СОЕДИНЕНИЕ, СПОСОБ И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ МОДУЛИРОВАНИЯ ЭКСПРЕСИИ DUX4 Российский патент 2024 года по МПК C12N15/113 A61K31/7088 A61K48/00 A61P21/00 A61P43/00 

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Область техники, к которой относится изобретение

[0001]

Настоящее изобретение относится к соединению, снижающему экспрессию мРНК и белка DUX4 у животных, способу применения соединения и фармацевтической композиции, содержащей это соединение. Способ по настоящему изобретению может быть использован для терапевтического лечения, предотвращения или облегчения заболеваний, связанных с DUX4, например, фациоскапуло-плечевой мышечной дистрофии (FSHD).

Описание уровня техники

[0002]

Фациоскапуло-плечевая мышечная дистрофия (FSHD) является мышечной дистрофией, которая встречается с частотой приблизительно 1 из 20000 во всем мире и 1 из 7500 в Европе, и является третьей по распространенности мышечной дистрофией после мышечной дистрофии Дюшенна и миотонической дистрофии. Первым симптомом является слабость лицевых мышц, верхних конечностей, лопатки и пояса верхних конечностей. Пояс нижних конечностей и нижние конечности также повреждаются по мере прогрессирования заболевания, и около 20% пациентов к 40 годам будут находиться в инвалидном кресле (даже в среднем возрасте может быть только легкое поражение лицевых мышц). Также распространены осложнения в виде боли, неврологической глухоты и ретинопатии. Примерно у 90% пациентов симптомы развиваются к 20 годам. У пациентов с тяжелыми заболеваниями (около 4%) мышечная слабость проявляется с младенчества.

[0003]

FSHD подразделяется на два типа: FSHD1 и FSHD2, в зависимости от генов, вызывающих заболевание. FSHD1 составляет около 95% всех пациентов с FSHD. У пациентов с FSHD1 область повторов D4Z4 в 4q35 генетически укорочена (от 1 до 10 повторов D4Z4). В результате возникает аномальная экспрессия DUX4, кодируемого в повторяющейся области D4Z4 (DUX4 не экспрессируется у здоровых людей). FSHD2 составляет около 5% всех пациентов с FSHD, а аномальная экспрессия DUX4 происходит из-за мутации SMCHD1 (ДНК-метилазы). DUX4 выполняет функцию фактора транскрипции и экспрессирует группу генов, которые кодируются ниже по течению и вызывают апоптоз мышечных клеток или мышечную атрофию. Аномальная экспрессия DUX4 связана с наличием аллеля, называемого 4qA, из двух аллелей 4qA и 4qB. Сайт полиаденилирования, присутствующий в 4qA, необходим для стабилизации мРНК DUX4 (непатентный документ 1, непатентный документ 2, непатентный документ 3).

[0004]

Антисмысловая технология появляется как эффективное средство для модуляции экспрессии определенных генных продуктов и, таким образом, может оказаться уникально полезной в некоторых терапевтических, диагностических и исследовательских приложениях для модуляции DUX4.

[0005]

Сообщалось о способе подавления экспрессии гена DUX4 с использованием аденоассоциированного вируса, кодирующего миРНК DUX4 (патентный документ 1). Однако получение аденоассоциированного вируса обременительно, а доставка аденоассоциированного вируса к необходимым системным мышцам затруднена.

[0006]

Сообщалось о способе подавления экспрессии гена DUX4 с использованием лентивируса, кодирующего кшРНК DUX4 (патентный документ 2). Однако получение лентивируса обременительно, а доставка лентивируса к необходимым системным мышцам затруднена. Кроме того, подавление гена in vitro имеет 21% и 44% остаточной активности в клетках четырехглавой мышцы и трапециевидной мышцы, и, таким образом, этого недостаточно.

[0007]

Сообщалось о соединении, в котором связаны множественные антисмысловые олигонуклеотиды, нацеленные на DUX4 (патентный документ 2). Однако это не модифицированный олигонуклеотид, и его ингибирующий эффект недостаточен.

[0008]

Сообщалось об антисмысловом олигонуклеотидном соединении, которое связывается с сайтом сплайсинга мРНК DUX4 (патентный документ 3). Однако, поскольку эти соединения селективны в отношении пре-мРНК, содержащей интрон, их ингибирующий эффект в отношении зрелой мРНК является слабым, и из-за нокдауна методом липофекции их трудно вводить в живой организм.

[0009]

Современные методы лечения FSHD включают реабилитацию (растяжку и упражнения) в качестве симптоматического лечения, прием НПВП, респираторную помощь и тому подобное. Однако их эффекты недостаточны, и нагрузка на пациента велика. Следовательно, целью настоящего документа является предоставление соединения, композиции и способа лечения FSHD.

[Предшествующий уровень техники]

[Патентные документы]

[0010]

[Патентный документ 1] Международная публикация № 2013/016352.

[Патентный документ 2] Международная публикация № 2017/007886.

[Патентный документ 3] Публикация патентной заявки США № 2012/0225034.

[Непатентные документы]

[0011]

[Непатентный документ 1] Snider et al., PLoS 2010, Vol.6 (10) p1.

[Непатентный документ 2] Ferreboeuf et al., Human Molecular Genetics 2013, Vol. 23 (1), p171.

[Непатентный документ 3] Sacconi et al., Biochim. Biophys. Acta 2015, p607.

Полное содержание этих публикаций включено в настоящий документ посредством ссылки.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[Задачи, решаемые изобретением]

[0012]

Целью настоящего изобретения является предоставление соединения, способа и фармацевтической композиции для ингибирования экспрессии DUX4 и для лечения, то есть терапевтического лечения, предотвращения, отсрочки или облегчения заболеваний, связанных с DUX4, и/или их симптомов. Описанные в настоящем документе соединение и фармацевтическая композиция также ингибируют мутантный DUX4, такой как варианты сплайсинга SNP и DUX4.

[0013]

В некоторых вариантах осуществления изобретения предложен способ снижения экспрессии DUX4 у животных (включая людей), где способ включает введение животному соединения, содержащего модифицированный олигонуклеотид, нацеленного на DUX4, или фармацевтической композиции, содержащей это соединение, как описано в настоящем документе.

[0014]

В некоторых вариантах осуществления изобретения предложен способ нокдауна с помощью ядерной рибонуклеазы (такой как РНКаза H) путем введения животному соединения или фармацевтическая композиции, содержащей модифицированный олигонуклеотид, нацеленный на DUX4. Кроме того, предложен способ ингибирования транскрипции мРНК DUX4 и трансляции белка DUX4 путем введения соединения, содержащего модифицированный олигонуклеотид. Модифицированный олигонуклеотид, предпочтительно, распределяется в мышцах и особенно предпочтительно в скелетных мышцах.

[0015]

В некоторых вариантах осуществления изобретения предложен способ лечения животного, страдающего FSHD. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ по настоящему изобретению дополнительно включает введение животному терапевтически эффективного количества соединения или фармацевтической композиции, содержащей модифицированный олигонуклеотид, нацеленный на DUX4, описанный в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ по настоящему изобретению включает идентификацию животного, страдающего FSHD1 и/или FSHD2.

[0016]

В некоторых вариантах осуществления изобретения предложен способ лечения, то есть терапевтического лечения, предотвращения, отсрочки или облегчения мышечной атрофии и мышечной слабости. Он предназначен для облегчения или отсрочки ухудшения плохой мимики лица, сна с открытыми глазами, затруднений при поднятии верхних конечностей, а также крылатых лопаток. Кроме того, предпочтительным является предотвращение мышечной слабости поясничного пояса и нижних конечностей, а также предотвращение осложнений неврологической глухоты и ретинопатии.

[0017]

В некоторых вариантах осуществления изобретения мРНК DUX4 имеет последовательность, указанную под регистрационным номером GenBank NM_001293798.2 (включена в настоящий документ как SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей). Вариант сплайсинга мРНК DUX4 с SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей также упоминается как DUX4-FL1 или зрелая мРНК DUX4. В некоторых вариантах осуществления изобретения мРНК DUX4 имеет последовательность, указанную под регистрационным номером GenBank NM_001306068.2 (включена в настоящий документ как SEQ ID NO: 5 в списке последовательностей). Вариант сплайсинга мРНК DUX4 с SEQ ID NO: 5 в списке последовательностей также обозначается как DUX4-FL2. В некоторых вариантах осуществления изобретения DUX4 имеет последовательность, указанную в регистрационном номере GenBank NM_001363820.1 (включена в настоящий документ как SEQ ID NO: 6 в списке последовательностей). Вариант сплайсинга мРНК DUX4 с SEQ ID NO: 6 в списке последовательностей обозначается также как DUX4-s. В некоторых вариантах осуществления изобретения DUX4 относится к SNP указанного выше варианта сплайсинга.

[Средства решения задач]

[0018]

Настоящее изобретение относится к неограничивающим пронумерованным вариантам осуществления, описанным в следующих аспектах [1]-[27], но не ограничивается ими.

[0019]

Аспект [1] Модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 12-30 остатков, содержащий последовательность нуклеиновых оснований, которая включает по меньшей мере 8 непосредственно примыкающих друг к другу последовательностей нуклеиновых оснований и комплементарна части равной длины в положениях 126-147, 232-248, 1306-1325 или 1480-1495 от 5ʼ-конца последовательности нуклеиновых оснований зрелой мРНК DUX4 в SEQ ID NO: 1, где последовательность нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида имеет по меньшей мере 90% комплементарности с частью равной длины в последовательности нуклеиновых оснований зрелой мРНК DUX4 в SEQ ID NO: 1, когда по меньшей мере 8 непосредственно примыкающих друг к другу последовательностей нуклеиновых оснований включают последовательность нуклеиновых оснований, которая комплементарна части равной длины в положениях 1480-1495 от 5ʼ-конца последовательности нуклеиновых оснований в SEQ ID NO: 1, указанный модифицированный олигонуклеотид состоит из последовательности нуклеиновых оснований, имеющей на 3ʼ-конце основание, комплементарное основанию в положении 1480 от 5ʼ-конца нуклеинового основания SEQ ID NO: 1.

[0020]

Аспект [2] Модифицированный олигонуклеотид в соответствии с аспектом [1], где один или несколько модифицированных нуклеотидов модифицированного олигонуклеотида включают, каждый, модифицированный сахар.

Аспект [3] Модифицированный олигонуклеотид в соответствии с аспектом [2], где модифицированный сахар выбран из группы, состоящей из бициклического сахара, модифицированного 2ʼ-O-метоксиэтил-модифицированного сахара и 2ʼ-O-метил-модифицированного сахара.

Аспект [4] Модифицированный олигонуклеотид в соответствии с аспектом [3], где бициклический сахар выбран из группы, включающей LNA, GuNA, ALNA [Ms], ALNA [mU], ALNA [ipU], ALNA [Oxz] и ALNA [Trz].

[0021]

Аспект [5] Модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 12-30 остатков, где модифицированный олигонуклеотид содержит последовательность нуклеиновых оснований, которая включает по меньшей мере 8 непосредственно примыкающих друг к другу последовательностей нуклеиновых оснований и комплементарна части равной длины в положениях 1472-1495 от 5ʼ-конца последовательности нуклеиновых оснований зрелой мРНК DUX4 в SEQ ID NO: 1, указанная последовательность нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида по меньшей мере на 90% комплементарна части равной длины в последовательности нуклеиновых оснований зрелой мРНК DUX4 в SEQ ID NO: 1, и указанный модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере один нуклеозид, который включает модифицированный сахар, выбранный из GuNA, ALNA [Ms], ALNA [mU], ALNA [ipU], ALNA [Oxz] и ALNA [Trz].

[0022]

Аспект [6] Модифицированный олигонуклеотид в соответствии с аспектом [5], дополнительно содержащий 2ʼ-O-метоксиэтил-модифицированный сахар и/или 2ʼ-O-метил-модифицированный сахар.

[0023]

Аспект [7] Модифицированный олигонуклеотид в соответствии с любым из аспектов [1]-[6], где по меньшей мере один модифицированный нуклеотид модифицированного олигонуклеотида включает модифицированное нуклеиновое основание.

Аспект [8] Модифицированный олигонуклеотид в соответствии с аспектом [7], где модифицированное нуклеиновое основание представляет собой 5-метилцитозин.

[0024]

Аспект [9] Модифицированный олигонуклеотид в соответствии с любым из аспектов [1]-[8], где по меньшей мере одна межнуклеозидная связь представляет собой модифицированную межнуклеозидную связь.

Аспект [10] Модифицированный олигонуклеотид в соответствии с аспектом [9], где модифицированная межнуклеозидная связь представляет собой фосфоротиоатную межнуклеозидную связь.

[0025]

Аспект [11] Модифицированный олигонуклеотид в соответствии с любым из аспектов [1]-[10], включающий: 1) сегмент гэпа, 2) сегмент 5ʼ-крыла и 3) сегмент 3ʼ-крыла, где сегмент гэпа расположен между сегментом 5ʼ-крыла и сегментом 3ʼ-крыла, все нуклеозиды сегмента 5ʼ-крыла и сегмента 3ʼ-крыла, каждый, включают по меньшей мере один модифицированный сахар, и сегмент гэпа включает только нуклеозиды, которые не содержат модифицированный сахар, или включает один или два нуклеозида, каждый из которых содержит модифицированный сахар, и включает другие нуклеозиды, которые не содержат модифицированный сахар.

[0026]

Аспект [12] Модифицированный олигонуклеотид в соответствии с любым из аспектов [1]-[11], состоящий из последовательности нуклеиновых оснований, которая комплементарна

последовательности нуклеиновых оснований в положениях 128-143 от 5ʼ-конца последовательности нуклеиновых оснований зрелой мРНК DUX4 в SEQ ID NO: 1,

последовательности нуклеиновых оснований в положениях 232-247 от 5ʼ-конца,

последовательности нуклеиновых оснований в положениях 233-248 от 5ʼ-конца,

последовательности нуклеиновых оснований в положениях 1309-1323 от 5ʼ-конца или

последовательности нуклеиновых оснований в положениях 1480-1495 от 5ʼ-конца.

[0027]

Аспект [13] Модифицированный олигонуклеотид в соответствии с любым из аспектов [1]-[12], состоящий из последовательности оснований

gtggcgatgc ccgggt (SEQ ID NO: 75),

gagattcccg cnggtg (SEQ ID NO: 78: n представляет собой 5-метилцитозин),

ngagattcccgccggt (SEQ ID NO: 2: n представляет собой 5-метилцитозин),

gnagttctccgcggt (SEQ ID NO: 3: n представляет собой 5-метилцитозин) или

gnntagacagcgtngg (SEQ ID NO: 4: n представляет собой 5-метилцитозин).

[0028]

Аспект [14] Модифицированный олигонуклеотид в соответствии с аспектом [13], представленный следующей формулой:

GlsMlsMlsTdsAdsGdsAdsCdsAdsGdsCdsGdsTdsMlsGlsGl,

где нуклеиновые основания представлены следующими символами:

A=аденин, T=тимин, G=гуанин, C=цитозин и M=5-метилцитозин;

сахарные компоненты представлены следующими символами:

l=LNA и d=2ʼ-дезоксирибоза;

и межнуклеозидные связи представлены следующим символом:

s=фосфоротиоат.

[0029]

Аспект [15] Модифицированный олигонуклеотид в соответствии с аспектом [13], представленный следующей формулой:

GmsMmsMmsTdsAdsGdsAdsCdsAdsGdsCdsGdsTdsMmsGmsGm,

где нуклеиновые основания представлены следующими символами:

A=аденин, T=тимин, G=гуанин, C=цитозин и M=5-метилцитозин;

сахарные компоненты представлены следующими символами:

m=ALNA [Ms] и d=2ʼ-дезоксирибоза;

и межнуклеозидные связи представлены следующим символом:

s=фосфоротиоат.

[0030]

Аспект [16] Модифицированный олигонуклеотид в соответствии с аспектом [13], представленный следующей формулой:

GmsMmsAmsGdsTdsTdsCdsTdsCdsCdsGdsCdsGmsGmsTm,

где нуклеиновые основания представлены следующими символами:

A=аденин, T=тимин, G=гуанин, C=цитозин и M=5-метилцитозин;

сахарные компоненты представлены следующими символами: m=ALNA [Ms], и d=2ʼ-дезоксирибоза;

и межнуклеозидные связи представлены следующим символом:

s=фосфоротиоат.

[0031]

Аспект [17] Модифицированный олигонуклеотид в соответствии с аспектом [13], представленный следующей формулой:

MlsGlsAlsGdsAdsTdsTdsCdsCdsCdsGdsCdsCdsGlsGlsTl,

где нуклеиновые основания представлены следующими символами:

A=аденин, T=тимин, G=гуанин, C=цитозин и M=5-метилцитозин;

сахарные компоненты представлены следующими символами:

l=LNA и d=2ʼ-дезоксирибоза;

и межнуклеозидные связи представлены следующим символом:

s=фосфоротиоат.

[0032]

Аспект [18] Модифицированный олигонуклеотид в соответствии с аспектом [14], представленный следующей формулой, или его соль:

.

[0033]

Аспект [19] Модифицированный олигонуклеотид в соответствии с аспектом [15], представленный следующей формулой, или его соль:

.

[0034]

Аспект [20] Модифицированный олигонуклеотид в соответствии с аспектом [16], представленный следующей формулой, или его соль:

.

[0035]

Аспект [21] Модифицированный олигонуклеотид в соответствии с аспектом [17], представленный следующей формулой, или его соль:

.

[0036]

Аспект [22] Фармацевтическая композиция, содержащая модифицированный олигонуклеотид в соответствии с любым из аспектов [1]-[21] или его фармацевтически приемлемую соль и фармацевтически приемлемый носитель.

[0037]

Аспект [23] Фармацевтическая композиция в соответствии с аспектом [22] для терапевтического лечения, предотвращения или задержки развития заболевания, связанного с DUX4.

[0038]

Аспект [24] Фармацевтическая композиция в соответствии с аспектом [23], где заболевание, связанное с DUX4, представляет собой фациоскапуло-плечевую мышечную дистрофию.

[0039]

Аспект [25] Способ терапевтического лечения, предотвращения или замедления прогрессирования заболевания, связанного с DUX4, у субъекта, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества модифицированного олигонуклеотида в соответствии с любым из аспектов [1]-[21].

[0040]

Аспект [26] Применение модифицированного олигонуклеотида в соответствии с любым из аспектов [1]-[21] при изготовлении медицинского препарата для терапевтического лечения, предотвращения или замедления прогрессирования заболевания, связанного с DUX4.

[0041]

Аспект [27] Применение модифицированного олигонуклеотида в соответствии с любым из аспектов [1]-[21] для терапевтического лечения, предотвращения или замедления прогрессирования заболевания, связанного с DUX4.

[Эффект изобретения]

[0042]

В соответствии с настоящим изобретением может быть предоставлен модифицированный олигонуклеотид, эффективный для лечения таких заболеваний, как фациоскапуло-плечевая мышечная дистрофия, вызванная аномальной экспрессией гена DUX4.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Более полное понимание изобретения и многих сопутствующих ему преимуществ будет легко получено по мере того, как оно станет более понятным со ссылкой на следующее подробное описание при рассмотрении в сочетании с прилагаемыми фигурами, где:

[0043]

[Фиг. 1] Фигура, показывающая эффекты подавления экспрессии гена DUX4 путем введения различных олигонуклеотидов, модифицированных DUX4.

[Фиг. 2] Фигура, показывающая эффекты подавления экспрессии гена DUX4 путем введения различных олигонуклеотидов, модифицированных DUX4.

[Фиг. 3] Фигура, показывающая дозозависимые эффекты подавления экспрессии гена DUX4 путем введения олигонуклеотидов, модифицированных DUX4.

[Фиг. 4] Фигуры, показывающие эффекты подавления экспрессии гена DUX4 путем введения различных олигонуклеотидов, модифицированных DUX4.

[Фиг. 5] Фигуры, показывающие эффекты подавления креатинкиназы у мышей DUX4 Tg и подавления мРНК DUX4 путем введения олигонуклеотида, модифицированного DUX4 (соединение № 3).

[Фиг. 6] Фигуры, показывающие эффекты подавления креатинкиназы у мышей DUX4 Tg и подавления мРНК DUX4 путем введения олигонуклеотидов, модифицированных DUX4 (соединение № 123, соединение № 247 и соединение № 113).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Далее описаны варианты осуществления со ссылкой на прилагаемые чертежи, где на разных чертежах одинаковые ссылочные позиции обозначают соответствующие или идентичные элементы.

[0044]

Следует учесть, что как приведенное выше краткое изложение, так и последующее подробное описание являются только иллюстративными и пояснительными и не ограничивают настоящее изобретение, как заявлено. В настоящем описании, если специально не указано иное, использование формы единственного числа включает форму множественного числа. В настоящем описании, если специально не указано иное, использование термина «или» означает «и/или». Кроме того, использование термина «включающий» и других его форм, таких как «включает» и «включенный», не является ограничивающим. Кроме того, если специально не указано иное, термин «элемент» и тому подобное включает элемент, который охватывает одну единицу, и элемент, который охватывает более одной субъединицы.

[0045]

Заголовки разделов, используемые в настоящем документе, предназначены только для организационных целей и не должны рассматриваться как ограничение описываемого предмета. Все документы или части документов, процитированные в настоящей заявке, включая, помимо прочего, патенты, заявки на патенты, отчеты, книги и статьи, явным образом включены в настоящий документ посредством ссылки в отношении частей документа, обсуждаемых в данном документе, и во всей их полноте.

[0046]

(Определения)

Если не приведено особое определение, то номенклатура, используемая в соответствии с аналитической химией, синтетической органической химией, медицинской химией и фармацевтической химией, а также способы и методы, описанные в настоящем документе, хорошо известны в данной области и широко используются. Как используется в настоящем документе, в случае химического синтеза и химического анализа могут использоваться стандартные методы. Где возможно, все патенты, заявки на патенты, опубликованные заявки на патенты и другие публикации, упоминаемые в описании настоящего изобретения, а также регистрационные номера GenBank и соответствующая информация о последовательностях, а также другие данные, доступные через базы данных, такие как Национальный центр биотехнологической информации (NCBI), включены посредством ссылки в отношении частей документов, обсуждаемых в настоящем документе, и во всей полноте.

Кроме того, настоящее описание представлено вместе с перечнем последовательностей в электронном формате. Однако информация о списке последовательностей, приведенная в электронном формате, полностью включена в настоящий документ посредством ссылки.

[0047]

Если не указано иное, следующие термины имеют следующие значения.

[0048]

Термин «нуклеиновая кислота» относится к соединению, состоящему из мономерного нуклеотида. Примеры нуклеиновых кислот включают, но этим не ограничиваются, рибонуклеиновую кислоту (РНК), дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК), одноцепочечную нуклеиновую кислоту, двухцепочечную нуклеиновую кислоту, короткую интерферирующую рибонуклеиновую кислоту (киРНК) и микроРНК (миРНК). Нуклеиновая кислота также может включать комбинации этих элементов в одной молекуле.

[0049]

Термин «нуклеиновое основание» означает гетероциклический фрагмент, который может образовывать пару с основанием другой нуклеиновой кислоты. Нуклеиновые основания включают «модифицированные нуклеиновые основания» и «немодифицированные нуклеиновые основания».

[0050]

Термин «последовательность нуклеиновых оснований» означает порядок непосредственно примыкающих друг к другу нуклеиновых оснований, не зависящий от какой-либо сахарной связи или модификации нуклеиновых оснований.

[0051]

Термин «нуклеозид» означает нуклеиновое основание, связанное с сахаром. В некоторых вариантах осуществления изобретения нуклеозид связан с фосфатной группой.

[0052]

Термин «нуклеотид» означает нуклеозид, имеющий фосфатную группу или тому подобное, ковалентно связанную с сахарным фрагментом нуклеозида. Природные нуклеотиды содержат рибозные или дезоксирибозные сахарные фрагменты и ковалентно связаны фосфодиэфирными связями через фосфатные группы.

[0053]

Термин «олигомерное соединение» или «олигомер» относится к полимеру из связанных мономерных субъединиц, который способен гибридизоваться по меньшей мере с одной областью молекулы нуклеиновой кислоты.

[0054]

Термин «олигонуклеотид» означает полимер из связанных нуклеозидов, в котором нуклеозиды и межнуклеозидные связи могут быть независимо друг от друга модифицированными или немодифицированными.

[0055]

Термин «немодифицированный нуклеотид» означает нуклеотид, состоящий из природного нуклеинового основания, сахарного фрагмента и межнуклеозидной связи. В некоторых вариантах осуществления изобретения немодифицированный нуклеотид представляет собой, без ограничения, нуклеотид РНК (то есть β-D-рибонуклеозид) или нуклеотид ДНК (то есть β-D-дезоксирибонуклеозид).

[0056]

Термин «модифицированный нуклеотид» означает нуклеотид, содержащий, независимо, модифицированный сахарный фрагмент, модифицированную межнуклеозидную связь или модифицированное нуклеиновое основание. «Модифицированный нуклеозид» означает нуклеозид, независимо имеющий модифицированный сахарный фрагмент или модифицированное нуклеиновое основание.

[0057]

Термин «межнуклеозидная связь» относится к химической связи между нуклеозидами.

[0058]

Термин «связанные нуклеозиды» означают соседние нуклеозиды, которые связаны или связаны межнуклеозидной связью.

[0059]

Термин «природная межнуклеозидная связь» означает 3ʼ-5ʼ-фосфодиэфирную связь.

[0060]

Термин «модифицированная межнуклеозидная связь» относится к замене или любому изменению природной межнуклеозидной связи (то есть фосфодиэфирной межнуклеозидной связи). Например, существует фосфоротиоатная межнуклеозидная связь, но этим не ограничивается.

[0061]

Термин «фосфоротиоатная межнуклеозидная связь» означает межнуклеозидную связь, в которой фосфодиэфирная связь модифицируется заменой одного из немостиковых атомов кислорода на атом серы. Фосфоротиоатная связь является одним из примеров модифицированной межнуклеозидной связи.

[0062]

Термин «модифицированное нуклеиновое основание» относится к любому нуклеиновому основанию, иному, чем аденин, цитозин, гуанин, тимидин или урацил. Например, существует 5-метилцитозин, но этим не ограничивается. «Немодифицированные нуклеиновые основания» означают пуриновые основания аденин (A) и гуанин (G), а также пиримидиновые основания тимин (T), цитозин (C) и урацил (U).

[0063]

Термин «модифицированный олигонуклеотид» означает олигонуклеотид, который содержит по меньшей мере одну из модифицированной нуклеозидной и/или модифицированной межнуклеозидной связи.

Термин «соль» является общим термином для соединений, в которых один или несколько диссоциируемых ионов водорода, содержащихся в кислоте, заменены на катионы, такие как ионы металлов и ионы аммония, и примеры солей модифицированного олигонуклеотида включают, но этим не ограничиваются, соли (например, натриевая соль и магниевая соль), образованные с неорганическими ионами (например, ионами натрия и ионами магния) на тио (S) группах фосфоротиоатных связей или функциональных группах (в случае, например, аминогруппы) в модифицированном азотистом основании.

[0064]

Термин «сахар» или «сахарный фрагмент» означает природный или модифицированный сахарный фрагмент.

[0065]

Термин «природный сахарный фрагмент» означает сахар, содержащийся в ДНК (2ʼ-H) или РНК (2ʼ-OH).

[0066]

Термин «модифицированный сахар» относится к замещению или замене фрагмента природного сахара. Примеры модифицированных сахаров включают замещенный сахарный фрагмент и заменитель сахарного фрагмента.

[0067]

Термин «замещенный сахарный фрагмент» означает фуранозил, отличный от природного сахара РНК или ДНК.

[0068]

«2ʼ-O-Метоксиэтил» (а также 2ʼ-MOE и 2ʼ-O(CH₂)₂-OCH₃) относится к O-метоксиэтил-модификации в 2ʼ-положении фуранозильного кольца. 2ʼ-O-метоксиэтил-модифицированный сахар представляет собой модифицированный сахар.

[0069]

«2ʼ-O-Метоксиэтилнуклеотид» означает нуклеотид, содержащий 2ʼ-O-метоксиэтил-модифицированный сахарный фрагмент.

[0070]

«2ʼ-O-Метил» (а также 2ʼ-OMe и 2ʼ-OCH₃) относится к O-метил-модификации в 2ʼ-положении фуранозильного кольца. 2ʼ-O-метил-модифицированный сахар представляет собой модифицированный сахар.

[0071]

«2ʼ-O-Метилнуклеотид» означает нуклеотид, который содержит 2ʼ-O-метил-модифицированный сахарный фрагмент.

[0072]

Термин «заменитель сахара» для выражения «заменитель сахарного фрагмента» предназначен для обозначения замены только сахарной единицы (фуранозного кольца). Заменитель сахара может заменить природный сахарный фрагмент нуклеозида, и в результате полученные субъединицы нуклеозида могут быть связаны друг с другом и/или с другими нуклеозидами с образованием олигомерного соединения, которое может гибридизоваться с комплементарным олигомерным соединением. Такие структуры включают кольца (например, 4, 6 или 7-членные кольца), содержащие иное количество атомов, чем фуранозил; замену кислорода в фуранозиле на не кислородные атомы (например, углерод, серу или азот); или как изменение числа атомов, так и замену кислорода. Такие структуры могут также содержать замены, соответствующие тем, которые описаны в отношении замещенного сахарного фрагмента (например, 6-членный карбоциклический бициклический заменитель сахара, необязательно содержащий дополнительные заместители). Заменители сахара также включают более сложные заменители сахара (например, ациклические пептидные нуклеиновые кислоты). Примеры заменителей сахара включают, но этим не ограничиваются, морфолино, циклогексенил и циклогекситол.

[0073]

Термин «бициклический сахар» означает фуранозильное кольцо, модифицированное связыванием двух разных атомов углерода, присутствующих в одном кольце. Предпочтительно, «бициклический сахар» означает модифицированный сахар, в котором положения 2ʼ и 4ʼ фуранозильного кольца модифицированы связыванием посредством мостика. «Бициклическая нуклеиновая кислота» относится к нуклеозиду или нуклеотиду, в котором фуранозный фрагмент нуклеозида или нуклеотида содержит «бициклический сахар».

[0074]

«LNA» означает нуклеозид или нуклеотид, обычно называемый 2ʼ,4ʼ-заблокированной нуклеиновой кислотой, и его примеры включают нуклеозид или нуклеотид, представленные общей формулой::

[где B представляет собой нуклеиновое основание; и X и Y, каждый, независимо, представляют собой атом водорода, защитную группу для гидроксильной группы, фосфатную группу, которая может быть замещена, фосфорный фрагмент, ковалентно присоединенный к основе, или тому подобное] (см. WO 98/39352). Их типичные конкретные примеры включают нуклеозид или нуклеотид, представленный следующей формулой:

.

[0075]

«GuNA» представляет собой нуклеозид или нуклеотид, представленный следующей формулой:

[где B представляет собой нуклеиновое основание; R₃, R₄, R₅ и R₆, каждый, независимо, представляют собой атом водорода или C_1-6 алкильную группу, которая может быть замещена одним или несколькими заместителями; R₇ и R₈, каждый, независимо, представляют собой атом водорода, защитную группу для гидроксильной группы, фосфатную группу, которая может быть замещена, фосфорный фрагмент, ковалентно присоединенный к основе, или тому подобное; и R₉, R₁₀ и R₁₁, каждый, независимо, представляют собой атом водорода, C_1-6 алкильную группу, которая может быть замещена одним или несколькими заместителями, или защитную группу для аминогруппы]. (См., например, WO 2014/046212 и WO 2017/047816).

[0076]

«ALNA [mU]» представляет собой нуклеозид или нуклеотид, представленный следующей общей формулой (I):

[где B представляет собой нуклеиновое основание; R₁, R₂, R₃ и R₄, каждый, независимо, представляют собой атом водорода или C_1-6 алкильную группу, которая может быть замещена одним или несколькими заместителями; R₅ и R₆, каждый, независимо, представляют собой атом водорода, защитную группу для гидроксильной группы или фосфатную группу, которая может быть замещена, фосфорный фрагмент, ковалентно присоединенный к основе, или тому подобное; m обозначает 1 или 2; X представляет собой группу, представленную следующей формулой (II-1):

;

символ:

,

описанный в формуле (II-1), обозначает точку присоединения к 2ʼ-аминогруппе; один из R₇ и R₈ представляет собой атом водорода, и другой представляет собой метильную группу, которая может быть замещена одним или несколькими заместителями] (см., например, заявка на патент Японии № 2018-212424). Типичным конкретным примером является нуклеозид или нуклеотид, в котором один из R₇ и R₈ представляет собой атом водорода и другой представляет собой незамещенную метильную группу.

[0077]

«ALNA [ipU]» представляет собой нуклеозид или нуклеотид, представленный общей формулой (I), определенной в приведенном выше описании «ALNA [mU]», и в формуле X представляет собой группу, представленную следующей формулой (II-1):

,

где один из R₇ и R₈ представляет собой атом водорода, и другой представляет собой изопропильную группу, которая может быть замещена одним или несколькими заместителями (см., например, заявка на патент Японии № 2018-212424). Типичным конкретным примером является нуклеозид или нуклеотид, в котором один из R₇ и R₈ представляет собой атом водорода и другой представляет собой незамещенную изопропильную группу.

[0078]

«ALNA [Trz]» представляет собой нуклеозид или нуклеотид, представленный общей формулой (I), определенной в приведенном выше описании «ALNA [mU]», и в формуле X представляет собой группу, представленную следующей формулой (II-2):

,

где A представляет собой триазолильную группу, которая может быть замещена одним или несколькими заместителями (см., например, заявка на патент Японии № 2018-212424). Типичным конкретным примером является нуклеозид или нуклеотид, в котором A представляет собой триазолильную группу, которая может иметь одну или несколько метильных групп, более конкретно, 1,5-диметил-1,2,4-триазол-3-ильную группу.

[0079]

«ALNA [Oxz]» представляет собой нуклеозид или нуклеотид, представленный общей формулой (I), определенной в приведенном выше описании «ALNA [mU]», и в формуле X представляет собой группу, представленную следующей формулой (II-2):

,

где A представляет собой оксадиазолильную группу, которая может быть замещена одним или несколькими заместителями (см., например, заявка на патент Японии № 2018-212424). Типичным конкретным примером является нуклеозид или нуклеотид, в котором A представляет собой оксадиазолильную группу, которая может иметь одну или несколько метильных групп, более конкретно, 5-метил-1,2,4-оксадиазол-3-ильную группу.

[0080]

«ALNA [Ms]» представляет собой нуклеозид или нуклеотид, представленный общей формулой (I), определенной в приведенном выше описании «ALNA [mU]», и в формуле X представляет собой группу, представленную следующей формулой (II-3):

,

где M представляет собой сульфонильную группу, замещенную метильной группой, которая может быть замещена одним или несколькими заместителями (см., например, заявка на патент Японии № 2018-212424). Типичным конкретным примером является нуклеозид или нуклеотид, в котором M представляет собой сульфонильную группу, замещенную незамещенной метильной группой.

[0081]

«5-Метилцитозин» означает цитозин, модифицированный метильной группой, присоединенной в 5-положении. 5-Метилцитозин представляет собой модифицированное нуклеиновое основание.

[0082]

Термин «одноцепочечный олигонуклеотид» означает олигонуклеотид, который не гибридизуется с комплементарной цепью.

[0083]

«DUX4» означает нуклеиновую кислоту или белок фактора транскрипции, который также называется двойным гомеобоксом 4. DUX4 имеет, например, различные варианты сплайсинга, транскрибируемые из гена DUX4, или его однонуклеотидные замены (SNP), и они могут быть и вариантами и/или SNP.

[0084]

Сообщалось о многих вариантах сплайсинга мРНК DUX4. DUX4 человека (SEQ ID NO: 6 в списке последовательностей) состоит из короткого экзона 1 (экзон 1), экзона 2 и экзона 3 из-за атипичного донорского сайта сплайсинга в экзоне 1 и кодирует нетоксичный короткий белок DUX4. Человеческий DUX4-FL состоит из экзона 1, экзона 2 и экзона 3 и кодирует полноразмерный белок DUX4. DUX4-FL включает DUX4-FL1 (SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей), который представляет собой зрелую мРНК, не содержащую интрон 1, и DUX4-FL2 (SEQ ID NO: 5 в списке последовательностей), который содержит интрон 1, и оба кодируют полноразмерный белок DUX4 и при экспрессии в мышцах вызывают FSHD (см. вышеупомянутый непатентный документ 2).

[0085]

мРНК DUX4 также экспрессируется в нормальном семеннике, и помимо DUX4-FL экспрессируются варианты сплайсинга экзона 1, экзона 2, экзона 6, экзона 7 и/или варианты сплайсинга экзона 1, экзона 2, экзона 4, экзона 5, экзона 6, экзона 7 (см. вышеупомянутый непатентный документ 1).

[0086]

Белок DUX4 функционирует как фактор транскрипции, и примеры генов, транскрипция которых модулируется DUX4, включают MBD3L2, ZSCAN4, TRIM43, DEFB103, ZNF217 и тому подобное (см. вышеупомянутый непатентный документ 2).

[0087]

мРНК DUX4, на которую нацелен модифицированный олигонуклеотид по настоящему изобретению, представляет собой, например, предпочтительно, DUX4 человека, более предпочтительно, DUX4-FL и, еще более предпочтительно, DUX4-FL1, описанную в SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей. Кроме того, в качестве сайта-мишени модифицированного олигонуклеотида по настоящему изобретению по отношению к DUX4 предпочтительны экзон 1, интрон 1, экзон 2, интрон 2 и экзон 3.

[0088]

Известно, что ген DUX4 экспрессируется путем слияния с другими генами из-за хромосомных аномалий, таких как транслокация. Сообщается, что другие гены, например, IGH (Yasuda et al., Nature Genetics 48 (5), 569 (2016)), CIC (Yoshimoto et al., Cancer research 77, 2927 (2017)), EWSR1 (Sirvent et al., Cancer Genetics and Cytogenetics 195, 12 (2009)), являются генами, вызывающими В-клеточный острый лимфоцитарный лейкоз, дифференцированную круглоклеточную саркому, рабдомиосаркому плода и тому подобное. Модифицированные олигонуклеотиды по настоящему изобретению также включают соединения, нацеленные на эти слитые гены.

[0089]

Термин «экспрессия DUX4» означает уровень мРНК, транскрибируемой с гена, кодирующего DUX4, или уровень белка, транслируемого с мРНК. Экспрессию DUX4 можно определить с помощью методов, известных в данной области, таких как нозерн- или вестерн-блоттинг, PCR.

[0090]

Термин «нуклеиновая кислота DUX4» означает любую нуклеиновую кислоту, кодирующую DUX4. Например, в некоторых вариантах осуществления изобретения нуклеиновая кислота DUX4 включает последовательность ДНК, кодирующую DUX4, последовательность РНК, транскрибируемую с ДНК, кодирующей DUX4 (включая геномную ДНК, содержащую интроны и экзоны), и предшественник мРНК или сплайсированную зрелую мРНК, кодирующую DUX4. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления изобретения включены последовательности ДНК и РНК генов, полученные слиянием гена DUX4 и других генов.

[0091]

Термин «мРНК DUX4» означает мРНК, кодирующую белок DUX4.

[0092]

Выражение «непосредственно примыкающие друг к другу нуклеиновые основания» или «консекутивные нуклеиновые основания» означает нуклеиновые основания, которые находятся непосредственно рядом друг с другом.

[0093]

Термин «комплементарность» означает способность образовывать пары между нуклеиновыми основаниями первой нуклеиновой кислоты и второй нуклеиновой кислоты.

[0094]

Термин «полностью комплементарный (также называемый комплементарностью)» или «100% комплементарный (также называемый комплементарностью)» означает, что все нуклеиновые основания в последовательности нуклеиновых оснований первой нуклеиновой кислоты имеют комплементарные нуклеиновые основания со второй последовательности нуклеиновых оснований второй нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления изобретения первая нуклеиновая кислота представляет собой модифицированный олигонуклеотид и целевая нуклеиновая представляет собой вторую нуклеиновую кислоту.

[0095]

Термин «гибридизация» означает отжиг комплементарной молекулы нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления изобретения примеры комплементарных молекул нуклеиновой кислоты включают модифицированный олигонуклеотид и нуклеиновую кислоту-мишень.

[0096]

Термин «специфически гибридизируемый» относится к модифицированному олигонуклеотиду, который обладает достаточной комплементарностью между модифицированным олигонуклеотидом и нуклеиновой кислотой-мишенью, чтобы вызвать желаемый эффект, при этом проявляя минимальное действие или не оказывая никакого эффекта на нуклеиновую кислоту, не являющуюся мишенью, в условиях, когда желательно специфическое связывание, то есть в физиологических условиях для анализов in vivo и терапевтического лечения.

[0097]

Термин «ошибочное спаривание» или «некомплементарное нуклеиновое основание» относится к случаю, когда нуклеиновое основание первой нуклеиновой кислоты не может образовывать пару с соответствующим нуклеиновым основанием второй нуклеиновой кислоты или целевой нуклеиновой кислоты.

[0098]

Термин «нацеливание» или «избирать мишенью» означает процесс конструирования и выбора модифицированного олигонуклеотида, который специфически гибридизуется с нуклеиновой кислотой-мишенью и вызывает желаемый эффект.

[0099]

Термин «нуклеиновая кислота-мишень», «РНК-мишень» и «транскрипт РНК-мишени» относятся к нуклеиновой кислоте, на которую может нацеливаться модифицированный олигонуклеотид. В некоторых вариантах осуществления изобретения нуклеиновая кислота-мишень включает область нуклеиновой кислоты DUX4.

[0100]

Термин «целевой сегмент» относится к нуклеотидной последовательности мишеневой нуклеиновой кислоты, на которую нацелен модифицированный олигонуклеотид. «5ʼ-целевой сайт» относится к 5ʼ-крайнему нуклеотиду целевого сегмента. «3ʼ-целевой сайт» относится к 3ʼ-крайнему нуклеотиду целевого сегмента.

[0101]

Термин «активная целевая область» или «целевая область» означает область, на которую нацелены один или несколько активных модифицированных олигонуклеотидов. «Активный модифицированный олигонуклеотид» означает модифицированный олигонуклеотид, который снижает целевой уровень нуклеиновой кислоты или уровень белка.

[0102]

Термин «антисмысловое ингибирование» означает, что по сравнению с уровнем целевой нуклеиновой кислоты или уровнем целевого белка в отсутствие модифицированного олигонуклеотида, уровень целевой нуклеиновой кислоты или уровень белка в присутствии модифицированного олигонуклеотида, комплементарного целевой нуклеиновой кислоте, снижается.

[0103]

Термин «киРНК» означает олигонуклеотид двухцепочечной РНК, имеющий последовательность нуклеиновых оснований, которая делает возможной гибридизацию в отношении соответствующей области или сегмента нуклеиновой кислоты-мишени.

[0104]

Термин «кшРНК» означает одноцепочечный олигонуклеотид РНК типа шпильки, имеющий последовательность нуклеиновых оснований, которая делает возможной гибридизацию в отношении соответствующей области или сегмента нуклеиновой кислоты-мишени.

[0105]

Термин «мякРНК» означает одноцепочечный олигонуклеотид, который представляет собой некодирующую РНК, присутствующую в ядрышке, имеет последовательность нуклеиновых оснований, которая делает возможной гибридизацию в отношении соответствующей области или сегмента нуклеиновой кислоты целевой РНК и направляет химическую модификацию метилирования или псевдоуридилирование нуклеиновой кислоты РНК-мишени.

[0106]

Термин «миРНК» означает одноцепочечный или двухцепочечный олигонуклеотид РНК, который представляет собой некодирующую РНК, модулирующую экспрессию других генов, и имеет последовательность нуклеиновых оснований, что делает возможной гибридизацию по отношению к соответствующей области или сегменту нуклеиновой кислоты-мишени.

[0107]

Термин «кэп-структура» или «концевой кэп-фрагмент» означает химическую модификацию, включенную в любой конец модифицированного олигонуклеотида.

[0108]

Термин «химически отличная область» относится к области модифицированного олигонуклеотида, которая некоторым образом химически отличается от другой области того же модифицированного олигонуклеотида. Например, область, содержащая 2ʼ-O-метоксиэтил нуклеотид, химически отличается от области, содержащей нуклеотид, который не является 2ʼ-O-метоксиэтил модифицированным.

[0109]

Термин «химерный модифицированный олигонуклеотид» означает модифицированный олигонуклеотид, имеющий по меньшей мере две химически различные области.

[0110]

Термин «мотив» означает набор химически различных областей в модифицированном олигонуклеотиде.

[0111]

Термин «гэпмер» означает химерный модифицированный олигонуклеотид, в котором внутренняя область, имеющая несколько нуклеозидов, поддерживающие расщепление РНКазой H, расположена между внешними областями, содержащими один или несколько нуклеозидов, а нуклеозиды, образующие внутреннюю область, химически отличаются от нуклеозида или нуклеозидов, образующих внешние области. Внутренняя область может называться «гэп-сегментом» и внешние области могут называться «сегментами крыльев». Сегмент крыла, расположенный в положении 5ʼ от гэп-сегмента, может указываться как «сегмент 5ʼ-крыла», и сегмент крыла, расположенный в положении 3ʼ от гэп-сегмента, может указываться как «сегмент 3ʼ-крыла».

[0112]

Термин «непосредственно рядом» означает, что между непосредственно смежными элементами нет промежуточных элементов.

[0113]

Термин «ядерная рибонуклеаза» означает рибонуклеазу, обнаруженную в ядре. Примеры ядерных рибонуклеаз включают, но этим не ограничиваются, РНКазу H, включая РНКазу H1 и РНКазу H2, и двухцепочечную РНКазу Дроша, и другие двухцепочечные РНКазы.

[0114]

В некоторых вариантах осуществления изобретения гэпмер означает модифицированный олигонуклеотид, имеющий сегмент 5ʼ-крыла, сегмент 3ʼ-крыла и гэп-сегмент, где сегменты 5ʼ- и 3ʼ-крыла, каждый, содержат 1-8 нуклеозидов, и гэп-сегмент содержит 6 или более нуклеозидов и расположен между двумя сегментами крыла и непосредственно примыкает к ним, причем все нуклеозиды сегмента гэпа являются нуклеозидами, не содержащими модифицированного сахара, или один или два нуклеозида гэп-сегмента являются нуклеозидами, каждый из которых содержат модифицированный сахар, а другие нуклеозиды гэп-сегмента являются нуклеозидами, не содержащими модифицированного сахара.

[0115]

Термин «агент» относится к активному веществу, которое может оказывать терапевтическое действие при введении животному. «Первый агент» означает терапевтическое соединение по настоящему изобретению. Например, первый агент может быть модифицированным олигонуклеотидом, нацеленным на DUX4. «Второй агент» означает второе терапевтическое соединение по настоящему изобретению (например, второй модифицированный олигонуклеотид, нацеленный на DUX4) и/или терапевтическое соединение, которое не нацелено на DUX4.

[0116]

Термин «фармацевтически приемлемая соль» означает физиологически и фармацевтически приемлемую соль модифицированного олигонуклеотида, то есть соль, которая сохраняет желаемую биологическую активность модифицированного олигонуклеотида и не придает нежелательный токсический эффект модифицированному олигонуклеотиду.

[0117]

Термин «разбавитель» означает ингредиент в композиции, который не обладает фармакологической активностью, но является фармацевтически необходимым или желательным. Например, разбавитель в композиции для инъекции может быть жидкостью, такой как физиологический раствор.

[0118]

Термин «заболевание, связанное с DUX4», относится к заболеванию, вызванному аномальной экспрессией мРНК DUX4 или белка DUX4, или мРНК или белка слитого гена из-за транслокации гена DUX4. Их примеры включают, но этим не ограничиваются, фациоскапуло-плечевую мышечную дистрофию, В-клеточный острый лимфоцитарный лейкоз, дифференцированную круглоклеточную саркому, рабдомиосаркому плода и тому подобное.

[0119]

«Фациоскапуло-плечевая мышечная дистрофия» или «FSHD» означает мышечную дистрофию, возникающую из-за мышечной слабости лицевых, лопаточных и плечевых мышц. Считается, что у людей наряду с укорочением геномного повтора (D4Z4), который находится в основном около теломеры (конца хромосомы) хромосомы 4, в результате изменяется структура генома, и ген DUX4, который изначально не экспрессируется в мышечных (предшественниках) клетках, эктопически экспрессируется и вызывает гибель клеток (FSHD1). Кроме того, у некоторых пациентов с FSHD была обнаружена мутация гена в SMCHD1, одном из геномных структурных регуляторов, которые подавляют экспрессию гена (FSHD2).

[0120]

FSHD представляет собой тип мышечной дистрофии, связанный с прогрессирующей мышечной слабостью и потерей мышечных волокон. В отличие от мышечной дистрофии Дюшенна и мышечной дистрофии Беккера, которые в основном поражают нижнюю часть тела, FSHD возникает в верхней части тела, в основном в лицевых, лопаточных и плечевых мышцах. Однако это может также произойти в тазу, пояснице и нижних конечностях. Симптомы FSHD часто появляются в возрасте от 10 до 26 лет, но нередко они развиваются намного позже. В некоторых случаях этого может вообще не произойти. Обычно симптомы легкие, а скорость ухудшения также очень медленная. Часто встречается слабость лицевых мышц и опущение век, неспособность посвистеть, уменьшение изменений выражения лица, меланхолия или сердитое выражение лица, трудности с произношением слов, слабость лопатных мышц (вызывающая деформации, такие как заметная лопатка (крылатые лопатки) и покатые плечи), слабость нижних конечностей, потеря слуха и возможные сердечные заболевания и тому подобное.

[0121]

Термин «активный фармацевтический агент» означает вещество (или вещества) в фармацевтической композиции, которое обеспечивает терапевтический эффект при введении животному. Например, в некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид, нацеленный на DUX4, является активным фармацевтическим агентом.

[0122]

Термин «одновременное введение» относится к совместному введению двух агентов любым способом, при котором фармакологические эффекты, возникающие в результате обоих агентов, проявляются у пациента одновременно. При одновременном введении не требуется, чтобы оба агента вводились в одной фармацевтической композиции, в одной и той же лекарственной форме или одним и тем же путем введения. Фармакологические эффекты, возникающие от обоих агентов, не обязательно должны проявляться одновременно. Фармакологические эффекты должны перекрываться только в течение определенного периода времени и не обязательно должны быть одинаковыми.

[0123]

Термин «введение» означает введение агента животному и включает, но не ограничивается, введение профессиональным медиком и самостоятельное введение.

[0124]

Термин «улучшение» относится к уменьшению по меньшей мере одного показателя, признака или симптома, связанного с заболеванием, расстройством или состоянием. Существенность показателя может быть определена субъективной или объективной мерой, известной специалисту в данной области.

[0125]

Термин «животное» относится к человеку или животному, не являющемуся человеком, включая, но не ограничиваясь этим, мышей, крыс, кроликов, собак, кошек, свиней и нечеловеческих приматов, включая, но не ограничиваясь ими, обезьян и шимпанзе.

[0126]

Термин «совместное введение» означает введение индивидууму двух или более агентов. Два или более агента могут находиться в одной фармацевтической композиции или могут быть в отдельных фармацевтических композициях. Каждый из двух или более агентов можно вводить одним и тем же или разными путями введения. Совместное введение включает параллельное или последовательное введение.

[0127]

Термин «доза» означает определенное количество фармацевтического агента, вводимое за один прием или в определенный период времени. В некоторых вариантах осуществления изобретения доза может вводиться в виде одного, двух или более болюсов, таблеток или инъекций. Например, в некоторых вариантах осуществления, где желательно подкожное введение, желаемая доза необходима в объеме, который нелегко охватить одной инъекцией, и, таким образом, можно использовать две или более инъекций для достижения желаемой дозы. В некоторых вариантах осуществления изобретения фармацевтический агент вводят путем инфузии в течение длительного периода времени или непрерывно. Доза может быть описана как количество фармацевтического агента в час, день, неделю или месяц.

[0128]

Термин «эффективное количество» или «терапевтически эффективное количество» означает количество активного фармацевтического агента, которое достаточно для достижения желаемого физиологического результата у индивидуума, нуждающегося в этом агенте. Эффективное количество может варьироваться от человека к человеку в зависимости от здоровья и физического состояния человека, подлежащего лечению, таксономической группы человека, подлежащего лечению, состава композиции, оценки состояния здоровья человека и других соответствующих факторов.

[0129]

Выражение «идентификация животного, страдающего фациоскапуло-плечевой мышечной дистрофией (FSHD)» означает идентификацию животного, у которого диагностировано расстройство или состояние FSHD, или идентификацию животного, восприимчивого к расстройству или состоянию FSHD. Например, человек с семейным анамнезом может быть предрасположен к расстройствам или состояниям FSHD.

Такая идентификация может быть выполнена с использованием любого метода, включая изучение истории болезни человека и стандартные клинические тесты или оценки. Как FSHD1, так и FSHD2, известны в зависимости от патогенеза, и оба включены в рассмотрение.

[0130]

Термин «индивидуум» означает человека или животное, не являющееся человеком, выбранное для лечения или терапии.

[0131]

Термин «миотония» означает аномально медленное расслабление мышц после произвольного сокращения или электростимуляции.

[0132]

Термин «парентеральное введение» означает введение путем инъекции или инфузии. Примеры парентерального введения включают подкожное введение, внутривенное введение, внутримышечное введение, внутриартериальное введение, внутрибрюшинное введение или внутричерепное введение, например интратекальное или внутрижелудочковое введение. Введение может быть непрерывным или долгосрочным, краткосрочным или периодическим.

[0133]

Термин «фармацевтическая композиция» означает смесь веществ, подходящих для введения индивидууму. Например, фармацевтическая композиция может содержать один или несколько активных агентов и стерильный водный раствор.

[0134]

Термин «предотвращение» означает отсрочку или предотвращение начала или развития заболевания, расстройства, неблагоприятного состояния здоровья или одного или нескольких симптомов, связанных с заболеванием, нарушением или нежелательным состоянием здоровья на период времени от минут до неопределенного срока. «Предотвращение» также означает снижение риска развития заболевания, расстройства или нежелательного состояния здоровья.

[0135]

Термин «терапевтическое лечение» означает облегчение или устранение заболевания, расстройства или неблагоприятного состояния здоровья, или одного или нескольких симптомов, связанных с заболеванием, нарушением или неблагоприятным состоянием, или частичное устранение или устранение одной или нескольких причин заболевания, расстройства или неблагоприятное самочувствие.

[0136]

Подразумевается, что «лечение» включает предупреждение или терапевтическое лечение, описанное выше. Например, «лечение» включает введение фармацевтической композиции по настоящему изобретению, чтобы вызвать изменение или облегчение заболевания, расстройства или нежелательного состояния здоровья.

[0137]

Термин «пролекарство» означает терапевтическое средство, которое получают в неактивной форме, но которое преобразуется в активную форму в организме или его клетках под действием эндогенного фермента или других химических веществ или условий.

[0138]

Термин «побочные эффекты» означает физиологические реакции, которые можно отнести к реагированию, отличающемуся от желаемых эффектов. В некоторых вариантах реализации побочные эффекты включают реакции в месте инъекции, аномалии тестов функции печени, аномалии функции почек, токсичность для печени, почечную токсичность, аномалии центральной нервной системы, миопатии и недомогание. Например, повышенный уровень аланинаминотрансферазы (ALT), аспартатаминотрансферазы (AST) или γ-глутамилтранспептидазы (γ-GTP) в крови может указывать на токсичность для печени или нарушение функции печени. Например, повышенный билирубин может указывать на токсичность или нарушение функции печени. Кроме того, повышенный уровень белка в моче и повышенные уровни креатинина и азота мочевины (UN) в крови могут указывать на почечную токсичность или нарушение функции почек.

[0139]

Термин «подкожное введение» означает введение непосредственно под кожу.

[0140]

Термин «терапевтически эффективное количество» означает количество агента, которое обеспечивает терапевтический эффект для индивидуума.

[0141]

(Конкретные варианты осуществления)

Варианты осуществления

В некоторых конкретных вариантах осуществления, описанных далее, представлены, но этим не ограничиваются, соединения для ингибирования экспрессии DUX4, способы применения соединений и фармацевтические композиции, содержащие эти соединения.

[0142]

В некоторых вариантах осуществления изобретения предложен способ снижения экспрессии DUX4 у животного, включающий введение животному соединения, содержащего модифицированный олигонуклеотид, нацеленный на DUX4.

[0143]

В некоторых вариантах осуществления изобретения предложен способ введения модифицированного олигонуклеотида для предотвращения накопления патогенных факторов транскрипции DUX4 путем ингибирования транскрипции гена DUX4, или ингибирования трансляции мРНК DUX4, или управления расщеплением мРНК DUX4.

[0144]

В некоторых вариантах осуществления изобретения предложен способ лечения животного, страдающего фациоскапуло-плечевой мышечной дистрофией, где способ включает следующие стадии: a) идентификация животного, страдающего фациоскапуло-плечевой мышечной дистрофией; и b) введение животному терапевтически эффективного количества соединения, содержащего модифицированный олигонуклеотид, нацеленный на DUX4.

[0145]

В некоторых вариантах осуществления изобретения предложен способ облегчения миотонии у нуждающегося в этом субъекта. Способ включает введение субъекту модифицированного олигонуклеотида, комплементарного мРНК DUX4. Модифицированный олигонуклеотид активирует рибонуклеазу или ядерную рибонуклеазу при связывании с мРНК DUX4, тем самым снижая миотонию. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект имеет или подозревается в наличии фациоскапуло-плечевой мышечной дистрофии, либо имеет или подозревается в наличии высокой экспрессии мРНК DUX4, имеет или подозревается в наличии пониженного количества повторов D4Z4 на хромосоме 4 человека или имеет или подозревается наличие мутации SMCHD1 (ДНК-метилазы).

[0146]

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид, используемый в способе по настоящему изобретению является химерным. В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный способа, используемого по настоящему изобретению, представляет собой гэпмер.

[0147]

В некоторых вариантах осуществления способа по настоящему изобретению, описанному в настоящем документе, введение осуществляется подкожно. В некоторых вариантах осуществления изобретения введение является внутривенным или внутримышечным.

[0148]

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид, используемый в способе по настоящему изобретению, нацелен на кодирующую область белка DUX4, интрон, 5ʼ-UTR или 3ʼ-UTR мРНК DUX4. В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид, используемый в способе по настоящему изобретению, нацелен на экзон 1, экзон 2, экзон 3, интрон 1 и интрон 2 мРНК DUX4.

[0149]

В некоторых вариантах осуществления способа по настоящему изобретению, описанного в настоящем документе, мРНК DUX4 расщепляется ядерной рибонуклеазой РНКазой H1.

[0150]

В некоторых вариантах осуществления способа по настоящему изобретению, мРНК DUX4 снижается в мышечной ткани. В некоторых вариантах осуществления изобретения варианты сплайсинга DUX4-FL1 (SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей), DUX4-FL2 (SEQ ID NO: 5 в списке последовательностей) предпочтительно сокращаются.

[0151]

В некоторых вариантах осуществления изобретения мРНК DUX4 имеет последовательность, указанную в регистрационном номере GenBank NM_001293798.2 (включена в настоящий документ как SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей). Вариант сплайсинга SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей также упоминается как DUX4-FL1 или зрелая мРНК DUX4. В некоторых вариантах осуществления изобретения мРНК DUX4 имеет последовательность, указанную в регистрационном номере GenBank NM_001306068.2 (включена в настоящий документ как SEQ ID NO: 5 в списке последовательностей). Вариант сплайсинга SEQ ID NO: 5 в списке последовательностей также обозначается как DUX4-FL2. В некоторых вариантах осуществления изобретения DUX4 имеет последовательность, указанную под регистрационным номером GenBank NM_001363820.1 (включена в настоящий документ как SEQ ID NO: 6 в списке последовательностей). Вариант сплайсинга SEQ ID NO: 6 в списке последовательностей также обозначается как DUX4-s. В некоторых вариантах осуществления изобретения мРНК DUX4 имеет SNP описанного выше варианта сплайсинга.

[0152]

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид представляет собой модифицированный олигонуклеотид, который состоит из 12-30 остатков и имеет последовательность нуклеиновых оснований, содержащую модифицированный олигонуклеотид, который представляет собой последовательность нуклеиновых оснований, включающую по меньшей мере 8 непосредственно примыкающих друг к другу последовательностей нуклеиновых оснований, которые комплементарны части равной длины в положениях 126-147, 232-248, 1306-1325, или 1472-1495 от 5ʼ-конца нуклеинового основания зрелой мРНК DUX4 в SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей. В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид представляет собой модифицированный олигонуклеотид, который состоит из 12-30 остатков и имеет последовательность нуклеиновых оснований, содержащую модифицированный олигонуклеотид, который представляет собой последовательность нуклеиновых оснований, включающую по меньшей мере 9, 10, 11 или 12 непосредственно примыкающих друг к другу последовательностей нуклеиновых оснований, которые комплементарны части равной длины в положениях 126-147, 232-248, 1306-1325, или 1472-1495 от 5ʼ-конца нуклеинового основания зрелой мРНК DUX4 в SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей.

Модифицированный олигонуклеотид может состоять из по меньшей мере 8 непосредственно примыкающих друг к другу последовательностей нуклеиновых оснований, которые комплементарны части равной длины в положениях 126-147, 232-248, 1306-1325 или 1472-1495 от 5ʼ-конца последовательности нуклеиновых оснований зрелой мРНК DUX4 в SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей, и может иметь, помимо этой последовательности нуклеиновых оснований, дополнительную последовательность на стороне 5ʼ-конца и/или стороне 3ʼ-конца.

[0153]

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид представляет собой последовательность нуклеиновых оснований, включающую по меньшей мере 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или 22 непосредственно примыкающих друг к другу последовательностей нуклеиновых оснований, которые комплементарны части равной длины в положениях 126-147 от 5ʼ-конца нуклеинового основания зрелой мРНК DUX4 в SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей, и является модифицированным олигонуклеотидом из 30 или менее остатков.

[0154]

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид представляет собой последовательность нуклеиновых оснований, включающую по меньшей мере 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, или 17 непосредственно примыкающих друг к другу последовательностей нуклеиновых оснований, которые комплементарны части равной длины в положениях 232-248 от 5ʼ-конца нуклеинового основания зрелой мРНК DUX4 в SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей, и является модифицированным олигонуклеотидом из 30 или менее остатков.

[0155]

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид представляет собой последовательность нуклеиновых оснований, включающую по меньшей мере 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, или 20 непосредственно примыкающих друг к другу последовательностей нуклеиновых оснований, которые комплементарны части равной длины в положениях 1306-1325 от 5ʼ-конца нуклеинового основания зрелой мРНК DUX4 в SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей, и является модифицированным олигонуклеотидом из 30 или менее остатков.

[0156]

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид представляет собой последовательность нуклеиновых оснований, включающую по меньшей мере 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, или 24 непосредственно примыкающих друг к другу последовательностей нуклеиновых оснований, которые комплементарны части равной длины в положениях 1472-1495 от 5ʼ-конца нуклеинового основания зрелой мРНК DUX4 в SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей, и является модифицированным олигонуклеотидом из 30 или менее остатков.

[0157]

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид представляет собой модифицированный олигонуклеотид, который состоит из 12-30 остатков и включает последовательность нуклеиновых оснований, которая комплементарна части равной длины в положениях 126-147 от 5ʼ-конца нуклеинового основания зрелой мРНК DUX4 в SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей, и является по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% комплементарной SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей в части равной длины. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид включает 12-29 остатков, 12-28 остатков, 12-27 остатков, 12-26 остатков, 12-25 остатков, 12-24 остатков, 12-23 остатков, 12-22 остатков, 12-21 остатков, 12-20 остатков, 12-19 остатков, 12-18 остатков, 12-17 остатков, 12-16 остатков, 12-15 остатков, 12-14 остатков, 13-29 остатков, 13-28 остатков, 13-27 остатков, 13-26 остатков, 13-25 остатков, 13-24 остатков, 13-23 остатков, 13-22 остатков, 13-21 остатков, 13-20 остатков, 13-19 остатков, 13-18 остатков, 13-17 остатков, 13-16 остатков, 13-15 остатков, 13-14 остатков, 14-29 остатков, 14-28 остатков, 14-27 остатков, 14-26 остатков, 14-25 остатков, 14-24 остатков, 14-23 остатков, 14-22 остатков, 14-21 остатков, 14-20 остатков, 14-19 остатков, 14-18 остатков, 14-17 остатков, 14-16 остатков или 14-15 остатков.

[0158]

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид представляет собой модифицированный олигонуклеотид, который состоит из 12-30 остатков и включает последовательность нуклеиновых оснований, которая комплементарна части равной длины в положениях 232-248 от 5ʼ-конца нуклеинового основания зрелой мРНК DUX4 в SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей, и является по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% комплементарной SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей в части равной длины. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид включает 12-29 остатков, 12-28 остатков, 12-27 остатков, 12-26 остатков, 12-25 остатков, 12-24 остатков, 12-23 остатков, 12-22 остатков, 12-21 остатков, 12-20 остатков, 12-19 остатков, 12-18 остатков, 12-17 остатков, 12-16 остатков, 12-15 остатков, 12-14 остатков, 13-29 остатков, 13-28 остатков, 13-27 остатков, 13-26 остатков, 13-25 остатков, 13-24 остатков, 13-23 остатков, 13-22 остатков, 13-21 остатков, 13-20 остатков, 13-19 остатков, 13-18 остатков, 13-17 остатков, 13-16 остатков, 13-15 остатков, 13-14 остатков, 14-29 остатков, 14-28 остатков, 14-27 остатков, 14-26 остатков, 14-25 остатков, 14-24 остатков, 14-23 остатков, 14-22 остатков, 14-21 остатков, 14-20 остатков, 14-19 остатков, 14-18 остатков, 14-17 остатков, 14-16 остатков или 14-15 остатков.

[0159]

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид представляет собой модифицированный олигонуклеотид, который состоит из 12-30 остатков и включает последовательность нуклеиновых оснований, которая комплементарна части равной длины в положениях 1306-1325 от 5ʼ-конца нуклеинового основания зрелой мРНК DUX4 в SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей, и является по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% комплементарной SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей в части равной длины. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид включает 12-29 остатков, 12-28 остатков, 12-27 остатков, 12-26 остатков, 12-25 остатков, 12-24 остатков, 12-23 остатков, 12-22 остатков, 12-21 остатков, 12-20 остатков, 12-19 остатков, 12-18 остатков, 12-17 остатков, 12-16 остатков, 12-15 остатков, 12-14 остатков, 13-29 остатков, 13-28 остатков, 13-27 остатков, 13-26 остатков, 13-25 остатков, 13-24 остатков, 13-23 остатков, 13-22 остатков, 13-21 остатков, 13-20 остатков, 13-19 остатков, 13-18 остатков, 13-17 остатков, 13-16 остатков, 13-15 остатков, 13-14 остатков, 14-29 остатков, 14-28 остатков, 14-27 остатков, 14-26 остатков, 14-25 остатков, 14-24 остатков, 14-23 остатков, 14-22 остатков, 14-21 остатков, 14-20 остатков, 14-19 остатков, 14-18 остатков, 14-17 остатков, 14-16 остатков или 14-15 остатков.

[0160]

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид представляет собой модифицированный олигонуклеотид, который состоит из 12-30 остатков и включает последовательность нуклеиновых оснований, которая комплементарна части равной длины в положениях 1472-1495 от 5ʼ-конца нуклеинового основания зрелой мРНК DUX4 в SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей, и является по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% комплементарной SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей в части равной длины. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид состоит из 12-29 остатков, 12-28 остатков, 12-27 остатков, 12-26 остатков, 12-25 остатков, 12-24 остатков, 12-23 остатков, 12-22 остатков, 12-21 остатков, 12-20 остатков, 12-19 остатков, 12-18 остатков, 12-17 остатков, 12-16 остатков, 12-15 остатков, 12-14 остатков, 13-29 остатков, 13-28 остатков, 13-27 остатков, 13-26 остатков, 13-25 остатков, 13-24 остатков, 13-23 остатков, 13-22 остатков, 13-21 остатков, 13-20 остатков, 13-19 остатков, 13-18 остатков, 13-17 остатков, 13-16 остатков, 13-15 остатков, 13-14 остатков, 14-29 остатков, 14-28 остатков, 14-27 остатков, 14-26 остатков, 14-25 остатков, 14-24 остатков, 14-23 остатков, 14-22 остатков, 14-21 остатков, 14-20 остатков, 14-19 остатков, 14-18 остатков, 14-17 остатков, 14-16 остатков или 14-15 остатков.

[0161]

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид представляет собой модифицированный олигонуклеотид, который состоит из 12-30 остатков и имеет последовательность нуклеиновых оснований, содержащую модифицированный олигонуклеотид, который представляет собой последовательность нуклеиновых оснований, включающую по меньшей мере 8 непосредственно примыкающих друг к другу последовательностей нуклеиновых оснований, которые комплементарны части равной длины в положениях 128-143, 233-248, 1309-1323 или 1480-1495 от 5ʼ-конца нуклеинового основания зрелой мРНК DUX4 в SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей. В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид представляет собой модифицированный олигонуклеотид, который состоит из 12-30 остатков и имеет последовательность нуклеиновых оснований, содержащую модифицированный олигонуклеотид, который представляет собой последовательность нуклеиновых оснований, включающую по меньшей мере 9, 10, 11 или 12 непосредственно примыкающих друг к другу последовательностей нуклеиновых оснований, которые комплементарны части равной длины в положениях 128-143, 233-248, 1309-1323 или 1480-1495 от 5ʼ-конца нуклеинового основания зрелой мРНК DUX4 в SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей.

[0162]

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид представляет собой последовательность нуклеиновых оснований, включающую по меньшей мере 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 непосредственно примыкающих друг к другу последовательностей нуклеиновых оснований, которые комплементарны части равной длины в положениях 128-143 от 5ʼ-конца нуклеинового основания зрелой мРНК DUX4 в SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей, и является модифицированным олигонуклеотидом из 30 или менее остатков.

[0163]

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид представляет собой последовательность нуклеиновых оснований, включающую по меньшей мере 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 непосредственно примыкающих друг к другу последовательностей нуклеиновых оснований, которые комплементарны части равной длины в положениях 233-248 от 5ʼ-конца нуклеинового основания зрелой мРНК DUX4 в SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей, и является модифицированным олигонуклеотидом из 30 или менее остатков.

[0164]

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид представляет собой последовательность нуклеиновых оснований, включающую по меньшей мере 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 непосредственно примыкающих друг к другу последовательностей нуклеиновых оснований, которые комплементарны части равной длины в положениях 1309-1323 от 5ʼ-конца нуклеинового основания зрелой мРНК DUX4 в SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей, и является модифицированным олигонуклеотидом из 30 или менее остатков.

[0165]

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид представляет собой модифицированный олигонуклеотид из 30 или менее остатков, который включает по меньшей мере 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 непосредственно примыкающих друг к другу последовательностей нуклеиновых оснований, которые комплементарны части равной длины в положениях 1480-1495 от 5ʼ-конца нуклеинового основания зрелой мРНК DUX4 в SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей, и состоит из последовательности нуклеиновых оснований, имеющей на 3ʼ-конце основание, комплементарное основанию в положении 1480 от 5ʼ-конца последовательности нуклеиновых оснований of SEQ ID NO: 1.

[0166]

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид представляет собой модифицированный олигонуклеотид, который состоит из 12-30 остатков и включает последовательность нуклеиновых оснований, которая комплементарна части равной длины в положениях 128-143 от 5ʼ-конца нуклеинового основания зрелой мРНК DUX4 в SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей, и является по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% комплементарной SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей в части равной длины. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид включает 12-29 остатков, 12-28 остатков, 12-27 остатков, 12-26 остатков, 12-25 остатков, 12-24 остатков, 12-23 остатков, 12-22 остатков, 12-21 остатков, 12-20 остатков, 12-19 остатков, 12-18 остатков, 12-17 остатков, 12-16 остатков, 12-15 остатков, 12-14 остатков, 13-29 остатков, 13-28 остатков, 13-27 остатков, 13-26 остатков, 13-25 остатков, 13-24 остатков, 13-23 остатков, 13-22 остатков, 13-21 остатков, 13-20 остатков, 13-19 остатков, 13-18 остатков, 13-17 остатков, 13-16 остатков, 13-15 остатков, 13-14 остатков, 14-29 остатков, 14-28 остатков, 14-27 остатков, 14-26 остатков, 14-25 остатков, 14-24 остатков, 14-23 остатков, 14-22 остатков, 14-21 остатков, 14-20 остатков, 14-19 остатков, 14-18 остатков, 14-17 остатков, 14-16 остатков или 14-15 остатков.

[0167]

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид представляет собой модифицированный олигонуклеотид, который состоит из 12-30 остатков и включает последовательность нуклеиновых оснований, которая комплементарна части равной длины в положениях 233-248 от 5ʼ-конца нуклеинового основания зрелой мРНК DUX4 в SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей, и является по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% комплементарной SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей в части равной длины. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид включает 12-29 остатков, 12-28 остатков, 12-27 остатков, 12-26 остатков, 12-25 остатков, 12-24 остатков, 12-23 остатков, 12-22 остатков, 12-21 остатков, 12-20 остатков, 12-19 остатков, 12-18 остатков, 12-17 остатков, 12-16 остатков, 12-15 остатков, 12-14 остатков, 13-29 остатков, 13-28 остатков, 13-27 остатков, 13-26 остатков, 13-25 остатков, 13-24 остатков, 13-23 остатков, 13-22 остатков, 13-21 остатков, 13-20 остатков, 13-19 остатков, 13-18 остатков, 13-17 остатков, 13-16 остатков, 13-15 остатков, 13-14 остатков, 14-29 остатков, 14-28 остатков, 14-27 остатков, 14-26 остатков, 14-25 остатков, 14-24 остатков, 14-23 остатков, 14-22 остатков, 14-21 остатков, 14-20 остатков, 14-19 остатков, 14-18 остатков, 14-17 остатков, 14-16 остатков или 14-15 остатков.

[0168]

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид представляет собой модифицированный олигонуклеотид, который состоит из 12-30 остатков и включает последовательность нуклеиновых оснований, которая комплементарна части равной длины в положениях 1309-1323 от 5ʼ-конца нуклеинового основания зрелой мРНК DUX4 в SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей, и является по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% комплементарной SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей в части равной длины. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид включает 12-29 остатков, 12-28 остатков, 12-27 остатков, 12-26 остатков, 12-25 остатков, 12-24 остатков, 12-23 остатков, 12-22 остатков, 12-21 остатков, 12-20 остатков, 12-19 остатков, 12-18 остатков, 12-17 остатков, 12-16 остатков, 12-15 остатков, 12-14 остатков, 13-29 остатков, 13-28 остатков, 13-27 остатков, 13-26 остатков, 13-25 остатков, 13-24 остатков, 13-23 остатков, 13-22 остатков, 13-21 остатков, 13-20 остатков, 13-19 остатков, 13-18 остатков, 13-17 остатков, 13-16 остатков, 13-15 остатков, 13-14 остатков, 14-29 остатков, 14-28 остатков, 14-27 остатков, 14-26 остатков, 14-25 остатков, 14-24 остатков, 14-23 остатков, 14-22 остатков, 14-21 остатков, 14-20 остатков, 14-19 остатков, 14-18 остатков, 14-17 остатков, 14-16 остатков или 14-15 остатков.

[0169]

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид представляет собой a модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 12-30 остатков, и представляет собой последовательность нуклеиновых оснований, которая комплементарна части равной длины в положениях 1480-1495 от 5ʼ-конца нуклеинового основания зрелой мРНК DUX4 в SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей, и состоит из последовательности нуклеиновых оснований, которая имеет на 3ʼ-конце основание, комплементарное основанию в положении 1480 от 5ʼ-конца нуклеинового основания SEQ ID NO: 1, и является по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% комплементарной SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей в части равной длины. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид состоит из 12-29 остатков, 12-28 остатков, 12-27 остатков, 12-26 остатков, 12-25 остатков, 12-24 остатков, 12-23 остатков, 12-22 остатков, 12-21 остатков, 12-20 остатков, 12-19 остатков, 12-18 остатков, 12-17 остатков, 12-16 остатков, 12-15 остатков, 12-14 остатков, 13-29 остатков, 13-28 остатков, 13-27 остатков, 13-26 остатков, 13-25 остатков, 13-24 остатков, 13-23 остатков, 13-22 остатков, 13-21 остатков, 13-20 остатков, 13-19 остатков, 13-18 остатков, 13-17 остатков, 13-16 остатков, 13-15 остатков, 13-14 остатков, 14-29 остатков, 14-28 остатков, 14-27 остатков, 14-26 остатков, 14-25 остатков, 14-24 остатков, 14-23 остатков, 14-22 остатков, 14-21 остатков, 14-20 остатков, 14-19 остатков, 14-18 остатков, 14-17 остатков, 14-16 остатков или 14-15 остатков.

[0170]

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид, предложенный в настоящем документе, нацелен на любую из следующих областей в SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей: положения 126-141, 126-143, 127-142, 127-143, 127-144, 127-146, 128-143, 128-144, 128-147, 232-245, 232-247, 233-246, 233-247, 233-248, 234-247, 234-248, 1304-1323, 1306-1321, 1306-1324, 1307-1323, 1307-1324, 1307-1325, 1307-1326, 1308-1323, 1308-1324, 1308-1322, 1308-1325, 1309-1323, 1309-1324, 1309-1325, 1309-1322, 1310-1323, 1310-1324, 1472-1485, 1472-1486, 1472-1487, 1472-1488, 1473-1487, 1473-1488, 1473-1489, 1474-1488, 1474-1489, 1475-1490, 1476-1490, 1476-1491, 1476-1495, 1477-1495, 1478-1496, 1479-1495, 1479-1496, 1479-1498, 1480-1494, 1480-1495, 1480-1496, 1480-1497 или 1480-1499 от 5ʼ-конца. В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид, предложенный в настоящем документе, нацелен на любую из следующих областей в SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей: положения 128-143, 232-247, 233-248, 1309-1323 и 1480-1495 от 5ʼ-конца.

[0171]

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид, предложенный в настоящем документе, имеет последовательность нуклеиновых оснований, которая включает комплементарную область, содержащую по меньшей мере 8 непосредственно примыкающих друг к другу нуклеиновых оснований, комплементарных по отношению к целевой области. В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид, предложенный в настоящем документе, имеет последовательность нуклеиновых оснований, которая включает комплементарную область, содержащую по меньшей мере 8 непосредственно примыкающих друг к другу нуклеиновых оснований, комплементарных по отношению к целевой области, и целевая область нацелена на положения 126-141, 126-143, 127-142, 127-143, 127-144, 127-146, 128-143, 128-144, 128-147, 232-245, 232-247, 233-246, 233-247, 233-248, 234-247, 234-248, 1304-1323, 1306-1321, 1306-1324, 1307-1323, 1307-1324, 1307-1325, 1307-1326, 1308-1323, 1308-1324, 1308-1322, 1308-1325, 1309-1323, 1309-1324, 1309-1325, 1309-1322, 1310-1323, 1310-1324, 1472-1485, 1472-1486, 1472-1487, 1472-1488, 1473-1487, 1473-1488, 1473-1489, 1474-1488, 1474-1489, 1475-1490, 1476-1490, 1476-1491, 1476-1495, 1477-1495, 1478-1496, 1479-1495, 1479-1496, 1479-1498, 1480-1494, 1480-1495, 1480-1496, 1480-1497 или 1480-1499 от 5ʼ-конца в SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей. В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид, предложенный в настоящем документе, имеет последовательность нуклеиновых оснований, которая включает комплементарную область, содержащую по меньшей мере 8 непосредственно примыкающих друг к другу нуклеиновых оснований, комплементарных по отношению к целевой области, и целевая область нацелена на положения 128-143, 232-247, 233-248, 1309-1323 или 1480-1495 от 5ʼ-конца в SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей.

[0172]

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид, предложенный в настоящем документе, имеет последовательность нуклеиновых оснований, которая включает комплементарную область, содержащую по меньшей мере 10 непосредственно примыкающих друг к другу нуклеиновых оснований, комплементарных по отношению к целевой области. В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид, предложенный в настоящем документе, имеет последовательность нуклеиновых оснований, которая включает комплементарную область, содержащую по меньшей мере 10 непосредственно примыкающих друг к другу нуклеиновых оснований, комплементарных по отношению к целевой области, и целевая область нацелена на положения 126-141, 126-143, 127-142, 127-143, 127-144, 127-146, 128-143, 128-144, 128-147, 232-245, 232-247, 233-246, 233-247, 233-248, 234-247, 234-248, 1304-1323, 1306-1321, 1306-1324, 1307-1323, 1307-1324, 1307-1325, 1307-1326, 1308-1323, 1308-1324, 1308-1322, 1308-1325, 1309-1323, 1309-1324, 1309-1325, 1309-1322, 1310-1323, 1310-1324, 1472-1485, 1472-1486, 1472-1487, 1472-1488, 1473-1487, 1473-1488, 1473-1489, 1474-1488, 1474-1489, 1475-1490, 1476-1490, 1476-1491, 1476-1495, 1477-1495, 1478-1496, 1479-1495, 1479-1496, 1479-1498, 1480-1494, 1480-1495, 1480-1496, 1480-1497 или 1480-1499 от 5ʼ-конца в SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей. В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид, предложенный в настоящем документе, имеет последовательность нуклеиновых оснований, которая включает комплементарную область, содержащую по меньшей мере 10 непосредственно примыкающих друг к другу нуклеиновых оснований, комплементарных по отношению к целевой области, и целевая область нацелена на положения 128-143, 232-247, 233-248, 1309-1323 или 1480-1495 от 5ʼ-конца в SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей.

[0173]

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид, предложенный в настоящем документе, имеет последовательность нуклеиновых оснований, которая включает комплементарную область, содержащую по меньшей мере 12 непосредственно примыкающих друг к другу нуклеиновых оснований, комплементарных по отношению к целевой области. В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид, предложенный в настоящем документе, имеет последовательность нуклеиновых оснований, которая включает комплементарную область, содержащую по меньшей мере 12 непосредственно примыкающих друг к другу нуклеиновых оснований, комплементарных по отношению к целевой области, и целевая область нацелена на положения 126-141, 126-143, 127-142, 127-143, 127-144, 127-146, 128-143, 128-144, 128-147, 232-245, 232-247, 233-246, 233-247, 233-248, 234-247, 234-248, 1304-1323, 1306-1321, 1306-1324, 1307-1323, 1307-1324, 1307-1325, 1307-1326, 1308-1323, 1308-1324, 1308-1322, 1308-1325, 1309-1323, 1309-1324, 1309-1325, 1309-1322, 1310-1323, 1310-1324, 1472-1485, 1472-1486, 1472-1487, 1472-1488, 1473-1487, 1473-1488, 1473-1489, 1474-1488, 1474-1489, 1475-1490, 1476-1490, 1476-1491, 1476-1495, 1477-1495, 1478-1496, 1479-1495, 1479-1496, 1479-1498, 1480-1494, 1480-1495, 1480-1496, 1480-1497 или 1480-1499 от 5ʼ-конца в SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей. В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид, предложенный в настоящем документе, имеет последовательность нуклеиновых оснований, которая включает комплементарную область, содержащую по меньшей мере 12 непосредственно примыкающих друг к другу нуклеиновых оснований, комплементарных по отношению к целевой области, и целевая область нацелена на положения 128-143, 232-247, 233-248, 1309-1323 или 1480-1495 от 5ʼ-конца в SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей.

[0174]

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид, предложенный в настоящем документе, имеет последовательность нуклеиновых оснований, которая включает комплементарную область, содержащую по меньшей мере 14 непосредственно примыкающих друг к другу нуклеиновых оснований, комплементарных по отношению к целевой области. В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид, предложенный в настоящем документе, имеет последовательность нуклеиновых оснований, которая включает комплементарную область, содержащую по меньшей мере 14 непосредственно примыкающих друг к другу нуклеиновых оснований, комплементарных по отношению к целевой области, и целевая область нацелена на положения 126-141, 126-143, 127-142, 127-143, 127-144, 127-146, 128-143, 128-144, 128-147, 232-245, 232-247, 233-246, 233-247, 233-248, 234-247, 234-248, 1304-1323, 1306-1321, 1306-1324, 1307-1323, 1307-1324, 1307-1325, 1307-1326, 1308-1323, 1308-1324, 1308-1322, 1308-1325, 1309-1323, 1309-1324, 1309-1325, 1309-1322, 1310-1323, 1310-1324, 1472-1485, 1472-1486, 1472-1487, 1472-1488, 1473-1487, 1473-1488, 1473-1489, 1474-1488, 1474-1489, 1475-1490, 1476-1490, 1476-1491, 1476-1495, 1477-1495, 1478-1496, 1479-1495, 1479-1496, 1479-1498, 1480-1494, 1480-1495, 1480-1496, 1480-1497 или 1480-1499 от 5ʼ-конца в SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей. В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид, предложенный в настоящем документе, имеет последовательность нуклеиновых оснований, которая включает комплементарную область, содержащую по меньшей мере 14 непосредственно примыкающих друг к другу нуклеиновых оснований, комплементарных по отношению к целевой области, и целевая область нацелена на положения 128-143, 232-247, 233-248, 1309-1323 или 1480-1495 от 5ʼ-конца в SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей.

[0175]

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид представляет собой модифицированный олигонуклеотид, который включает последовательность нуклеиновых оснований, которая комплементарна части равной длины в положениях 126-141, 126-143, 127-142, 127-143, 127-144, 127-146, 128-143, 128-144, 128-147, 232-245, 232-247, 233-246, 233-247, 233-248, 234-247, 234-248, 1304-1323, 1306-1321, 1306-1324, 1307-1323, 1307-1324, 1307-1325, 1307-1326, 1308-1323, 1308-1324, 1308-1322, 1308-1325, 1309-1323, 1309-1324, 1309-1325, 1309-1322, 1310-1323, 1310-1324, 1472-1485, 1472-1486, 1472-1487, 1472-1488, 1473-1487, 1473-1488, 1473-1489, 1474-1488, 1474-1489, 1475-1490, 1476-1490, 1476-1491, 1476-1495, 1477-1495, 1478-1496, 1479-1495, 1479-1496, 1479-1498, 1480-1494, 1480-1495, 1480-1496, 1480-1497 или 1480-1499 от 5ʼ-конца нуклеинового основания зрелой мРНК DUX4 в SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид представляет собой модифицированный олигонуклеотид, который включает последовательность нуклеиновых оснований, которая комплементарна части равной длины в положениях 128-143, 232-247, 233-248, 1309-1323, или 1480-1495 от 5ʼ-конца нуклеинового основания зрелой мРНК DUX4 в SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей.

[0176]

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид представляет собой модифицированный олигонуклеотид, включающий последовательность нуклеиновых оснований, представленную любой из SEQ ID NO: 2-4, 7-64, 69-97 и 102-109 в списке последовательностей. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид представляет собой модифицированный олигонуклеотид, включающий последовательность нуклеиновых оснований, представленную любой из SEQ ID NO: 2-4, 75 и 78 в списке последовательностей.

[0177]

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид представляет собой модифицированный олигонуклеотид, включающий последовательность нуклеиновых оснований, представленную любой из SEQ ID NO: 2-4, 7-64, 69-97 и 102-109 в списке последовательностей. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид представляет собой модифицированный олигонуклеотид, включающий последовательность нуклеиновых оснований, представленную любой из SEQ ID NO: 2-4, 75 и 78 в списке последовательностей.

[0178]

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид имеет последовательность нуклеиновых оснований, включающую по меньшей мере 8 непосредственно примыкающих друг к другу нуклеотидов в последовательности нуклеиновых оснований, представленной любой из SEQ ID NO: 2, 3, 4, 75 или 78 в списке последовательностей.

[0179]

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид имеет последовательность нуклеиновых оснований, включающую по меньшей мере 10 непосредственно примыкающих друг к другу нуклеотидов в последовательности нуклеиновых оснований, представленной любой из SEQ ID NO: 2, 3, 4, 75 или 78 в списке последовательностей.

[0180]

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид имеет последовательность нуклеиновых оснований, включающую по меньшей мере 12 непосредственно примыкающих друг к другу нуклеотидов в последовательности нуклеиновых оснований, представленной любой из SEQ ID NO: 2, 3, 4, 75 или 78 в списке последовательностей.

[0181]

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид имеет последовательность нуклеиновых оснований, включающую по меньшей мере 14 непосредственно примыкающих друг к другу нуклеотидов в последовательности нуклеиновых оснований, представленной любой из SEQ ID NO: 2, 3, 4, 75 или 78 в списке последовательностей.

[0182]

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид имеет последовательность нуклеиновых оснований, включающую нуклеиновое основание, состоящее из последовательности нуклеиновых оснований, представленной любой из SEQ ID NO: 2, 3, 4, 75 или 78 в списке последовательностей.

[0183]

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид имеет последовательность нуклеиновых оснований, состоящую из последовательности нуклеиновых оснований, представленной любой из SEQ ID NO: 2, 3, 4, 75 или 78 в списке последовательностей.

[0184]

В некоторых вариантах осуществления изобретения животным является человек.

[0185]

В некоторых вариантах осуществления изобретения введение включает парентеральное введение.

[0186]

В некоторых вариантах осуществления изобретения соединение представляет собой одноцепочечный модифицированный олигонуклеотид.

[0187]

В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательность нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида является комплементарной по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% по отношению к части равной длины любой из областей SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей, как определено по всему модифицированному олигонуклеотиду. В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательность нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида на 100% комплементарна по отношению к равной длине части любой из областей SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей, как определено по всему модифицированному олигонуклеотиду.

[0188]

В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере одна межнуклеозидная связь модифицированного олигонуклеотида представляет собой модифицированную межнуклеозидную связь. В некоторых вариантах осуществления изобретения каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфоротиоатную межнуклеозидную связь.

[0189]

В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере один нуклеозид модифицированного олигонуклеотида включает модифицированный сахар. В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере один модифицированный сахар представляет собой бициклический сахар. В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере один модифицированный сахар включает мостик 2ʼ-O-метоксиэтил, 2ʼ-O-метил и/или 4ʼ-(CH₂)_n-O-2ʼ (где n обозначает 1 или 2).

[0190]

В некоторых вариантах осуществления изобретения сахарный фрагмент модифицированного олигонуклеотида включает модифицированный сахар, который представляет собой по меньшей мере один бициклический сахар. В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере один модифицированный сахар представляет собой LNA, GuNA, ALNA [Ms], ALNA [mU], ALNA [ipU], ALNA [Oxz] и/или ALNA [Trz].

[0191]

В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере один нуклеозид модифицированного олигонуклеотида включает модифицированное нуклеиновое основание. В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированное нуклеиновое основание представляет собой 5-метилцитозин.

[0192]

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид представляет собой гэпмер, включающий: a) сегмент гэпа состоящий из связанных дезоксинуклеозидов, b) сегмент 5ʼ-крыла, состоящий из связанных нуклеозидов и c) сегмент 3ʼ-крыла, состоящий из связанных нуклеозидов. Сегмент гэпа расположен между сегментом 5ʼ-крыла и сегментом 3ʼ-крыла, и нуклеозид сегментов крыла, каждый, включает модифицированный сахар, такой как 2ʼ-O-метил-модифицированный сахар, 2ʼ-O-метоксиэтил-модифицированный сахар или бициклический сахар.

[0193]

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид представляет собой гэпмер, включающий: a) сегмент гэпа, который включает один или два нуклеозида, которые, каждый, включает модифицированный сахар, такой как 2ʼ-O-метил-модифицированный сахар или 2ʼ-O-метоксиэтил-модифицированный сахар, и включает другие нуклеозиды, которые не включают модифицированный сахар, b) сегмент 5ʼ-крыла, который включает связанные нуклеозиды и c) сегмент 3ʼ-крыла, который включает связанные нуклеозиды. Сегмент гэпа расположен между сегментом 5ʼ-крыла и сегментом 3ʼ-крыла, и нуклеозид сегментов крыла, каждый, включает модифицированный сахар, такой как 2ʼ-O-метил-модифицированный сахар, 2ʼ-O-метоксиэтил сахар или бициклический сахар.

[0194]

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид представляет собой гэпмер, включающий: a) сегмент гэпа, который включает 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 нуклеозидов и в котором все нуклеозиды представляют собой нуклеозиды, не содержащие модифицированный сахар, или один или два нуклеозида, каждый, содержат модифицированный сахар, такой как 2ʼ-O-метил-модифицированный сахар или 2ʼ-O-метоксиэтил-модифицированный сахар, а другие нуклеозиды не содержат модифицированный сахар, b) сегменты 5ʼ-крыла, включающие 2, 3, 4, 5, 6 или 7 нуклеозидов и c) сегменты 3ʼ-крыла, включающие 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 нуклеозидов.

В этом случае сегмент гэпа расположен между сегментом 5ʼ-крыла и сегментом 3ʼ-крыла; нуклеозиды сегментов крыла, каждый, включают 2ʼ-O-метил-модифицированный сахар, 2ʼ-O-метоксиэтил сахар или бициклический сахар; межнуклеозидные связи модифицированного олигонуклеотида включают фосфоротиоатную связь; и часть или весь цитозин в модифицированном олигонуклеотиде может быть 5ʼ-метилцитозином.

[0195]

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид представляет собой гэпмер, и число нуклеозидов, образующих гэпмер, равно 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30.

[0196]

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид представляет собой гэпмер, и включает мостик 2ʼ-O-метил, 2ʼ-O-метоксиэтил и/или 4ʼ-(CH₂)_n-O-2ʼ (где n обозначает 1 или 2) в сахарном компоненте нуклеозида.

[0197]

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид представляет собой гэпмер, и включает LNA, GuNA, ALNA [Ms], ALNA [mU], ALNA [ipU], ALNA [Oxz] и/или ALNA [Trz] в сахарном компоненте нуклеозида.

[0198]

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид представляет собой гэпмер, являющийся модифицированным олигонуклеотидом, который состоит из 12-30 остатков и имеет последовательность нуклеиновых оснований, содержащую модифицированный олигонуклеотид, который представляет собой последовательность нуклеиновых оснований, включающую по меньшей мере 8 непосредственно примыкающих друг к другу последовательностей нуклеиновых оснований, которые комплементарны части равной длины в положениях 126-147, 232-248, 1306-1325 или 1472-1495 от 5ʼ-конца нуклеинового основания зрелой мРНК DUX4 в SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей. В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид представляет собой модифицированный олигонуклеотид, который состоит из 12-30 остатков и имеет последовательность нуклеиновых оснований, содержащую модифицированный олигонуклеотид, который представляет собой последовательность нуклеиновых оснований, включающую по меньшей мере 9, 10, 11 или 12 непосредственно примыкающих друг к другу последовательностей нуклеиновых оснований, которые комплементарны части равной длины в положениях 126-147, 232-248, 1306-1325, или 1472-1495 от 5ʼ-конца нуклеинового основания зрелой мРНК DUX4 в SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей.

[0199]

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид представляет собой гэпмер, и представляет собой последовательность нуклеиновых оснований, включающую по меньшей мере 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или 22 непосредственно примыкающих друг к другу последовательностей нуклеиновых оснований, которые комплементарны части равной длины в положениях 126-147 от 5ʼ-конца нуклеинового основания зрелой мРНК DUX4 в SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей, и является модифицированным олигонуклеотидом из 30 или менее остатков.

[0200]

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид представляет собой гэпмер, который представляет собой последовательность нуклеиновых оснований, включающую по меньшей мере 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, или 17 непосредственно примыкающих друг к другу последовательностей нуклеиновых оснований, которые комплементарны части равной длины в положениях 232-248 от 5ʼ-конца нуклеинового основания зрелой мРНК DUX4 в SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей, и является модифицированным олигонуклеотидом из 30 или менее остатков.

[0201]

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид представляет собой гэпмер, который представляет собой последовательность нуклеиновых оснований, которая включает по меньшей мере 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, или 20 непосредственно примыкающих друг к другу последовательностей нуклеиновых оснований, которые комплементарны части равной длины в положениях 1306-1325 от 5ʼ-конца нуклеинового основания зрелой мРНК DUX4 в SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей, и является модифицированным олигонуклеотидом из 30 или менее остатков.

[0202]

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид представляет собой гэпмер, который представляет собой последовательность нуклеиновых оснований, которая включает по меньшей мере 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, или 24 непосредственно примыкающих друг к другу последовательностей нуклеиновых оснований, которые комплементарны части равной длины в положениях 1472-1495 от 5ʼ-конца нуклеинового основания зрелой мРНК DUX4 в SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей, и является модифицированным олигонуклеотидом из 30 или менее остатков.

[0203]

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид представляет собой гэпмер модифицированного олигонуклеотида, состоящий из 12-30 остатков, и включает последовательность нуклеиновых оснований, которая комплементарна части равной длины в положениях 126-147 от 5ʼ-конца нуклеинового основания зрелой мРНК DUX4 в SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей, и является по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% комплементарной SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей в части равной длины. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид включает 12-29 остатков, 12-28 остатков, 12-27 остатков, 12-26 остатков, 12-25 остатков, 12-24 остатков, 12-23 остатков, 12-22 остатков, 12-21 остатков, 12-20 остатков, 12-19 остатков, 12-18 остатков, 12-17 остатков, 12-16 остатков, 12-15 остатков, 12-14 остатков, 13-29 остатков, 13-28 остатков, 13-27 остатков, 13-26 остатков, 13-25 остатков, 13-24 остатков, 13-23 остатков, 13-22 остатков, 13-21 остатков, 13-20 остатков, 13-19 остатков, 13-18 остатков, 13-17 остатков, 13-16 остатков, 13-15 остатков, 13-14 остатков, 14-29 остатков, 14-28 остатков, 14-27 остатков, 14-26 остатков, 14-25 остатков, 14-24 остатков, 14-23 остатков, 14-22 остатков, 14-21 остатков, 14-20 остатков, 14-19 остатков, 14-18 остатков, 14-17 остатков, 14-16 остатков или 14-15 остатков.

[0204]

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид представляет собой гэпмер модифицированного олигонуклеотида, состоящий из 12-30 остатков, и включает последовательность нуклеиновых оснований, которая комплементарна части равной длины в положениях 233-248 от 5ʼ-конца нуклеинового основания зрелой мРНК DUX4 в SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей, и является по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% комплементарной SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей в части равной длины. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид включает 12-29 остатков, 12-28 остатков, 12-27 остатков, 12-26 остатков, 12-25 остатков, 12-24 остатков, 12-23 остатков, 12-22 остатков, 12-21 остатков, 12-20 остатков, 12-19 остатков, 12-18 остатков, 12-17 остатков, 12-16 остатков, 12-15 остатков, 12-14 остатков, 13-29 остатков, 13-28 остатков, 13-27 остатков, 13-26 остатков, 13-25 остатков, 13-24 остатков, 13-23 остатков, 13-22 остатков, 13-21 остатков, 13-20 остатков, 13-19 остатков, 13-18 остатков, 13-17 остатков, 13-16 остатков, 13-15 остатков, 13-14 остатков, 14-29 остатков, 14-28 остатков, 14-27 остатков, 14-26 остатков, 14-25 остатков, 14-24 остатков, 14-23 остатков, 14-22 остатков, 14-21 остатков, 14-20 остатков, 14-19 остатков, 14-18 остатков, 14-17 остатков, 14-16 остатков или 14-15 остатков.

[0205]

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид представляет собой гэпмер модифицированного олигонуклеотида, состоящий из 12-30 остатков, и включает последовательность нуклеиновых оснований, которая комплементарна части равной длины в положениях 1309-1323 от 5ʼ-конца нуклеинового основания зрелой мРНК DUX4 в SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей, и является по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% комплементарной SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей в части равной длины. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид включает 12-29 остатков, 12-28 остатков, 12-27 остатков, 12-26 остатков, 12-25 остатков, 12-24 остатков, 12-23 остатков, 12-22 остатков, 12-21 остатков, 12-20 остатков, 12-19 остатков, 12-18 остатков, 12-17 остатков, 12-16 остатков, 12-15 остатков, 12-14 остатков, 13-29 остатков, 13-28 остатков, 13-27 остатков, 13-26 остатков, 13-25 остатков, 13-24 остатков, 13-23 остатков, 13-22 остатков, 13-21 остатков, 13-20 остатков, 13-19 остатков, 13-18 остатков, 13-17 остатков, 13-16 остатков, 13-15 остатков, 13-14 остатков, 14-29 остатков, 14-28 остатков, 14-27 остатков, 14-26 остатков, 14-25 остатков, 14-24 остатков, 14-23 остатков, 14-22 остатков, 14-21 остатков, 14-20 остатков, 14-19 остатков, 14-18 остатков, 14-17 остатков, 14-16 остатков или 14-15 остатков.

[0206]

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид представляет собой гэпмер модифицированного олигонуклеотида, состоящий из 12-30 остатков, и включает последовательность нуклеиновых оснований, которая комплементарна части равной длины в положениях 1472-1495 от 5ʼ-конца нуклеинового основания зрелой мРНК DUX4 в SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей, и является по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% комплементарной SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей в части равной длины. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид включает 12-29 остатков, 12-28 остатков, 12-27 остатков, 12-26 остатков, 12-25 остатков, 12-24 остатков, 12-23 остатков, 12-22 остатков, 12-21 остатков, 12-20 остатков, 12-19 остатков, 12-18 остатков, 12-17 остатков, 12-16 остатков, 12-15 остатков, 12-14 остатков, 13-29 остатков, 13-28 остатков, 13-27 остатков, 13-26 остатков, 13-25 остатков, 13-24 остатков, 13-23 остатков, 13-22 остатков, 13-21 остатков, 13-20 остатков, 13-19 остатков, 13-18 остатков, 13-17 остатков, 13-16 остатков, 13-15 остатков, 13-14 остатков, 14-29 остатков, 14-28 остатков, 14-27 остатков, 14-26 остатков, 14-25 остатков, 14-24 остатков, 14-23 остатков, 14-22 остатков, 14-21 остатков, 14-20 остатков, 14-19 остатков, 14-18 остатков, 14-17 остатков, 14-16 остатков или 14-15 остатков. В этом случае олигонуклеотид, включенный в сегмент 5ʼ-крыла и/или сегмент 3ʼ-крыла, включает по меньшей мере один нуклеозид, который включает по меньшей мере один модифицированный сахар, выбранный из GuNA, ALNA [Ms], ALNA [mU], ALNA [ipU], ALNA [Oxz] и ALNA [Trz], и может дополнительно включать 2ʼ-O-метоксиэтил-модифицированный сахар и/или 2ʼ-O-метил-модифицированный сахар.

[0207]

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид представляет собой гэпмер модифицированного олигонуклеотида, состоящий из 12-30 остатков, и представляет собой последовательность нуклеиновых оснований, которая комплементарна части равной длины в положениях 1480-1495 от 5ʼ-конца нуклеинового основания зрелой мРНК DUX4 в SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей, и состоит из последовательности нуклеиновых оснований, которая имеет на 3ʼ-конце основание, комплементарное основанию в положении 1480 от 5ʼ-конца нуклеинового основания SEQ ID NO: 1, и является по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% комплементарной SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей в части равной длины. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид состоит из 12-29 остатков, 12-28 остатков, 12-27 остатков, 12-26 остатков, 12-25 остатков, 12-24 остатков, 12-23 остатков, 12-22 остатков, 12-21 остатков, 12-20 остатков, 12-19 остатков, 12-18 остатков, 12-17 остатков, 12-16 остатков, 12-15 остатков, 12-14 остатков, 13-29 остатков, 13-28 остатков, 13-27 остатков, 13-26 остатков, 13-25 остатков, 13-24 остатков, 13-23 остатков, 13-22 остатков, 13-21 остатков, 13-20 остатков, 13-19 остатков, 13-18 остатков, 13-17 остатков, 13-16 остатков, 13-15 остатков, 13-14 остатков, 14-29 остатков, 14-28 остатков, 14-27 остатков, 14-26 остатков, 14-25 остатков, 14-24 остатков, 14-23 остатков, 14-22 остатков, 14-21 остатков, 14-20 остатков, 14-19 остатков, 14-18 остатков, 14-17 остатков, 14-16 остатков или 14-15 остатков.

[0208]

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид, предложенный в настоящем документе, представляет собой гэпмер, и нацелен на любую из следующих областей в SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей: положения 126-141, 126-143, 127-142, 127-143, 127-144, 127-146, 128-143, 128-144, 128-147, 232-245, 232-247, 233-246, 233-247, 233-248, 234-247, 234-248, 1304-1323, 1306-1321, 1306-1324, 1307-1323, 1307-1324, 1307-1325, 1307-1326, 1308-1323, 1308-1324, 1308-1322, 1308-1325, 1309-1323, 1309-1324, 1309-1325, 1309-1322, 1310-1323, 1310-1324, 1472-1485, 1472-1486, 1472-1487, 1472-1488, 1473-1487, 1473-1488, 1473-1489, 1474-1488, 1474-1489, 1475-1490, 1476-1490, 1476-1491, 1476-1495, 1477-1495, 1478-1496, 1479-1495, 1479-1496, 1479-1498, 1480-1494, 1480-1495, 1480-1496, 1480-1497 или 1480-1499 от 5ʼ-конца. В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид, предложенный в настоящем документе, представляет собой гэпмер, и нацелен на любую из следующих областей в SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей: положения 128-143, 232-247, 233-248, 1309-1323 и 1480-1495 от 5ʼ-конца.

[0209]

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид, предложенный в настоящем документе, представляет собой гэпмер, и имеет последовательность нуклеиновых оснований, которая включает комплементарную область, содержащую по меньшей мере 8 непосредственно примыкающих друг к другу нуклеиновых оснований, комплементарных по отношению к целевой области. В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид, предложенный в настоящем документе, имеет последовательность нуклеиновых оснований, которая включает комплементарную область, содержащую по меньшей мере 8 непосредственно примыкающих друг к другу нуклеиновых оснований, комплементарных по отношению к целевой области, и целевая область нацелена на положения 126-141, 126-143, 127-142, 127-143, 127-144, 127-146, 128-143, 128-144, 128-147, 232-245, 232-247, 233-246, 233-247, 233-248, 234-247, 234-248, 1304-1323, 1306-1321, 1306-1324, 1307-1323, 1307-1324, 1307-1325, 1307-1326, 1308-1323, 1308-1324, 1308-1322, 1308-1325, 1309-1323, 1309-1324, 1309-1325, 1309-1322, 1310-1323, 1310-1324, 1472-1485, 1472-1486, 1472-1487, 1472-1488, 1473-1487, 1473-1488, 1473-1489, 1474-1488, 1474-1489, 1475-1490, 1476-1490, 1476-1491, 1476-1495, 1477-1495, 1478-1496, 1479-1495, 1479-1496, 1479-1498, 1480-1494, 1480-1495, 1480-1496, 1480-1497 или 1480-1499 от 5ʼ-конца в SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей. В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид, предложенный в настоящем документе, представляет собой гэпмер, и имеет последовательность нуклеиновых оснований, которая включает комплементарную область, содержащую по меньшей мере 8 непосредственно примыкающих друг к другу нуклеиновых оснований, комплементарных по отношению к целевой области, и целевая область нацелена на положения 128-143, 232-247, 233-248, 1309-1323 или 1480-1495 от 5ʼ-конца в SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей.

[0210]

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид, предложенный в настоящем документе, представляет собой гэпмер, и имеет последовательность нуклеиновых оснований, которая включает комплементарную область, содержащую по меньшей мере 10 непосредственно примыкающих друг к другу нуклеиновых оснований, комплементарных по отношению к целевой области. В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид, предложенный в настоящем документе, имеет последовательность нуклеиновых оснований, которая включает комплементарную область, содержащую по меньшей мере 10 непосредственно примыкающих друг к другу нуклеиновых оснований, комплементарных по отношению к целевой области, и целевая область нацелена на положения 126-141, 126-143, 127-142, 127-143, 127-144, 127-146, 128-143, 128-144, 128-147, 232-245, 232-247, 233-246, 233-247, 233-248, 234-247, 234-248, 1304-1323, 1306-1321, 1306-1324, 1307-1323, 1307-1324, 1307-1325, 1307-1326, 1308-1323, 1308-1324, 1308-1322, 1308-1325, 1309-1323, 1309-1324, 1309-1325, 1309-1322, 1310-1323, 1310-1324, 1472-1485, 1472-1486, 1472-1487, 1472-1488, 1473-1487, 1473-1488, 1473-1489, 1474-1488, 1474-1489, 1475-1490, 1476-1490, 1476-1491, 1476-1495, 1477-1495, 1478-1496, 1479-1495, 1479-1496, 1479-1498, 1480-1494, 1480-1495, 1480-1496, 1480-1497 или 1480-1499 от 5ʼ-конца в SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей. В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид, предложенный в настоящем документе, представляет собой гэпмер, и имеет последовательность нуклеиновых оснований, которая включает комплементарную область, содержащую по меньшей мере 10 непосредственно примыкающих друг к другу нуклеиновых оснований, комплементарных по отношению к целевой области, и целевая область нацелена на положения 128-143, 232-247, 233-248, 1309-1323 или 1480-1495 от 5ʼ-конца в SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей.

[0211]

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид, предложенный в настоящем документе, представляет собой гэпмер, и имеет последовательность нуклеиновых оснований, которая включает комплементарную область, содержащую по меньшей мере 12 непосредственно примыкающих друг к другу нуклеиновых оснований, комплементарных по отношению к целевой области. В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид, предложенный в настоящем документе, имеет последовательность нуклеиновых оснований, которая включает комплементарную область, содержащую по меньшей мере 12 непосредственно примыкающих друг к другу нуклеиновых оснований, комплементарных по отношению к целевой области, и целевая область нацелена на положения 126-141, 126-143, 127-142, 127-143, 127-144, 127-146, 128-143, 128-144, 128-147, 232-245, 232-247, 233-246, 233-247, 233-248, 234-247, 234-248, 1304-1323, 1306-1321, 1306-1324, 1307-1323, 1307-1324, 1307-1325, 1307-1326, 1308-1323, 1308-1324, 1308-1322, 1308-1325, 1309-1323, 1309-1324, 1309-1325, 1309-1322, 1310-1323, 1310-1324, 1472-1485, 1472-1486, 1472-1487, 1472-1488, 1473-1487, 1473-1488, 1473-1489, 1474-1488, 1474-1489, 1475-1490, 1476-1490, 1476-1491, 1476-1495, 1477-1495, 1478-1496, 1479-1495, 1479-1496, 1479-1498, 1480-1494, 1480-1495, 1480-1496, 1480-1497 или 1480-1499 от 5ʼ-конца в SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей. В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид, предложенный в настоящем документе, представляет собой гэпмер, и имеет последовательность нуклеиновых оснований, которая включает комплементарную область, содержащую по меньшей мере 12 непосредственно примыкающих друг к другу нуклеиновых оснований, комплементарных по отношению к целевой области, и целевая область нацелена на положения 128-143, 232-247, 233-248, 1309-1323 или 1480-1495 от 5ʼ-конца в SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей.

[0212]

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид, предложенный в настоящем документе, представляет собой гэпмер, и имеет последовательность нуклеиновых оснований, которая включает комплементарную область, содержащую по меньшей мере 14 непосредственно примыкающих друг к другу нуклеиновых оснований, комплементарных по отношению к целевой области. В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид, предложенный в настоящем документе, имеет последовательность нуклеиновых оснований, которая включает комплементарную область, содержащую по меньшей мере 14 непосредственно примыкающих друг к другу нуклеиновых оснований, комплементарных по отношению к целевой области, и целевая область нацелена на положения 126-141, 126-143, 127-142, 127-143, 127-144, 127-146, 128-143, 128-144, 128-147, 232-245, 232-247, 233-246, 233-247, 233-248, 234-247, 234-248, 1304-1323, 1306-1321, 1306-1324, 1307-1323, 1307-1324, 1307-1325, 1307-1326, 1308-1323, 1308-1324, 1308-1322, 1308-1325, 1309-1323, 1309-1324, 1309-1325, 1309-1322, 1310-1323, 1310-1324, 1472-1485, 1472-1486, 1472-1487, 1472-1488, 1473-1487, 1473-1488, 1473-1489, 1474-1488, 1474-1489, 1475-1490, 1476-1490, 1476-1491, 1476-1495, 1477-1495, 1478-1496, 1479-1495, 1479-1496, 1479-1498, 1480-1494, 1480-1495, 1480-1496, 1480-1497 или 1480-1499 от 5ʼ-конца в SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей. В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид, предложенный в настоящем документе, представляет собой гэпмер, и имеет последовательность нуклеиновых оснований, которая включает комплементарную область, содержащую по меньшей мере 14 непосредственно примыкающих друг к другу нуклеиновых оснований, комплементарных по отношению к целевой области, и целевая область нацелена на положения 128-143, 232-247, 233-248, 1309-1323 или 1480-1495 от 5ʼ-конца в SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей.

[0213]

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид представляет собой гэпмер, и представляет собой модифицированный олигонуклеотид, который состоит из последовательности нуклеиновых оснований, которая комплементарна части равной длины в положениях 126-141, 126-143, 127-142, 127-143, 127-144, 127-146, 128-143, 128-144, 128-147, 232-245, 232-247, 233-246, 233-247, 233-248, 234-247, 234-248, 1304-1323, 1306-1321, 1306-1324, 1307-1323, 1307-1324, 1307-1325, 1307-1326, 1308-1323, 1308-1324, 1308-1322, 1308-1325, 1309-1323, 1309-1324, 1309-1325, 1309-1322, 1310-1323, 1310-1324, 1472-1485, 1472-1486, 1472-1487, 1472-1488, 1473-1487, 1473-1488, 1473-1489, 1474-1488, 1474-1489, 1475-1490, 1476-1490, 1476-1491, 1476-1495, 1477-1495, 1478-1496, 1479-1495, 1479-1496, 1479-1498, 1480-1494, 1480-1495, 1480-1496, 1480-1497 или 1480-1499 от 5ʼ-конца нуклеинового основания зрелой мРНК DUX4 в SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей. В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид представляет собой гэпмер, и представляет собой модифицированный олигонуклеотид, который состоит из последовательности нуклеиновых оснований, которая комплементарна части равной длины в положениях 128-143, 232-247, 233-248, 1309-1323, 1480-1495 от 5ʼ-конца нуклеинового основания зрелой мРНК DUX4 в SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей.

[0214]

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид представляет собой гэпмер, и представляет собой модифицированный олигонуклеотид, состоящий из последовательности нуклеиновых оснований, представленной любой из SEQ ID NO: 2-4, 7-64, 69-97, и 102-109 в списке последовательностей. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид представляет собой гэпмер, и представляет собой модифицированный олигонуклеотид, состоящий из последовательности нуклеиновых оснований, представленной любой из SEQ ID NO: 2-4, 75, и 78 в списке последовательностей.

[0215]

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид представляет собой гэпмер, и представляет собой модифицированный олигонуклеотид, являющийся любым из соединений №№ 1-112, 114-132 и 137-246. В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид представляет собой гэпмер, и представляет собой модифицированный олигонуклеотид, являющийся любым из соединений №№ 1-3, 123, 157, 204, 221 и 231.

[0216]

В настоящем описании в символах, таких как «Gls», обозначающих нуклеотиды, буквенное сокращение слева означает часть нуклеинового основания, буквенное сокращение в центре означает фрагмент сахара, а буквенное сокращение справа означает способ межнуклеозидной связи.

[0217]

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид представляет собой гэпмер и представлен формулой:

GlsMlsMlsTdsAdsGdsAdsCdsAdsGdsCdsGdsTdsMlsGlsGl,

где нуклеиновые основания представлены следующими символами:

A=аденин, T=тимин, G=гуанин, C=цитозин и M=5-метилцитозин;

сахарные компоненты представлены следующими символами:

l=LNA и d=2ʼ-дезоксирибоза;

и межнуклеозидные связи представлены следующим символом:

s=фосфоротиоат.

[0218]

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид представляет собой гэпмер и представлен формулой:

GmsMmsMmsTdsAdsGdsAdsCdsAdsGdsCdsGdsTdsMmsGmsGm,

где нуклеиновые основания представлены следующими символами:

A=аденин, T=тимин, G=гуанин, C=цитозин и M=5-метилцитозин;

сахарные компоненты представлены следующими символами:

m=ALNA [Ms] и d=2ʼ-дезоксирибоза;

и межнуклеозидные связи представлены следующим символом:

s=фосфоротиоат.

[0219]

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид представляет собой гэпмер и представлен формулой:

GmsMmsAmsGdsTdsTdsCdsTdsCdsCdsGdsCdsGmsGmsTm,

где нуклеиновые основания представлены следующими символами:

A=аденин, T=тимин, G=гуанин, C=цитозин и M=5-метилцитозин;

сахарные компоненты представлены следующими символами:

m=ALNA [Ms] и d=2ʼ-дезоксирибоза;

и межнуклеозидные связи представлены следующим символом:

s=фосфоротиоат.

[0220]

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид представляет собой гэпмер и представлен формулой:

MlsGlsAlsGdsAdsTdsTdsCdsCdsCdsGdsCdsCdsGlsGlsTl,

где нуклеиновые основания представлены следующими символами:

A=аденин, T=тимин, G=гуанин, C=цитозин и M=5-метилцитозин;

сахарные компоненты представлены следующими символами:

l=LNA и d=2ʼ-дезоксирибоза;

и межнуклеозидные связи представлены следующим символом:

s=фосфоротиоат.

[0221]

В некоторых вариантах осуществления изобретения предложен способ снижения уровней мРНК DUX4 и/или белка DUX4 (например, внутримышечных уровней) у животного, страдающего заболеванием, связанным с DUX4, который включает: введение животному эффективного по отношению к DUX4 количества модифицированного олигонуклеотида.

[0222]

В некоторых вариантах осуществления изобретения предложен способ снижения уровней мРНК DUX4 и/или белка DUX4 (например, внутримышечных уровней) у животного, страдающего FSHD, где способ включает введение животному эффективного по отношению к DUX4 количества модифицированного олигонуклеотида. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления изобретения предложен способ уменьшения повреждения мышц и/или улучшения двигательной функции у животного, страдающего FSHD, где способ включает введение животному эффективного по отношению к DUX4 количества модифицированного олигонуклеотида.

[0223]

В некоторых вариантах осуществления изобретения предложен способ лечения, то есть терапевтического лечения, профилактики, облегчения или облегчения FSHD, где способ включает введение животному эффективного по отношению к DUX4 количества модифицированного олигонуклеотида.

[0224]

В некоторых вариантах осуществления изобретения предложен способ предотвращения, облегчения или облегчения различных симптомов FSHD (например, слабость лицевых мышц, птоз век, неспособность посвистеть, уменьшение способности изменения выражения лица, меланхолическое или сердитое выражение лица, трудность с произношением слов, слабость лопатных мышц (деформации, такие как крылатые лопатки и покатые плечи), слабость нижних конечностей, потеря слуха и сердечные заболевания), где способ включает введение животному эффективного по отношению к DUX4 количества модифицированного олигонуклеотида.

[0225]

В некоторых вариантах осуществления изобретения предложен способ снижения уровней (например, уровней в B-клетках в крови) мРНК и/или белка, генерируемых слиянием гена DUX4 с геном IGH у животного с B-клеточным острым лимфоцитарным лейкозом или тому подобным, где способ включает введение животному эффективного по отношению к DUX4 количества модифицированного олигонуклеотида. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления изобретения предложен способ лечения, то есть терапевтического лечения, предотвращения, облегчения или облегчения B-клеточного острого лимфоцитарного лейкоза или тому подобного, где способ включает введение животному эффективного количества модифицированного олигонуклеотида в отношении в DUX4.

[0226]

В некоторых вариантах осуществления изобретения предложен способ снижения уровней (например, уровней в саркоме) мРНК и/или белка, образующихся путем слияния гена DUX4 с геном CIC у животного с дифференцированной круглоклеточной саркомой или тому подобным, где способ включает введение животному эффективного по отношению к DUX4 количества модифицированного олигонуклеотида. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления изобретения предложен способ лечения, то есть терапевтического лечения, предотвращения, облегчения или облегчения дифференцированной круглоклеточной саркомы или тому подобного, где способ включает введение животному эффективного по отношению к DUX4 количества модифицированного олигонуклеотида.

[0227]

В некоторых вариантах осуществления изобретения предложен способ снижения уровней (например, уровней в саркоме) мРНК и/или белка, генерируемых путем слияния гена DUX4 с геном EWSR1 у животного с рабдомиосаркомой плода или тому подобным, где способ включает введение животному эффективного по отношению к DUX4 количества модифицированного олигонуклеотида. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления изобретения предложен способ лечения, то есть терапевтического лечения, предотвращения, улучшения состояния или облегчения рабдомиосаркомы плода или тому подобного, где способ включает введение животному эффективного по отношению к DUX4 количества модифицированного олигонуклеотида.

[0228]

В некоторых вариантах осуществления изобретения предложен способ терапевтического лечения, предотвращения, улучшения состояния или облегчения заболевания, связанного с DUX4, с уменьшенными побочными эффектами, где способ включает введение животному модифицированного по отношению к DUX4 олигонуклеотида. В некоторых вариантах осуществления изобретения побочные эффекты включают реакции в месте инъекции, аномалии тестов функции печени, аномалии функции почек, токсичность для печени (гистопатологические отклонения от нормы: дегенеративный некроз гепатоцитов, гепатоцеллюлярная гипертрофия и тому подобное), почечную токсичность (гистопатологические отклонения от нормы и тому подобное), аномалии центральной нервной системы, миопатии и недомогания. Например, повышенный уровень ALT, AST, γ-GTP, GLDH, ALP (щелочная фосфатаза) или TBA (общее количество желчных кислот) в крови может указывать на гепатотоксичность или нарушение функции печени. Например, повышенный билирубин может указывать на токсичность или нарушение функции печени. Кроме того, повышенный уровень белка в моче или повышенный уровень креатинина или UN в крови может указывать на почечную токсичность или нарушение функции почек.

[0229]

В некоторых вариантах осуществления изобретения предложено применение соединения, описанного в настоящем документе, или фармацевтической композиции, содержащей это соединение, при изготовлении медицинского препарата для применения в любом из способов лечения, описанных в настоящем документе. Например, в некоторых вариантах осуществления изобретения предложено применение соединения, описанного в настоящем документе, или фармацевтической композиции, содержащей это соединение, при изготовлении медицинского препарата для лечения, то есть терапевтического лечения, предотвращения, отсрочки или улучшения состояния FSHD. В некоторых вариантах осуществления изобретения предложено применение соединения, описанного в настоящем документе, или фармацевтической композиции, содержащей это соединение, при изготовлении медицинского препарата для ингибирования экспрессии DUX4 и для лечения, то есть терапевтического лечения, предотвращения, отсрочки или улучшения состояния заболевания, связанного с DUX4, и/или его симптомов. В некоторых вариантах осуществления изобретения предложено применение соединения, описанного в настоящем документе, или фармацевтической композиции, содержащей это соединение, при изготовлении медицинского препарата для снижения экспрессии DUX4 у животных. В некоторых вариантах осуществления изобретения предложено применение соединения, описанного в настоящем документе, или фармацевтической композиции, содержащей это соединение, при изготовлении медицинского препарата для облегчения миотонии путем предпочтительного снижения уровня мРНК DUX4-FL (например, уровня в мышцах) у животных. В некоторых вариантах осуществления изобретения предложено применение соединения, описанного в настоящем документе, или фармацевтической композиции, содержащей это соединение, при изготовлении медицинского препарата для лечения животного, страдающего FSHD. В некоторых вариантах осуществления изобретения предложено применение соединения, описанного в настоящем документе, или фармацевтической композиции, содержащей это соединение, при изготовлении медицинского препарата для лечения одного или нескольких симптомов и исходов, связанных с развитием FSHD, включая жесткость мышц, миотонию, слабость лицевых мышц, птоз век, неспособность посвистеть, уменьшение способности изменения выражения лица, меланхолическое или сердитое выражение лица, трудности с произношением слов, слабость лопатных мышц (деформации, такие как крылатые лопатки и покатые плечи), слабость нижних конечностей, потерю слуха и сердечные заболевания. В некоторых вариантах осуществления изобретения предложено применение соединения, описанного в настоящем документе, или фармацевтической композиции, содержащей это соединение, при изготовлении медицинского препарата для предотвращения экспрессии белка DUX4 путем управления транскрипцией гена DUX4, трансляцией мРНК DUX4 и расщеплением мРНК DUX4.

[0230]

В некоторых вариантах осуществления изобретения предложен набор для лечения, то есть терапевтического лечения, предотвращения или улучшения состояния FSHD, описанного в настоящем документе, включающий: a) соединение, описанное в настоящем документе, и, необязательно, b) дополнительный агент или терапию, описанные в настоящем документе. Набор может дополнительно включать инструкцию или этикетку с описанием использования набора для лечения, то есть терапевтического лечения, предотвращения или улучшения состояния FSHD.

[0231]

В некоторых вариантах осуществления изобретения предложено применение соединения, описанного в настоящем документе, или фармацевтической композиции, содержащей это соединение, при изготовлении медицинского препарата для применения в любом из способов лечения, описанных в настоящем документе. Например, в некоторых вариантах осуществления изобретения предложено применение соединения, описанного в настоящем документе, или фармацевтической композиции, содержащей это соединение, при изготовлении медицинского препарата для лечения, то есть терапевтического лечения, облегчения состояния или предотвращения FSHD. В некоторых вариантах осуществления изобретения предложено применение соединения, описанного в настоящем документе, или фармацевтической композиции, содержащей это соединение, при изготовлении медицинского препарата для ингибирования экспрессии DUX4 и для лечения, то есть терапевтического лечения, предотвращения, отсрочки или улучшения состояния заболевания, связанного с DUX4, и/или его симптомов. В некоторых вариантах осуществления изобретения предложено применение соединения, описанного в настоящем документе, или фармацевтической композиции, содержащей это соединение, при изготовлении медицинского препарата для снижения экспрессии DUX4 у животных. В некоторых вариантах осуществления изобретения предложено применение соединения, описанного в настоящем документе, или фармацевтической композиции, содержащей это соединение, при изготовлении медицинского препарата для облегчения миотонии путем предпочтительного снижения уровня мРНК DUX4-FL (например, уровня в мышцах) у животных. В некоторых вариантах осуществления изобретения предложено применение соединения, описанного в настоящем документе, или фармацевтической композиции, содержащей это соединение, при изготовлении медицинского препарата для лечения животного, страдающего FSHD. В некоторых вариантах осуществления изобретения предложены соединение, описанное в настоящем документе, или фармацевтическая композиция, содержащая это соединение, для лечения одного или нескольких симптомов и исходов, связанных с развитием FSHD, включая жесткость мышц, миотонию, слабость лицевых мышц, птоз век, неспособность посвистеть, уменьшение способности изменения выражения лица, меланхолическое или сердитое выражение лица, трудности с произношением слов, слабость лопатных мышц (деформации, такие как крылатые лопатки и покатые плечи), слабость нижних конечностей, потерю слуха и сердечные заболевания. В некоторых вариантах осуществления изобретения предложен модифицированный олигонуклеотид, имеющий последовательность нуклеиновых оснований, состоящую из последовательности нуклеиновых оснований SEQ ID NO: 2-4, 7-64, 69-97 или 102-109 в списке последовательностей, или соединение, выбранное из соединений №№ 1-112, 114-132 или 137-246.

[0232]

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид имеет последовательность нуклеиновых оснований, которая при описании в направлении от 5ʼ до 3ʼ включает обратнокомплементарный участок целевого сегмента нуклеиновой кислоты-мишени, на которую нацелен модифицированный олигонуклеотид. В некоторых таких вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид имеет последовательность нуклеиновых оснований, которая при описании в направлении от 5ʼ до 3ʼ включает обратнокомплементарный участок целевого сегмента нуклеиновой кислоты-мишени, на которую нацелен модифицированный олигонуклеотид.

[0233]

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид, описанный в настоящем документе, который нацелен на DUX4, имеет длину из 12-30 нуклеотидов. Другими словами, в некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид представляет собой связанное нуклеиновое основание, состоящее из 12-30 остатков. В других вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид включает модифицированный олигонуклеотид, состоящий из связанного нуклеинового основания из 12-29 остатков, 12-28 остатков, 12-27 остатков, 12-26 остатков, 12-25 остатков, 12-24 остатков, 12-23 остатков, 12-22 остатков, 12-21 остатков, 12-20 остатков, 12-19 остатков, 12-18 остатков, 12-17 остатков, 12-16 остатков, 12-15 остатков, 12-14 остатков, 13-29 остатков, 13-28 остатков, 13-27 остатков, 13-26 остатков, 13-25 остатков, 13-24 остатков, 13-23 остатков, 13-22 остатков, 13-21 остатков, 13-20 остатков, 13-19 остатков, 13-18 остатков, 13-17 остатков, 13-16 остатков, 13-15 остатков, 13-14 остатков, 14-29 остатков, 14-28 остатков, 14-27 остатков, 14-26 остатков, 14-25 остатков, 14-24 остатков, 14-23 остатков, 14-22 остатков, 14-21 остатков, 14-20 остатков, 14-19 остатков, 14-18 остатков, 14-17 остатков, 14-16 остатков или 14-15 остатков. В некоторых таких вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид включает модифицированный олигонуклеотид, состоящий из связанного нуклеинового основания из 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 остатков по длине или в диапазоне, определяемом любыми двумя из вышеуказанных значений. В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид, имеющий любую такую длину, включает по меньшей мере 8 непосредственно примыкающих друг к другу нуклеиновых оснований в последовательности нуклеиновых оснований, описываемой любыми непосредственно примыкающими друг к другу нуклеиновыми основаниями (например, SEQ ID NO: 2-4, 7-64, 69-97 или 102-109 в списке последовательностей) из по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18 или по меньшей мере 19 остатков последовательности нуклеиновых оснований любого из приведенных в качестве примеров модифицированных олигонуклеотидов, описанный в настоящем документе.

[0234]

Можно увеличить или уменьшить длину антисмыслового соединения, такого как антисмысловой олигонуклеотид, и/или ввести ошибочно спаренное основание без устранения активности. Например, согласно Woolf et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7305-7309, 1992) ряд антисмысловых олигонуклеотидов длиной 13-25 нуклеиновых оснований исследовали на их способность индуцировать расщепление целевой РНК в модели инъекции в ооцит. Антисмысловой олигонуклеотид длиной 25 нуклеотидов с 8 или 11 ошибочно спаренными основаниями возле концов антисмыслового олигонуклеотида был способен управлять специфическим расщеплением целевой мРНК, хотя и в меньшей степени, чем антисмысловой олигонуклеотид, который не содержал ошибочных спариваний. Аналогичным образом сообщается, что специфическое для мишени расщепление достигалось с использованием антисмысловых олигонуклеотидов из 13 нуклеиновых оснований, включая олигонуклеотиды с 1 или 3 ошибочными спариваниями.

[0235]

Согласно Gautschi et al., (J. Natl. Cancer Inst. 93: 463-471, March 2001) олигонуклеотид, имеющий 100% комплементарность по отношению к мРНК bc1-2 и имеющий 3 ошибочных спаривания по отношению к мРНК bc1-xL, продемонстрировал способность снижать экспрессию как bc1-2, так и bc1-xL in vitro и in vivo. Кроме того, сообщается, что этот олигонуклеотид продемонстрировал сильную противоопухолевую активность in vivo.

[0236]

Нуклеиновая кислота-мишень, область-мишень и NSequence

Примеры нуклеотидной последовательности, кодирующей DUX4, включают, но этим не ограничиваются, следующие последовательности.

・ Последовательность, указанная под регистрационным номером GenBank NM_001293798.2 (включена в настоящий документ как SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей). Вариант сплайсинга SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей также упоминается как DUX4-FL1 или зрелая мРНК DUX4.

・ Последовательность, указанная под регистрационным номером GenBank NM_001306068.2 (включена в настоящий документ как SEQ ID NO: 5 в списке последовательностей). Вариант сплайсинга SEQ ID NO: 5 в списке последовательностей также упоминается как DUX4-FL2.

・ Последовательность, указанная под регистрационным номером GenBank NM_001363820.1 (включена в настоящий документ как SEQ ID NO: 6 в списке последовательностей). Вариант сплайсинга SEQ ID NO: 6 в списке последовательностей также упоминается как DUX4-s.

・ SNP вышеперечисленных вариантов сплайсинга.

Последовательности, представленные в SEQ ID NO в списке последовательностей в примерах, содержащихся в настоящем документе, не зависят от каких-либо модификаций в отношении сахарного фрагмента, межнуклеозидной связи или нуклеинового основания. Следовательно, модифицированный олигонуклеотид, определенный SEQ ID NO в списке последовательностей, может включать, независимо, одну или несколько модификаций в отношении сахарного фрагмента, межнуклеозидной связи или нуклеинового основания. Модифицированный олигонуклеотид, описанный номером соединения, указывает комбинацию последовательности нуклеиновых оснований и мотива.

[0237]

В некоторых вариантах осуществления изобретения целевая область представляет собой структурно определенную область целевой нуклеиновой кислоты. Например, целевая область может включать одну или несколько из следующих: 3ʼ UTR, 5ʼ UTR, экзон, интрон, соединение экзон/интрон, кодирующая область, область инициации трансляции, область терминации трансляции или другие определенные области нуклеиновой кислоты. Структурно определенный регион для DUX4 может быть получен по номеру доступа из базы данных последовательностей, такой как NCBI, и такая информация включена в настоящий документ посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления изобретения целевая область может включать последовательность от 5ʼ целевого сайта одного целевого сегмента в целевой области до 3ʼ целевого сайта другого целевого сегмента в целевой области.

[0238]

Нацеливание включает определение по меньшей мере одного целевого сегмента, с которым гибридизуется модифицированный олигонуклеотид, так что возникает желаемый эффект. В некоторых вариантах осуществления изобретения желаемый эффект представляет собой снижение уровня нуклеиновой кислоты-мишени мРНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения желаемый эффект представляет собой снижение уровня белка, кодируемого целевой нуклеиновой кислотой, или фенотипическое изменение, связанное с целевой нуклеиновой кислотой.

[0239]

Целевая область может содержать один или несколько целевых сегментов. Несколько целевых сегментов в целевом регионе могут перекрываться. Альтернативно, они могут не перекрываться. В некоторых вариантах осуществления изобретения целевые сегменты в целевой области разделены не более чем около 300 нуклеотидами. В некоторых вариантах осуществления изобретения целевые сегменты в целевой области разделены рядом нуклеотидов целевой нуклеиновой кислоты, причем это количество составляет или примерно составляет, или не превышает или примерно не превышает 250, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 или 10 или в диапазоне, определяемом любыми двумя из предыдущих чисел. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегменты в целевой области разделены не более чем или примерно не более чем на 5 нуклеотидов на целевой нуклеиновой кислоте. В некоторых вариантах осуществления изобретения целевые сегменты являются смежными. Предусматривается область-мишень, определяемая диапазоном, имеющим исходную нуклеиновую кислоту, которая представляет собой либо 5ʼ-целевой сайт, либо 3ʼ-целевой сайт, перечисленные в настоящем документе.

[0240]

Подходящий целевой сегмент можно найти в 5ʼ UTR, кодирующей области, 3ʼ UTR, интроне, экзоне или соединении экзон/интрон. Целевой сегмент, содержащий стартовый кодон или стоп-кодон, также является подходящим целевым сегментом. Подходящий целевой сегмент может специально исключать некоторую структурно определенную область, такую как стартовый кодон или стоп-кодон.

[0241]

Определение подходящего целевого сегмента может включать сравнение последовательности целевой нуклеиновой кислоты с другими последовательностями по всему геному. Например, для идентификации областей сходства между различными нуклеиновыми кислотами можно использовать алгоритм BLAST. Это сравнение может предотвратить выбор модифицированной олигонуклеотидной последовательности, которая может неспецифически гибридизоваться с последовательностью, отличной от выбранной нуклеиновой кислоты-мишени (то есть нецелевой последовательности или нецелевой последовательности).

[0242]

Могут быть вариации активности (например, определяемой процентным снижением уровня целевой нуклеиновой кислоты) модифицированного олигонуклеотида в активной области-мишени. В некоторых вариантах осуществления изобретения снижение уровня мРНК DUX4 является показателем ингибирования экспрессии белка DUX4. Снижение уровня белка DUX4 также является индикатором подавления экспрессии мРНК-мишени. Кроме того, фенотипические изменения, такие как уменьшение миотонии и уменьшение миопатии, могут быть индикаторами ингибирования экспрессии мРНК и/или белка DUX4.

[0243]

Гибридизация

В некоторых вариантах осуществления изобретения между модифицированным олигонуклеотидом, описанным в настоящем документе, и нуклеиновой кислотой DUX4 происходит гибридизация. Наиболее распространенный механизм гибридизации включает водородные связи (например, водородные связи Уотсона-Крика, Хугстина или обратные водородные связи Хугстина) между комплементарными основаниями нуклеиновых кислот молекул нуклеиновой кислоты. Сила гибридизации может быть представлена температурой плавления Tm. Tm представляет собой температуру, при которой 50% гибридизированной двухцепочечной нуклеиновой кислоты диссоциирует в одноцепочечную нуклеиновую кислоту. Tm варьируется в зависимости от солевого состояния раствора, длины нуклеиновой кислоты, последовательности оснований и тому подобное, но более высокое значение Tm указывает на более сильную гибридизацию.

[0244]

Гибридизация может происходить в различных условиях. Строгие условия зависят от последовательности и определяются природой и составом молекул нуклеиновой кислоты, подлежащих гибридизации.

[0245]

Способ определения того, является ли последовательность специфически гибридизируемой с нуклеиновой кислотой-мишенью, хорошо известен в данной области (Sambrooke and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., 2001). В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид, предложенный в настоящем документе, способен специфически гибридизоваться с нуклеиновой кислотой DUX4.

[0246]

Комплементарность

Модифицированный олигонуклеотид и нуклеиновая кислота-мишень комплементарны друг другу когда достаточное количество нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида может образовывать водородную связь с соответствующими нуклеиновыми основаниями нуклеиновой кислоты-мишени, так что возникает желаемый эффект (например, антисмысловое ингибирование нуклеиновой кислоты-мишени кислота, такой как нуклеиновая кислота DUX4).

[0247]

Модифицированный олигонуклеотид может гибридизоваться с одним или несколькими сегментами нуклеиновой кислоты DUX4, так что промежуточные или соседние сегменты не участвуют в событии гибридизации (например, петлевая структура, ошибочное спаривание или структура шпильки).

[0248]

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид, предложенный в настоящем документе, или его конкретная часть являются на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% комплементарными в отношении нуклеиновой кислоты DUX4, целевой области, целевого сегмента или их конкретной части. В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид является на по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% комплементарным в отношении нуклеиновой кислоты DUX4, целевой области, целевого сегмента или их конкретной части и содержит по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18 или по меньшей мере 19 непосредственно примыкающих друг к другу нуклеотидов в последовательности нуклеиновых оснований любого из приведенных в примерах модифицированных олигонуклеотидов, описанных в настоящем документе (например, по меньшей мере 8 непосредственно примыкающих друг к другу нуклеотидов в последовательности нуклеиновых оснований, описанных в любой из SEQ ID NO: 2, 3, 4, 7-64, 69-97 или 102-109 в списке последовательностей). Процент комплементарности модифицированного олигонуклеотида по отношению к нуклеиновой кислоте-мишени может быть определен с использованием обычного метода и измерен по всему модифицированному олигонуклеотиду.

[0249]

Например, 18 из 20 нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида комплементарны по отношению к целевой области, и, таким образом, модифицированный олигонуклеотид, который, по-видимому, гибридизуется, специфически соответствует 90-процентной комплементарности. В этом примере оставшиеся некомплементарные нуклеиновые основания могут быть сгруппированы или перемежены с комплементарными нуклеиновые основаниями и не обязательно должны непосредственно примыкать друг к другу или к комплементарным нуклеиновым основаниям. Процентная комплементарность модифицированного олигонуклеотида по отношению к области нуклеиновой кислоты-мишени может быть определена обычным образом с использованием программы BLAST (базовые инструменты поиска локального выравнивания) и программы PowerBLAST, известной в данной области (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403 410; Zhang and Madden, Genome Res., 1997, 7, 649 656). Процент гомологии, идентичности последовательностей или комплементарности можно определить, например, с помощью программы Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, версия 8 для Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison WI), используя настройки по умолчанию, используя алгоритм Смита и Уотермана (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482 489).

[0250]

Участок некомплементарного нуклеинового основания может находиться на 5ʼ-конце или 3ʼ-конце модифицированного олигонуклеотида. Альтернативно, некомплементарное нуклеиновое основание (или некомплементарные нуклеиновые основания) может находиться во внутреннем положении модифицированного олигонуклеотида. Когда присутствуют два или более некомплементарных нуклеиновых оснований, они могут либо непосредственно примыкать друг к другу (то есть, быть связанными), либо не примыкать непосредственно друг к другу. В одном варианте осуществления изобретения некомплементарное нуклеиновое основание расположено в сегменте крыла олигонуклеотида, модифицированного гэпмером.

[0251]

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид, который имеет в длину или до 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеиновых оснований, включают не более 3, не более 2 или не более 1 некомплементарных нуклеиновых оснований по отношению к целевой нуклеиновой кислоте, такой как нуклеиновая кислота DUX4, или ее определенной части.

[0252]

Модифицированные олигонуклеотиды, предложенные в настоящем документе, также включают такие, которые комплементарны части нуклеиновой кислоты-мишени. Как используется в настоящем документе, термин «часть» относится к определенному количеству непосредственно примыкающих друг к другу (то есть связанных) нуклеиновых оснований в области или сегменте нуклеиновой кислоты-мишени. «Часть» может также относиться к определенному количеству непосредственно примыкающих друг к другу нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида. В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид комплементарен по меньшей мере части из 8 нуклеиновых оснований целевого сегмента. В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид комплементарен по меньшей мере части из 10 нуклеиновых оснований целевого сегмента. В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид комплементарен по меньшей мере части из 15 нуклеиновых оснований целевого сегмента. Также рассматривается модифицированный олигонуклеотид, который комплементарен части из по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19, по меньшей мере 20 или более нуклеиновых оснований целевого сегмента, или части нуклеиновых оснований в количестве в диапазоне, определяемом любыми двумя из этих значений.

[0253]

Идентичность

Модифицированный олигонуклеотид, предложенный в настоящем документе, также может иметь определенный процент идентичности в отношении конкретной нуклеотидной последовательности SEQ ID NO в списке последовательностей или соединения, представленного конкретным номером соединения, или его части. Как используется в настоящем документе, модифицированный олигонуклеотид идентичен последовательности, описанной в настоящем документе, когда он обладает такой же способностью к спариванию нуклеиновых оснований. Например, РНК, которая содержит урацил вместо тимидина в описанной последовательности ДНК, считается идентичной последовательности ДНК, поскольку и урацил, и тимидин соединяются с аденином. Также рассматриваются укороченные и удлиненные версии модифицированного олигонуклеотида, описанного в настоящем документе, и соединения, имеющего неидентичное основание по отношению к модифицированному олигонуклеотиду, представленному в настоящем документе. Неидентичные основания могут быть примыкающими друг к другу или рассредоточенными по модифицированному олигонуклеотиду. Процент идентичности модифицированного олигонуклеотида рассчитывается в соответствии с количеством оснований, которые имеют идентичные пары оснований относительно сравниваемой последовательности.

[0254]

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид или его часть по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентичны одному или нескольким примерам модифицированных олигонуклеотидов, описанных в настоящем документе, или SEQ ID NO в списке последовательностей или их частям.

[0255]

Модификации

Нуклеозид представляет собой комбинацию базового сахара. Часть нуклеотидного основания (также известная как основание) нуклеозида обычно представляет собой фрагмент гетероциклического основания. Нуклеотид представляет собой нуклеозид, который дополнительно включает фосфатную группу, ковалентно связанную с сахарным фрагментом нуклеозида. Для нуклеозида, который включает пентофуранозильный сахар, фосфатная группа может быть связана с 2ʼ, 3ʼ или 5ʼ гидроксильной группой сахара. Олигонуклеотид образуется посредством ковалентного связывания соседних нуклеозидов друг с другом с образованием линейного полимерного олигонуклеотида. В структуре олигонуклеотида фосфатные группы обычно называют образующими межнуклеозидные связи олигонуклеотида.

[0256]

Модификации модифицированного олигонуклеотида включают замену или изменение в отношении межнуклеозидных связей, сахарных фрагментов или нуклеиновых оснований. Модифицированный олигонуклеотид часто предпочтительнее нативной формы из-за желаемых свойств, таких как, например, повышенное клеточное поглощение, повышенное сродство к мишеням нуклеиновых кислот, повышенная стабильность в присутствии нуклеаз или повышенная ингибирующая активность.

[0257]

Модифицированные межнуклеозидные связи

Природная межнуклеозидная связь РНК и ДНК представляет собой 3ʼ-5ʼ-фосфодиэфирную связь. Модифицированный олигонуклеотид, имеющий одну или несколько модифицированных, то есть не природных, межнуклеозидных связей, часто выбирается вместо модифицированного олигонуклеотида, имеющего природные межнуклеозидные связи, из-за желаемых свойств, таких как, например, усиленное клеточное поглощение, повышенное сродство к нуклеиновым кислотам-мишеням и повышенная стабильность в присутствии нуклеаз.

[0258]

Олигонуклеотид, имеющий модифицированные межнуклеозидные связи, включает межнуклеозидные связи, которые сохраняют атом фосфора, и межнуклеозидные связи, которые не имеют атома фосфора. Типичные фосфорсодержащие межнуклеозидные связи включают, но этим не ограничиваются, одно или несколько из следующих: фосфодиэфиры, фосфотриэфиры, метилфосфонаты, фосфорамидаты и фосфоротиоаты. Способы получения связей, содержащих фосфор и не содержащих фосфор, хорошо известны.

[0259]

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид, нацеленный на нуклеиновую кислоту DUX4, включает одну или несколько модифицированных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированные межнуклеозидные связи представляют собой фосфоротиоатные связи. В некоторых вариантах осуществления изобретения каждая межнуклеозидная связь модифицированного олигонуклеотида представляет собой фосфоротиоатную межнуклеозидную связь.

[0260]

Модифицированные сахарные фрагменты

В качестве модифицированного олигонуклеотида по настоящему изобретению предпочтительно использовать модифицированный олигонуклеотид, в котором по меньшей мере один нуклеозид содержит модифицированный сахар. В настоящем изобретении термин «модифицированный сахар» относится к сахару, в котором сахарный фрагмент модифицирован, и модифицированный олигонуклеотид, содержащий один или несколько таких модифицированных сахаров, имеет полезные характеристики, такие как повышенная стабильность нуклеаз и повышенная аффинность связывания. Предпочтительно, чтобы по крайней мере один из модифицированных сахаров содержал бициклический сахар или замещенный сахарный фрагмент.

[0261]

Примеры нуклеозидов, имеющих модифицированный сахар, включают, но этим не ограничиваются, нуклеозиды, содержащие 5ʼ-винил, 5ʼ-метил (R или S), 4ʼ-S, 2ʼ-F, 2ʼ-OCH₃, 2ʼ-OCH₂CH₃, заместители 2ʼ-OCH₂CH₂F и 2ʼ-O(CH₂)₂OCH₃. Заместитель в положении 2ʼ также может быть выбран из аллила, амино, азидо, тио, O-аллила, O-C₁-C₁₀ алкила, OCF₃, OCH₂F, O(CH₂)₂SCH₃, O(CH₂)₂-O-N(R_m)(R_n), O-CH₂-C(=O)-N(R_m)(R_n) и O-CH₂-C(=O)-N(R_l)-(CH₂)₂-N(R_m)(R_n) (где R_l, R_m и R_n, каждый, независимо, представляют собой H или замещенный или незамещенный C₁-C₁₀ алкил).

[0262]

Примеры нуклеозидов, имеющий бициклический сахар включают, но этим не ограничиваются, нуклеозиды, которые содержат мостик между 4ʼ и 2ʼ атомами рибозильного кольца. В некоторых вариантах осуществления изобретения олигонуклеотид, предложенный в настоящем документе, включает один или более нуклеозидов, имеющих бициклический сахар, в котором мостик включает одну из следующих формул: 4ʼ-(CH₂)-O-2ʼ(LNA); 4ʼ-(CH₂)-S-2ʼ; 4ʼ-(CH₂)₂-O-2ʼ(ENA); 4ʼ-CH(CH₃)-O-2ʼ и 4ʼ-CH(CH₂OCH₃)-O-2ʼ (и его аналоги, см. патент США № 7399845); 4ʼ-C(CH₃)(CH₃)-O-2ʼ (и его аналоги, см. WO 2009/006478); 4ʼ-CH₂-N(OCH₃)-2ʼ (и его аналоги; см. WO 2008/150729); 4ʼ-CH₂-O-N(CH₃)-2ʼ (и его аналоги; см. US 2004-0171570); 4ʼ-CH₂-N(R)-O-2ʼ (где R представляет собой H, C₁-C₁₂ алкил или защитную группу) (см. патент США № 7427672); 4ʼ-CH₂-C(H)(CH₃)-2ʼ (и его аналоги; см. Chattopadhyaya et al., J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134); и 4ʼ-CH₂-C(=CH₂)-2ʼ (и его аналоги; см. WO 2008/154401).

[0263]

О дополнительных нуклеозидах, содержащих бициклический сахар, сообщается в опубликованной литературе (см., например: Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129 (26) 8362-8379; Frieden et al., Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365-6372; Elayadi et al., Curr. Opinion Invens. Drugs, 2001, 2, 558-561; Braasch et al., Chem. Biol., 2001, 8, 1-7; Orum et al., Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243; Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2000, 97, 5633-5638; Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh et al.; патенты США №№ 7399845, 6770748, 6525191 и 6268490; US 2008-0039618; US 2007-0287831; US 2004-0171570; US 2009-0012281; WO 2010/036698; WO 2009/067647; WO 2009/067647; WO 2007/134181; WO 2005/021570; WO 2004/106356; WO 94/14226; WO 2009/006478; WO 2008/154401 и WO 2008/150729). Каждый из указанных выше нуклеозидов, содержащих бициклический сахар, может быть получен с одной или несколькими стереохимическими конфигурациями сахара, включая, например, α-L-рибофуранозу и β-D-рибофуранозу.

[0264]

GuNA, нуклеозид, содержащий бициклический сахар, описан как искусственный нуклеозид, имеющий гуанидиновый мостик (см. WO 2014/046212 и WO 2017/047816). Бициклические нуклеозиды ALNA [Ms], ALNA [mU], ALNA [ipU], ALNA [Trz] и ALNA [Oxz] были описаны как сшитые искусственные амино-нуклеиновые кислоты LNA (ALNA) (см. патентная заявка Японии № 2018-212424).

[0265]

В некоторых вариантах осуществления изобретения нуклеозид, имеющий бициклический сахар, включает мостик между 4ʼ и 2ʼ атомами углерода фрагмента пентофуранозилового сахара, и мостик содержит от 1 до 4 связанных групп, каждая из которых независимо выбрана, но этим не ограничивается, из -[C(R_a)(R_b)]_n-, -C(R_a)=C(R_b)-, -C(R_a)=N-, -C(=NR_a)-, -C(= O)-, -C(=S)-, -N(R_a)-, -O-, -Si(R_a)₂- и -S(=O)_x-, где: X обозначает 0, 1 или 2; n обозначает 1, 2, 3 или 4; R_a и R_b, каждый, независимо, представляют собой H, защитную группу, гидроксил, C₁-C₁₂ алкил, замещенный C₁-C₁₂ алкил, C₂-C₁₂ алкенил, замещенный C₂-C₁₂ алкенил, C₂-C₁₂ алкинил, замещенный C₂-C₁₂ алкинил, ароматическую кольцевую группу, замещенную ароматическую кольцевую группу, гетероциклическую группу, замещенную гетероциклическую группу, C₅-C₇ алициклическую группу, замещенную C₅-C₇ алициклическую группу, галоген, OJ₁, NJ₁J₂, SJ₁, N₃, COOJ₁, ацил (C(=O)-H), замещенный ацил, CN, сульфонил (S(=O)₂-J₁) или сульфоксил (S(=O)-J₁), J₁ и J₂, каждый, независимо, представляют собой H, C₁-C₁₂ алкил, замещенный C₁-C₁₂ алкил, C₂-C₁₂ алкенил, замещенный C₂-C₁₂ алкенил, C₂-C₁₂ алкинил, замещенный C₂-C₁₂ алкинил, ароматическую кольцевую группу, замещенную ароматическую кольцевую группу, ацил (C(=O)-H), замещенный ацил, гетероциклическую группу, замещенную гетероциклическую группу, C₁-C₁₂ аминоалкил, замещенный C₁-C₁₂ аминоалкил или защитную группу.

[0266]

В некоторых вариантах осуществления изобретения мостик бициклического сахарного фрагмента представляет собой [C(R_a)(R_b)]_n-, -[CR_a) (R_b)]_n-O-, -C(R_aR_b)-N(R)-O- или -C(R_aR_b)-O-N(R)-. В некоторых вариантах осуществления изобретения мостик представляет собой 4ʼ-CH₂-2ʼ, 4ʼ-(CH₂)₂-2ʼ, 4ʼ-(CH₂)₃-2ʼ, 4ʼ-CH₂-O-2ʼ (нуклеозид, имеющий бициклический сахар в этом случае также упоминается как LNA), 4ʼ-(CH₂)₂-O-2ʼ, 4ʼ-CH₂-O-N(R)-2ʼ и 4ʼ-CH₂-N(R)-O-2ʼ-, где каждый R, независимо, представляет собой H, защитную группу или C₁-C₁₂ алкил.

[0267]

В некоторых вариантах осуществления изобретения мостик бициклического сахарного фрагмента представляет собой 4ʼ-CH₂-O-2ʼ-(LNA) или -CH₂-N(R)-, где каждый R, независимо, представляет собой -SO₂-CH₃ (ALNA [Ms]), -CO-NH-CH₃ (ALNA [mU]), 1,5-диметил-1,2,4-триазол-3-ил (ALNA [Trz]), -CO-NH-CH(CH₃)₂ (ALNA [ipU]), или 5-метил-2,4-оксадиазол-3-ил (ALNA [Oxz]) (патентная заявка Японии № 2018-212424).

[0268]

В некоторых вариантах осуществления изобретения нуклеозид, содержащий бициклический сахар, дополнительно характеризуется изомерной стерической конфигурацией. Например, нуклеозид, содержащий мостик 4ʼ-(CH₂)-O-2ʼ, может существовать в α-L-стерической конфигурации или β-D-стерической конфигурации.

[0269]

В некоторых вариантах осуществления изобретения нуклеозиды, содержащие бициклический сахар, включают нуклеозиды, содержащие мостик 4ʼ-2ʼ, и примеры таких мостиков включают, но этим не ограничиваются, α-L-4ʼ-(CH₂)-O-2ʼ, β-D-4ʼ-CH₂-O-2ʼ,4ʼ-(CH₂)₂-O-2ʼ, 4ʼ-CH₂-O-N(R)-2ʼ, 4ʼ-CH₂-N(R)-O-2ʼ, 4ʼ-CH(CH₃)-O-2ʼ, 4ʼ-CH₂-S-2ʼ, 4ʼ-CH₂-CH(CH₃)-2ʼ и 4ʼ-(CH₂)₃-2ʼ (где R представляет собой H, защитную группу, C₁-C₁₂ алкил или мочевину или гуанидин, которые могут быть замещены C₁-C₁₂ алкилом).

[0270]

В некоторых вариантах осуществления изобретения нуклеозид, имеющий бициклический сахар имеет следующую формулу:

,

где Bx представляет собой фрагмент гетероциклического основания; T_a и T_b, каждый, независимо, представляют собой атом водорода, защитную группу для гидроксильной группы, фосфатную группу, которая может быть замещена, фосфорный фрагмент, ковалентно присоединенный к основе, или тому подобное; и Z_a представляет собой C₁-C₆ алкил, C₂-C₆ алкенил, C₂-C₆ алкинил, замещенный C₁-C₆ алкил, замещенный C₂-C₆ алкенил, замещенный C₂-C₆ алкинил, ацил, замещенный ацил, замещенный амид, тиол или замещенный тиол.

[0271]

В некоторых вариантах осуществления изобретения заместители, каждый, независимо, являются монозамещенными или полизамещенными заместителем, независимо выбранным из галогена, оксо, гидроксила, OJ_c, NJ_cJ_d, SJ_c, N₃, OC(=X)J_c и NJ_eC(=X)NJ_cJ_d (где J_c, J_d и J_e, каждый, независимо, представляют собой H, C₁-C₆ алкил или замещенный C₁-C₆ алкил; и X представляет собой O или NJ_c).

[0272]

В некоторых вариантах осуществления изобретения нуклеозид, имеющий бициклический сахар имеет следующую формулу:

,

где Bx представляет собой фрагмент гетероциклического основания; T_a и T_b, каждый, независимо, представляют собой атом водорода, защитную группу для гидроксильной группы, фосфатную группу, которая может быть замещена, фосфорный фрагмент, ковалентно присоединенный к основе, или тому подобное; и Z_b представляет собой C₁-C₆ алкил, C₂-C₆ алкенил, C₂-C₆ алкинил, замещенный C₁-C₆ алкил, замещенный C₂-C₆ алкенил, замещенный C₂-C₆ алкинил или замещенный ацил (C(=O)-).

[0273]

В некоторых вариантах осуществления изобретения нуклеозид, имеющий бициклический сахар имеет следующую формулу:

,

где Bx представляет собой фрагмент гетероциклического основания; T_a и T_b, каждый, независимо, представляют собой атом водорода, защитную группу для гидроксильной группы, фосфатную группу, которая может быть замещена, фосфорный фрагмент, ковалентно присоединенный к основе, или тому подобное; R_d представляет собой C₁-C₆ алкил, замещенный C₁-C₆ алкил, C₂-C₆ алкенил, замещенный C₂-C₆ алкенил, C₂-C₆ алкинил или замещенный C₂-C₆ алкинил; и q_a, q_b, q_c и q_d, каждый, независимо, представляют собой H, галоген, C₁-C₆ алкил, замещенный C₁-C₆ алкил, C₂-C₆ алкенил, замещенный C₂-C₆ алкенил, C₂-C₆ алкинил или замещенный C₂-C₆ алкинил, C₁-C₆ алкоксил, замещенный C₁-C₆ алкоксил, ацил, замещенный ацил, C₁-C₆ аминоалкил или замещенный C₁-C₆ аминоалкил.

[0274]

В некоторых вариантах осуществления изобретения нуклеозид, имеющий бициклический сахар имеет следующую формулу:

,

где Bx представляет собой фрагмент гетероциклического основания; T_a и T_b, каждый, независимо, представляют собой атом водорода, защитную группу для гидроксильной группы, фосфатную группу, которая может быть замещена, фосфорный фрагмент, ковалентно присоединенный к основе, или тому подобное; q_a, q_b, q_e и q_f, каждый, независимо, представляют собой водород, галоген, C₁-C₁₂ алкил, замещенный C₁-C₁₂ алкил, C₂-C₁₂ алкенил, замещенный C₂-C₁₂ алкенил, C₂-C₁₂ алкинил, замещенный C₂-C₁₂ алкинил, C₁-C₁₂ алкокси, замещенный C₁-C₁₂ алкокси, OJ_j, SJ_j, SOJ_j, SO₂J_j, NJ_jJ_k, N₃, CN, C(=O)OJ_j, C(=O)NJ_jJ_k, C(=O)J_j, O-C(=O)NJ_jJ_k, N(H)C(=NH)NJ_jJ_k, N(H)C(=O)-NJ_jJ_k или N(H)C(=S)NJ_jJ_k; или q_e и q_f оба представляют собой =C(q_g)(q_h); и q_g и q_h, каждый, независимо, представляют собой H, галоген, C₁-C₁₂ алкил или замещенный C₁-C₁₂ алкил.

[0275]

Синтез и получение аденина, цитозина, гуанина, 5-метилцитозина, тимина и бициклического нуклеозида урацила (также называемого LNA), которые имеют мостик 4ʼ-CH₂-O-2ʼ, описаны вместе с их свойствами олигомеризации и распознавания нуклеиновых кислот (Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630). Синтез нуклеозида, содержащего бициклический сахар, также описан в WO 98/39352 и WO 99/14226.

[0276]

Также были получены различные аналоги бициклических нуклеозидов, имеющих 4ʼ-2ʼ мостиковые группы, такие как 4ʼ-CH₂-O-2ʼ (бициклический нуклеозид в этом случае также упоминается как LNA) и 4ʼ-CH₂-S-2ʼ (Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222). Также было описано получение олигодезоксирибонуклеотидных дуплексов, содержащих бициклические нуклеозиды, для использования в качестве субстратов для полимераз нуклеиновых кислот (Wengel et al., WO 99/14226). Кроме того, в данной области был описан синтез 2ʼ-амино-BNA (бициклический нуклеозид в этом случае также упоминается как ALNA), то есть конформационно ограниченного аналога олигонуклеотида с высокой аффинностью, (Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039). Кроме того, были получены 2ʼ-амино- и 2ʼ-метиламино-BNA, и ранее сообщалось о термостабильности дуплексов с комплементарными цепями РНК и ДНК.

[0277]

В некоторых вариантах осуществления изобретения нуклеозид, имеющий бициклический сахар имеет следующую формулу:

,

где Bx представляет собой фрагмент гетероциклического основания; T_a и T_b, каждый, независимо, представляют собой атом водорода, защитную группу для гидроксильной группы, фосфатную группу, которая может быть замещена, фосфорный фрагмент, ковалентно присоединенный к основе, или тому подобное; q_i, q_j, q_k и q_l, каждый, независимо, представляют собой H, галоген, C₁-C₁₂ алкил, замещенный C₁-C₁₂ алкил, C₂-C₁₂ алкенил, замещенный C₂-C₁₂ алкенил, C₂-C₁₂ алкинил, замещенный C₂-C₁₂ алкинил, C₁-C₁₂ алкоксил, замещенный C₁-C₁₂ алкоксил, OJ_j, SJ_j, SOJ_j, SO₂J_j, NJ_jJ_k, N₃, CN, C(=O)OJ_j, C(=O)NJ_jJ_k, C(=O)J_j, O-C(=O)NJ_jJ_k, N(H)C(=NH)NJ_jJ_k, N(H)C(=O)NJ_jJ_k или N(H)C(=S)NJ_jJ_k; и оба q_i и q_j или q_l и q_k представляют собой =C(q_g)(q_h), где q_g и q_h, каждый, независимо, представляют собой H, галоген, C₁-C₁₂ алкил или замещенный C₁-C₁₂ алкил.

[0278]

Описан один карбоциклический бициклический нуклеозид, имеющий мостик 4ʼ-(CH₂)₃-2ʼ и мостик алкенильного аналога 4ʼ-CH=CH-CH₂-2ʼ (Frier et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25 (22), 4429-4443, и Albaek et al., J. Org. Chem., 2006, 71, 7731-7740). Также описаны синтез и получение карбоциклических бициклических нуклеозидов, а также их олигомеризация и биохимические исследования (Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc. 2007, 129 (26), 8362-8379).

[0279]

В некоторых вариантах осуществления изобретения примеры нуклеозидов, содержащих бициклический сахар, включают, но этим не ограничиваются,

(A) α-L-метиленокси (4ʼ-CH₂-O-2ʼ) BNA,

(B) β-D-метиленокси (4ʼ-CH₂-O-2ʼ) BNA,

(C) этиленокси (4ʼ-(CH₂)₂-O-2ʼ) BNA,

(D) аминоокси (4ʼ-CH₂-O-N(R)-2ʼ) BNA,

(E) оксиамино (4ʼ-CH₂-N(R)-O-2ʼ) BNA,

(F) метил (метиленокси) (4ʼ-CH(CH₃)-O-2ʼ) BNA (также называемый этил-ограниченным или cEt),

(G) метилен-тио (4ʼ-CH₂-S-2ʼ) BNA,

(H) метилен-амино (4ʼ-CH₂-N(R)-2ʼ) BNA,

(I) метилкарбоциклический (4ʼ-CH₂-CH(CH₃)-2ʼ) BNA,

(J) пропиленкарбоциклический (4ʼ-(CH₂)₃-2ʼ) BNA и

(K) винил BNA, как показано ниже:

[0280]

,

где Bx является основной составляющей; и R, независимо, представляет собой защитную группу, C₁-C₆ алкил или C₁-C₆ алкокси.

[0281]

В некоторых вариантах осуществления (LNA) нуклеозид, имеющий бициклический сахар, представляет собой нуклеозид, представленный следующей общей формулой:

,

[где B представляет собой нуклеиновое основание; и X и Y, каждый, независимо, представляют собой атом водорода, защитную группу для гидроксильной группы, фосфатную группу, которая может быть замещена, фосфорную составляющую, или ковалентное присоединение к основе или тому подобное] (см. WO 98/39352). Их типичные конкретные примеры включают нуклеотиды, представленные следующей формулой:

.

[0282]

В некоторых вариантах осуществления (GuNA) нуклеозид, имеющий бицикл, представляет собой нуклеозид, представленный следующей общей формулой:

,

[где B представляет собой нуклеиновое основание; R₃, R₄, R₅ и R₆, каждый, независимо, представляют собой атом водорода или C_1-6 алкильную группу, которая может быть замещена одним или несколькими заместителями; R₇ и R₈, каждый, независимо, представляют собой атом водорода, защитную группу для гидроксильной группы, фосфатную группу, которая может быть замещена, фосфорный фрагмент, ковалентно присоединенный к основе, или тому подобное; и R₉, R₁₀ и R₁₁, каждый, независимо, представляют собой атом водорода, C_1-6 алкильную группу, которая может быть замещена одним или несколькими заместителями, или защитную группу для аминогруппы] (см., например, WO 2014/046212, и WO 2017/047816).

[0283]

В некоторых вариантах осуществления (ALNA [mU]) нуклеозид, содержащий бициклический сахар, представляет собой нуклеозид, представленный следующей общей формулой (I):

,

[где B представляет собой нуклеиновое основание; R₁, R₂, R₃ и R₄, каждый, независимо, представляют собой атом водорода или C_1-6 алкильную группу, которая может быть замещена одним или несколькими заместителями; R₅ и R₆, каждый, независимо, представляют собой атом водорода, защитную группу для гидроксильной группы или фосфатную группу, которая может быть замещена, фосфорный фрагмент, ковалентно присоединенный к основе, или тому подобное; m обозначает 1 или 2; и X представляет собой группу, представленную следующей формулой (II-1):

;

символ:

,

описанный в формуле (II-1), представляет собой точку присоединения к 2ʼ-аминогруппе; один из R₇ и R₈ представляет собой атом водорода, и другой представляет собой метильную группу, которая может быть замещена одним или несколькими заместителями] (см., например, заявка на патент Японии № 2018-212424). Типичным конкретным примером является нуклеозид, в котором один из R₇ и R₈ представляет собой атом водорода и другой представляет собой незамещенную метильную группу.

[0284]

В некоторых вариантах осуществления (ALNA [ipU]) нуклеозид, имеющий бициклический сахар, представляет собой нуклеозид, имеющий общую формулу (I), определенную выше ALNA [mU], и в формуле X представляет собой группу, представленную следующей формулой (II-1):

,

где один из R₇ и R₈ представляет собой атом водорода и другой представляет собой изопропильную группу, которая может быть замещена одним или несколькими заместителями (см., например, заявка на патент Японии № 2018-212424). Типичным конкретным примером является нуклеозид, в котором один из R₇ и R₈ представляет собой атом водорода и другой представляет собой незамещенную изопропильную группу.

[0285]

В некоторых вариантах осуществления (ALNA [Trz]) нуклеозид, имеющий бицикл, представляет собой нуклеозид, имеющий вышеуказанную общую формулу (I), и в формуле X представляет собой группу, представленную следующей формулой (II-2):

,

где A представляет собой триазолильную группу, которая может быть замещена одним или несколькими заместителями (см., например, заявка на патент Японии № 2018-212424). Типичный пример ALNA [Trz] представляет собой нуклеозид, в котором A представляет собой триазолильную группу, которая может иметь одну или несколько метильных групп, более конкретно, 1,5-диметил-1,2,4-триазол-3-ильную группу.

[0286]

В некоторых вариантах осуществления (ALNA [Oxz]) представляет собой нуклеозид, имеющий общую формулу (I), определенную выше ALNA [mU], и в формуле X представляет собой группу, представленную следующей формулой (II-2):

,

где A представляет собой оксадиазолильную группу, которая может быть замещена одним или несколькими заместителями (см., например, заявка на патент Японии № 2018-212424). Типичным конкретным примером является нуклеозид или нуклеотид, в котором A представляет собой оксадиазолильную группу, которая может иметь одну или несколько метильных групп, более конкретно, 5-метил-1,2,4-оксадиазол-3-ильную группу.

[0287]

В некоторых вариантах осуществления (ALNA [Ms]) нуклеозид, имеющий бицикл, представляет собой нуклеозид, имеющий вышеуказанную общую формулу (I), и в формуле X представляет собой группу, представленную следующей формулой (II-3):

,

где M представляет собой сульфонильную группу, замещенную метильной группой, которая может быть замещена одним или несколькими заместителями (см., например, заявка на патент Японии № 2018-212424). Типичный конкретный пример ALNA [Ms] представляет собой нуклеозид, в котором M представляет собой сульфонильную группу, замещенную незамещенной метильной группой.

[0288]

В некоторых вариантах осуществления изобретения нуклеозид модифицируют заменой рибозильного кольца заменителем сахара. Примеры таких модификаций включают, но этим не ограничиваются, замены рибозильного кольца на замещающую кольцевую систему (иногда называемую аналогом ДНК), например, морфолиновое кольцо, циклогексенильное кольцо, циклогексильное кольцо или тетрагидропиранильное кольцо, и, например, имеющую одну из следующих формул:

,

[0289]

В некоторых вариантах осуществления изобретения выбран заменитель сахара, имеющий следующую формулу:

,

где Bx представляет собой фрагмент гетероциклического основания; T₃ и T₄, каждый, независимо, представляют собой межнуклеозидную связывающую группу, соединяющую аналог тетрагидропиранового нуклеозида с олигомерным соединением; или один из T₃ и T₄ представляет собой межнуклеозидную связывающую группу, соединяющую аналог тетрагидропиранового нуклеозида с олигомерным соединением или олигонуклеотидом, а другой из T₃ и T₄ представляет собой Н, гидроксильную защитную группу, связывающую группу конъюгата или 5ʼ- или 3ʼ-концевую группу; q₁, q₂, q₃, q₄, q₅, q₆ и q₇, каждый, независимо, представляют собой H, C₁-C₆ алкил, замещенный C₁-C₆ алкил, C₂-C₆ алкенил, замещенный C₂-C₆ алкенил, C₂-C₆ алкинил или замещенный C₂-C₆ алкинил; и один из R₁ и R₂ представляет собой водород, а другой выбран из галогена, замещенного или незамещенного алкокси, NJ₁J₂, SJ₁, N₃, OC(=X)J₁, OC(=X)NJ₁J₂, NJ₃C(=X)NJ₁J₂ и CN (где X представляет собой O, S или NJ₁; и J₁, J₂ и J₃, каждый, независимо, представляют собой H или C₁-C₆ алкил).

[0290]

В некоторых вариантах осуществления изобретения q₁, q₂, q₃, q₄, q₅, q₆ и q₇, каждый, представляют собой H. В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере один из q₁, q₂, q₃, q₄, q₅, q₆ и q₇ отличается от H. В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере один из q₁, q₂, q₃, q₄, q₅, q₆ и q₇ представляет собой метил. В некоторых вариантах осуществления изобретения представлен нуклеозид THP, в котором один из R₁ и R₂ представляет собой F. В некоторых вариантах осуществления изобретения R₁ представляет собой фтор и R₂ представляет собой H; R₁ представляет собой метокси и R₂ представляет собой H; и R₁ представляет собой метоксиэтокси и R₂ представляет собой H.

[0291]

Примеры таких заменителей сахара включают, но этим не ограничиваются, такие, которые известны в данной области как гекситол-нуклеиновая кислота (HNA), альтит-нуклеиновая кислота (ANA) и маннитол-нуклеиновая кислота (MNA) (см. Leumann, C. J., Bioorg. & Med. Chem., 2002, 10, 841-854).

[0292]

В некоторых вариантах осуществления изобретения заменитель сахара включает кольцо, содержащее более 5 атомов и более одного гетероатома. Например, сообщалось о нуклеозиде, содержащем морфолиносахарный фрагмент, и об его использовании в олигомерном соединении (см., например, Braasch et al., Biochemistry, 2002, 41, 4503-4510; и патенты США №№ 5698685, 5166315, 5185444 и 5034506).

[0293]

Как используется в настоящем документе, термин «морфолино» означает заменитель сахара, имеющий следующую структуру:

.

[0294]

В некоторых вариантах осуществления изобретения морфолино можно модифицировать, например, путем добавления или изменения различных заместителей в указанной выше структуре морфолино. Такой заменитель сахара упоминается здесь как «модифицированный морфолино».

[0295]

В некоторых вариантах осуществления изобретения олигонуклеотид включает один или несколько модифицированных циклогексенильных нуклеозидов, которые представляют собой нуклеозиды, содержащие 6-членный циклогексенил вместо пентофуранозильного остатка природного нуклеозида. Примеры модифицированных циклогексенильных нуклеозидов включают, но этим не ограничиваются, нуклеозиды, описанные в данной области (см., например, в соответствии с опубликованными документами WO 2010/036696, опубликован 10 апреля 2010, Robeyns et al., J. Am. Chem. Soc., 2008, 130 (6), 1979-1984; Horvath et al., Tetrahedron Letters, 2007, 48, 3621-3623; Nauwelaerts et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129 (30), 9340-9348; Gu et al., Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 2005, 24 (5-7), 993-998; Nauwelaerts et al., Nucleic Acids Research, 2005, 33 (8), 2452-2463; Robeyns et al., Acta Crystallographica, Section F: Structural Biology and Crystallization Communications, 2005, F61 (6), 585-586; Gu et al., Tetrahedron, 2004, 60 (9), 2111-2123; Gu et al., Oligonucleotides, 2003, 13 (6), 479-489; Wang et al., J. Org. Chem., 2003, 68, 4499-4505; Verbeure et al., Nucleic Acids Research, 2001, 29 (24), 4941-4947; Wang et al., J. Org. Chem., 2001, 66, 8478-82; Wang et al., Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 2001, 20 (4-7), 785-788; Wang et al., J. Am. Chem., 2000, 122, 8595-8602; WO 06/047842 и WO 01/049687; содержание каждого из них полностью включено в настоящий документ посредством ссылки).

[0296]

Некоторые модифицированные циклогексенильные нуклеозиды имеют следующую формулу:

,

где

Bx представляет собой фрагмент гетероциклического основания; T₃ и T₄, каждый, независимо, представляют собой межнуклеозидную связывающую группу, соединяющую аналог циклогексенильного нуклеозида с олигонуклеотидным соединением; или один из T₃ и T₄ представляет собой межнуклеозидную связывающую группу, соединяющую аналог тетрагидропиранового нуклеозида с олигонуклеотидным соединением, а другой из T₃ и T₄ представляет собой H, гидроксильную защитную группу, группу связывающего конъюгата или 5ʼ- или 3ʼ-концевую группу; и q₁, q₂, q₃, q₄, q₅, q₆, q₇, q₈ и q₉, каждый, независимо, представляют собой H, C₁-C₆ алкил, замещенный C₁-C₆ алкил, C₂-C₆ алкенил, замещенный C₂-C₆ алкенил, C₂-C₆ алкинил, замещенный C₂-C₆ алкинил или другой сахарный заместитель.

[0297]

В данной области известны многие другие бициклические и трициклические кольцевые системы заменителей сахара, которые можно использовать для модификации нуклеозида для включения в олигонуклеотид (см., например, обзор: Leumann, Christian J., Bioorg. & Med. Chem., 2002, 10, 841-854). Такие кольцевые системы могут подвергаться различным дополнительным заменам для повышения активности.

[0298]

Способ получения модифицированного сахара хорошо известен специалисту в данной области. Некоторые репрезентативные патенты США, которые описывают получение таких модифицированных сахаров, включают, но этим не ограничиваются: патенты США №№ 4981957, 5118800, 5319080, 5359044, 5393878, 5446137, 5466786, 5514785, 5519134, 5567811, 5576427, 5591722, 5597909, 5610300, 5627053, 5639873, 5646265, 5670633, 5700920, 5792847 и 6600032, а также WO 2005/121371, и каждый из них полностью включен в настоящий документ посредством ссылки.

[0299]

В нуклеотиде, содержащем модифицированный сахарный фрагмент, фрагмент нуклеинового основания (природный, модифицированный или их комбинация) сохраняется во время гибридизации с подходящей нуклеиновой кислотой-мишенью.

[0300]

Модифицированные нуклеиновые основания

Модификация или замещение нуклеинового основания (или основания) структурно отличается от природного или синтетического немодифицированного нуклеинового основания и, кроме того, функционально взаимозаменяема с таким немодифицированным нуклеиновым основанием. Как природные, так и модифицированные нуклеиновые основания способны участвовать в образовании водородных связей. Такая модификация нуклеиновых оснований может придавать модифицированному олигонуклеотиду стабильность нуклеаз, сродство связывания или некоторые другие полезные биологические свойства. Модифицированные нуклеиновые основания включают синтетические и природные нуклеиновые основания, такие как, например, 5-метилцитозин (5-me-C). Некоторые замещения нуклеиновых оснований, включая замещение 5-метилцитозином, особенно полезны для увеличения аффинности связывания модифицированного олигонуклеотида по отношению к нуклеиновой кислоте-мишени. Например, замещение 5-метилцитозином увеличивает стабильность дуплекса нуклеиновой кислоты на 0,6-1,2ºC (Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. and Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278).

[0301]

Дополнительные модифицированные нуклеиновые основания включают 5-гидроксиметилцитозин, ксантин, гипоксантин, 2-аминоаденин, 6-метил и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-пропил и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-тиоурацил, 2-тиотимин и 2-тиоцитозин, 5-галогенурацил и цитозин, 5-пропинил (-C≡C-CH₃) урацил и цитозин и другие алкинильные производные пиримидиновых оснований, 6-азоурацил, цитозин и тимин, 5-урацил (псевдоурацил), 4-тиоурацил, 8-галоген, 8-амино, 8-тиол, 8-тиоалкил, 8-гидроксил и другие 8-замещенные аденины и гуанины, 5-галоген, в частности, 5-бром, 5-трифторметил и другие 5-замещенные урацилы и цитозины, 7-метилгуанин и 7-метиладенин, 2-F-аденин, 2-аминоаденин, 8-азагуанин и 8-азааденин, 7-деазагуанин и 7-деазааденин, 3-деазагуанин и 3-деазааденин.

[0302]

Фрагменты гетероциклических оснований могут также включать такие, в которых пуриновое или пиримидиновое основание заменено на другие гетероциклы, например, 7-деазааденин, 7-дезазагуанозин, 2-аминопиридин и 2-пиридон. Нуклеиновые основания, которые особенно полезны для увеличения аффинности связывания модифицированного олигонуклеотида, включают 5-замещенные пиримидины, 6-азапиримидины и N-2, N-6 и O-6 замещенные пурины (включая 2 аминопропиладенин, 5-пропинилурацил и 5-пропинилцитозин).

[0303]

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид, нацеленный на нуклеиновую кислоту DUX4, включает одно или несколько модифицированных нуклеиновых оснований. В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид, нацеленный на нуклеиновую кислоту DUX4, включает одно или несколько модифицированных нуклеиновых оснований. В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированное нуклеиновое основание представляет собой 5-метилцитозин. В некоторых вариантах осуществления изобретения каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин.

[0304]

Некоторые мотивы модифицированных олигонуклеотидов

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид, нацеленный на нуклеиновую кислоту DUX4, имеет химически модифицированную субъединицу, расположенную в виде узора или мотива, чтобы придать модифицированному олигонуклеотиду такие свойства, как повышенная ингибирующая активность, повышенное сродство связывания с целевой нуклеиновой кислотой или устойчивость к деградации нуклеазой in vivo.

[0305]

Химерный модифицированный олигонуклеотид обычно содержит по меньшей мере одну модифицированную область для обеспечения повышенной устойчивости к деградации нуклеазой, повышенного клеточного поглощения, повышенной аффинности связывания с целевой нуклеиновой кислотой и/или повышенной ингибирующей активности. Вторая область химерного модифицированного олигонуклеотида может необязательно служить субстратом для внутриклеточной эндонуклеазы РНКазы Н, которая расщепляет РНК цепь дуплекса РНК:ДНК.

[0306]

Модифицированный олигонуклеотид, имеющий гэпмерный мотив, представляет собой химерный модифицированный олигонуклеотид. В гэпмере внутренняя область, имеющая несколько нуклеотидов, которая поддерживает расщепление РНКазой H, расположена между внешними областями, имеющими несколько нуклеотидов, которые химически отличаются от нуклеозидов внутренней области. В случае модифицированного олигонуклеотида, имеющего гэпмерный мотив, гэп-сегмент обычно служит субстратом для расщепления эндонуклеазой, в то время как сегмент крыла включает модифицированный нуклеозид. В некоторых вариантах осуществления изобретения гэпмерные области различаются по типам сахарных фрагментов, которые соответственно содержат разные области. В некоторых вариантах осуществления изобретения типы сахарных фрагментов, которые используются для дифференциации гэпмерных областей, могут включать: β-D-рибонуклеозиды, β-D-дезоксирибонуклеозиды, 2ʼ-модифицированные нуклеозиды (такие 2ʼ-модифицированные нуклеозиды среди прочего могут включать 2ʼ-MOE и 2ʼ-O-CH₃s) и бициклические сахар-модифицированные нуклеозиды (такие бициклические сахар-модифицированные нуклеозиды могут включать нуклеозиды, содержащие LNA, GuNA, ALNA [Ms], ALNA [mU], ALNA [ipU], ALNA [Trz] и/или ALNA [Oxz]). Мотив крыло-гэп-крыло часто описывается как «X-Y-Z», где «X» обозначает длину 5ʼ-крыла, «Y» обозначает длину области гэпа, а «Z» обозначает длину области 3ʼ-крыла. Как используется в настоящем документе, гэпмер, описываемый как «X-Y-Z», имеет такую стерическую конфигурацию, что гэп-сегмент расположен непосредственно прилегающим к каждому сегменту 5ʼ-крыла и сегменту 3ʼ-крыла. Таким образом, не существует промежуточных нуклеотидов между сегментом 5ʼ-крыла и гэп-сегментом или между гэп-сегментом и сегментом 3ʼ-крыла. Модифицированные олигонуклеотиды, описанные в настоящем документе, могут иметь гэпмерный мотив. В некоторых вариантах осуществления изобретения X и Z одинаковы, а в других вариантах осуществления они различны. В предпочтительном варианте Y составляет от 8 до 16 нуклеотидов. X, Y или Z могут быть любыми, состоящими из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 или более нуклеотидов. Следовательно, гэпмеры включают, но этим не ограничиваются, например, 2-10-3, 2-14-2, 2-15-2, 2-16-2, 3-6-7, 3-7-5, 3-8-3, 3-8-4, 3-8-5, 3-9-2, 3-9-3, 3-9-4, 3-9-5, 3-9-8, 3-10-2, 3-10-3, 3-10-4, 3-11-3, 3-12-3, 3-14-3, 4-7-4, 4-7-5, 4-8-3, 4-8-4, 4-9-3, 4-10-3, 5-6-4, 5-6-5, 5-7-3, 5-7-4, 5-8-3, 5-8-4 или 7-6-3.

[0307]

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид, нацеленный на нуклеиновую кислоту DUX4, имеет гэпмерный мотив 3-10-3. В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид, нацеленный на нуклеиновую кислоту DUX4, имеет гэпмерный мотив 3-9-3. В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид, нацеленный на нуклеиновую кислоту DUX4, имеет гэпмерный мотив 3-9-4. В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид, нацеленный на нуклеиновую кислоту DUX4, имеет гэпмерный мотив 3-8-5.

[0308]

В некоторых вариантах осуществления изобретения эти гэпмер-модифицированные олигонуклеотиды включают по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 21, по меньшей мере 22, по меньшей мере 23, по меньшей мере 24, по меньшей мере 25, по меньшей мере 26, по меньшей мере 27, по меньшей мере 28, по меньшей мере 29 или по меньшей мере 30 непосредственно примыкающих друг к другу нуклеотидов в последовательности нуклеиновых оснований любого из приведенных в примерах модифицированных олигонуклеотидов, описанных в настоящем документе (например, по меньшей мере 8 непосредственно примыкающих друг к другу нуклеотидов в последовательности нуклеиновых оснований, описанных в любой из SEQ ID NO: 2,3,4, 7-64, 69-97 или 102-109 в списке последовательностей).

[0309]

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к олигомерному соединению, содержащему олигонуклеотид. В некоторых вариантах осуществления изобретения такой олигонуклеотид включает одну или несколько химических модификаций. В некоторых вариантах осуществления изобретения химически модифицированный олигонуклеотид включает один или несколько модифицированных сахаров. В некоторых вариантах осуществления изобретения химически модифицированный олигонуклеотид включает одно или несколько модифицированных нуклеиновых оснований. В некоторых вариантах осуществления изобретения химически модифицированный олигонуклеотид включает одну или несколько модифицированных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах осуществления изобретения химические модификации (модификация сахара, модификация нуклеиновых оснований и/или модификация связывания) определяют профили или мотивы. В некоторых вариантах осуществления изобретения профили химических модификаций сахарных фрагментов, межнуклеозидных связей и нуклеиновых оснований независимы друг от друга. Таким образом, олигонуклеотид может быть описан его мотивом модификации сахара, мотивом межнуклеозидной связи и/или мотивом модификации нуклеиновых оснований (как используется в настоящем документе, мотив модификации нуклеиновых оснований описывает химическую модификацию относительно нуклеиновых оснований независимо от последовательности нуклеиновых оснований).

[0310]

Некоторые мотивы сахаров

В некоторых вариантах осуществления изобретения олигонуклеотид включает один или более типов модифицированных сахарных фрагментов и/или природных сахарных фрагментов, расположенных вдоль олигонуклеотида или его области в определенном порядке или мотиве модификации сахара. Такие мотивы могут включать любую из обсуждаемых здесь модификаций сахара и/или другие известные модификации сахара.

[0311]

В некоторых вариантах осуществления изобретения олигонуклеотид включает или состоит из области, содержащей мотив модификации гэпмер-сахара, который включает две внешние области, то есть «сегменты крыла», и одну внутреннюю область, то есть «гэп-сегмент». Три области гэпмерного мотива (сегмент 5ʼ-крыла, гэп-сегмент и сегмент 3ʼ-крыла) образуют непрерывную последовательность нуклеозидов, в которой по меньшей мере некоторые из сахарных фрагментов нуклеозидов каждого из сегментов крыльев отличаются по меньшей мере от некоторых из сахарных фрагментов нуклеозидов гэп-сегмента. В частности, по меньшей мере сахарные фрагменты нуклеозидов сегментов крыла, которые находятся ближе всего к гэп-сегменту (3ʼ-самый крайний нуклеозид сегмента 5ʼ-крыла и 5ʼ-самый крайний нуклеозид сегмента 3ʼ-крыла) отличаются от сахарных фрагментов соседних нуклеозидов гэп-сегмента, и, таким образом, определяются граничные стороны между сегментами крыла и гэп-сегментом. В некоторых вариантах осуществления изобретения сахарные компоненты в гэп-сегменте идентичны друг другу. В некоторых вариантах осуществления изобретения гэп-сегмент включает один или несколько нуклеозидов, содержащих сахарный фрагмент, который отличается от сахарного фрагмента одного или нескольких других нуклеозидов гэп-сегмента. В некоторых вариантах осуществления изобретения мотивы модификации сахара двух сегментов крыла идентичны друг другу (симметричный гэпмер). В некоторых вариантах осуществления изобретения мотив модификации сахара сегмента 5ʼ-крыла отличается от мотива модификации сахара сегмента 3ʼ-крыла (асимметричный гэпмер).

[0312]

Некоторые сегменты 5ʼ-крыла

В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера состоит из от 1 до 5 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера состоит из от 2 до 5 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера состоит из от 3 до5 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера состоит из 4 или 5 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера состоит из от 1 до 4 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера состоит из от 1 до 3 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера состоит из 1 или 2 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера состоит из от 2 до 4 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера состоит из 2 или 3 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера состоит из 3 или 4 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера состоит из 1 нуклеозида. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера состоит из 2 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера состоит из 3 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера состоит из 4 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера состоит из 5 связанных нуклеозидов.

[0313]

В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера включает по меньшей мере 1 бициклический нуклеозид. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера включает по меньшей мере 2 бициклических нуклеозида. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера включает по меньшей мере 3 бициклических нуклеозида. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера включает по меньшей мере 4 бициклических нуклеозида. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера включает по меньшей мере 1 конформационно затрудненный этилом нуклеозид. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера включает по меньшей мере один LNA-содержащий нуклеозид, GuNA-содержащий нуклеозид, ALNA [Ms]-содержащий нуклеозид, ALNA [mU]-содержащий нуклеозид, ALNA [ipU]-содержащий нуклеозид, ALNA [Trz]-содержащий нуклеозид и/или ALNA [Oxz]-содержащий нуклеозид. В некоторых вариантах осуществления изобретения каждый нуклеозид сегмента 5ʼ-крыла гэпмера представляет собой бициклический нуклеозид. В некоторых вариантах осуществления изобретения каждый нуклеозид сегмента 5ʼ-крыла гэпмера представляет собой конформационно затрудненный этилом нуклеозид. В некоторых вариантах осуществления изобретения каждый нуклеозид сегмента 5ʼ-крыла гэпмера представляет собой LNA-содержащий нуклеозид, GuNA-содержащий нуклеозид, ALNA [Ms]-содержащий нуклеозид, ALNA [mU]-содержащий нуклеозид, ALNA [ipU]-содержащий нуклеозид, ALNA [Trz]-содержащий нуклеозид и/или ALNA [Oxz]-содержащий нуклеозид.

[0314]

В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера включает по меньшей мере один небициклический модифицированный нуклеозид. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера включает по меньшей мере один 2ʼ-замещенный нуклеозид. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера включает по меньшей мере один, например, три, четыре, или пять 2ʼ-MOE нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера включает по меньшей мере один 2ʼ-OMe нуклеозид. В некоторых вариантах осуществления изобретения каждый нуклеозид сегмента 5ʼ-крыла гэпмера представляет собой небициклический модифицированный нуклеозид. В некоторых вариантах осуществления изобретения каждый нуклеозид сегмента 5ʼ-крыла гэпмера представляет собой 2ʼ-замещенный нуклеозид. В некоторых вариантах осуществления изобретения каждый нуклеозид сегмента 5ʼ-крыла гэпмера представляет собой 2ʼ-MOE нуклеозид. В некоторых вариантах осуществления изобретения каждый нуклеозид сегмента 5ʼ-крыла гэпмера представляет собой 2ʼ-OMe нуклеозид.

[0315]

В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера включает по меньшей мере один бициклический нуклеозид и по меньшей мере один небициклический модифицированный нуклеозид. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера включает по меньшей мере один бициклический нуклеозид и по меньшей мере один 2ʼ-замещенный нуклеозид. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера включает по меньшей мере один бициклический нуклеозид и по меньшей мере один 2ʼ-MOE нуклеозид. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера включает по меньшей мере один бициклический нуклеозид и по меньшей мере один 2ʼ-OMe нуклеозид. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера включает по меньшей мере один бициклический нуклеозид и по меньшей мере один 2ʼ-дезоксинуклеозид.

[0316]

В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера включает по меньшей мере один конформационно затрудненный этилом нуклеозид и по меньшей мере один небициклический модифицированный нуклеозид. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера включает по меньшей мере один конформационно затрудненный этилом нуклеозид и по меньшей мере один 2ʼ-замещенный нуклеозид. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера включает по меньшей мере один конформационно затрудненный этилом нуклеозид и по меньшей мере один 2ʼ-MOE нуклеозид. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера включает по меньшей мере один конформационно затрудненный этилом нуклеозид и по меньшей мере один 2ʼ-OMe нуклеозид. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера включает по меньшей мере один конформационно затрудненный этилом нуклеозид и по меньшей мере один 2ʼ-дезоксинуклеозид.

[0317]

В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера включает по меньшей мере один модифицированный нуклеозид, выбранный из 2ʼ-MOE нуклеозида, 2ʼ-OMe нуклеозида, LNA-содержащего нуклеозида, GuNA-содержащего нуклеозида, ALNA [Ms]-содержащего нуклеозида, ALNA [mU]-содержащего нуклеозида, ALNA [ipU]-содержащего нуклеозида, ALNA [Trz]-содержащего нуклеозида и/или ALNA [Oxz]-содержащего нуклеозида. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера включает по меньшей мере 2 модифицированных нуклеозида, выбранных из 2ʼ-MOE нуклеозида, 2ʼ-OMe нуклеозида, LNA-содержащего нуклеозида, GuNA-содержащего нуклеозида, ALNA [Ms]-содержащего нуклеозида, ALNA [mU]-содержащего нуклеозида, ALNA [ipU]-содержащего нуклеозида, ALNA [Trz]-содержащего нуклеозида и/или ALNA [Oxz]-содержащего нуклеозида. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера включает по меньшей мере 3 модифицированных нуклеозида, выбранных из 2ʼ-MOE нуклеозида, 2ʼ-OMe нуклеозида, LNA-содержащего нуклеозида, GuNA-содержащего нуклеозида, ALNA [Ms]-содержащего нуклеозида, ALNA [mU]-содержащего нуклеозида, ALNA [ipU]-содержащего нуклеозида, ALNA [Trz]-содержащего нуклеозида и/или ALNA [Oxz]-содержащего нуклеозида. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера включает по меньшей мере 4 модифицированных нуклеозида, выбранных из 2ʼ-MOE нуклеозида, 2ʼ-OMe нуклеозида, LNA-содержащего нуклеозида, GuNA-содержащего нуклеозида, ALNA [Ms]-содержащего нуклеозида, ALNA [mU]-содержащего нуклеозида, ALNA [ipU]-содержащего нуклеозида, ALNA [Trz]-содержащего нуклеозида и/или ALNA [Oxz]-содержащего нуклеозида. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера включает по меньшей мере 5 модифицированных нуклеозида, выбранных из 2ʼ-MOE нуклеозида, 2ʼ-OMe нуклеозида, LNA-содержащего нуклеозида, GuNA-содержащего нуклеозида, ALNA [Ms]-содержащего нуклеозида, ALNA [mU]-содержащего нуклеозида, ALNA [ipU]-содержащего нуклеозида, ALNA [Trz]-содержащего нуклеозида и/или ALNA [Oxz]-содержащего нуклеозида.

[0318]

В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера включает два LNA-содержащих нуклеозида. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера включает три LNA-содержащих нуклеозида. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера включает четыре LNA-содержащих нуклеозида. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера включает три ALNA [Ms]-содержащих нуклеозида. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера включает два GuNA-содержащих нуклеозида. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера включает три GuNA-содержащих нуклеозида. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера включает 3 ALNA [mU]-содержащих нуклеозида. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера включает три ALNA [ipU]-содержащих нуклеозида. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера включает два LNA-содержащих нуклеозида и один GuNA-содержащий нуклеозид. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера включает три ALNA [Trz]-содержащих нуклеозида. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера включает три ALNA [Ms]-содержащих нуклеозида и один 2ʼ-OMe нуклеозид. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера включает три ALNA [Ms]-содержащих нуклеозида и два 2ʼ-OMe нуклеозидов.

[0319]

В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера включает три конформационно затрудненных этилом нуклеозида. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера включает два бициклических нуклеозида и два небициклических модифицированных нуклеозида. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера включает два конформационно затрудненных этилом нуклеозида и два 2ʼ-OMe нуклеозида. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера включает два бициклических нуклеозида и два небициклических модифицированных нуклеозида. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера включает два конформационно затрудненных этилом нуклеозида и два 2ʼ-OMe нуклеозида. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера включает два конформационно затрудненных этилом нуклеозида и три 2ʼ-OMe нуклеозида.

[0320]

В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера состоит из одного ALNA [Ms]-содержащего нуклеозида. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера состоит из двух связанных ALNA [Ms]-содержащих нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера состоит из трех связанных ALNA [Ms]-содержащих нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера состоит из четырех связанных ALNA [Ms]-содержащих нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера состоит из пяти связанных ALNA [Ms]-содержащих нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера состоит из связанных одного, двух или трех ALNA [Ms]-содержащих нуклеозидов и одного 2ʼ-OMe нуклеозида. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера состоит из связанных одного, двух или трех ALNA [Ms]-содержащих нуклеозидов и двух 2ʼ-OMe нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера состоит из связанных одного, двух или трех ALNA [Ms]-содержащих нуклеозидов и трех 2ʼ-OMe нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера состоит из связанных трех ALNA [Ms]-содержащих нуклеозидов и один 2ʼ-MOE нуклеозид. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера состоит из связанных двух ALNA [Ms]-содержащих нуклеозидов и двух 2ʼ-MOE нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера состоит из связанных трех LNA-содержащих нуклеозидов и двух 2ʼ-MOE нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера состоит из связанных двух LNA-содержащих нуклеозидов и двух 2ʼ-MOE нуклеозидов.

В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера состоит из связанных одного, двух или трех ALNA [Ms]-содержащих нуклеозидов и одного 5-метилцитозина. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера состоит из связанных одного, двух или трех ALNA [Ms]-содержащих нуклеозидов и двух 5-метилцитозинов. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера состоит из связанных одного, двух или трех ALNA [Ms]-содержащих нуклеозидов и трех 5-метилцитозинов.

[0321]

Некоторые сегменты 3ʼ-крыла

В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера состоит из от 1 до 8 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера состоит из от 2 до 5 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера состоит из от 3 до 5 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера состоит из 4 или 5 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера состоит из от 1 до 4 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера состоит из от 1 до 3 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера состоит из 1или 2 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера состоит из от 2 до 4 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера состоит из 2 или 3 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера состоит из 3 или 4 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера состоит из 1 нуклеозида. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера состоит из 2 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера состоит из 3 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера состоит из 4 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера состоит из 5 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера состоит из 6 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера состоит из 7 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера состоит из 8 связанных нуклеозидов.

[0322]

В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера включает по меньшей мере один бициклический нуклеозид. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера включает по меньшей мере два бициклических нуклеозида. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера включает по меньшей мере три бициклических нуклеозида. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера включает по меньшей мере четыре бициклических нуклеозида. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера включает по меньшей мере один конформационно затрудненный этилом нуклеозид. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера включает по меньшей мере один LNA-содержащий нуклеозид, GuNA-содержащий нуклеозид, ALNA [Ms]-содержащий нуклеозид, ALNA [mU]-содержащий нуклеозид, ALNA [ipU]-содержащий нуклеозид, ALNA [Trz]-содержащий нуклеозид и/или ALNA [Oxz]-содержащий нуклеозид. В некоторых вариантах осуществления изобретения каждый нуклеозид сегмента 3ʼ-крыла гэпмера представляет собой бициклический нуклеозид. В некоторых вариантах осуществления изобретения каждый нуклеозид сегмента 3ʼ-крыла гэпмера представляет собой конформационно затрудненный этилом нуклеозид. В некоторых вариантах осуществления изобретения каждый нуклеозид сегмента 3ʼ-крыла гэпмера представляет собой LNA-содержащий нуклеозид, GuNA-содержащий нуклеозид, ALNA [Ms]-содержащий нуклеозид, ALNA [mU]-содержащий нуклеозид, ALNA [ipU]-содержащий нуклеозид, ALNA [Trz]-содержащий нуклеозид и/или ALNA [Oxz]-содержащий нуклеозид.

[0323]

В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера включает по меньшей мере один небициклический модифицированный нуклеозид. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера включает по меньшей мере один 2ʼ-замещенный нуклеозид. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера включает по меньшей мере один 2ʼ-MOE нуклеозид. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера включает по меньшей мере один 2ʼ-OMe нуклеозид. В некоторых вариантах осуществления изобретения каждый нуклеозид сегмента 3ʼ-крыла гэпмера представляет собой небициклический модифицированный нуклеозид. В некоторых вариантах осуществления изобретения каждый нуклеозид сегмента 3ʼ-крыла гэпмера представляет собой 2ʼ-замещенный нуклеозид. В некоторых вариантах осуществления изобретения каждый нуклеозид сегмента 3ʼ-крыла гэпмера представляет собой 2ʼ-MOE нуклеозид. В некоторых вариантах осуществления изобретения каждый нуклеозид сегмента 3ʼ-крыла гэпмера представляет собой 2ʼ-OMe нуклеозид.

[0324]

В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера включает по меньшей мере один бициклический нуклеозид и по меньшей мере один небициклический модифицированный нуклеозид. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера включает по меньшей мере один бициклический нуклеозид и по меньшей мере один 2ʼ-замещенный нуклеозид. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера включает по меньшей мере один бициклический нуклеозид и по меньшей мере один 2ʼ-MOE нуклеозид. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера включает по меньшей мере один бициклический нуклеозид и по меньшей мере один 2ʼ-OMe нуклеозид. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера включает по меньшей мере один бициклический нуклеозид и по меньшей мере один 2ʼ-дезоксинуклеозид.

[0325]

В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера включает по меньшей мере один конформационно затрудненный этилом нуклеозид и по меньшей мере один небициклический модифицированный нуклеозид. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера включает по меньшей мере один конформационно затрудненный этилом нуклеозид и по меньшей мере один 2ʼ-замещенный нуклеозид. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера включает по меньшей мере один конформационно затрудненный этилом нуклеозид и по меньшей мере один 2ʼ-MOE нуклеозид. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера включает по меньшей мере один конформационно затрудненный этилом нуклеозид и по меньшей мере один 2ʼ-OMe нуклеозид. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера включает по меньшей мере один конформационно затрудненный этилом нуклеозид и по меньшей мере один 2ʼ-дезоксинуклеозид.

[0326]

В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера включает по меньшей мере один модифицированный нуклеозид, выбранный из 2ʼ-MOE нуклеозида, 2ʼ-OMe нуклеозида, LNA-содержащего нуклеозида, GuNA-содержащего нуклеозида, ALNA [Ms]-содержащего нуклеозида, ALNA [mU]-содержащего нуклеозида, ALNA [ipU]-содержащего нуклеозида, ALNA [Trz]-содержащего нуклеозида и/или ALNA [Oxz]-содержащего нуклеозида. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера включает по меньшей мере два модифицированных нуклеозида, выбранных из 2ʼ-MOE нуклеозида, 2ʼ-OMe нуклеозида, LNA-содержащего нуклеозида, GuNA-содержащего нуклеозида, ALNA [Ms]-содержащего нуклеозида, ALNA [mU]-содержащего нуклеозида, ALNA [ipU]-содержащего нуклеозида, ALNA [Trz]-содержащего нуклеозида и/или ALNA [Oxz]-содержащего нуклеозида. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера включает по меньшей мере три модифицированных нуклеозида, выбранных из 2ʼ-MOE нуклеозида, 2ʼ-OMe нуклеозида, LNA-содержащего нуклеозида, GuNA-содержащего нуклеозида, ALNA [Ms]-содержащего нуклеозида, ALNA [mU]-содержащего нуклеозида, ALNA [ipU]-содержащего нуклеозида, ALNA [Trz]-содержащего нуклеозида и/или ALNA [Oxz]-содержащего нуклеозида. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера включает по меньшей мере четыре модифицированных нуклеозида, выбранных из 2ʼ-MOE нуклеозида, 2ʼ-OMe нуклеозида, LNA-содержащего нуклеозида, GuNA-содержащего нуклеозида, ALNA [Ms]-содержащего нуклеозида, ALNA [mU]-содержащего нуклеозида, ALNA [ipU]-содержащего нуклеозида, ALNA [Trz]-содержащего нуклеозида и/или ALNA [Oxz]-содержащего нуклеозида. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера включает по меньшей мере пять модифицированных нуклеозидов, выбранных из 2ʼ-MOE нуклеозида, 2ʼ-OMe нуклеозида, LNA-содержащего нуклеозида, GuNA-содержащего нуклеозида, ALNA [Ms]-содержащего нуклеозида, ALNA [mU]-содержащего нуклеозида, ALNA [ipU]-содержащего нуклеозида, ALNA [Trz]-содержащего нуклеозида и/или ALNA [Oxz]-содержащего нуклеозида. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера включает по меньшей мере шесть модифицированных нуклеозидов, выбранных из 2ʼ-MOE нуклеозида, 2ʼ-OMe нуклеозида, LNA-содержащего нуклеозида, GuNA-содержащего нуклеозида, ALNA [Ms]-содержащего нуклеозида, ALNA [mU]-содержащего нуклеозида, ALNA [ipU]-содержащего нуклеозида, ALNA [Trz]-содержащего нуклеозида и/или ALNA [Oxz]-содержащего нуклеозида. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера включает по меньшей мере семь модифицированных нуклеозидов, выбранных из 2ʼ-MOE нуклеозида, 2ʼ-OMe нуклеозида, LNA-содержащего нуклеозида, GuNA-содержащего нуклеозида, ALNA [Ms]-содержащего нуклеозида, ALNA [mU]-содержащего нуклеозида, ALNA [ipU]-содержащего нуклеозида, ALNA [Trz]-содержащего нуклеозида и/или ALNA [Oxz]-содержащего нуклеозида. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера включает по меньшей мере восемь модифицированных нуклеозидов, выбранных из 2ʼ-MOE нуклеозида, 2ʼ-OMe нуклеозида, LNA-содержащего нуклеозида, GuNA-содержащего нуклеозида, ALNA [Ms]-содержащего нуклеозида, ALNA [mU]-содержащего нуклеозида, ALNA [ipU]-содержащего нуклеозида, ALNA [Trz]-содержащего нуклеозида и/или ALNA [Oxz]-содержащего нуклеозида.

[0327]

В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера включает два LNA-содержащих нуклеозида. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера включает три LNA-содержащих нуклеозида. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера включает четыре LNA-содержащих нуклеозида. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера включает три ALNA [Ms]-содержащих нуклеозида. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера включает два GuNA-содержащих нуклеозида. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера включает три GuNA-содержащих нуклеозида. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера включает три ALNA [mU]-содержащих нуклеозида. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера включает три ALNA [ipU]-содержащих нуклеозида. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера включает два LNA-содержащих нуклеозида и один GuNA-содержащий нуклеозид. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера включает три ALNA [Trz]-содержащих нуклеозида. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера включает три ALNA [Ms]-содержащих нуклеозида и один 2ʼ-OMe нуклеозид. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера включает три ALNA [Ms]-содержащих нуклеозида и два 2ʼ-OMe-содержащий нуклеозид. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера включает три 2ʼ-MOE нуклеозида. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера включает четыре 2ʼ-MOE нуклеозида. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера включает пять 2ʼ-MOE нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера включает три ALNA [Ms]-содержащих нуклеозида и один 2ʼ-MOE-содержащий нуклеозид. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера включает три ALNA [Ms]-содержащих нуклеозида и два 2ʼ-MOE нуклеозида. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера включает два ALNA [Ms]-содержащих нуклеозида и два 2ʼ-MOE нуклеозида. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера включает два ALNA [Ms]-содержащих нуклеозида и три 2ʼ-MOE нуклеозида. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера включает три ALNA [Ms]-содержащих нуклеозида и пять 2ʼ-MOE нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера включает один ALNA [Ms]-содержащий нуклеозид и три 2ʼ-MOE нуклеозида. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера включает два LNA-содержащих нуклеозида и два 2ʼ-MOE нуклеозида.

[0328]

В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера включает три конформационно затрудненных этилом нуклеозида. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера включает два бициклических нуклеозида и два небициклических модифицированных нуклеозида. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера включает два конформационно затрудненных этилом нуклеозида и два 2ʼ-OMe нуклеозида. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера включает два бициклических нуклеозида и два небициклических модифицированных нуклеозида. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера включает два конформационно затрудненных этилом нуклеозида и два 2ʼ-OMe нуклеозида. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера включает два конформационно затрудненных этилом нуклеозида и три 2ʼ-OMe нуклеозида.

[0329]

В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера состоит из одного ALNA [Ms]-содержащего нуклеозида. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера состоит из двух связанных ALNA [Ms]-содержащих нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера состоит из трех связанных ALNA [Ms]-содержащих нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера состоит из четырех связанных ALNA [Ms]-содержащих нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера состоит из пяти связанных ALNA [Ms]-содержащих нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера состоит из трех, четырех или пяти связанных 2ʼ-MOE нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера состоит из связанных одного, двух или трех ALNA [Ms]-содержащих нуклеозидов и одного 2ʼ-OMe нуклеозида. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера состоит из связанных одного, двух или трех ALNA [Ms]-содержащих нуклеозидов и двух 2ʼ-OMe нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера состоит из связанных одного, двух или трех ALNA [Ms]-содержащих нуклеозидов и трех 2ʼ-OMe нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера состоит из связанных одного, двух или трех ALNA [Ms]-содержащих нуклеозидов и одного 2ʼ-MOE нуклеозида. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера состоит из связанных одного, двух или трех ALNA [Ms]-содержащих нуклеозидов и двух 2ʼ-MOE нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера состоит из связанных одного, двух или трех ALNA [Ms]-содержащих нуклеозидов и трех 2ʼ-MOE нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера состоит из связанных одного, двух или трех ALNA [Ms]-содержащих нуклеозидов и пяти 2ʼ-MOE нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера состоит из связанных двух LNA-содержащих нуклеозидов и двух 2ʼ-MOE нуклеозидов.

В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера состоит из связанных одного, двух или трех ALNA [Ms]-содержащих нуклеозидов и одного 5-метилцитозина. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера состоит из связанных одного, двух или трех ALNA [Ms]-содержащих нуклеозидов и двух 5-метилцитозинов. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера состоит из связанных одного, двух или трех ALNA [Ms]-содержащих нуклеозидов и трех 5-метилцитозинов. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 3ʼ-крыла гэпмера состоит из связанных одного, двух, трех, четырех или пяти 2ʼ-MOE нуклеозидов и одного 5-метилцитозина.

[0330]

В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера состоит из одного ALNA [Ms]-содержащего нуклеозида и сегмент 3ʼ-крыла состоит из одного ALNA [Ms]-содержащего нуклеозида. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера состоит из двух связанных ALNA [Ms]-содержащих нуклеозидов и сегмент 3ʼ-крыла состоит из двух связанных ALNA [Ms]-содержащих нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера состоит из трех связанных ALNA [Ms]-содержащих нуклеозидов и сегмент 3ʼ-крыла состоит из трех связанных ALNA [Ms]-содержащих нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера состоит из четырех связанных ALNA [Ms]-содержащих нуклеозидов и сегмент 3ʼ-крыла состоит из четырех связанных ALNA [Ms]-содержащих нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера состоит из пяти связанных ALNA [Ms]-содержащих нуклеозидов и сегмент 3ʼ-крыла состоит из пяти связанных ALNA [Ms]-содержащих нуклеозидов.

В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера состоит из связанных одного, двух или трех ALNA [Ms]-содержащих нуклеозидов и одного 2ʼ-OMe нуклеозида; и сегмент 3ʼ-крыла состоит из связанных одного, двух или трех ALNA [Ms]-содержащих нуклеозидов и одного 2ʼ-OMe нуклеозида. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера состоит из связанных одного, двух или трех ALNA [Ms]-содержащих нуклеозидов и двух 2ʼ-OMe нуклеозидов; и сегмент 3ʼ-крыла состоит из связанных одного, двух или трех ALNA [Ms]-содержащих нуклеозидов и двух 2ʼ-OMe нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера состоит из связанных одного, двух или трех ALNA [Ms]-содержащих нуклеозидов и трех 2ʼ-OMe нуклеозидов; и сегмент 3ʼ-крыла состоит из связанных одного, двух или трех ALNA [Ms]-содержащих нуклеозидов и трех 2ʼ-OMe нуклеозидов.

В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера состоит из связанных одного, двух или трех ALNA [Ms]-содержащих нуклеозидов и одного или двух 2ʼ-MOE нуклеозидов; и сегмент 3ʼ-крыла состоит из связанных одного, двух или трех ALNA [Ms]-содержащих нуклеозидов и одного или двух 2ʼMOE нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера состоит из одного, двух или трех связанных ALNA [Ms]-содержащих нуклеозидов; и сегмент 3ʼ-крыла состоит из связанных одного, двух или трех ALNA [Ms]-содержащих нуклеозидов и одного, двух или трех 2ʼ-MOE нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера состоит из одного, двух или трех связанных ALNA [Ms]-содержащих нуклеозидов; и сегмент 3ʼ-крыла состоит из одного, двух, трех, четырех или пяти связанных 2ʼ-MOE нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера состоит из одного, двух, трех, четырех или пяти связанных 2ʼ-MOE нуклеозидов; и сегмент 3ʼ-крыла состоит из одного, двух или трех связанных ALNA [Ms]-содержащих нуклеозидов.

В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера состоит из одного, двух или трех связанных ALNA [Ms]-содержащих нуклеозидов и включает один 5-метилцитозин; и сегмент 3ʼ-крыла гэпмера состоит из одного, двух или трех связанных ALNA [Ms]-содержащих нуклеозидов и включает один 5-метилцитозин. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера состоит из одного, двух или трех связанных ALNA [Ms]-содержащих нуклеозидов и включает два 5-метилцитозина; и сегмент 3ʼ-крыла гэпмера состоит из одного, двух или трех связанных ALNA [Ms]-содержащих нуклеозидов и включает один 5-метилцитозин. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера состоит из одного, двух или трех связанных ALNA [Ms]-содержащих нуклеозидов и включает два 5-метилцитозина; и сегмент 3ʼ-крыла гэпмера состоит из одного, двух или трех связанных ALNA [Ms]-содержащих нуклеозидов и включает два 5-метилцитозина. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера состоит из одного, двух или трех связанных ALNA [Ms]-содержащих нуклеозидов и включает три 5-метилцитозина; и сегмент 3ʼ-крыла гэпмера состоит из одного, двух или трех связанных ALNA [Ms]-содержащих нуклеозидов и включает три 5-метилцитозина. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера состоит из одного, двух или трех связанных ALNA [Ms]-содержащих нуклеозидов и включает один 5-метилцитозин; и сегмент 3ʼ-крыла гэпмера состоит из одного, двух, трех, четырех или пяти связанных 2ʼ-MOE нуклеозидов и включает один 5-метилцитозин. В некоторых вариантах осуществления изобретения сегмент 5ʼ-крыла гэпмера состоит из одного, двух или трех связанных ALNA [Ms]-содержащих нуклеозидов; и сегмент 3ʼ-крыла гэпмера состоит из связанных одного, двух или трех ALNA [Ms]-содержащих нуклеозидов и из одного, двух или трех 2ʼ-MOE нуклеозидов и включает один 5-метилцитозин.

[0331]

В некоторых вариантах осуществления изобретения гэп-сегмент гэпмера включает 10 непосредственно примыкающих друг к другу нуклеозидов и включает 2ʼ-OMe нуклеозид в качестве 1-го, 2-го, 3-го, 4-го, 5-го, 6-го, 7-го, 8-го, 9-го или 10-го нуклеозида, а оставшиеся нуклеозиды являются дезоксинуклеозидами.

[0332]

Композиции и способы приготовления фармацевтических композиций

Модифицированный олигонуклеотид можно смешивать с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми активными или неактивными веществами для приготовления фармацевтической композиции или препарата. Композиция и способ приготовления фармацевтической композиции зависят от ряда критериев, которые включают, но этим не ограничиваются, способ введения, степень заболевания или дозу, которую необходимо ввести.

[0333]

Модифицированный олигонуклеотид, нацеленный на нуклеиновую кислоту DUX4, можно использовать в фармацевтической композиции путем объединения модифицированного олигонуклеотида с подходящим фармацевтически приемлемым разбавителем или носителем. Примеры фармацевтически приемлемого разбавителя включают забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS). PBS представляет собой разбавитель, подходящий для использования в композиции, предназначенной для парентеральной доставки. Следовательно, в одном варианте осуществления фармацевтическая композиция, включающая модифицированный олигонуклеотид, нацеленный на нуклеиновую кислоту DUX4, и фармацевтически приемлемый разбавитель используется в способе, описанном в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления изобретения фармацевтически приемлемый разбавитель представляет собой PBS.

[0334]

Фармацевтические композиции, содержащие модифицированные олигонуклеотиды, включают любую фармацевтически приемлемую соль, сложный эфир или соль такого сложного эфира или любые другие олигонуклеотиды, которые могут обеспечивать (прямо или косвенно) биологически активные метаболиты или их остатки при введении животным, включая человека. Поэтому, например, настоящее описание также относится к фармацевтически приемлемой соли модифицированного олигонуклеотида, пролекарству, фармацевтически приемлемой соли такого пролекарства и другим биоэквивалентам. Подходящие фармацевтически приемлемые соли включают, но этим не ограничиваются, соли натрия и соли калия.

[0335]

Пролекарство может включать включение дополнительных нуклеозидов на одном или обоих концах модифицированного олигонуклеотида, расщепляемого эндогенными нуклеазами в организме, с образованием активного модифицированного олигонуклеотида.

[0336]

Конъюгированный модифицированный олигонуклеотид

Модифицированный олигонуклеотид может быть ковалентно связан с одним или несколькими фрагментами или конъюгатами, которые усиливают активность, клеточное распределение или клеточное поглощение полученного модифицированного олигонуклеотида. Типичные группы конъюгата включают фрагменты холестерина и фрагменты липидов. Дополнительные группы конъюгатов включают углеводы, фосфолипиды, биотин, феназин, фолат, фенантридин, антрахинон, акридин, флуоресцеины, родамины, кумарины и красители.

[0337]

Например, модифицированный олигонуклеотид также может быть модифицирован так, чтобы иметь одну или несколько стабилизирующих групп, которые обычно присоединены к одному или обоим концам модифицированного олигонуклеотида, чтобы улучшить такие свойства, как стабильность нуклеазы. Структура кэпа входит в стабилизирующую группу. Эти концевые модификации могут защищать модифицированный олигонуклеотид, содержащий концевую нуклеиновую кислоту, от деградации экзонуклеазами и могут способствовать внутриклеточной доставке и/или локализации. Кэп может присутствовать на 5ʼ конце (5ʼ кэп) или на 3ʼ конце (3ʼ кэп), или может присутствовать на обоих концах. Структуры кэпов хорошо известны в данной области и включают, например, инвертированный дезокси абазический кэп. Дополнительные стабилизирующие группы 3ʼ и 5ʼ, которые можно использовать для кэпирования одного или обоих концов модифицированного олигонуклеотида с целью придания стабильности нуклеаз, включают группы, описанные в WO 03/004602.

[0338]

Культура клеток и обработка модифицированными олигонуклеотидами

Действие модифицированного олигонуклеотида на уровень, активность или экспрессию нуклеиновой кислоты DUX4 можно исследовать in vitro на различных типах клеток. Типы клеток, используемые для таких анализов, доступны от коммерческих поставщиков (например, American Type Culture Collection, Manassus, VA; Zen-Bio, Inc., Research Triangle Park, NC; Clonetics Corporation, Walkersville, MD), и клетки культивируют в соответствии с инструкциями поставщика с использованием коммерчески доступных реагентов (например, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). Примеры типов клеток включают, но этим не ограничиваются, клетки C2C12, клетки HepG2, клетки Hep3B, первичные гепатоциты, клетки A549, фибробласты GM04281 и клетки LLC-MK2. Эти клетки можно использовать для трансфекции вектора, экспрессирующего мРНК DUX4 человека. Вектор, предпочтительно, экспрессируется как слитый белок с репортерным геном, таким как люцифераза или GFP, и его примером является вектор psiCHECK-2 (Promega).

[0339]

Исследование модифицированного олигонуклеотида in vitro

В настоящем документе описан способ обработки клеток модифицированным олигонуклеотидом, который может быть соответствующим образом модифицирован в соответствии с типом модифицированного олигонуклеотида.

[0340]

Обычно клетки обрабатывают модифицированным олигонуклеотидом, когда клетки достигают примерно 60-80% слияния в культуре.

[0341]

Модифицированный олигонуклеотид можно вводить в клетки, например, с помощью метода липофекции.

Одним из реагентов, обычно используемых для введения модифицированного олигонуклеотида в культивируемые клетки, является реагент катионной липидной трансфекции, LIPOFECTIN (зарегистрированная торговая марка) (Invitrogen, Carlsbad, CA). Модифицированный олигонуклеотид смешивают с LIPOFECTIN (зарегистрированная торговая марка) в OPTI-MEM (зарегистрированная торговая марка) (Invitrogen, Carlsbad, CA) для достижения желаемой конечной концентрации модифицированного олигонуклеотида и концентрации LIPOFECTIN (зарегистрированная торговая марка), которая обычно находится в диапазоне 2-12 мкг/мл на 100 нМ модифицированного олигонуклеотида.

[0342]

Другим реагентом, используемым для введения модифицированного олигонуклеотида в культивируемые клетки, является LIPOFECTAMINE 2000 (зарегистрированная торговая марка) (Invitrogen, Carlsbad, CA). Модифицированный олигонуклеотид смешивают с LIPOFECTAMINE 2000 (зарегистрированная торговая марка) в среде для восстановления сыворотки OPTI-MEM (зарегистрированная торговая марка) 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) для достижения желаемой концентрации модифицированного олигонуклеотида и концентрации LIPOFECTAMINE (зарегистрированная торговая марка), которая обычно находится в диапазоне 2-12 мкг/мл на 100 нМ модифицированного олигонуклеотида.

[0343]

Другим реагентом, используемым для введения модифицированного олигонуклеотида в культивируемые клетки, является цитофектин (зарегистрированная торговая марка) (Invitrogen, Carlsbad, CA). Модифицированный олигонуклеотид смешивают с цитофектином (зарегистрированная торговая марка) в среде для восстановления сыворотки OPTI-MEM (зарегистрированная торговая марка) 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) для достижения желаемой концентрации модифицированного олигонуклеотида и концентрации цитофектина (зарегистрированная торговая марка), которая обычно находится в диапазоне 2-12 мкг/мл на 100 нМ модифицированного олигонуклеотида.

[0344]

Другим методом, используемым для введения модифицированного олигонуклеотида в культивируемые клетки, является электропорация.

[0345]

Модифицированный олигонуклеотид можно вводить в клетки без использования LIPOFECTION или подобного. Метод подавления экспрессии целевого гена модифицированного олигонуклеотида в этом случае называется методом гимнозиса.

[0346]

Клетки обрабатывают модифицированным олигонуклеотидом с использованием обычного метода. Обычно клетки собирают через 16-48 часов после обработки модифицированным олигонуклеотидом, в это время измеряют уровень РНК или белка нуклеиновой кислоты-мишени с использованием метода, известного в данной области и описанного в настоящем документе. Обычно, когда обработка выполняется в многократных повторениях, данные представлены как среднее значение повторной обработки.

[0347]

Концентрация используемого модифицированного олигонуклеотида варьируется от клеточной линии к клеточной линии. Метод определения оптимальной концентрации модифицированного олигонуклеотида по отношению к конкретной клеточной линии хорошо известен в данной области. Модифицированный олигонуклеотид обычно используется в концентрации от 1 до 300 нМ при трансфекции с использованием LIPOFECTAMINE2000 (зарегистрированная торговая марка), LIPOFECTIN или Cytofectin. Модифицированный олигонуклеотид используется в более высокой концентрации в диапазоне от 625 до 20000 нМ при трансфекции с использованием электропорации. Исходя из степени ингибирования экспрессии гена при каждой концентрации, можно рассчитать концентрацию IC₅₀ модифицированного олигонуклеотида, которая подавляет 50% экспрессию гена.

[0348]

Выделение РНК

Анализ РНК можно проводить на общей клеточной РНК или поли (А)+мРНК. Метод выделения РНК хорошо известен в данной области. РНК получают с использованием метода, хорошо известного в данной области, например, с использованием реагента TRIZOL (зарегистрированная торговая марка) (Invitrogen, Carlsbad, CA) в соответствии с протоколом, рекомендованным производителем.

[0349]

Анализ ингибирования целевого уровня или экспрессии

Ингибирование уровня или экспрессии нуклеиновой кислоты DUX4 может быть проанализировано с использованием различных методов, известных в данной области. Например, целевой уровень нуклеиновой кислоты может быть определен количественно, например, с помощью нозерн-блоттинга, конкурентной полимеразной цепной реакции (ПЦР) или количественной ПЦР в реальном времени. Анализ РНК можно проводить на общей клеточной РНК или поли (А)+мРНК. Метод выделения РНК хорошо известен в данной области. Нозерн-блоттинг также обычно проводят в данной области техники. Количественная ПЦР в реальном времени может быть легко выполнена с использованием коммерчески доступной системы обнаружения последовательностей ABI PRISM (зарегистрированная торговая марка) 7600, 7700 или 7900, которую можно приобрести у компании PE-Applied Biosystems, Foster City, CA, и использовать в соответствии с инструкциями производителя.

[0350]

Количественный анализ уровня целевой РНК с помощью ПЦР в реальном времени

Количественное определение уровня целевой РНК может быть выполнено с помощью количественной ПЦР в реальном времени с использованием ABI PRISM (зарегистрированная торговая марка) 7600, 7700 или 7900 Sequence Detection System (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) в соответствии с инструкциями производителя. Метод количественной ПЦР в реальном времени хорошо известен в данной области.

[0351]

Перед ПЦР в реальном времени выделенную РНК подвергают реакции обратной транскриптазы (ОТ), и в результате образуется комплементарная ДНК (кДНК), которая затем используется в качестве субстрата для амплификации ПЦР в реальном времени. Реакции ОТ и ПЦР в реальном времени выполняются последовательно в одной лунке для образцов. Реагенты ОТ и ПЦР в реальном времени получены от компании Invitrogen (Carlsbad, CA). Реакции ОТ и ПЦР в реальном времени проводят с использованием методов, хорошо известных специалисту в данной области.

[0352]

Целевое количество гена (или РНК), полученное с помощью ПЦР в реальном времени, нормализуется с использованием либо уровня экспрессии гена, экспрессия которого постоянна, такого как циклофилин А, либо путем количественного определения общей РНК с использованием RIBOGREEN (зарегистрированная торговая марка) (Invitrogen, Inc. Carlsbad, CA). Экспрессия циклофилина А количественно оценивается путем проведения мультиплексной или отдельной ПЦР в реальном времени одновременно с мишенью. Суммарную РНК определяют количественно с использованием реагента для количественной оценки РНК RIBOGREEN (зарегистрированная торговая марка) (Invitrogen, Inc. Eugene, OR). Метод количественного определения РНК с использованием RIBOGREEN (зарегистрированная торговая марка) описан в работе Jones, L. J., et al, (Analytical Biochemistry, 1998, 265, 368-374). Флуоресценцию RIBOGREEN (зарегистрированная торговая марка) измеряли с помощью прибора CYTOFLUOR (зарегистрированная торговая марка) 4000 (PE Applied Biosystems).

[0353]

Для гибридизации с нуклеиновой кислотой DUX4 предназначены зонды и праймеры. Способы конструирования зондов и праймеров для ПЦР в реальном времени хорошо известны в данной области и могут включать использование программного обеспечения, такого как программное обеспечение PRIMER EXPRESS (зарегистрированная торговая марка) (Applied Biosystems, Foster City, CA).

[0354]

Анализ уровня протеина

Антисмысловое ингибирование нуклеиновой кислоты DUX4 можно оценить путем измерения уровня белка DUX4. Уровень белка DUX4 может быть исследован или количественно определен с использованием различных методов, хорошо известных в данной области, такие как иммунопреципитация, вестерн-блоттинг (иммуноблоттинг), иммуноферментный анализ (ELISA), количественные анализы белков, анализы активности белков (например, анализы активности каспаз), иммуногистохимия, иммуноцитохимия или сортировка клеток с активацией флуоресценции (FACS). Антитело, направленное на мишень, может быть идентифицировано и получено из различных источников, таких как каталог антител MSRS (Aerie Corporation, Birmingham, MI), или может быть получено с использованием общепринятых способов получения моноклональных или поликлональных антител, хорошо известных в данной области.

[0355]

Анализ экспрессии генов

Уровень экспрессии гена DUX4 также можно измерить с использованием репортерного гена, такого как люцифераза. Например, используя вектор psiCHECK-2 (Promega), экспрессию гена DUX4 можно измерить по величине люминесценции люциферазы Renilla, которая представляет собой слитый белок с DUX4, и скорректировав с величиной люминесценции люциферазы Firefly, присутствующей в том же векторе, можно исключить неспецифические эффекты, такие как гибель клеток.

[0356]

Исследование модифицированного олигонуклеотида in vivo

Модифицированный олигонуклеотид испытывают на животном, чтобы оценить его способность ингибировать экспрессию DUX4 и вызывать изменение фенотипа. Исследование может быть выполнено на нормальном животном или на экспериментальной модели заболевания, такой как модель трансгенной мыши DUX4 (Jones, T. et al., PLoS One 2018; 13 (2), номер статьи e0192657) или мыши, экспрессирующей ген DUX4, с использованием генного рекомбинантного вируса AAV (Wallace, L M et al., Mol Ther 2012; 20 (7): 1417, Wallace, L M et al., Ann Neurol 2011; 69 (3): 540).

[0357]

Для введения животному модифицированный олигонуклеотид готовят в фармацевтически приемлемом разбавителе, таком как забуференный фосфатом физиологический раствор. Введение включает парентеральный путь введения. После периода лечения модифицированным олигонуклеотидом РНК выделяют из ткани и измеряют изменение экспрессии нуклеиновой кислоты DUX4. Также измеряется изменение уровня белка DUX4.

[0358]

Некоторые антисмысловые механизмы

FSHD вызывается аномальной экспрессией гена DUX4 (в частности, вариантов сплайсинга DUX4-FL) в мышцах. С другой стороны, DUX4 также экспрессируется в семенниках и тому подобном у здоровых людей. В некоторых вариантах сплайсинга DUX4, экспрессируемых в семенниках и тому подобном, в дополнение к DUX4-FL, экспрессируются варианты сплайсинга экзона 1, экзона 2, экзона 6, экзона 7 и/или экзона 1, экзона 2, экзона 4, экзона 5, экзона 6, варианты сплайсинга экзона 7 (вышеуказанный непатентный документ 1).

[0359]

Некоторые биомаркеры

По крайней мере, частично, например, экспрессия генов MBD3L2, ZSCAN4, TRIM43, DEFB103, ZNF217 или тому подобное модулируется уровнем накопления белка DUX4 (вышеуказанный непатентный документ 2). Кроме того, уровень креатининкиназы в крови можно измерить как маркер миопатии.

[0360]

Некоторые показания

В некоторых вариантах осуществления изобретения в настоящем документе предложен способ лечения индивидуума, включающий введение одной или нескольких фармацевтических композиций, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления человек страдает FSHD.

[0361]

Таким образом, в настоящем документе предложен способ облегчения симптома, связанного с FSHD, у субъекта, нуждающегося в этом. В некоторых вариантах реализации предложен способ снижения частоты одного или нескольких симптомов, связанных с FSHD. В некоторых вариантах осуществления изобретения предложен способ уменьшения тяжести симптома, связанного с FSHD. В некоторых вариантах осуществления изобретения симптомы, связанные с FSHD, включают жесткость мышц, миотонию, слабость лицевых мышц, птоз век, неспособность посвистеть, уменьшение способности изменения выражения лица, меланхолическое или сердитое выражение лица, трудности с произношением слов, слабость лопатных мышц (деформации, такие как крылатые лопатки и покатые плечи), слабость нижних конечностей, потерю слуха и сердечные заболевания.

[0362]

В некоторых вариантах осуществления изобретения способ по изобретению включает введение нуждающемуся в этом индивидууму терапевтически эффективного количества соединения, нацеленного на нуклеиновую кислоту DUX4.

[0363]

В некоторых вариантах осуществления изобретения введение модифицированного олигонуклеотида, нацеленного на нуклеиновую кислоту DUX4, приводит к снижению экспрессии DUX4 на по меньшей мере около 15%, по меньшей мере около 20%, по меньшей мере около 25%, по меньшей мере около 30%, по меньшей мере около 35%, по меньшей мере около 40%, по меньшей мере около 45%, по меньшей мере около 50%, по меньшей мере около 55%, по меньшей мере около 60%, по меньшей мере около 65%, по меньшей мере около 70%, по меньшей мере около 75%, по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95% или по меньшей мере около 99% или в диапазоне, определяемом любыми двумя из этих значений.

[0364]

В некоторых вариантах осуществления изобретения фармацевтическая композиция, содержащая модифицированный олигонуклеотид, нацеленный на DUX4, используется при приготовлении медицинского препарата для лечения пациента, страдающего или предрасположенного к заболеванию, связанному с DUX4, такого как FSHD.

[0365]

В некоторых вариантах осуществления изобретения способ, описанный в настоящем документе, включает введение соединения, содержащего модифицированный олигонуклеотид, имеющий непосредственно примыкающих друг к другу части нуклеиновых оснований, описанных в настоящем документе, представленные как последовательность SEQ ID NO: 2, 3, 4, 7-64, 69-97 или 102-109 в списке последовательностей.

[0366]

Введение

В некоторых вариантах осуществления изобретения соединение и фармацевтическую композицию, описанные в настоящем документе, вводят парентерально.

[0367]

В некоторых вариантах осуществления изобретения парентеральное введение осуществляется инфузией. Инфузия может быть длительной или непрерывной, краткосрочной или прерывистой. В некоторых вариантах осуществления изобретения вводимый фармацевтический агент доставляется с помощью насоса. В некоторых вариантах осуществления изобретения парентеральное введение осуществляется путем инъекции (например, путем болюсной инъекции). Препарат для инъекций можно вводить с помощью шприца.

[0368]

Примеры парентерального введения включают подкожное введение, внутривенное введение, внутримышечное введение, внутриартериальное введение, внутриполостное введение или внутричерепное введение, например, интратекальное или внутрижелудочковое введение. Введение может быть непрерывным или длительным, краткосрочным или периодическим.

[0369]

В некоторых вариантах осуществления изобретения доставка соединения или фармацевтической композиции, описанных в настоящем документе, приводит к снижению уровней целевой мРНК и/или белка по крайней мере на 70%. В некоторых вариантах осуществления изобретения доставка соединения или композиции, описанных в настоящем документе, приводит к 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% снижению уровней целевой мРНК и/или целевого белка в течение по меньшей мере 1 дня, по меньшей мере 3 дней, по меньшей мере 5 дней, по меньшей мере 7 дней, по меньшей мере 10 дней, по меньшей мере 14 дней, по меньшей мере 20 дней, по меньшей мере 21 дня, по меньшей мере 28 дней, по меньшей мере 30 дней, по меньшей мере 35 дней, по меньшей мере 40 дней, по меньшей мере 45 дней, по меньшей мере 50 дней, по меньшей мере 55 дней, по меньшей мере 60 дней, по меньшей мере 65 дней, по меньшей мере 70 дней, по меньшей мере 75 дней, по меньшей мере 76 дней, по меньшей мере 77 дней, по меньшей мере 78 дней, по меньшей мере 79 дней, по меньшей мере 80 дней, по меньшей мере 85 дней, по меньшей мере 90 дней, по меньшей мере 95 дней, по меньшей мере 100 дней, по меньшей мере 105 дней, по меньшей мере 110 дней, по меньшей мере 115 дней, по меньшей мере 120 дней, по меньшей мере 1 года.

[0370]

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид доставляется путем инъекции или инфузии один раз в день, один раз в три дня, один раз в неделю, один раз в две недели, один раз в три недели, один раз в месяц, один раз в два месяца, один раз в три месяца, один раз. каждые шесть месяцев, два раза в год или один раз в год.

[0371]

Некоторые комбинированные методы лечения

В некоторых вариантах осуществления изобретения первый агент, включающий модифицированный олигонуклеотид по настоящему изобретению, вводят совместно с одним или несколькими вторыми агентами. В некоторых вариантах осуществления изобретения такие вторые агенты предназначены для лечения той же FSHD, что и первый агент, описанный в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления изобретения такие вторые агенты предназначены для лечения заболевания, расстройства или состояния, отличного от предназначения первого агента, описанного в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления изобретения такие вторые агенты предназначены для лечения нежелательного побочного эффекта одной или нескольких фармацевтических композиций, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления изобретения второй агент вводят совместно с первым агентом для лечения нежелательного эффекта первого агента. В некоторых вариантах осуществления изобретения второй агент вводят совместно с первым агентом для получения комбинационного эффекта. В некоторых вариантах осуществления изобретения второй агент вводят совместно с первым агентом для получения синергетического эффекта.

[0372]

В некоторых вариантах осуществления изобретения первый агент и один или несколько вторых агентов вводят одновременно. В некоторых вариантах осуществления изобретения первый агент и один или несколько вторых агентов вводят в разное время. В некоторых вариантах осуществления изобретения первый агент и один или несколько вторых агентов готовят вместе в едином фармацевтическом составе. В некоторых вариантах осуществления изобретения первый агент и один или несколько вторых агентов готовят отдельно.

[0373]

Некоторые соединения

В некоторых вариантах осуществления изобретения соединение, описанное в настоящем документе, может давать олигомер с использованием фосфорамидитного метода с использованием коммерчески доступных амидитов (включая LNA) для синтеза ДНК и РНК. Искусственная нуклеиновая кислота GuNA может давать олигомер с использованием способа, описанного в WO 2014/046212 и WO 2017/047816. Искусственные нуклеиновые кислоты ALNA [Ms], ALNA [mU], ALNA [ipU], ALNA [Trz] и ALNA [Oxz] могут давать олигомер с использованием способа, описанного в заявке на патент Японии № 2018-212424.

[0374]

В некоторых вариантах осуществления изобретения соединение, описанное в настоящем документе, обладает преимуществом по одному или нескольким свойствам in vitro и/или in vivo, которые улучшены по сравнению с подходящим сравнительным соединением.

[0375]

В некоторых вариантах осуществления изобретения соединение, обозначаемое как соединение № 1, имеющее последовательность (от 5ʼ до 3ʼ) ngagattcccgccggt (n обозначает 5-метилцитозин, включено в настоящий документ как SEQ ID NO: 2), то есть гэпмер, в котором крыло 5ʼ и крыло 3ʼ, каждое из которых состоит из трех LNA-содержащих нуклеозидов, представляет собой соединение, в котором каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфоротиоатную связь.

[0376]

В некоторых вариантах осуществления изобретения соединение, обозначаемое как соединение № 2, имеющее последовательность (от 5ʼ до 3ʼ) gnagttctccgcggt (n обозначает 5-метилцитозин, включено в настоящий документ как SEQ ID NO: 3 в списке последовательностей), то есть гэпмер, в котором каждое 5ʼ-крыло и 3ʼ-крыло состоят из трех ALNA [Ms]-содержащих нуклеозидов, представляет собой соединение, в котором каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфоротиоатную связь.

[0377]

В некоторых вариантах осуществления изобретения соединение, обозначаемое как соединение № 3, имеющее последовательность (от 5ʼ до 3ʼ) gnntagacagcgtngg (n обозначает 5-метилцитозин, включено в настоящий документ как SEQ ID NO: 4 в списке последовательностей), то есть гэпмер, в котором каждое 5ʼ-крыло и 3ʼ-крыло состоят из трех LNA-содержащих нуклеозидов, представляет собой соединение, в котором каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфоротиоатную связь.

[0378]

В некоторых вариантах осуществления изобретения соединение, обозначаемое как соединение № 123, имеющее последовательность (от 5ʼ до 3ʼ) gnntagacagcgtngg (n обозначает 5-метилцитозин, включено в настоящий документ как SEQ ID NO: 4 в списке последовательностей), то есть гэпмер, в котором каждое 5ʼ-крыло и 3ʼ-крыло состоят из трех ALNA [Ms]-содержащих нуклеозидов, представляет собой соединение, в котором каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфоротиоатную связь.

[0379]

Неограничивающее описание и включение посредством ссылки

Хотя некоторые соединения, композиции и способы, описанные в настоящем документе, были описаны конкретно в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, следующие примеры служат только для иллюстрации описанных в настоящем документе соединений и не предназначены для их ограничения. Каждые ссылки, регистрационные номера GENBANK и тому подобное, описанные в данной заявке, полностью включены в настоящий документ посредством ссылки.

[0380]

В списке последовательностей, прилагаемом к данной заявке, каждая последовательность указана как «РНК» или «ДНК», в зависимости от ситуации. Однако на практике эти последовательности можно модифицировать любой комбинацией химических модификаций. Специалист в данной области легко поймет, что обозначение, такое как «РНК» или «ДНК» для описания модифицированного олигонуклеотида, в некоторых случаях является произвольным. Например, олигонуклеотид, содержащий нуклеозид, содержащий 2ʼ-ОН сахарный фрагмент и тиминовое основание, может быть описан как ДНК, имеющая модифицированный сахар (2ʼ-ОН по отношению к природному 2ʼ-H ДНК), или как РНК, имеющая модифицированное основание (тимин (метилированный урацил) по отношению к природному урацилу РНК).

[0381]

Следовательно, последовательности нуклеиновых кислот, представленные в настоящем документе, включая, но этим не ограничиваясь, последовательности в списке последовательностей, предназначены для включения, но этим не ограничиваясь, нуклеиновых кислот, содержащих любую комбинацию природных или модифицированных РНК и/или ДНК, включая такие нуклеиновые кислоты, которые имеют модифицированные нуклеиновые основания. В качестве неограничивающего дополнительного примера, олигомерное соединение, имеющее последовательность нуклеиновых оснований «ATCGATCG», включает любое олигомерное соединение, модифицированное или немодифицированное, имеющее такую последовательность нуклеиновых оснований, которая включает, но этим не ограничивается, такие соединения, которые содержат основания РНК, такие как соединения, имеющие последовательность «AUCGAUCG», и такие, которые имеют некоторые основания ДНК и некоторые основания РНК, такие как «AUCGATCG», и олигомерные соединения с другими модифицированными или природными основаниями, такими как «ATmeCGAUCG» (здесь meC означает цитозиновое основание, содержащее метильную группу в положении 5).

[Примеры]

[0382]

Неограничивающее описание и включение посредством ссылки

Хотя некоторые соединения, композиции и способы, описанные в настоящем документе, были описаны конкретно в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, следующие примеры служат только для иллюстрации описанных в настоящем документе соединений и не предназначены для их ограничения. Каждая из ссылок, приведенных в этой заявке, полностью включена в настоящий документ посредством ссылки.

[0383]

Структуры искусственных нуклеиновых кислот, используемых в настоящем описании, показаны следующими структурными формулами вместе с их соответствующими сокращениями.

Структуры и сокращения искусственных нуклеиновых кислот

.

[0384]

Пример 1

Синтез и очистка модифицированного олигонуклеотидного соединения для оценки in vitro

С использованием различных амидитов (амидит LNA был приобретен у компании Chem Genes and Hongene Biotechnology Limited; амидит 2ʼ-OMe был приобретен у компании Sigma-Aldrich; GuNA был синтезирован с использованием методов, описанных в WO 2014/046212 и WO 2017/047816; и ALNA [Ms], ALNA [mU], ALNA [ipU], ALNA [Trz] и ALNA [Oxz] были синтезированы с использованием методов, описанных в заявке на патент Японии № 2018-212424) модифицированное олигонуклеотидное соединение было синтезировано в масштабе 0,2 или 1,0 мкмоль с использованием CPG или полистирольного носителя с использованием автоматического синтезатора олигонуклеотидов ДНК/РНК nS-8II (производства Gene Design Inc.). Все амидиты доводили до 0,1 М раствора ацетонитрила; время связывания для неприродных нуклеозидов составляло 10 минут; и другие стадии осуществляли в стандартных условиях nS-8II. В качестве активатора использовали активатор 42 (Sigma-Aldrich), для тиолирования использовали сульфурирующий реагент II (Gren Research Corporation). К синтезированному олигонуклеотиду добавляли 28% водный раствор аммиака и проводили реакцию при 60-65ºC в течение 8 часов, чтобы вырезать из носителя и снять защиту с основной части. После концентрирования и отгонки аммиака проводили очистку с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой.

[0385]

Пример 2

Синтез и очистка модифицированного олигонуклеотидного соединения для оценки in vivo

С использованием различных амидитов было синтезировано модифицированное олигонуклеотидное соединение с использованием полистирольного носителя в масштабе 20-50 мкм с использованием автоматического синтезатора олигонуклеотидов ДНК/РНК AKTA oligopilot plus 10 (производства GE Healthcare Japan). ДНК-амидит доводили до 0,1 М, неприродный амидит доводили до 0,05-0,1 М раствора ацетонитрила; время рецикла связывания для неприродных нуклеозидов составляло 20 минут; и, когда первое основание вводили в универсальный носитель, каждую из стадий связывания, тиолирования и кэпирования выполняли два раза подряд. Остальные стадии выполняли в стандартных условиях AKTA oligopilot plus10. В качестве активатора использовали активатор 42 (Sigma-Aldrich), для тиолирования использовали сульфурирующий реагент II (Gren Research Corporation). Синтезированный олигонуклеотид подвергали децианоэтильной обработке на твердой фазе с использованием 20% диэтиламин ацетонитрила или 50% триэтиламина/ацетонитрила, добавляли 28% водный раствор аммиака и проводили реакцию при 60-65ºC в течение 8-24 часов, чтобы вырезать из носителя и снять защиту с базовой части. После концентрирования и отгонки аммиака проводили очистку с использованием анионообменной колонки. Избыток соли, содержащийся после анионного обмена, удаляли с помощью обессоливающей колонны.

[0386]

Пример 3

Подтверждение чистоты модифицированного олигонуклеотидного соединения

Очистку и подтверждение чистоты синтезированных модифицированных олигонуклеотидных соединений проводили с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой в следующих условиях. Все соединения имели чистоту 85% или более.

Обращенно-фазовая ВЭЖХ (очистка)

Подвижная фаза:

Раствор A: 400 мМ гексафторизопропанол, 15 мМ триэтиламин

Раствор B: метанол

Градиент: A:B=85:15→70:30 (10 мин)

Используемые колонки:

Колонка Preparative Waters XBridge @ Oligonucleotide BEH C18 OBDTM Prep, 130 Å, 2,5 мкм, 10 мМ*50 мМ

Скорость потока:

Препаративная 5 мл/мин

Температура колонки: 60ºC

Детектирование: УФ (260 нм)

Обращенно-фазовая ВЭЖХ (подтверждение чистоты)

Подвижная фаза:

Раствор A: 400 мМ гексафторизопропанол, 15 мМ водный раствор триэтиламина

Раствор B: метанол

Градиент: A:B=80:20→70:30 (6,5 мин)

Используемые колонки:

Колонка Analysis Waters ACQUITY UPLC @ Oligonucleotide BEH C18, 130 Å 1,7 мкм, 2,1 мМ*50 мМ

Скорость потока: 0,2 мл/мин

Температура колонки: 60ºC

Детектирование: УФ (260 нм)

Анионообменная очистка

Подвижная фаза:

Раствор A: 1 мМ NaOH 20%-ный водный раствор ацетонитрила

Раствор B: 1 мМ NaOH, 1,5 M NaCl/20%-ный водный раствор ацетонитрила

Используемая колонка: TSKgel SuperQ-5PW (13) φ21,1*15 мМ

Скорость потока: 7 мл/мин

Температура колонки: комнатная температура

Детектирование: УФ (260 нм)

Колонка обессоливания

Подвижная фаза:

Раствор A: 20%-ный водный раствор ацетонитрила

Раствор B: 20%-ный водный раствор ацетонитрила

Используемые колонки:

GE HiPrep 26/10 Desalting* 4 по порядку

Скорость потока: 12 мл/мин

Температура колонки: комнатная температура

[0387]

Пример 4

Определение молекулярной массы модифицированного олигонуклеотидного соединения

Молекулярную массу синтезированного модифицированного олигонуклеотидного соединения определяли с использованием Waters ZQ в следующих условиях.

Подвижная фаза:

Раствор A: 400 мМ гексафторизопропанол, 15 мМ водный раствор триэтиламина

Раствор B: метанол

Градиент: A:B=80:20→70:30 (6,5 мин)

Используемые колонки:

Колонка Waters ACQUITY UPLC @ Oligonucleotide BEH C18, 130 Å 1,7 мкм, 2,1 мМ*50 мМ

Скорость потока: 0,2 мл/мин

Температура колонки: 60ºC

Детектирование: УФ (260 нм)

[0388]

Пример 5

Молекулярная масса синтезированного модифицированного олигонуклеотидного соединения

Синтезированные модифицированные олигонуклеотидные соединения показаны в таблице 1 ниже. В обозначениях соединений каждый нуклеотид представлен тремя буквами. Однако 3ʼ-концевой нуклеотид представлен двумя буквами, поскольку межнуклеозидная связь отсутствует.

1) Первая буква заглавная и указывает на следующие азотные основания:

A=аденин, T=тимин, G=гуанин, C=цитозин, U=урацил, M=5-метилцитозин;

2) вторая буква указывает на следующие сахарные фрагменты:

l=LNA, g=GuNA, m=ALNA[Ms], u=ALNA[mU], p=ALNA[ipU], t=ALNA[Trz], e=2ʼ-MOE, o=2ʼ-OMe, d=2ʼ-дезоксирибоза,

3) третья буква указывает на следующие межнуклеозидные связи:

s=фосфоротиоат, p=фосфодиэфир.

Положение-мишень указывает 5ʼ-сайт-мишень зрелой мРНК DUX4 модифицированного олигонуклеотида (положение SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей, соответствующее 3ʼ-концу модифицированного олигонуклеотида).

[Таблица 1-1]

Таблица 1 Соединение
№ SEQ NO Положение-
мишень Последовательность m/z Виды ионов 1 2 233 MlsGlsAlsGdsAdsTdsTdsCdsCdsCdsGdsCdsCdsGlsGlsTl 1318,8 [M-4H]4- 2 3 1309 GmsMmsAmsGdsTdsTdsCdsTdsCdsCdsGdsCdsGmsGmsTm 1807,9 [M-3H]3- 3 4 1480 GlsMlsMlsTdsAdsGdsAdsCdsAdsGdsCdsGdsTdsMlsGlsGl 1784,3 [M-3H]3- 4 7 232 GlsAlsTlsTdsCdsCdsCdsGdsCdsCdsGdsGlsTlsGl 4630,44 [M-H]- 5 8 233 AgsGgsAgsTdsTdsCdsCdsCdsGdsCdsCdsGgsGgsTg 1214,8 [M-4H]4- 6 9 233 GgsAgsGgsAdsTdsTdsCdsCdsCdsGdsCdsCdsGgsGgsTg 1300,8 [M-4H]4- 7 9 233 GlsAlsGlsAdsTdsTdsCdsCdsCdsGdsCdsCdsGlsGlsTl 1239,3 [M-4H]4- 8 10 233 MmsGmsAdsGmsAdsTdsTdsMdsMdsMdsGdsMdsMmsGdsGmsTm 1161,8 [M-5H]5- 9 10 233 MmsGdsAmsGmsAdsTdsTdsMdsMdsMdsGdsMdsMmsGmsGdsTm 1161,9 [M-5H]5- 10 2 233 MgsGgsAgsGdsAdsTdsTdsCdsCdsCdsGdsCdsCdsGgsGgsTg 1381,0 [M-4H]4- 11 10 233 MusGusAusGdsAdsTdsTdsMdsMdsMdsGdsMdsMdsGusGusTu 1136,5 [M-5H]5- 12 10 233 MpsGpsApsGdsAdsTdsTdsMdsMdsMdsGdsMdsMdsGpsGpsTp 1170,2 [M-5H]5- 13 11 234 GlsAlsGlsAdsTdsTdsCdsCdsCdsGdsCdsMlsGlsGl 4653,17 [M-H]- 14 11 234 GgsAgsGgsAdsTdsTdsCdsCdsCdsGdsCdsMgsGgsGg 1224,5 [M-4H]4- 15 12 234 GtsAtsGtsAdsTdsTdsMdsMdsMdsGdsMdsMtsGtsGt 1317,7 [M-4H]4- 16 12 234 GusAusGusAdsTdsTdsMdsMdsMdsGdsMdsMusGusGu 1261,0 [M-4H]4- 17 12 234 GmsAmsGmsAdsTdsTdsMdsMdsMdsGdsMdsMmsGmsGm 1292,5 [M-4H]4- 18 13 234 MmsGdsAmsGmsAdsTdsTdsMdsMdsMdsGdsMmsMmsGdsGm 1097,5 [M-5H]5- 19 14 234 MgsGgsAgsGdsAdsTdsTdsCdsCdsCdsGdsCdsMgsGgsGg 1304,5 [M-4H]4- 20 14 234 MlsGlsAlsGdsAdsTdsTdsCdsCdsCdsGdsCdsMlsGlsGl 1242,6 [M-4H]4- 21 15 1306 AlsGlsTlsTdsCdsTdsCdsCdsGdsCdsGdsGdsTdsGlsTlsGl 1769,7 [M-3H]3- 22 16 1307 GlsMlsAlsGdsTdsTdsCdsTdsCdsCdsGdsCdsGdsGdsTlsGlsTl 1876,0 [M-3H]3-

[Таблица 1-2]

(Таблица 1, продолжение) 23 17 1307 GlsGlsMlsAdsGdsTdsTdsCdsTdsCdsCdsGdsCdsGdsGdsTlsGlsTl 1990,8 [M-3H]3- 24 18 1308 MgsAgsGgsTdsTdsCdsTdsCdsCdsGdsCdsGdsGgsTgsGg 1736,7 [M-3H]3- 25 18 1308 MgsAgsGgsTdsTdsCdsTdsCdsCdsGdsCdsGdsGdsTgsGg 1284,9 [M-4H]4- 26 19 1308 MmsAmsGdsTmsTdsMdsTdsMdsMdsGdsMdsGmsGdsTmsGm 1096,2 [M-5H]5- 27 19 1308 MmsAdsGmsTmsTdsMdsTdsMdsMdsGdsMdsGmsGmsTdsGm 1370,6 [M-4H]4- 28 20 1308 GlsCdsAlsGlsTdsTdsCdsTdsCdsCdsGdsCdsGlsGlsTdsGl 1765,4 [M-3H]3- 29 20 1308 GlsCdsAlsGdsTlsTdsCdsTdsCdsCdsGdsCdsGlsGdsTdsGl 1755,3 [M-3H]3- 30 20 1308 GgsCdsAgsGgsTdsTdsCdsTdsCdsCdsGdsCdsGgsGgsTdsGg 1385,1 [M-4H]4- 31 20 1308 GlsCdsAlsGlsTdsTdsCdsTdsCdsCdsGdsCdsGlsGdsTlsGl 1323,4 [M-4H]4- 32 97 1308 GgsCdsAgsGdsTdsTdsCdsTdsCdsCdsGdsMgsGdsGgsTdsGg 1828,3 [M-3H]3- 33 21 1308 GlsMlsAlsGdsTdsTdsCdsTdsCdsCdsGdsCdsGdsGlsTlsGl 1769,4 [M-3H]3- 34 21 1308 GlsMlsAlsGlsTdsTdsCdsTdsCdsCdsGdsCdsGlsGlsTlsGl 1788,3 [M-3H]3- 35 21 1308 GlsMlsAdsGlsTdsTdsCdsTdsCdsCdsGdsCdsGlsGdsTlsGl 1769,2 [M-3H]3- 36 21 1308 GmsMmsAmsGdsTdsTdsCdsTdsCdsCdsGdsCdsGdsGmsTmsGm 1923,5 [M-3H]3- 37 21 1308 GgsMgsAgsGdsTdsTdsCdsTdsCdsCdsGdsCdsGdsGgsTgsGg 1851,7 [M-3H]3- 38 21 1308 GgsMgsAgsGdsTdsTdsCdsTdsCdsCdsGdsCdsGgsGdsTgsGg 1388,3 [M-4H]4- 39 21 1308 GgsMgsAdsGgsTdsTdsCdsTdsCdsCdsGdsCdsGgsGdsTgsGg 1389,1 [M-4H]4- 40 21 1308 GlsMlsAdsGlsTdsTdsCdsTdsCdsCdsGdsCdsGlsGlsTdsGl 1769,5 [M-3H]3- 41 22 1308 GmsMmsAdsGmsTdsTdsMdsTdsMdsMdsGdsMdsGmsGdsTmsGm 1165,5 [M-5H]5- 42 22 1308 GmsMdsAmsGmsTdsTdsMdsTdsMdsMdsGdsMdsGmsGmsTdsGm 1165,4 [M-5H]5- 43 22 1308 GmsMmsAdsGmsTdsTdsMdsTdsMdsMdsGdsMdsGmsGmsTdsGm 1165,2 [M-5H]5- 44 22 1308 GmsMmsAdsGmsTdsTdsMdsTdsMdsMdsGdsMdsGmsGdsTdsGm 1144,2 [M-5H]5- 45 22 1308 GmsMmsAdsGmsTdsTdsMdsTdsMdsMdsGdsMmsGdsGmsTdsGm 1165,2 [M-5H]5-

[Таблица 1-3]

(Таблица 1, продолжение) 46 22 1308 GlsMlsAdsGlsTdsTdsMdsTdsMdsMdsGdsMdsGlsGlsTdsGl 1341,2 [M-4H]4- 47 22 1308 GlsMlsAdsGlsTdsTdsMdsTdsMdsMdsGdsMdsGlsGdsTdsGl 1334,2 [M-4H]4- 48 23 1308 GlsGlsMlsAdsGdsTdsTdsCdsTdsCdsCdsGdsCdsGdsGlsTlsGl 1884,5 [M-3H]3- 49 24 1308 GmsGdsMmsAdsGmsTdsTdsMdsTdsMdsMdsGdsMdsGmsGdsTdsGm 1213,3 [M-5H]5- 50 24 1308 GmsGdsMmsAdsGmsTdsTdsMdsTdsMdsMdsGdsMdsGmsGmsTdsGm 1028,5 [M-6H]6- 51 24 1308 GlsGdsMlsAdsGlsTdsTdsMdsTdsMdsMdsGdsMdsGlsGdsTdsGl 1136,2 [M-5H]5- 52 24 1308 GlsGdsMlsAdsGlsTdsTdsMdsTdsMdsMdsGdsMdsGlsGlsTdsGl 1141,8 [M-5H]5- 53 25 1309 MgsAgsGgsTdsTdsCdsTdsCdsCdsGdsCdsGgsGgsTg 1621,0 [M-3H]3- 54 26 1309 GmsCdsAmsGmsTdsTdsCdsTdsCdsCdsGdsMmsGmsGdsTm 1356,7 [M-4H]4- 55 3 1309 GlsMlsAlsGdsTdsTdsCdsTdsCdsCdsGdsCdsGlsGlsTl 1654,3 [M-3H]3- 56 3 1309 GlsMlsAdsGdsTdsTdsCdsTdsCdsCdsGdsCdsGlsGlsTl 4936,4 [M-H]- 57 3 1309 GlsMlsAlsGdsTdsTdsCdsTdsCdsCdsGdsCdsGdsGlsTl 1645,4 [M-3H]3- 58 3 1309 GgsMgsAgsGdsTdsTdsCdsTdsCdsCdsGdsCdsGgsGgsTg 1736,8 [M-3H]3- 59 3 1309 GgsMgsAdsGdsTdsTdsCdsTdsCdsCdsGdsCdsGgsGgsTg 1285,1 [M-4H]4- 60 3 1309 GlsMlsAgsGdsTdsTdsCdsTdsCdsCdsGdsCdsGgsGlsTl 1261,1 [M-4H]4- 61 3 1309 GlsMgsAlsGdsTdsTdsCdsTdsCdsCdsGdsCdsGlsGgsTl 1261,1 [M-4H]4- 62 3 1309 GgsMlsAlsGdsTdsTdsCdsTdsCdsCdsGdsCdsGlsGlsTg 1261,1 [M-4H]4- 63 3 1309 GlsMlsAdsGlsTdsTdsCdsTdsCdsCdsGdsCdsGlsGlsTl 1240,6 [M-4H]4- 64 27 1309 GmsMmsAdsGmsTdsTdsCdsTdsCdsCdsGdsMmsGdsGmsTm 1360,1 [M-4H]4- 65 28 1309 GgsMgsAgsGdsTdsTdsMdsTdsMdsMdsGdsMdsGgsGgsTg 1316,1 [M-4H]4- 66 29 1309 GmsMmsAmsGdsTdsTdsMdsTdsMdsMdsGdsCosGmsGmsTm 1374,8 [M-4H]4- 67 29 1309 GmsMmsAmsGosTdsTdsMdsTdsMdsMdsGdsCosGmsGmsTm 1381,9 [M-4H]4- 68 29 1309 GmsMmsAmsGdsTdsTdsMdsTdsMdsMdsGosCosGmsGmsTm 1381,9 [M-4H]4-

[Таблица 1-4]

(Таблица 1, продолжение) 69 30 1309 GlsMlsAlsGdsTdsTdsMdsTdsMdsMdsGdsMdsGlsGlsTl 1254,6 [M-4H]4- 70 30 1309 GmsMmsAmsGdsTdsTdsMdsTdsMdsMdsGdsMdsGmsGmsTm 1370,2 [M-4H]4- 71 30 1309 GtsMtsAtsGdsTdsTdsMdsTdsMdsMdsGdsMdsGtsGtsTt 1395,9 [M-4H]4- 72 30 1309 GusMusAusGdsTdsTdsMdsTdsMdsMdsGdsMdsGusGusTu 1338,8 [M-4H]4- 73 30 1309 GpsMpsApsGdsTdsTdsMdsTdsMdsMdsGdsMdsGpsGpsTp 1381,3 [M-4H]4- 74 30 1309 GmsMmsAmsGosTdsTdsMdsTdsMdsMdsGdsMdsGmsGmsTm 1377,9 [M-4H]4- 75 31 1309 GmsMmsAmsGosUosTdsMdsTdsMdsMdsGdsCosGmsGmsTm 1385,9 [M-4H]4- 76 32 1309 GmsMmsAmsGosUosTdsMdsTdsMdsMdsGdsMdsGmsGmsTm 1381,9 [M-4H]4- 77 33 1309 GgsGgsCdsAgsGdsTdsTdsCdsTdsCdsCdsGdsCdsGgsGgsTg 1384,9 [M-4H]4- 78 33 1309 GlsGlsCdsAdsGlsTdsTdsCdsTdsCdsCdsGlsCdsGdsGlsTl 1323,6 [M-4H]4- 79 34 1309 GlsGlsMlsAdsGdsTdsTdsCdsTdsCdsCdsGdsCdsGlsGlsTl 1769,2 [M-3H]3- 80 34 1309 GlsGdsMlsAdsGdsTdsTdsCdsTdsCdsCdsGdsCdsGlsGdsTl 1750,7 [M-3H]3- 81 34 1309 GgsGgsMgsAdsGdsTdsTdsCdsTdsCdsCdsGdsCdsGgsGgsTg 1388,6 [M-4H]4- 82 34 1309 GmsGmsMmsAdsGdsTdsTdsCdsTdsCdsCdsGdsCdsGmsGmsTm 1442,3 [M-4H]4- 83 35 1309 GgsGgsMgsAdsGdsTdsTdsMdsTdsMdsMdsGdsMdsGgsGgsTg 1402,4 [M-4H]4- 84 35 1309 GlsGlsMlsAdsGdsTdsTdsMdsTdsMdsMdsGdsMdsGlsGlsTl 1340,9 [M-4H]4- 85 36 1309 TmsGmsGmsCdsAdsGdsTdsTdsCdsTdsCdsCdsGdsCdsGmsGmsTm 2025,9 [M-3H]3- 86 36 1309 TgsGgsGgsCdsAdsGdsTdsTdsCdsTdsCdsCdsGdsCdsGgsGgsTg 1953,3 [M-3H]3- 87 37 1310 GlsMlsAlsGdsTdsTdsCdsTdsCdsCdsGdsCdsGlsGl 1538,2 [M-3H]3- 88 37 1310 GgsMgsAgsGdsTdsTdsCdsTdsCdsCdsGdsCdsGgsGg 1204,8 [M-4H]4- 89 38 1310 GlsGlsCdsAdsGdsTdsTdsCdsTdsCdsCdsGdsMlsGlsGl 1653,1 [M-3H]3- 90 39 1310 GlsGlsMlsAdsGdsTdsTdsCdsTdsCdsCdsGdsCdsGlsGl 1653,4 [M-3H]3- 91 39 1310 GgsGgsMgsAdsGdsTdsTdsCdsTdsCdsCdsGdsCdsGgsGg 1291,1 [M-4H]4-

[Таблица 1-5]

(Таблица 1, продолжение) 92 40 1310 GgsGgsMgsAdsGdsTdsTdsCdsTdsCdsCdsGdsMgsGgsGg 1312,0 [M-4H]4- 93 41 1310 GlsGlsMlsAdsGdsTdsTdsMdsTdsMdsMdsGdsMdsGlsGl 1253,9 [M-4H]4- 94 42 1472 MlsGlsTlsCdsGdsGdsAdsAdsGdsGdsTdsGlsGlsGl 4774,58 [M-H]- 95 43 1472 GlsMlsGlsTdsCdsGdsGdsAdsAdsGdsGdsTdsGlsGlsGl 1705,7 [M-3H]3- 96 44 1472 AlsGlsMlsGdsTdsCdsGdsGdsAdsAdsGdsGdsTdsGlsGlsGl 1815,1 [M-3H]3- 97 45 1472 MgsAgsGgsCdsGdsTdsCdsGdsGdsAdsAdsGdsGdsTgsGgsGdsGg 1499,9 [M-4H]4- 98 46 1473 AlsGlsMlsGdsTdsCdsGdsGdsAdsAdsGdsGdsTlsGlsGl 1700,3 [M-3H]3- 99 46 1473 AgsGgsMgsGdsTdsCdsGdsGdsAdsAdsGdsGdsTgsGgsGg 1336,7 [M-4H]4- 100 47 1473 AlsGlsMlsGdsTdsMdsGdsGdsAdsAdsGdsGdsTlsGlsGl 1278,6 [M-4H]4- 101 48 1473 MlsAlsGlsCdsGdsTdsCdsGdsGdsAdsAdsGdsGdsTlsGlsGl 1801,8 [M-3H]3- 102 48 1473 MmsAmsGmsCdsGdsTdsCdsGdsGdsAdsAdsGdsGdsTmsGmsGm 1956,1 [M-3H]3- 103 48 1473 MgsAgsGgsCdsGdsTdsCdsGdsGdsAdsAdsGdsGdsTgsGgsGg 1883,9 [M-3H]3- 104 48 1473 MgsAgsGgsCdsGdsTdsCdsGdsGdsAdsAdsGdsGgsTgsGdsGg 1413,0 [M-4H]4- 105 49 1473 MgsAgsGgsMdsGdsTdsMdsGdsGdsAdsAdsGdsGdsTgsGgsGg 1419,9 [M-4H]4- 106 50 1473 AgsMgsAdsGgsCdsGdsTdsCdsGdsGdsAdsAdsGdsGdsTgsGgsGg 1495,5 [M-4H]4- 107 50 1473 AgsMgsAgsGdsCdsGdsTdsCdsGdsGdsAdsAdsGdsGdsTgsGgsGg 1495,1 [M-4H]4- 108 51 1474 MlsAlsGlsCdsGdsTdsCdsGdsGdsAdsAdsGdsGdsTlsGl 1678,1 [M-3H]3- 109 52 1474 AlsMlsAlsGdsCdsGdsTdsCdsGdsGdsAdsAdsGdsGlsTlsGl 1797,1 [M-3H]3- 110 52 1474 AlsMlsAlsGdsCdsGdsTdsCdsGdsGdsAdsAdsGlsGlsTlsGl 1354,3 [M-4H]4- 111 53 1475 GlsAlsMlsAlsGdsCdsGdsTdsCdsGdsGdsAdsAdsGlsGlsTl 1354,4 [M-4H]4- 112 54 1476 GlsAlsMlsAdsGdsCdsGdsTdsCdsGdsGdsAdsAlsGlsGl 5073,96 [M-H]- 113 55 1476 AlsGlsAlsCdsAdsGdsCdsGdsTdsCdsGdsGdsAdsAlsGlsGl 1795,1 [M-3H]3- 114 56 1480 MgsMgsTgsAdsGdsAdsCdsAdsGdsCdsGdsTdsMgsGgsGg 1313,8 [M-4H]4-

[Таблица 1-6]

(Таблица 1, продолжение) 115 57 1480 GlsCdsMlsTlsAdsGdsAdsCdsAdsGdsCdsGdsTlsMlsGdsGl 1334,9 [M-4H]4- 116 58 1480 GlsMlsCdsTlsAdsGdsAdsCdsAdsGdsCdsGdsTlsCdsGlsGl 1331,3 [M-4H]4- 117 59 1480 GlsMlsCdsTlsAdsGdsAdsCdsAdsGdsCdsGdsTdsMlsGlsGl 1335,1 [M-4H]4- 118 59 1480 GlsMlsCdsTdsAdsGdsAlsCdsAdsGdsCdsGdsTdsMlsGlsGl 1335,2 [M-4H]4- 119 60 1480 GlsMlsMlsTdsAdsGdsAdsCdsAdsGdsCdsGlsTdsCdsGlsGl 1334,9 [M-4H]4- 120 60 1480 GlsMlsMlsTdsAdsGdsAdsCdsAdsGlsCdsGdsTdsCdsGlsGl 1335,2 [M-4H]4- 121 4 1480 GgsMgsMgsTdsAdsGdsAdsCdsAdsGdsCdsGdsTdsMgsGgsGg 1399,7 [M-4H]4- 122 4 1480 GlsMlsMlsTlsAdsGdsAdsCdsAdsGdsCdsGdsTdsMlsGlsGl 1345,4 [M-4H]4- 123 4 1480 GmsMmsMmsTdsAdsGdsAdsCdsAdsGdsCdsGdsTdsMmsGmsGm 1454,0 [M-4H]4- 124 61 1480 GlsMlsMlsTdsAdsGdsAdsMdsAdsGdsMdsGdsTdsMlsGlsGl 1345,3 [M-4H]4- 125 61 1480 GtsMtsMtsTdsAdsGdsAdsMdsAdsGdsMdsGdsTdsMtsGtsGt 1189,2 [M-5H]5- 126 61 1480 GusMusMusTdsAdsGdsAdsMdsAdsGdsMdsGdsTdsMusGusGu 1143,5 [M-5H]5- 127 61 1480 GmsMmsMmsTdsAdsGdsAdsMdsAdsGdsMdsGdsTdsMmsGmsGm 1168,8 [M-5H]5- 128 62 1480 GmsMmsMmsTdsAdsGdsAdsMdsAdsGdsMdsGdsUosMmsGmsGm 1172,0 [M-5H]5- 129 62 1480 GmsMmsMmsTdsAdsGdsAdsMdsAdsGdsMdsGosUosMmsGmsGm 1178,0 [M-5H]5- 130 63 1480 GmsMmsMmsUosAdsGdsAdsMdsAdsGdsMdsGdsTdsMmsGmsGm 1172,0 [M-5H]5- 131 63 1480 GmsMmsMmsUosAosGdsAdsMdsAdsGdsMdsGdsTdsMmsGmsGm 1178,0 [M-5H]5- 132 64 1480 GmsMmsMmsUosAdsGdsAdsMdsAdsGdsMdsGdsUosMmsGmsGm 1175,2 [M-5H]5- 133 65 214 MlsTlsMlsAdsGdsCdsTdsGdsGdsCdsGdsTlsGlsAl 4683,56 [M-H]- 134 66 1323 MlsMlsAlsGdsGdsAdsAdsAdsGdsAdsAdsTlsGlsGl 4748,41 [M-H]- 135 67 1458 GlsGlsGlsAdsGdsAdsCdsAdsTdsTdsCdsAlsGlsMl 4701,26 [M-H]- 136 68 1495 MlsTlsAlsAdsTdsCdsCdsAdsGdsGdsTdsTlsTlsGl 4641,35 [M-H]-

[0389]

Пример 6

Тест на активность DUX4 при нокдауне in vitro (метод липофекции)

Клетки C2C12 высевали при концентрации 1,25×10⁴ клеток/см² на реагент для трансфекции, в котором смешивали олигонуклеотид, модифицированный DUX4, и реагент Lipofectamine RNAi, и культивировали в течение ночи в инкубаторе с CO₂. На следующий день клетки трансфицировали репортерной плазмидой, в которой последовательность DUX4 была клонирована в несколько сайтов клонирования вектора psiCHECK-2 (Promega) с использованием реагента Lipofectamine 2000, и культивировали в инкубаторе с CO₂ в течение примерно 24 часов. После этого, используя систему анализа люциферазы Dual-Glo, с помощью планшет-ридера определяли значения внутриклеточной люциферазы Firefly и люминесценции Renilla. Чтобы скорректировать влияние эффективности трансфекции и количества клеток на величину люминесценции, обусловленную активностью люциферазы Renilla, рассчитывали отношение активности люциферазы Firefly к величине люминесценции. Степень ингибирования рассчитывали как процент от скорости снижения Renilla/Firefly при добавлении модифицированного олигонуклеотида, а значение IC₅₀ рассчитывали из концентраций в двух точках, составляющих 50%, и степени ингибирования в это время (таблица 2). По сравнению с соединениями (соединения №№ 1-132), которые комплементарны положениям 232-248, 1306-1325 или 1472-1495 зрелой мРНК DUX4, соединения №№ 133 (комплементарно положениям 214-227 SEQ ID NO: 1 в список последовательностей), 134 (комплементарно положениям 1323-1336 SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей), 135 (комплементарно положениям 1458-1471 SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей) и 136 (комплементарно положениям положения 1495-1508 SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей), как было обнаружено, имеют значительно более низкие уровни ингибирования.

[0390]

Пример 7

Тест на активность DUX4 при нокдауне in vitro (метод гимнозиса)

Клетки C2C12 высевали при 6×10³ клеток/см² в раствор олигонуклеотидов, модифицированных DUX4, и культивировали в инкубаторе с CO₂ в течение 2 ночей. Два дня спустя культуральную среду, содержащую раствор олигонуклеотида, модифицированного DUX4, удаляли из клеток, и клетки промывали свежей культуральной средой. После этого клетки трансфицировали репортерной плазмидой, в которой последовательность DUX4 была клонирована в несколько сайтов клонирования вектора psiCHECK-2 (Promega) с использованием реагента Lipofectamine 2000, и культивировали в инкубаторе с CO₂ в течение примерно 24 часов. После этого, используя систему анализа люциферазы Dual-Glo, с помощью планшет-ридера определяли значения внутриклеточной люциферазы Firefly и люминесценции Renilla. Чтобы скорректировать влияние эффективности трансфекции и количества клеток на величину люминесценции, обусловленную активностью люциферазы Renilla, рассчитывали отношение активности люциферазы Firefly к величине люминесценции. Степень ингибирования рассчитывали как процент от скорости снижения Renilla/Firefly, когда добавляли модифицированный олигонуклеотид, и значение IC₅₀ рассчитывали из концентраций в двух точках, составляющих 50%, и степени ингибирования в это время. Результаты показаны в таблице 2 ниже. По сравнению с соединениями (соединения №№ 1-132), содержащими последовательность нуклеиновых оснований, комплементарную части равной длины в области положений 232-248, 1306-1325 или 1472-1495 зрелой мРНК DUX4, соединения №№ 133 (комплементарно положениям 214-227 SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей), 134 (комплементарно положениям 1323-1336 SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей), 135 (комплементарно положениям 1458-1471 SEQ ID NO: 1 в список последовательностей) и 136 (комплементарно положениям 1495-1508 SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей), как было обнаружено, имеют значительно более низкие скорости ингибирования.

[Таблица 2-1]

Таблица 2 Соединение № IC₅₀[мкМ] Метод липофекции Метод гимнозиса 1 0,004 0,108 2 0,008 0,084 3 0,003 0,142 4 0,098 0,829 5 0,027 0,341 6 0,007 0,128 7 0,009 0,378 8 0,022 0,495 9 0,018 0,340 10 0,006 0,182 11 0,008 0,114 12 0,020 0,423 13 0,015 0,242 14 0,002 0,079 15 0,010 0,128 16 0,008 0,091 17 0,006 0,079 18 0,016 0,394 19 0,006 0,158 20 0,018 0,724 21 0,006 0,964 22 0,004 0,280 23 0,007 0,365 24 0,018 0,188 25 0,009 0,447 26 0,043 0,259 27 0,037 0,201 28 0,003 0,080 29 0,010 0,556 30 0,006 0,559 31 0,006 0,117 32 0,007 0,404 33 0,007 0,272 34 0,008 0,073

[Таблица 2-2]

(Таблица 2, продолжение) 35 0,009 0,105 36 0,006 0,390 37 0,003 0,133 38 0,005 0,125 39 0,006 0,143 40 0,002 0,051 41 0,007 0,184 42 0,008 0,166 43 0,008 0,148 44 0,009 0,174 45 0,023 0,699 46 0,003 0,109 47 0,005 0,181 48 0,005 0,166 49 0,009 0,261 50 0,003 0,206 51 0,005 0,419 52 0,006 0,414 53 0,016 0,164 54 0,010 0,402 55 0,006 0,052 56 <0,03 0,577 57 0,012 0,435 58 0,002 0,058 59 0,002 0,052 60 0,005 0,100 61 0,002 0,048 62 0,003 0,038 63 0,004 0,090 64 0,019 0,426 65 0,002 0,128 66 0,002 0,066 67 0,003 0,188 68 0,013 0,850 69 0,002 0,083 70 0,005 0,111

[Таблица 2-3]

(Таблица 2, продолжение) 71 0,002 0,037 72 0,002 0,072 73 0,005 0,292 74 0,002 0,079 75 0,005 0,237 76 0,003 0,073 77 0,004 0,091 78 0,010 0,132 79 0,010 0,099 80 0,009 0,373 81 0,003 0,115 82 0,011 0,529 83 0,003 0,113 84 0,007 0,207 85 0,017 0,400 86 0,005 0,106 87 0,005 0,097 88 0,007 0,154 89 0,019 0,434 90 0,008 0,077 91 0,009 0,148 92 0,015 0,763 93 0,007 0,135 94 <0,03 0,793 95 0,021 0,496 96 0,036 0,306 97 0,009 0,546 98 0,010 0,363 99 0,008 0,624 100 0,014 0,669 101 0,029 0,443 102 0,014 0,657 103 0,011 0,307 104 0,007 0,255 105 0,005 0,122 106 0,006 0,291

[Таблица 2-4]

(Таблица 2, продолжение) 107 0,004 0,321 108 0,076 0,877 109 0,075 0,730 110 0,020 0,266 111 0,017 0,223 112 0,050 0,616 113 0,016 0,569 114 0,013 0,259 115 0,011 0,531 116 0,003 0,112 117 0,003 0,092 118 0,015 0,461 119 0,004 0,467 120 0,004 0,456 121 0,008 0,239 122 0,006 0,289 123 0,013 0,154 124 0,003 0,338 125 0,010 0,272 126 0,004 0,159 127 0,003 0,093 128 0,006 0,256 129 0,008 0,088 130 0,003 0,079 131 0,005 0,245 132 0,006 0,294 133 >0,3 >3 134 >0,3 >3 135 0,140 >3 136 >0,3 >3

[0391]

Пример 8

Синтез модифицированного олигонуклеотидного соединения и тест на активность DUX4 при нокдауне in vitro (метод гимнозиса)

В таблице 3 показаны вновь синтезированные модифицированные олигонуклеотидные соединения и результаты исследований на активность DUX4 при нокдауне in vitro, проведенных с соединениями таким же образом, как в примере 7.

[0392]

В обозначениях соединений каждый нуклеотид представлен тремя буквами. Однако 3ʼ-концевой нуклеотид представлен двумя буквами, поскольку межнуклеозидная связь отсутствует.

1) Первая буква заглавная и указывает на следующие азотные основания:

A=аденин, T=тимин, G=гуанин, C=цитозин, U=урацил, M=5-метилцитозин;

2) вторая буква указывает на следующие сахарные фрагменты:

l=LNA, m=ALNA[Ms], e=2ʼ-MOE, o=2ʼ-OMe, d=2ʼ-дезоксирибоза,

3) третья буква указывает на следующие межнуклеозидные связи:

s=фосфоротиоат, p=фосфодиэфир.

Положение-мишень указывает 5ʼ-сайт-мишень зрелой мРНК DUX4 модифицированного олигонуклеотида (положение SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей, соответствующее 3ʼ-концу модифицированного олигонуклеотида).

[0393]

По сравнению с соединениями (соединения № 137-247), содержащими последовательность нуклеиновых оснований, комплементарную части равной длины в области положений 126-147, 232-248, 1306-1325 или 1472-1495 зрелой мРНК DUX4, соединения №№ 248 (комплементарно положениям 112-127 SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей), 249 (комплементарно положениям 162-177 SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей), 250 (комплементарно положениям 264-279 SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей) и 251 (комплементарно положениям 1273-1288 SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей), как было обнаружено, имеют значительно более низкие уровни ингибирования.

[0394]

[Таблица 3-1]

[0395]

[Таблица 3-2]

[0396]

Пример 9

Тест на активность DUX4 при нокдауне in vivo

Готовили аденоассоциированный вирусный вектор AAV-DUX4 (SignaGen Laboratories, № по каталогу SL100862), включающий зрелую мРНК DUX4 с SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей. Под анестезией изофлураном (Pfizer Inc.) в переднюю большеберцовую мышцу 8-недельных мышей C57BL/6J (самцы, Charles River, Япония) внутримышечно вводили AAV-DUX4 в дозе 1E+10 VG/50 мкл. Три дня спустя в физиологическом растворе готовили модифицированные олигонуклеотиды, нацеленные на DUX4, в концентрации 1, 3, 10 и 50 мг/(5 мл)/кг и через хвостовую вену вводили 8-недельным мышам C57BL/6J (самцы, Charles River, Япония). Через 72 часа из полой вены брюшной полости под цервикальной дислокацией или анестезией изофлураном (Pfizer Inc.) собирали цельную кровь и мышей умерщвляли. После этого отбирали переднюю большеберцовую мышцу, погружали в RNAlater Soln (invitrogen) и замораживали при -80ºC. К ткани добавляли буфер для гомогенизации Maxwell RSC JustRNA Tissue Kit (Promega), ткань измельчали с использованием шейкера с несколькими шариками, и РНК очищали в соответствии с протоколом, прилагаемым к набору. 400 нг РНК подвергали обратной транскрипции и проводили количественную ПЦР с использованием полученной кДНК. Активность модифицированного олигонуклеотида при нокдауне выражали как количественное отношение DUX4 к 18S рРНК по отношению к группе носителя. Результаты для 1, 3, 10 и 50 мг/(5 мл)/кг показаны на фиг. 1-4. Соединение № 1 (последовательность, комплементарная положениям 233-248 DUX4 зрелой мРНК), соединение № 2 (последовательность, комплементарная положениям 1309-1323 DUX4 зрелой мРНК), соединение № 3 (последовательность, комплементарная положениям 1480-1495 DUX4 зрелой мРНК), соединение № 13 (последовательность, комплементарная положениям 234-247 DUX4 зрелой мРНК), соединение № 41 (последовательность, комплементарная положениям 1308-1323 DUX4 зрелой мРНК), соединение № 54 (последовательность, комплементарная положениям 1309-1323 DUX4 зрелой мРНК), соединение № 57 (последовательность, комплементарная положениям 1309-1323 DUX4 зрелой мРНК), соединение № 68 (последовательность, комплементарная положениям 1309-1323 DUX4 зрелой мРНК), соединение № 78 (последовательность, комплементарная положениям 1309-1324 DUX4 зрелой мРНК), соединение № 88 (последовательность, комплементарная положениям 1310-1323 DUX4 зрелой мРНК), соединение № 104 (последовательность, комплементарная положениям 1473-1488 DUX4 зрелой мРНК), соединение № 122 (последовательность, комплементарная положениям 1480-1495 DUX4 зрелой мРНК) были способны подавлять экспрессию гена DUX4 в мышцах даже при введении в живой организм.

[0397]

Пример 10

Безопасность модифицированного олигонуклеотида

При внутривенном введении соединений №№ 3, 42 и 123 6-недельным мышам ICR (самцы, Charles River, Япония) в максимальной дозе 100 мг/кг токсичность для печени (повышение в крови ALT и AST и гистопатологические отклонения), почечная токсичность (повышение в крови UN и креатинина и гистопатологические отклонения), изменения общих симптомов, смертности и тому подобное не наблюдались.

[0398]

Пример 11

Тест на активность DUX4 при нокдауне на мышах Tg in vivo

Использовали 9-недельных самцов FLExDUX4-heteto/HSA-MCM-hetero: TG (DUX4-Tg) и FLExDUX4-wild/HSA-MCM-hetero: TG (MCM, контроль) (самец, доставленный в Charles River Japan из The Jackson Laboratory). Модифицированный олигонуклеотид, нацеленный на DUX4, готовили в физиологическом растворе таким образом, чтобы вводимая жидкость каждой дозы составляла 5 мл/кг, и вводили еженедельно через хвостовую вену. Через неделю после 4-недельного введения цельную кровь собирали из брюшной полой вены под изофлурановой анестезией, и мышь подвергали эвтаназии. Плазму с EDTA отделяли и проводили определение креатинкиназы (СК). Брали мышцу нижней конечности, измеряли влажный вес и подвергали мышцу анализу экспрессии гена.

Как показано на фиг. 5 и 6, соединение № 3 и соединение № 123 подавляли экспрессию мРНК DUX4. Кроме того, уровень СК в крови как маркера миопатии был снижен. С другой стороны, в случае соединения № 113 и соединения № 247 явного влияния на экспрессию мРНК DUX4 и уровень CK в крови не было.

[0399]

Пример 12

Тест на токсичность при непрерывном введении мышам

Модифицированный олигонуклеотид, нацеленный на DUX4, готовили в физиологическом растворе в концентрации 100 мг/(5 мл)/кг и вводили через хвостовую вену 6-недельным мышам ICR (самец, Charles River Japan) в течение четырех дней подряд. Через 72 часа после последнего введения под изофлурановой анестезией из задней полой вены отбирали кровь и проводили клиническое биохимическое исследование. Кроме того, после того, как мышь была умерщвлена путем обескровливания, осуществляли вскрытие, и печень и почка подвергли гистопатологическому исследованию. В случае соединения № 123 после введения не было смертности, и не наблюдались изменения в общем состоянии, потреблении пищи и массе тела, а также гепатотоксичности (повышение ALT и AST в сыворотке и гистопатологические отклонения) и нефротоксичности (увеличение UN и креатинина в сыворотке, и гистопатологические отклонения). С другой стороны, после введения соединения № 113 и соединения № 247, хотя не было смертности и изменений в общем состоянии, потреблении пищи и массе тела, в случае обоих соединений наблюдалась явная гепатотоксичность (повышение уровней ALT, AST, GLDH, ALP, билирубина и желчной кислоты в сыворотке и гистопатологические аномалии: дегенеративный некроз гепатоцитов и гипертрофия гепатоцитов) и нефротоксичность (повышение креатинина в сыворотке). Кроме того, концентрации соединения № 123 в печени и почках составляли, соответственно, 323 и 251 мкг/г, и гепатотоксичность и нефротоксичность отсутствовали, несмотря на то, что концентрации соединения № 123 в тканях были сравнимы или превышали концентрации 111 и 185 мкг/г в печени и почках в случае соединения № 247 и концентрации 39,3 и 235 мкг/г соединения № 113 в печени и почках в случае соединения № 113.

[0400]

[Таблица 4]

Биохимическое исследование крови в тесте непрерывного введения мышам

Предмет исследования Контрольная группа Соединение № 123 Контрольная группа Соединение № 247 Соединение № 113 AST (ЕД/Л) 53,8 60,2 38,0 1187,0 1355,8 ALT (ЕД/Л) 30,4 38,6 17,6 2300,2 1282,8 GLDH (ЕД/Л) 16,0 36,0 7,0 813,2 768,8 ALP (ЕД/Л) 340,2 345,2 204,2 1063,8 640,6 T-Bil (мг/дл) 0,086 0,052 0,106 1,208 0,298 D-Bil (мг/дл) 0,024 0,012 0,044 1,086 0,238 I-Bil (мг/дл) 0,062 0,040 0,062 0,122 0,060 TBA (мкмоль/л) 0,80 1,60 0,90 28,02 63,32 UN (мг/дл) 20,34 18,62 18,32 23,02 23,20 Cre (мг/дл) 0,056 0,054 0,062 0,126 0,152

[0401]

[Таблица 5]

Результаты патологических исследований в тесте непрерывного введения мышам

Результаты патологических исследований Контрольная группа Соедин.№ 123 Контрольная группа Соедин. № 247 Соедин. № 113 Дегенеративный некроз гепатоцитов 0/5 0/5 0/5 3/5 4/5 Гипертрофия гепатоцитов 0/5 0/5 0/5 4/5 5/5

[0402]

Ссылочный пример

Ниже приведены схемы методов синтеза ALNA [Ms]-содержащих нуклеотидов, ALNA [mU]-содержащих нуклеотидов, ALNA [ipU]-содержащих нуклеотидов, ALNA [Trz]-содержащих нуклеотидов, ALNA [Oxz]-содержащих нуклеотидов. Исходные соединения (1a, 1d и 1g) можно синтезировать с использованием метода, описанного в WO 2017/047816.

[0403]

Синтез ALNA [Ms]-T

[0404]

Синтез ALNA [Ms]-mC

[0405]

Синтез ALNA [Ms]-G

[0406]

Синтез ALNA [Ms]-A

[0407]

Синтез ALNA [mU]-T

[0408]

Синтез ALNA [mU]-mC

[0409]

Синтез ALNA [mU]-G

[0410]

Синтез ALNA [mU]-A

[0411]

Синтез ALNA [ipU]-T

[0412]

Синтез ALNA [ipU]-mC

[0413]

Синтез ALNA [ipU]-G

[0414]

Синтез ALNA [ipU]-A

[0415]

Синтез ALNA [Trz]-T

[0416]

Синтез ALNA [Trz]-mC

[0417]

Синтез ALNA [Trz]-G

[0418]

Синтез ALNA [Trz]-A

[0419]

Синтез ALNA [Oxz]-T

[0420]

Синтез ALNA [Oxz]-mC

[Промышленная применимость]

[0421]

Модифицированный олигонуклеотид по настоящему изобретению может быть использован в качестве соединения, применяемого для терапевтического лечения, предотвращения или замедления прогрессирования заболевания, связанного с DUX4.

[Пояснительный вариант перевода списка последовательностей]

[0422]

SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей показывает последовательности оснований DUX4 зрелой мРНК.

SEQ ID NO. 2-4 и 7-109 в списке последовательностей показывают последовательности оснований модифицированных олигонуклеотидов.

SEQ ID NO: 5-6 в списке последовательностей, соответственно, показывают последовательности оснований DUX4-FL2 и DUX4 в качестве вариантов сплайсинга SEQ ID NO: 1.

Предложенная группа изобретений относится к области биотехнологии и может быть использована в медицине. Раскрываются модифицированные олигонуклеотиды, способные к ингибированию экспрессии гена двойного гомеобокса 4 (DUX4). Изобретение может быть применимо при лечении заболеваний, связанных аномальной экспрессий указанного гена у индивидуума, в частности при антисмысловой генной терапии фациоскапуло-плечевой мышечной дистрофии (FSHD), В-клеточного острого лимфоцитарного лейкоза, дифференцированной круглоклеточной саркомы и рабдомиосаркомы плода.10 н. и 19 з.п. ф-лы, 6 ил., 5 табл., 12 пр.

1. Модифицированный олигонуклеотид для ингибирования экспрессии двойного гомеобокса 4, состоящий из 12-30 остатков, включающий:

последовательность нуклеиновых оснований, которая включает по меньшей мере 8 непосредственно примыкающих друг к другу последовательностей нуклеиновых оснований и комплементарна части равной длины в положениях 126-147, 232-248, 1306-1325 или 1480-1495 от 5ʼ-конца последовательности нуклеиновых оснований зрелой мРНК двойного гомеобокса 4 в SEQ ID NO: 1,

где последовательность нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида имеет по меньшей мере 90% комплементарности с частью равной длины в последовательности нуклеиновых оснований зрелой мРНК двойного гомеобокса 4 в SEQ ID NO: 1, и, когда по меньшей мере 8 непосредственно примыкающих друг к другу последовательностей нуклеиновых оснований включают последовательность нуклеиновых оснований, которая комплементарна части равной длины в положениях 1480-1495 от 5ʼ-конца последовательности нуклеиновых оснований SEQ ID NO: 1, модифицированный олигонуклеотид состоит из последовательности нуклеиновых оснований, имеющей на 3ʼ-конце основание, комплементарное основанию в положении 1480 от 5ʼ-конца нуклеинового основания SEQ ID NO: 1,

где один или несколько модифицированных нуклеотидов модифицированного олигонуклеотида включают модифицированный сахар.

2. Модифицированный олигонуклеотид по п.1, где модифицированный сахар выбран из группы, состоящей из бициклического сахара, модифицированного 2ʼ-O-метоксиэтил-модифицированного сахара и 2ʼ-O-метил-модифицированного сахара.

3. Модифицированный олигонуклеотид по п.2, где бициклический сахар выбран из группы, включающей LNA, GuNA, ALNA [Ms], ALNA [mU], ALNA [ipU], ALNA [Oxz] и ALNA [Trz].

4. Модифицированный олигонуклеотид для ингибирования экспрессии двойного гомеобокса 4, состоящий из 12-30 остатков, содержащий:

последовательность нуклеиновых оснований, которая включает по меньшей мере 8 непосредственно примыкающих друг к другу последовательностей нуклеиновых оснований и комплементарна части равной длины в положениях 1472-1495 от 5ʼ-конца последовательности нуклеиновых оснований зрелой мРНК двойного гомеобокса 4 в SEQ ID NO: 1,

где последовательность нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида имеет по меньшей мере 90% комплементарности с частью равной длины в последовательности нуклеиновых оснований зрелой мРНК двойного гомеобокса 4 в SEQ ID NO: 1, и модифицированный олигонуклеотид включает по меньшей мере один нуклеозид, который включает модифицированный сахар, выбранный из группы, состоящей из GuNA, ALNA [Ms], ALNA [mU], ALNA [ipU], ALNA [Oxz] и ALNA [Trz].

5. Модифицированный олигонуклеотид по п.4, дополнительно содержащий:

2ʼ-O-метоксиэтил-модифицированный сахар и/или 2ʼ-O-метил-модифицированный сахар.

6. Модифицированный олигонуклеотид по любому из пп.1-5, где по меньшей мере один модифицированный нуклеотид модифицированного олигонуклеотида включает модифицированное нуклеиновое основание.

7. Модифицированный олигонуклеотид по п.6, где модифицированное нуклеиновое основание представляет собой 5-метилцитозин.

8. Модифицированный олигонуклеотид по любому из пп.1-7, где по меньшей мере одна межнуклеозидная связь представляет собой модифицированную межнуклеозидную связь.

9. Модифицированный олигонуклеотид по п.8, где модифицированная межнуклеозидная связь представляет собой фосфоротиоатную межнуклеозидную связь.

10. Модифицированный олигонуклеотид по любому из пп.1-9, включающий:

1) сегмент гэпа,

2) сегмент 5ʼ-крыла и

3) сегмент 3ʼ-крыла,

где сегмент гэпа расположен между сегментом 5ʼ-крыла и сегментом 3ʼ-крыла, все нуклеозиды сегмента 5ʼ-крыла и сегмента 3ʼ-крыла, каждый, включают по меньшей мере один модифицированный сахар, и сегмент гэпа включает только нуклеозиды, которые не содержат модифицированный сахар, или включает один или два нуклеозида, каждый из которых содержит модифицированный сахар, и включает другие нуклеозиды, которые не содержат модифицированный сахар.

11. Модифицированный олигонуклеотид по любому из пп.1-10, состоящий из:

последовательности нуклеиновых оснований, которая комплементарна последовательности нуклеиновых оснований в положениях 128-143 от 5ʼ-конца последовательности нуклеиновых оснований, последовательности нуклеиновых оснований в положениях 232-247 от 5ʼ-конца, последовательности нуклеиновых оснований в положениях 233-248 от 5ʼ-конца, последовательности нуклеиновых оснований в положениях 1309-1323 от 5ʼ-конца или последовательности нуклеиновых оснований в положениях 1480-1495 от 5ʼ-конца зрелой мРНК двойного гомеобокса 4 в SEQ ID NO: 1.

12. Модифицированный олигонуклеотид по любому из пп.1-11, состоящий из:

последовательности оснований gtggcgatgc ccgggt (SEQ ID NO: 75), gagattcccg cnggtg (SEQ ID NO: 78: n представляет собой 5-метилцитозин), ngagattcccgccggt (SEQ ID NO: 2: n представляет собой 5-метилцитозин), gnagttctccgcggt (SEQ ID NO: 3: n представляет собой 5-метилцитозин) или gnntagacagcgtngg (SEQ ID NO: 4: n представляет собой 5-метилцитозин).

13. Модифицированный олигонуклеотид по п.12, представленный следующей формулой,

GlsMlsMlsTdsAdsGdsAdsCdsAdsGdsCdsGdsTdsMlsGlsGl,

где нуклеиновые основания представлены следующими символами:

A=аденин, T=тимин, G=гуанин, C=цитозин и M=5-метилцитозин;

сахарные компоненты представлены следующими символами:

l=LNA и d=2ʼ-дезоксирибоза;

и межнуклеозидные связи представлены следующим символом:

s=фосфоротиоат.

14. Модифицированный олигонуклеотид по п.12, представленный следующей формулой,

GmsMmsMmsTdsAdsGdsAdsCdsAdsGdsCdsGdsTdsMmsGmsGm,

где нуклеиновые основания представлены следующими символами:

A=аденин, T=тимин, G=гуанин, C=цитозин и M=5-метилцитозин;

сахарные компоненты представлены следующими символами:

m=ALNA [Ms] и d=2ʼ-дезоксирибоза;

и межнуклеозидные связи представлены следующим символом:

s=фосфоротиоат.

15. Модифицированный олигонуклеотид по п.12, представленный следующей формулой,

GmsMmsAmsGdsTdsTdsCdsTdsCdsCdsGdsCdsGmsGmsTm,

где нуклеиновые основания представлены следующими символами:

A=аденин, T=тимин, G=гуанин, C=цитозин и M=5-метилцитозин;

сахарные компоненты представлены следующими символами:

m=ALNA [Ms], и d=2ʼ-дезоксирибоза;

и межнуклеозидные связи представлены следующим символом:

s=фосфоротиоат.

16. Модифицированный олигонуклеотид по п.12, представленный следующей формулой,

MlsGlsAlsGdsAdsTdsTdsCdsCdsCdsGdsCdsCdsGlsGlsTl,

где нуклеиновые основания представлены следующими символами:

A=аденин, T=тимин, G=гуанин, C=цитозин и M=5-метилцитозин; сахарные компоненты представлены следующими символами:

l=LNA и d=2ʼ-дезоксирибоза;

и межнуклеозидные связи представлены следующим символом:

s=фосфоротиоат.

17. Модифицированный олигонуклеотид по п.13, представленный следующей формулой, или его соль:

18. Модифицированный олигонуклеотид по п.14, представленный следующей формулой, или его соль:

19. Модифицированный олигонуклеотид по п.15, представленный следующей формулой, или его соль:

20. Модифицированный олигонуклеотид по п.16, представленный следующей формулой, или его соль:

21. Модифицированный олигонуклеотид для ингибирования экспрессии двойного гомеобокса 4, представленный следующей формулой, или его соль:

22. Модифицированный олигонуклеотид для ингибирования экспрессии двойного гомеобокса 4, представленный следующей формулой, или его соль:

23. Модифицированный олигонуклеотид для ингибирования экспрессии двойного гомеобокса 4, представленный следующей формулой, или его соль:

24. Модифицированный олигонуклеотид для ингибирования экспрессии двойного гомеобокса 4, представленный следующей формулой, или его соль:

25. Фармацевтическая композиция для лечения, предотвращения или задержки развития заболевания, связанного с двойным гомеобоксом 4, содержащая:

эффективное количество модифицированного олигонуклеотида по любому из пп.1-24 или его фармацевтически приемлемой соли,

при этом заболевание, связанное с двойным гомеобоксом 4, представляет собой заболевание, выбранное из группы, состоящей из фациоскапуло-плечевой мышечной дистрофии, В-клеточного острого лимфоцитарного лейкоза, дифференцированной круглоклеточной саркомы и рабдомиосаркомы плода.

26. Фармацевтическая композиция по п.25, где заболевание, связанное с двойным гомеобоксом 4, представляет собой фациоскапуло-плечевую мышечную дистрофию.

27. Способ терапевтического лечения, предотвращения или замедления прогрессирования заболевания, связанного с двойным гомеобоксом 4, у субъекта, где способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества модифицированного олигонуклеотида по любому из пп.1-24,

при этом заболевание, связанное с двойным гомеобоксом 4, представляет собой заболевание, выбранное из группы, состоящей из фациоскапуло-плечевой мышечной дистрофии, В-клеточного острого лимфоцитарного лейкоза, дифференцированной круглоклеточной саркомы и рабдомиосаркомы плода.

28. Применение модифицированного олигонуклеотида по любому из пп.1-24 при изготовлении медицинского препарата для терапевтического лечения, предотвращения или замедления прогрессирования заболевания, связанного с двойным гомеобоксом 4, при этом заболевание, связанное с двойным гомеобоксом 4, представляет собой заболевание, выбранное из группы, состоящей из фациоскапуло-плечевой мышечной дистрофии, В-клеточного острого лимфоцитарного лейкоза, дифференцированной круглоклеточной саркомы и рабдомиосаркомы плода.

29. Применение модифицированного олигонуклеотида по любому из пп.1-24 для терапевтического лечения, предотвращения или замедления прогрессирования заболевания, связанного с двойным гомеобоксом 4, при этом заболевание, связанное с двойным гомеобоксом 4, представляет собой заболевание, выбранное из группы, состоящей из фациоскапуло-плечевой мышечной дистрофии, В-клеточного острого лимфоцитарного лейкоза, дифференцированной круглоклеточной саркомы и рабдомиосаркомы плода.