имеющего значимость для классификации образцов. Полное наименование кривой ROC представляет собой кривая рабочих характеристик приемника, которая также известна как рабочая характеристическая кривая. Ее в основном используют для клинических биохимических диагностических тестов. Кривая ROC представляет собой всеобъемлющий показатель, отражающий непрерывные переменные частоты истинноположительных результатов (чувствительность) и частоты ложноположительных результатов (1-специфичность). Она выявляет взаимосвязь между чувствительностью и специфичностью с использованием способа совмещения изображений. Серии различных значений порогов отсечения (пороговых или критических значений, пограничных значений между нормальными и аномальными результатами диагностического теста) устанавливают в качестве непрерывных переменных для расчета серий значений чувствительности и специфичности. Затем чувствительность используют в качестве вертикальной координаты, и специфичность используют в качестве горизонтальной координаты для построения кривой. Чем больше площадь под кривой (AUC), тем выше точность диагноза. На кривой ROC, точка, наиболее близкая к самой верхней левой точке диаграммы координат, является критической точкой, имеющей как высокие значения чувствительности, так и высокие значения специфичности. Значение AUC кривой ROC составляет между 1,0 и 0,5. Когда AUC>0,5, диагностический результат становится лучше и лучше, по мере приближения AUC к 1. Когда AUC составляет между 0,5 и 0,7, точность является низкой. Когда AUC составляет между 0,7 и 0,9, точность является хорошей. Когда AUC составляет выше, чем 0,9, точность является довольно высокой. Этот алгоритмический способ, предпочтительно, осуществляют с использованием компьютера. Существующие в данной области программное обеспечение или системы можно использовать для построения кривой ROC, такие как: медицинское статистическое программное обеспечение MedCalc 9.2.0.1, SPSS 9.0, предпочтительно, GraphPad Prism 6.

• Выражение «более высокий уровень метилирования» относится к статистически значимому увеличению относительного уровня метилирования нуклеиновой кислоты, например, ДНК, по сравнению с уровнем метилирования, измеренным у субъекта/пациента, используемого в качестве контрольного/эталонного. Таким образом, в настоящем описании, «более высокий уровень метилирования» определяют по отношению к исходному уровню, представленному статусом метилирования данной геномной области в образце, полученном от субъекта или пациента. Например, «более высокий уровень метилирования» может составлять по меньшей мере на 2% более, чем исходный уровень метилирования, например, по меньшей мере на 5% более, чем исходный уровень метилирования, или по меньшей мере на 10% более, чем исходный уровень метилирования, или по меньшей мере на 15% более, чем исходный уровень метилирования, или по меньшей мере на 20% более, чем исходный уровень метилирования, или по меньшей мере на 25% более, чем исходный уровень метилирования, или по меньшей мере на 30% более, чем исходный уровень метилирования, или по меньшей мере на 40% более, чем исходный уровень метилирования, или по меньшей мере на 50% более, чем исходный уровень метилирования, или по меньшей мере на 60% более, чем исходный уровень метилирования, или по меньшей мере на 70% более, чем исходный уровень метилирования, или по меньшей мере на 80% более, чем исходный уровень метилирования, или по меньшей мере на 90% более, чем исходный уровень метилирования.

• Под «содержащий» понимают включающий, но без ограничения, то, что следует за словом «содержащий». Таким образом, использование термина «содержащий» показывает, что перечисленные элементы являются необходимыми или обязательными, но что другие элементы являются необязательными и могут присутствовать или могут не присутствовать.

• Под «состоящий из» понимают «включающий, и органиченный» тем, что следует за фразой «состоящий из». Таким образом, фраза «состоящий из» показывает, что перечисленные элементы являются необходимыми или обязательными, и что другие элементы не могут присутствовать.

Краткое описание чертежей

Фигура 1. Уровни метилирования ДНК промотора LINC00473 в образцах колоректальной ткани. В когорте 1 (A) и 2 (B), для пациентов с колоректальным раком показаны значимо более высокие уровни метилирования LINC00473, чем в контроле без опухоли. Уровни метилирования промотора LINC00473 анализировали (A) посредством чипа Infinium HumanMethylation450K BeadChip (массив 450K) и (B) посредством пиросеквенирования. Данные метилирования ДНК выражены как значения β в A, и как % метилирования в B. Горизонтальные линии представляют медиану уровней метилирования. P, показывает значение p, анализированное посредством U-критерия Манна-Уитни. Опухоль, представляет колоректальный рак.

Фигура 2. Кривая рабочих характеристик приемника (ROC) для метилирования промотора LINC00473 в образцах колоректальной ткани. Площадь под кривой ROC (AUC) в когорте 1 (A) и когорте 2 (B) показывает высокую диагностическую точность метилирования промотора LINC00473 для установления различий между пациентами с колоректальным раком и контрольными индивидуумами без опухоли. P, показывает значение p из кривой ROC. CI, представляет собой доверительный интервал.

Фигура 3. Уровни метилирования ДНК промотора LINC00473 в образцах колоректальной ткани из атласа генома злокачественных опухолей The Cancer Genome Atlas (TCGA) в соответствии с их клинической стадией. Для пациентов со всеми стадиями колоректального рака показаны значимо более высокие уровни метилирования LINC00473 в (A) когорте 1 (I: 0,55±0,023; II: 0,53±0,018; III: 0,45±0,028; IV: 0,47±0,031) и (B) когорте 2 (I: 38,54%±7,67%; II: 34,31%±2,11%; III: 32,14%±2,84%; IV: 35,31%±3,95%), чем у соответствующих им контрольных индивидуумов без опухоли (когорта 1: 0,11±0,006; когорта 2: 5,84%±0,78%). Уровни метилирования LINC00473 анализировали (A) посредством чипа Infinium HumanMethylation450K BeadChip (массив 450K) и выражали как значения β, и (B) посредством пиросеквенирования и выражали как % метилирования. Звездочки (*), показывают P<0,0001, по отношению к контрольным индивидуумам. Значение p анализировали посредством U-критерия Манна-Уитни. Опухоль, представляет колоректальный рак.

Фигура 4. Уровни метилирования ДНК промотора LINC00473 в аденомах. Для пациентов с аденомами и с колоректальным раком показаны значимо более высокие уровни метилирования LINC00473, чем в контроле без опухоли. Уровни метилирования промотора LINC00473 анализировали посредством пиросеквенирования и выражали как % метилирования. Горизонтальные линии представляют медиану уровней метилирования. P, показывает значение p, анализированное посредством U-критерия Манна-Уитни.

Фигура 5. Кривая рабочих характеристик приемника (ROC) для метилирования промотора LINC00473 при аденомах. Площадь под кривой ROC (AUC) в когорте 3 показывает высокую диагностическую точность метилирования промотора LINC00473 для установления различий между аденомами и контролем без опухоли. P, показывает значение p из кривой ROC. CI, представляет собой доверительный интервал.

Фигура 6. Уровни метилирования ДНК промотора LINC00473 в циркулирующей в плазме ДНК пациентов с колоректальным раком и здоровых контрольных индивидуумов. Для пациентов с колоректальным раком показаны значимо более высокие уровни метилирования LINC00473, чем у здоровых контрольных индивидуумов. Уровни метилирования LINC00473 анализировали в трех повторах посредством ПЦР с детекцией в реальном времени. Горизонтальные линии представляют медиану уровней метилирования. P, показывает значение p, анализированное посредством U-критерия Манна-Уитни.

Фигура 7. Кривая рабочих характеристик приемника (ROC) для метилирования промотора LINC00473 в циркулирующей в плазме ДНК пациентов с колоректальным раком, по отношению к нормальным контрольным индивидуумам. Площадь под кривой ROC (AUC) показывает высокую диагностическую точность метилирования промотора LINC00473 для установления различий между пациентами с колоректальным раком и здоровыми индивидуумами. P, показывает значение p из кривой ROC.

Фигура 8. Анализ выживаемости Каплана-Мейера для метилирования промотора LINC00473 у пациентов с колоректальным раком. Пациентов с колоректальным раком классифицировали в соответствии с более высоким или более низким уровнем метилирования LINC00473, по отношению к медианному уровню метилирования группы (10% метилирования). Анализ выживаемости Каплана показал, что высокие уровни метилирования LINC00473 являлись значимо ассоциированными с более короткой общей выживаемостью (OS) (P=0,0256). P, относится к значению p по логарифмическому ранговому критерию. H (высокий) показывает уровень метилирования >10%; и L (низкий) - уровень метилирования <10%.

Фигура 9. Уровни метилирования ДНК промотора LINC00473 в циркулирующей в плазме ДНК пациентов с колоректальной аденомой на поздних стадиях и здоровых контрольных индивидуумов. Для пациентов с колоректальной аденомой на поздних стадиях показаны значимо более высокие уровни метилирования LINC00473, чем у здоровых контрольных индивидуумов. Уровни метилирования LINC00473 анализировали в трех повторах посредством ПЦР с детекцией в реальном времени. Горизонтальные линии представляют медиану уровней метилирования. P, показывает значение p, анализированное посредством U-критерия Манна-Уитни.

Фигура 10. Кривая рабочих характеристик приемника (ROC) для метилирования промотора LINC00473 в циркулирующей в плазме ДНК пациентов с колоректальной аденомой на поздних стадиях, по отношению к нормальным контрольным индивидуумам. Площадь под кривой ROC (AUC) показывает высокую диагностическую точность метилирования промотора LINC00473 для установления различий между пациентами с колоректальной аденомой на поздних стадиях и здоровыми контрольными индивидуумами. P, показывает значение p из кривой ROC. CI, представляет собой доверительный интервал.

Фигура 11. Уровни метилирования ДНК промотора LINC00473 в колоректальной аденоме на поздних стадиях из тканей. Для колоректальных аденом на поздних стадиях показаны значимо более высокие уровни метилирования LINC00473, чем в контроле без опухоли. Уровни метилирования промотора LINC00473 анализировали посредством пиросеквенирования и выражали как % метилирования. Горизонтальные линии представляют медиану уровней метилирования. P, показывает значение p, анализированное посредством U-критерия Манна-Уитни.

Фигура 12. Кривая рабочих характеристик приемника (ROC) для метилирования промотора LINC00473 в колоректальной аденоме на поздних стадиях из тканей. Площадь под кривой ROC (AUC) показывает высокую диагностическую точность метилирования промотора LINC00473 для установления различий между колоректальными аденомами на поздних стадиях и контролем без опухоли. P, показывает значение p из кривой ROC. CI, представляет собой доверительный интервал.

Фигура 13. Уровни метилирования ДНК промотора LINC00473 в циркулирующей в плазме ДНК колоректального рака по капельной цифровой ПЦР (кцПЦР). Для пациентов с колоректальным раком показаны значимо более высокие уровни метилирования LINC00473, чем для контроля без опухоли. Уровни метилирования промотора LINC00473 анализировали в трех повторах посредством кцПЦР. Горизонтальные линии представляют медиану уровней метилирования. P, показывает значение p, анализированное посредством U-критерия Манна-Уитни.

Фигура 14. Кривая рабочих характеристик приемника (ROC) для метилирования промотора LINC00473 в циркулирующей в плазме ДНК пациентов с колоректальным раком, по отношению к нормальным контрольным индивидуумам, анализированного посредством капельной цифровой ПЦР (кцПЦР). Площадь под кривой ROC (AUC) показывает высокую диагностическую точность метилирования промотора LINC00473 для установления различий между пациентами с колоректальным раком и здоровыми индивидуумами. P, показывает значение p из кривой ROC.

Фигура 15. Уровни метилирования ДНК промотора LINC00473 в циркулирующей в плазме ДНК колоректальных аденом на поздних стадиях по капельной цифровой ПЦР. Для пациентов с колоректальной аденомой на поздних стадиях показаны значимо более высокие уровни метилирования LINC00473, чем у здоровых контрольных индивидуумов. Уровни метилирования LINC00473 анализировали в трех повторах посредством капельной цифровой ПЦР. Горизонтальные линии представляют медиану уровней метилирования, и P показывает значение p, анализированное посредством U-критерия Манна-Уитни.

Подробное описание изобретения

Пример 1. Способы.

Пример 1.1. Участники исследования для анализа колоректальной ткани.

Авторы настоящего изобретения сначала анализировали 3 независимых когорты (когорту 1, когорту 2 и когорту 3) для исследования метилирования ДНК LINC00473 в колоректальных тканях. Когорта 1 представлена пациентами с первичным колоректальным раком (n=273) и контрольными индивидуумами без опухоли (n=38). Когорта 2 включает 180 пациентов с первичным колоректальным раком и 93 контрольных индивидуумов без опухоли. И в когорте 3 присутствуют 12 пациентов с первичным колоректальным раком, 12 с аденомой и 12 контрольных индивидуумов без опухоли.

Кроме того, для целей по настоящей заявке PCT, авторы настоящего изобретения также анализировали новую независимую когорту (когорту 4) для исследования метилирования ДНК LINC00473 в колоректальных тканях, которая включает 50 колоректальных аденом (включая 20 подтвержденных колоректальных аденом на поздних стадиях) и 10 контрольных образцов без опухоли.

Пример 1.2. Анализ данных метилирования ДНК из колоректальных тканей посредством массива 450K.

Результаты метилирования ДНК из когорты 1 анализировали по данным массива Infinium HumanMethylation450K BeadChip (массив 450K), полученным в публичной базе данных The Cancer Genome Atlas (TCGA). Массив 450K (Illumina) покрывает > 450000 участков CpG среди генома человека, и показатель метилирования каждого CpG представлен как значения бета (β), лежавшие в диапазоне между 0,0 (полностью неметилированный) и 1,0 (полностью метилированный).

Пример 1.3. Анализ бисульфитного пиросеквенирования колоректальных тканей.

Статус метилирования ДНК промотора LINC00473 в когортах 2, 3 и 4 анализировали посредством бисульфитного пиросеквенирования. После бисульфитного превращения ~500  нг ДНК с использованием набора метилирования ДНК EZ-96 (Zymo Research Corp.), уровни метилирования ДНК промотора LINC00473 анализировали с использованием системы PyroMark Q96 (Qiagen), в соответствии с инструкциями производителя. Количественную оценку участка метилирования CpG получали с использованием Pyro Q-CpG 1.0.9 (Qiagen). Последовательности праймеров (Таблица 1) разрабатывали с использованием PyroMark Assay Design 2.0 (Qiagen). В таблице 1 показаны праймеры для анализов метилирования LINC00473 посредством пиросеквенирования.

Таблица 1

Последовательность праймера (5’-3’) Размер праймера (н.) F: SEQ ID NO: 1 27 R: SEQ ID NO: 2 23 S: SEQ ID NO: 3 22

F: Прямой; R: Обратный; S: Секвенирование; н.: нуклеотиды

В предпочтительном варианте осуществления, праймеры, используемые по настоящему изобретению, предпочтительно, праймер из SEQ ID NO: 2, являются биотинилированными посредством включения молекулы биотина.

Пример 1.4. Участники исследования для анализа жидкого биоптата.

Для анализа LINC00473 в жидком биоптате колоректального рака, исследование включало 26 пациентов с колоректальным раком на поздних стадиях (стадиях III и IV), проспективно зарегистрированных на время диагностики (в исходной точке), до начала лечения и хирургии. Демографические и клинические характеристики пациентов представлены в таблице 2. Двадцать восемь здоровых контрольных индивидуумов также включены в исследование. Статус заболевания и определение стадии для пациентов с колоректальным раком получены от медицинских работников - онкологов в отделении онкологии Complejo Hospitalario Universitario de Santiago de Compostela (CHUS). В таблице 2 показаны клинические характеристики пациентов с колоректальным раком.

Таблица 2

Характеристики Пациенты (n=26) Пол Мужской 17 Женский 9 Возраст (лет) Среднее±SD 67±10 Стадия III 4 IV 22 Гистология Аденокарцинома 24 Муцинозная карцинома 2

SD: Стандартное отклонение

Для анализа LINC00473 в жидких биоптатах колоректальной аденомы на поздних стадиях, исследование включало 5 здоровых контрольных индивидуумов и 12 пациентов с аденомой на поздних стадиях. Всех индивидуумов для анализа жидких биоптатов привлекали в Complejo Hospitalario Universitario de Santiago de Compostela (CHUS).

Для анализа LINC00473 в жидких биоптатах колоректального рака посредством капельной цифровой ПЦР (кцПЦР), исследование включало 5 пациентов с колоректальным раком на поздних стадиях, проспективно зарегистрированных на время диагностики (в исходной точке), до начала лечения и хирургии. Десять пациентов с аденомами на поздних стадиях и 5 здоровых контрольных индивидуумов также включены в исследование. Пациентов и контрольных индивидуумов получали в Complejo Hospitalario Universitario de Santiago de Compostela (CHUS).

Пример 1.5. Сбор образцов крови и выделение плазмы.

Образцы крови получали посредством флеботомии с использованием пробирок для сбора, содержащих ЭДТА в качестве антикоагулянта. Плазму выделяли из образцов крови в пределах 2 час от сбора с использованием первого центрифугирования пробирок с кровью (1500 g, 10 мин, 4°C). Плазму переносили в 1,5 мл пробирки, и проводили второе центрифугирование (15000 g, 10 мин, 4°C). Плазму переносили в новые 1,5 мл пробирки и хранили при -80°C.

Пример 1.6. Выделение циркулирующей ДНК из образцов плазмы.

После разрушения образцов плазмы, циркулирующую ДНК выделяли из 2-3 мл плазмы с использованием набора для выделения циркулирующей нуклеиновой кислоты QIAamp® (Qiagen) и вакуумной системы QIAvac 24 Plus (Qiagen), следуя рекомендациям производителя. Циркулирующую ДНК, наконец, элюировали в 75 мкл буфера для элюции, и 1 мкл этого элюата использовали для количественной оценки концентрации циркулирующей ДНК посредством набора QuantiFluor® ONE dsDNA с использованием флюориметра Quantus™ (Promega). После количественной оценки, циркулирующую ДНК хранили при -80°C.

Пример 1.7. Бисульфитное превращение циркулирующей ДНК.

Для бисульфитного превращения ДНК, использовали 15-50 нг циркулирующей ДНК, и превращение осуществляли с использованием набора EZ DNA Methylation-Lightning (Zymo Research), в соответствии с рекомендациями производителя, следуя этим стадиям термоциклирования: 98°C 8 мин, 54°C 60 мин и 4°C. После очистки на основе колонки со стадиями связывания, L-десульфирования и промывки, модифицированную бисульфитом ДНК (бис-ДНК) элюировали в 15 мкл буфера для элюции и хранили при -80°C.

Пример 1.8. Анализ метилирования ДНК промоторной области LINC00473 в жидких биоптатах посредством ПЦР с детекцией в реальном времени.

Статус метилирования промоторной области длинной межгенной не кодирующей белок РНК 473 (LINC00473; предшествующий символ C6orf176) анализировали в циркулирующей в плазме ДНК. Некодирующий ген LINC00473 (NCBI ID: 90632; UCSC ID: uc063sul.1; Ensambl ID: ENSG00000223414; HGNC ID: HGNC:21160) локализован на хромосоме (chr) 6 в положении 6q27, и имеет островок CpG, содержащий его промоторную область, локализованный на chr6: 166401527-166402659. Кроме того, промоторная область LINC00473 перекрывается в геноме с основной частью длинной межгенной не кодирующей белок РНК 602 или LINC00602 (NCBI ID: 441177; UCSC ID: uc011egm.4; Ensambl ID: ENSG00000281832; HGNC ID: HGNC:43917).

Уровни метилирования промоторной области LINC00473 определяли посредством ПЦР с детекцией в реальном времени с использованием количественного специфического для метилирования анализа ПЦР (qMSP) в системе StepOne Plus (Applied Biosystems). Каждая реакционная смесь содержала 2 мкл модифицированной бисульфитом ДНК (бис-ДНК) в качестве матрицы, 10 мкл готовой смеси для ПЦР Power SYBR™ Green Master Mix (ThermoFisher) и 150 нМ каждого из прямых и обратных праймеров (Таблица 3) для детекции метилирования или отсутствия метилирования в общем объеме 20 мкл. Реакции проводили в оптическом 96-луночном реакционном планшете MicroAmp™ Fast (Applied Biosystems). Условия термоциклирования в системе StepOne Plus представляли собой: 10 мин при 95°C, с последующими 50 циклами 94°C в течение 15 с и 60°C в течение 30 с. Воду включали в качестве контроля без матрицы в каждый эксперимент для проверки отсутствия контаминации во время реакций. Линию клеток колоректальной злокачественной опухоли HCT-116 и нормальные лейкоциты (NL) использовали в каждом анализе в качестве положительного контроля для метилирования и отсутствия метилирования, соответственно. Все образцы и контроль анализировали в трех повторах. Пороговый цикл (Ct) определяли для каждой реакции с использованием специфических праймеров для метилирования и отсутствия метилирования с использованием программного обеспечения StepOne Real-Time PCR (Applied Biosystems). Уровень метилирования ДНК каждого образца выражали как процент метилирования (%), в соответствии со следующим расчетом на основании Cottrell et al. (2007):

Метилирование (%)=100/[1+2^(CT_CG-CT_TG)]

В этой формуле, CT_CG представляет пороговый цикл статуса метилирования, и CT_TG показывает пороговый цикл статуса отсутствия метилирования. При этом расчете уровни метилирования могут лежать в диапазоне между 0% и 100% метилирования. В таблице 3 показаны праймеры для анализов метилирования LINC00473 посредством ПЦР с детекцией в реальном времени.

Таблица 3

Статус метилирования Последовательность праймера (5’-3’) Размер праймера (н.) Размер ампликона (п.о.) Метилированный F: SEQ ID NO: 4 20 114 ^(*) R: SEQ ID NO: 5 20 Неметилированный F: SEQ ID NO: 6 23 116 ^(#) R: SEQ ID NO: 7 23

F: Прямой; R: Обратный; н.: нуклеотиды; п.о.: пары оснований.

^(*) Положение: chr6: 166402364-166402477; ^(#)Положение: chr6:166402363-166402478.

Прямые и обратные праймеры, используемые для анализа метилирования LINC00473, позволяют детекцию статуса метилирования 6 CpG (Таблица 4), локализованных в промоторной области LINC00473. Один из CpG (chr6: 166402416), содержащийся в последовательности (ампликоне), амплифицированной посредством ПЦР с детекцией в реальном времени, соответствует CpG, названному cg08886973, в соответствии с анализами Infinium Human Methylation 450K и Infinium MethylationEPIC (Illumina), которые представляют собой анализы микромассивов, способные детектировать статус метилирования более чем 450000 и 850000 CpG, соответственно. Эти микромассивы являются также способными детектировать другие CpG из промотора LINC00473, идентифицированные как cg06545143 (chr6: 166402638) и cg21306006 (chr6: 166402081), которые локализованы, соответственно, на 162 нуклеотида выше и 282 нуклеотида ниже ампликона LINC00473, анализированного в этом исследовании. Три CpG, включенные в этот тип анализов микромассивов (cg06545143, cg08886973, cg21306006), локализованы в промоторной области TSS1500 из LINC00473, которая представляет собой область промотора между 200 и 1500 нуклеотидами выше ее участка старта транскрипции (TSS). Все хромосомные положения, указанные ранее, соответствуют версии GRCh37/hg19 UCSC Genome Browser от University of California (https://genome.ucsc.edu/index.html). В таблице 4 показаны CpG из LINC00473, детектированные в анализах метилирования посредством ПЦР с детекцией в реальном времени.

Таблица 4

Статус метилирования Праймер Хромосомное положение Метилированный или неметилированный Прямой chr6: 166402474
chr6: 166402463
chr6: 166402457 Обратный chr6: 166402379
chr6: 166402375
chr6: 166402364

Пример 1.9. Анализ метилирования ДНК промоторной области LINC00473 в жидких биоптатах посредством капельной цифровой ПЦР (кцПЦР).

Уровни метилирования промоторной области LINC00473 определяли посредством капельной цифровой ПЦР (кцПЦР) в системе QX200 (Bio-Rad). Сначала проводили мультиплексную реакцию предварительной амплификации с использованием ~2 нг модифицированной бисульфитом ДНК (бис-ДНК), 25 мкл готовой реакционной смеси SsoAdvanced™ PreAmp Supermix (Bio-Rad), 0,5 мкл разработанной на заказ смеси для анализа Bio-Rad, содержащей прямой и обратный праймеры и зонд для метилирования (Bio-Rad) (Таблица 5), и 0,5 мкл разработанной на заказ смеси для анализа Bio-Rad, содержащей прямой и обратный праймеры и зонд для отсутствия метилирования (Таблица 5), в общем объеме 50 мкл. Конечный объем дополняли водой. Реакции проводили в 0,2 мл пробирках для ПЦР (Axygen) в системе ProFlex ПЦР (Applied Biosystems): 3 мин при 95°C, 10 циклов 95°C в течение 15 с и 56,2°C в течение 4 мин; и конечная стадия хранения при 4°C.

Затем проводили реакцию в мультиплексной смеси, содержащей 2 мкл продукта предварительной амплификации, полученного ранее, 11 мкл готовой смеси для кцПЦР Supermix для зондов (без dUTP) (Bio-Rad), 2,2 мкл разработанной на заказ смеси для анализа Bio-Rad, содержащей прямой и обратный праймеры и зонд для метилирования (Таблица 5), и 2,2 мкл разработанной на заказ смеси для анализа Bio-Rad, содержащей прямой и обратный праймеры и зонд для отсутствия метилирования (Bio-Rad) (Таблица 5), в общем объеме 22 мкл. Конечный объем дополняли водой. Затем, 20 мкл каждой реакционной смеси и 70 мкл масла для получения капель (Bio-Rad) переносили, соответственно, в лунки для образца и масла картриджа DG8™ Cartridge (BIO-RAD), и загружали в генератор капель QX200™ (Bio-Rad). Капли получали в лунках для капель картриджа, переносили в 96-луночный планшет для кцПЦР (Bio-Rad) и загружали в термоциклер C1000 Touch (Bio-Rad): 10 мин при 95°C, 40 циклов 95°C в течение 15 с и 56,2°C в течение 30 с; 98°C в течение 10 мин и конечная стадия хранения при 4°C. Скорость линейного увеличения температуры составляла 2,5°C/с для всех стадий. Затем, 96-луночный планшет считывали в считывателе для капель QX200™ (Bio-Rad). Воду включали в качестве контроля без матрицы в каждый эксперимент для проверки отсутствия контаминации во время реакций. Линию клеток колоректальной злокачественной опухоли HCT-116 и нормальные лейкоциты (NL) использовали в каждом анализе в качестве положительного контроля для метилирования и отсутствия метилирования, соответственно. Все контрольные образцы включали в каждый планшет со стадией предварительной амплификации и без. Все образцы и контроль анализировали в трех повторах. Анализ данных проводили с использованием программного обеспечения QuantaSoft (Bio-Rad).

Уровень метилирования ДНК каждого образца выражали как процент метилирования (%) в соответствии со следующим расчетом:

Метилирование (%)=[M/(U+M)] x 100

В этой формуле, M (метилирование) представляет количество копий/мкл молекулы ДНК-мишени для зонда для метилирования (зонда FAM), и U (отсутствие метилирования) показывает количество копий/мкл молекулы ДНК-мишени для зонда для отсутствия метилирования (зонда HEX). При этом расчете уровни метилирования могут лежать в диапазоне между 0% и 100% метилирования. В таблице 5 показаны последовательности праймеров и зондов для анализов метилирования LINC00473 посредством кцПЦР. На основании этих последовательностей, две разработанных на заказ смеси для анализа Bio-Rad, содержащих праймеры и зонд для метилирования и отсутствия метилирования, соответственно, получали из Bio-Rad, в соответствии с рекомендациями производителя: соотношение праймера к зонду: 1,8, концентрация праймера в конечной реакционной смеси 450 нМ и концентрация зонда в конечной реакционной смеси 250 нМ.

Таблица 5

Статус метилирования Последовательность праймера и зонда
(5’-3’) Размер праймера/зонда (н.) Размер ампликона (п.о.) Метилированный F: SEQ ID NO: 4 20 114 ^(*) R: SEQ ID NO: 5 20 P: FAM-SEQ ID NO: 8 20 Неметилированный F: SEQ ID NO: 6 23 116 ^(#) R: SEQ ID NO: 7 23 P: HEX- SEQ ID NO: 9 27

F: Прямой; R: Обратный; P: Зонд; н.: нуклеотиды; п.о.: пары оснований.

FAM: флуоресцеин; HEX: гексахлор-флуоресцеин

^(*)Положение: chr6: 166402364-166402477; ^(#)Положение: chr6:166402363-166402478.

Прямые и обратные праймеры, и зонды, используемые для анализа метилирования LINC00473 посредством кцПЦР, позволяют детекцию статуса метилирования 9 CpG (Таблица 6), локализованных в промоторной области LINC00473. Один из CpG (chr6: 166402416), соответствующий CpG, названному cg08886973, в соответствии с анализами Infinium Human Methylation 450K и Infinium MethylationEPIC (Illumina), содержится в амплифицированной последовательности (ампликоне) и детектирован с использованием зондов для метилирования и отсутствия метилирования, указанных в таблице 5. Все положения CpG LINC00473, детектированные в анализах метилирования посредством кцПЦР, представлены в таблице 6. Все хромосомные положения, указанные в таблице 6, соответствуют версии GRCh37/hg19 UCSC Genome Browser от University of California (https://genome.ucsc.edu/index.html).

Таблица 6

Статус метилирования Праймер Хромосомное положение Метилированный или неметилированный Прямой chr6: 166402474
chr6: 166402463
chr6: 166402457 Probe chr6: 166402416
chr6: 166402411
chr6: 166402400 Обратный chr6: 166402379
chr6: 166402375
chr6: 166402364

Пример 1.10. Статистический анализ.

Критерий Колмогорова-Смирнова сначала использовали для оценки нормальности распределения данных. Затем непараметрический U-критерий Манна-Уитни использовали для сравнения данных. Для оценки диагностической точности метилирования LINC00473 для детекции колоректального рака, получали кривую рабочих характеристик приемника (ROC). Индекс Юдена (J), позволяющий получать точку отсечения для метилирования, обеспечивающую наилучшую комбинацию чувствительности и специфичности, рассчитывали в соответствии с формулой: J=Чувствительность+Специфичность-1 (Fluss et al., 2005). Для измерения эффективности диагностического теста, рассчитывали положительную (PPV) и отрицательную прогностическую ценность (NPV): PPV=истинноположительные/(истинноположительные+ложноположительные); NPV=истинноотрицательные/(истинноотрицательные+ложноотрицательные) (Hajian-Tilaki, 2013). Для оценки анализа выживаемости, осуществляли способ Каплана-Мейера, и логарифмический ранговый критерий (Мантеля-Кокса) использовали для проверки различий между метилированной и неметилированной группой. Программное обеспечение SPSS или GraphPad Prism 7.0 использовали для статистического анализа и графического представления. Все выраженные значения p рассчитывали с использованием двусторонних критериев и считали значимыми, когда p<0,05.

Пример 2. Результаты.

Пример 2.1. Образцы тканей.

Пример 2.1.1. Анализ метилирования промотора LINC00473 в тканях опухолей позволяет детекцию пациентов с колоректальным раком.

Уровни метилирования ДНК промоторной области LINC00473 для образцов колоректальной ткани (273 пациентов с колоректальным раком на стадии I, II, III и IV; и 38 контрольных индивидуумов без опухоли) получали после анализа посредством Infinium HumanMethylation450K BeadChip (массива 450K) из международной публичной базы данных The Cancer Genome Atlas (TCGA) (Когорта 1). В этом анализе данные метилирования из массива 450K выражены как средние значения (β), определенные от 0,0 до 1,0. Авторы настоящего изобретения сфокусировали анализ на CpG из промоторной области LINC00473, идентифицированном в массиве 450K как cg08886973. Этот анализ показал значимо (p<0,0001) более высокие уровни метилирования у пациентов с колоректальным раком (0,51±0,011), чем у контрольных индивидуумов без опухоли (0,11±0,006) (Фигура 1A). Сходные результаты получены, когда авторы настоящего изобретения анализировали статус метилирования промотора LINC00473 в когорте 2 посредством бисульфитного пиросеквенирования (180 пациентов с колоректальным раком: 33,93%±1,51%; 93 контрольных индивидуума без опухоли: 5,84%±0,78%; p<0,0001) (Фигура 1B). В этом случае, значения метилирования, полученные посредством пиросеквенирования, выражены в проценте метилирования (%), определенном от 0% до 100%. Совместно, эти данные показывают, что уровни метилирования промоторной области LINC00473, анализируемые в колоректальных тканях, являются способными к установлению различий между индивидуумами без опухоли и пациентами с колоректальным раком.

Анализ уровней метилирования LINC00473 в образцах колоректальной ткани из когорты 1 посредством кривой рабочих характеристик приемника (ROC) показал очень высокую диагностическую точность для установления различий между пациентами с колоректальным раком (I, II, III и IV) и контрольными индивидуумами без опухоли, с площадью под кривой (AUC) 0,94 (p<0,0001; CI 95%: 0,91-0,97) (Фигура 2A). Сходные результаты получены для когорты 2 (AUC=0,90; p<0,0001; CI 95%: 0,86-0,94) (Фигура 2B). Эти результаты показывают, что анализ статуса метилирования промоторной области LINC00473 в образцах колоректальной ткани имеет большую диагностическую точность для идентификации пациентов с колоректальным раком.

Важно, что когда авторы настоящего изобретения стратифицировали пациентов с колоректальным раком, в соответствии с их стадией, в когорте 1 (I: n=41; II: n=106; III: n=58; IV: n=35) и когорте 2 (I: n=10; II: n=84; III: n=56; IV: n=28) (Фигура 3), результаты также показали значимо (p<0,0001) более высокие уровни метилирования у пациентов с колоректальным раком на каждой стадии, по сравнению с контрольными индивидуумами без опухоли (когорта 1, n=38; когорта 2, n= 93).

Пример 2.1.2. Анализ метилирования промотора LINC00473 в колоректальных тканях позволяет идентификацию аденом и колоректальных аденом на поздних стадиях.

Уровни метилирования ДНК промоторной области LINC00473 в колоректальных тканях 12 контрольных индивидуумов без опухоли, 12 пациентов с аденомами и 12 пациентов с колоректальным раком (когорта 3) анализировали посредством бисульфитного пиросеквенирования и выражали как % метилирования. Эти результаты показали значимо (p=0,0036) более высокие уровни метилирования в аденомах (28,21%±%), чем у здоровых контрольных индивидуумов (7,28%±0,81%) (Фигура 4). Как ожидали, для пациентов с колоректальным раком (32,83%±5,19%) также показаны значимые (P=0,002) различия в уровнях метилирования, относительно контрольных индивидуумов без опухоли. Важно, что уровни метилирования LINC00473 в аденомах являлись сходными с пациентами с колоректальным раком (P=0,3186). Эти данные показывают, что уровни метилирования промоторной области LINC00473, анализируемые в колоректальных тканях являются способными к установлению различий между индивидуумами без опухолей и пациентами с аденомами, позволяя предполагать, что статус метилирования промотора LINC00473 можно использовать для ранней детекции колоректального рака.

Анализ уровней метилирования LINC00473 в образцах колоректальной ткани из выборок без опухоли и с аденомой из когорты 3 посредством кривой рабочих характеристик приемника (ROC) показал очень высокую диагностическую точность для установления различий между аденомами и контрольными индивидуумами без опухоли, с площадью под кривой (AUC) 0,84 (p=0,0047; 95% CI: 0,66-1,00) (Фигура 5). Эти результаты показывают, что анализ статуса метилирования промоторной области LINC00473 в образцах колоректальной ткани имеет большую диагностическую точность для идентификации пациентов с колоректальными аденомами, подверженных риску развития колоректального рака.

Кроме того, для оценки статуса метилирования колоректальных аденом и колоректальных аденом на поздних стадиях, авторы настоящего изобретения анализировали уровни метилирования ДНК промоторной области LINC00473 посредством бисульфитного пиросеквенирования в новой независимой когорте образцов ткани с 10 контрольными образцами без опухоли и 50 образцами аденом, которые включали 20 подтвержденных колоректальных аденом на поздних стадиях. Этот анализ показал значимо (p<0,0001) более высокие уровни метилирования в аденомах (20,96%±15,33%), чем у здоровых контрольных индивидуумов (5,70%±0,82%). Конкретно, этот анализ показал значимо (p<0,0003) более высокие уровни метилирования в колоректальных аденомах на поздних стадиях, (26,35%±19,66%), чем у контрольных индивидуумов (5,70%±0,82%) (Фигура 11). Фактически, анализ кривой рабочих характеристик приемника (ROC) также показал очень высокую диагностическую точность для установления различий между колоректальными аденомами на поздних стадиях и контролем без опухоли с AUC 0,88 (p<0,0008; 95% CI: 0,75-1,00) (Фигура 12). Эти результаты подтверждают, что уровни метилирования промоторной области LINC00473 можно использовать для детекции аденом, конкретно, для детекции колоректальных аденом на поздних стадиях.

Пример 2.2. Жидкий биоптат

Пример 2.2.1. Анализ метилирования промотора LINC00473 в жидких биоптатах детектирует пациентов с колоректальным раком.

Уровни метилирования ДНК (%) промоторной области LINC00473 в плазме 28 контрольных индивидуумов и 26 пациентов с колоректальным раком анализировали посредством ПЦР с детекцией в реальном времени, показав значимо (p<0,0001) более высокие уровни метилирования у пациентов с колоректальным раком (25,87%±32,73%), чем у здоровых контрольных индивидуумов (0,003%±0,009%) (Фигура 6). Более высокие уровни метилирования LINC00473 детектированы у 21 из 26 (81%) пациентов с колоректальным раком, относительно здоровых индивидуумов. Эти данные показывают, что уровни метилирования промоторной области LINC00473, анализированные в жидких биоптатах, являются способными к установлению различий между здоровыми индивидуумами и пациентами с колоректальным раком.

Анализ уровней метилирования LINC00473 в плазме посредством кривой рабочих характеристик приемника (ROC) показал очень высокую диагностическую точность для установления различий между пациентами с колоректальным раком и здоровыми контрольными индивидуумами, с площадью под кривой (AUC) 0,87 (p<0,0001; CI 95%: 0,76-0,99) (Фигура 7). На основании анализа кривой ROC и с использованием значения индекса Юдена, получен порог отсечения метилирования для LINC00473 в плазме 0,30%, позволяющий детекцию колоректального рака с чувствительностью 81% (CI 95%: 61%-93%) и специфичностью 100% (CI 95%: 88-100) (Таблица 7). С использованием этого порога отсечения уровня метилирования, положительная прогностическая ценность (PPV) 100% и отрицательная прогностическая ценность (NPV) 85% получена для детекции колоректального рака. Эти результаты показывают, что неинвазивный анализ в жидких биоптатах статуса метилирования промоторной области LINC00473 имеет большую диагностическую точность для идентификации пациентов с колоректальным раком. В Таблица 7 показаны характеристики анализа метилирования промоторной области LINC00473 в качестве диагностического теста для детекции колоректального рака.

Таблица 7

Параметры Процент (%) Чувствительность 81 Специфичность 100 VPP 100 VPN 85

VPP: Положительная прогностическая ценность; VPN: Отрицательная прогностическая ценность

Кроме того, уровни метилирования ДНК (%) промоторной области LINC00473 в плазме пациентов с колоректальным раком также оценивали с использованием способа капельной цифровой ПЦР (кцПЦР). Для этой цели, авторы настоящего изобретения использовали 5 контрольных индивидуумов и 5 пациентов с колоректальным раком. Эти анализы показали значимо (p=0,005) более высокие уровни метилирования у пациентов с колоректальным раком (41,19%±28,79%), чем у здоровых контрольных индивидуумов (0,0%±0,0%) (Фигура 13). Более высокие уровни метилирования LINC00473 детектировали у 5 из 5 (100%) пациентов с колоректальным раком, относительно здоровых индивидуумов, показывая, что уровни метилирования промоторной области LINC00473, анализированные в жидких биоптатах посредством кцПЦР, также являются способными к установлению различий между здоровыми индивидуумами и пациентами с колоректальным раком. Кроме того, анализ кривой рабочих характеристик приемника (ROC) показал, что уровни метилирования LINC00473 в плазме, полученные посредством кцПЦР, имели очень высокую диагностическую точность для установления различий между пациентами с колоректальным раком и здоровыми контрольными индивидуумами, с площадью под кривой (AUC) 1,0 (p<0,0062; CI 95%: 1,0-1,0) (Фигура 14). Эти результаты показывают, что неинвазивный анализ в жидких биоптатах статуса метилирования промоторной области LINC00473 посредством кцПЦР имеет большую диагностическую точность для идентификации пациентов с колоректальным раком.

Пример 2.2.2. Уровни метилирования ДНК из промоторной области LINC00473 в жидких биоптатах прогнозируют исход для пациентов с колоректальным раком.

Клиническое влияние на выживаемость уровней метилирования промотора LINC00473 исследовали в образцах плазмы 25 пациентов с колоректальным раком из таблицы 2 с доступными клиническими данными. Пациентов с колоректальным раком классифицировали по отношению к медианному уровню метилирования группы (уровень метилирования 10%) как представлено посредством i) высокий уровень метилирования в LINC00473 (H: уровень метилирования >10%) или ii) низкий уровень метилирования в LINC00473 (L: уровень метилирования <10%). В соответствии с этой классификацией пациентов, анализ Каплана-Мейера показал, что присутствие высоких уровней метилирования в LINC00473 было значимо ассоциировано с более короткой общей выживаемостью (OS) [отношение рисков (HR)=3,37, 95% доверительный интервал (CI)=1,19-9,93, P=0,0256] (Фигура 8). Эти результаты показывают, что статус метилирования LINC00473 в жидких биоптатах является способным к прогнозированию клинического исхода для пациентов с колоректальным раком, что позволяет предполагать, что анализ метилирования LINC00473 в плазме можно использовать в качестве прогностического биомаркера на время диагностики колоректального рака.

Пример 2.2.3. Анализ метилирования промотора LINC00473 в жидких биоптатах детектирует пациентов с колоректальной аденомой на поздних стадиях.

Уровни метилирования ДНК (%) промоторной области LINC00473 в плазме 5 здоровых контрольных индивидуумов и 12 пациентов с колоректальной аденомой на поздних стадиях анализировали посредством ПЦР с детекцией в реальном времени, показывающей значимо (p=0,0262) более высокие уровни метилирования у пациентов с колоректальной аденомой на поздних стадиях (0,0676%±0,1195%), чем у здоровых контрольных индивидуумов (0,0001%±0,0002%) (Фигура 9). Эти данные показывают, что уровни метилирования промоторной области LINC00473, анализированные в жидких биоптатах, являются способными к установлению различий между здоровыми индивидуумами и пациентами с колоректальной аденомой на поздних стадиях.

Анализ уровней метилирования LINC00473 в плазме посредством кривой рабочих характеристик приемника (ROC) показал очень высокую диагностическую точность для установления различий между пациентами с колоректальной аденомой на поздних стадиях и здоровыми контрольными индивидуумами, с площадью под кривой (AUC) 0,85 (p=0,00269; CI 95%: 0,65-1,0) (Фигура 10). На основании анализа кривой ROC, получен порог отсечения метилирования для LINC00473 в плазме 0,000115, позволяющий детекцию аденомы на поздних стадиях с чувствительностью 92% и специфичностью 80% (Таблица 8). С использованием этого порога отсечения уровня метилирования, PPV 92% и NPV 80% получены для детекции колоректальной аденомы на поздних стадиях. Эти результаты показывают, что неинвазивный анализ в жидких биоптатах статуса метилирования промоторной области LINC00473 имеет большую диагностическую точность для идентификации пациентов с колоректальной аденомой на поздних стадиях. В таблице 8 показаны характеристики анализа метилирования промоторной области LINC00473 в качестве диагностического теста для детекции колоректальной аденомы на поздних стадиях.

Таблица 8

Параметры Процент (%) Чувствительность 92 Специфичность 80 VPP 92 VPN 80

VPP: Положительная прогностическая ценность; VPN: Отрицательная прогностическая ценность

Кроме того, уровни метилирования ДНК (%) промоторной области LINC00473 в плазме также оценивали посредством капельной цифровой ПЦР у 5 здоровых контрольных индивидуумов и 10 пациентов с колоректальной аденомой на поздних стадиях. Эти результаты показали значимо (p=0,038) более высокие уровни метилирования у пациентов с колоректальной аденомой на поздних стадиях (0,94%±0,99%), чем у здоровых контрольных индивидуумов (0,0%±0,0%) (Фигура 15), показывая, что уровни метилирования промоторной области LINC00473, анализируемые в жидких биоптатах посредством кцПЦР, также являются способными к установлению различий между здоровыми индивидуумами и пациентами с колоректальной аденомой на поздних стадиях.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> SERVIZO GALEGO DE SAÚDE

FUNDACIÓN INSTITUTO DE INVESTIGACIÓN SANITARIA DE SANTIAGO

DE COMPOSTELA

<120> СПОСОБ IN VITRO ДИАГНОСТИКИ ИЛИ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ КОЛОРЕКТАЛЬНОГО

РАКА ИЛИ ЕГО ПРЕДРАКОВОЙ СТАДИИ

<130> 905170

<160> 9

<170> PatentIn версии 3.5

<210> 1

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственная последовательность

<400> 1

ggggaggyga taggtttggt tttagtt 27

<210> 2

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственная последовательность

<400> 2

acacaccaaa aatcttttct acc 23

<210> 3

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственная последовательность

<400> 3

gataggtttg gttttagtta ta 22

<210> 4

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственная последовательность

<400> 4

tacggttttg ggtcgttagc 20

<210> 5

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственная последовательность

<400> 5

cgaaaccaac acgaacgata 20

<210> 6

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственная последовательность

<400> 6

gtatggtttt gggttgttag tgg 23

<210> 7

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственная последовательность

<400> 7

ccaaaaccaa cacaaacaat aac 23

<210> 8

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственная последовательность

<400> 8

taacgttgcg ttatttgggc 20

<210> 9

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственная последовательность

<400> 9

ttagttataa tgttgtgtta tttgggt 27

<---

Изобретение относится медицинской биотехнологии. Предложен способ in vitro идентификации пациента с колоректальным раком или его предраковой стадией, включающий определение статуса метилирования гена LINC00473 в жидком биоптате, полученном от пациента, где уровень метилирования гена LINC00473 выше, чем эталонный уровень метилирования гена LINC00473, измеренный у здоровых контрольных субъектов, является показателем того, что субъект страдает колоректальным раком или предраковой стадией или имеет плохой прогноз. Предложено применение in vitro метилированного гена LINC00473 для диагностики и/или прогнозирования колоректального рака или его предраковой стадии на основе статуса метилирования гена LINC00473. Способ по изобретению обеспечивает высокую чувствительность и специфичность, что означает, что он представляет собой мощный и эффективный способ детекции как колоректального рака, так и колоректальных аденом. 4 н. и 11 з.п. ф-лы, 8 табл., 15 ил., 2 пр.

1. Способ in vitro идентификации пациента с колоректальным раком или его предраковой стадией, включающий определение статуса метилирования гена LINC00473 в жидком биоптате, полученном от пациента, где уровень метилирования гена LINC00473 выше, чем эталонный уровень метилирования гена LINC00473, измеренный у здоровых контрольных субъектов, является показателем того, что субъект страдает колоректальным раком или предраковой стадией.

2. Способ in vitro прогнозирования колоректального рака, включающий определение статуса метилирования гена LINC00473 в жидком биоптате, полученном от пациента, где уровень метилирования гена LINC00473 выше, чем эталонный уровень метилирования гена LINC00473, измеренный у контрольных пациентов, является показателем того, что пациент имеет плохой прогноз.

3. Способ in vitro по любому из предшествующих пунктов, где жидкий биоптат представляет собой образец плазмы, крови или сыворотки.

4. Способ in vitro, по любому из предшествующих пунктов, где предраковая стадия представляет собой колоректальную аденому, предпочтительно колоректальную аденому на поздних стадиях.

5. Способ in vitro по любому из предшествующих пунктов, где статус метилирования гена LINC00473 определяют по меньшей мере в CpG из промоторной области.

6. Способ in vitro по любому из предшествующих пунктов, где статус метилирования гена LINC00473 определяют по меньшей мере в CpG из промоторной области, локализованном между хромосомными положениями Chr6: 166402081 и Chr6: 166402638.

7. Способ in vitro по любому из предшествующих пунктов, где статус метилирования гена LINC00473 определяют по меньшей мере в CpG из промоторной области, локализованном в хромосомном положении, выбранном из группы, содержащей: Chr6: 166402638, и/или Chr6: 166402474, и/или Chr6: 166402463, и/или Chr6: 166402457, и/или Chr6: 166402416, и/или Chr6: 166402379, и/или Chr6: 166402375, и/или Chr6: 166402364, и/или Chr6: 166402081, предпочтительно CpG, выбранном из группы, содержащей: cg06545143, и/или cg08886973, и/или cg21306006.

8. Способ in vitro по любому из предшествующих пунктов, где диагноз колоректального рака и/или его предраковой стадии подтверждают посредством способа визуализации, предпочтительно колоноскопии.

9. Применение in vitro метилированного гена LINC00473 для диагностики и/или прогнозирования колоректального рака или его предраковой стадии на основе статуса метилирования гена LINC00473.

10. Применение in vitro набора, содержащего реагенты для определения по меньшей мере статуса метилирования гена LINC00473, для диагностики и/или прогнозирования колоректального рака или его предраковой стадии.

11. Применение in vitro по любому из пп. 9 или 10, где предраковая стадия представляет собой колоректальную аденому, предпочтительно колоректальную аденому на поздних стадиях.

12. Применение in vitro по любому из пп. 9-11, где метилированный ген LINC00473 используется для определения статуса метилирования по меньшей мере CpG из промоторной области гена LINC00473.

13. Применение in vitro по любому из пп. 9-12, где метилированный ген LINC00473 используется для определения статуса метилирования по меньшей мере CpG из промоторной области гена LINC00473, локализованного между хромосомными положениями Chr6: 166402081 и Chr6: 166402638.

14. Применение in vitro по любому из пп. 9-13, где метилированный ген LINC00473 используется для определения статуса метилирования по меньшей мере CpG из промоторной области гена LINC00473, локализованного в хромосомном положении, выбранном из группы, содержащей: Chr6: 166402638, и/или Chr6: 166402474, и/или Chr6: 166402463, и/или Chr6: 166402457, и/или Chr6: 166402416, и/или Chr6: 166402379, и/или Chr6: 166402375, и/или Chr6: 166402364, и/или Chr6: 166402081, предпочтительно CpG, выбранном из группы, содержащей: cg06545143, и/или cg08886973, и/или cg21306006.

15. Применение in vitro по любому из пп. 9-14, где диагноз колоректального рака и/или его предраковой стадии подтверждают посредством способа визуализации, предпочтительно колоноскопии.