Штамм "А/Египет/Africa G-IV/2022" вируса ящура Aphtae epizooticae генотипа А/AFRICA/G-IV для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура Российский патент 2024 года по МПК C12N7/00 A61K39/135 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, может быть использовано для разработки и изготовления средств диагностики, специфической профилактики ящура генотипа А/AFRICA/G-IV и контроля антигенной и иммуногенной активности противоящурных вакцин.

Ящур остается одним из наиболее важных инфекционных заболеваний домашнего скота в мире, поражающим множество видов парнокопытных животных [1]. Вирус ящура – афтовирус из семейства Picornaviridae. На сегодняшний день идентифицировано семь различных серотипов (O, A, C, Азия-1, SAT-1, SAT-2 и SAT-3) и более 60 генотипов, причем в последние годы активно распространяются представители серотипа А, которые являются весьма разнообразными из представленных серологических типов [2, 3].

В пределах одного генотипа вируса ящура имеет место явление мутационной изменчивости генома и, как следствие, строения и функций белковых молекул, что приводит к возникновению новых изолятов, которые отличаются по степени вирулентности и иммуногенности от ранее выделенных штаммов вируса ящура.

Различия между генотипами вируса ящура определяют при анализе нуклеотидной последовательности 1D-гена (белок VP₁), который характеризуется высокой геномной и антигенной вариабельностью [1, 2, 3]. Данный структурный белок является наиболее изменчивым по своему аминокислотному составу, поскольку на него приходится не менее 90% мутаций всех структурных генов. Самыми вариабельными областями считаются участки 40-60, 130-160 и 190-213 а.о. [4, 5, 6]. Филогенетический анализ на основе нуклеотидной последовательности 1D-гена (белок VP₁) широко используется для вывода эволюционной динамики, эпидемиологических отношений между генетическими линиями и для отслеживания происхождения и перемещения штаммов вируса ящура [2].

Антигенные вариации возникают из-за аминокислотных мутаций, которые изменяют распознавание вирусных белков иммунной системой организма. Поверхностно открытые структуры вируса особенно подвержены иммунной атаке. Процесс появления новых антигенных форм определяется сложным взаимодействием поверхностных вирусных белков и факторов клеток-хозяев [5, 6].

Борьба с ящуром заключается в проведении своевременных профилактических мероприятий, таких как эффективный эпидемиологический контроль за болезнью; вакцинирование против ящура домашних и сельскохозяйственных животных; надзор за передвижением диких парнокопытных животных в приграничных районах, подверженных риску проникновения возбудителя из стран, неблагополучных по ящуру; мониторинговые исследования по оценке иммунного статуса сельскохозяйственного и домашнего скота, включая ретроспективную диагностику ящура [7].

Высокое генетическое и антигенное разнообразие изолятов и штаммов вируса ящура серотипа А приводит к проблемам в специфической профилактике ящура при применении культуральных инактивированных противоящурных вакцин, а также затрудняет штаммоспецифическую диагностику выделенных изолятов вируса ящура. В результате возникает необходимость создания новых средств диагностики и специфической иммунопрофилактики в отношении вируса ящура серотипа А и, в частности, генотипа А/AFRICA/G-IV, представители которого активно распространяются на территории Африканского континента. В результате возникает необходимость создания новых средств диагностики и специфической иммунопрофилактики в отношении ящура генотипа А/AFRICA/G-IV.

На протяжении многих лет периодически фиксировали вспышки ящура генотипа А/AFRICA/G-IV в странах Северной Африки, в частности, в Египте, Ливии, Судане. В настоящее время проводятся исследования, по результатам которых выявляют распространение вируса ящура данного генотипа на территорию стран Ближнего Востока. Наличие тесных торговых отношений Российской Федерации с этими государствами является угрожающим фактором в отношении распространения возбудителя ящура на территории нашей страны и требует исследования штаммов данного генотипа для создания средств диагностики и специфической профилактики ящура генотипа А/AFRICA/G-IV.

В настоящее время известны производственные штаммы вируса ящура типа А, которые применяются для производства средств специфической профилактики ящура:

- штамм «А₂₂/Ирак 24/64» (генотип A/ASIA/Iraq-64),

- штамм «А/Турция/06» (генотип A/ASIA/Iran-05),

- штамм «А №2166/Краснодарский/2013» (генотип A/ASIA/Iran-05^SIS-10),

- штамм «А №2155/Забайкальский/2013» (генотип A/ASIA/Sea-97),

- штамм «А №2269/ВНИИЗЖ/2015» (генотип A/ASIA/G-VII),

- штамм «А 2205/G IV» (генотип A/AFRICA/G-IV) (прототип),

- штамм «А/Танзания/2013» (генотип A/AFRICA/G-I).

Изолят вируса ящура серотипа А был выделен из патологического материала, отобранного в 2022 году от крупного рогатого скота в деревне Al-Aawinia района Adfo провинции Aswan Арабской Республики Египет, и был передан в ФГБУ «ВНИИЗЖ» из научно-исследовательского института здоровья животных (Animal Health Research Institute of the Agricultural Research Center, Арабская Республика Египет).

При проведении научных исследований в ФГБУ «ВНИИЗЖ» изолят был охарактеризован и получил название - штамм «А/Египет/Africa G-IV/2022».

По результатам сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей выделенный штамм принадлежит к генотипу А/AFRICA/G-IV вируса ящура, который значительно отличается от производственных штаммов вируса ящура серотипа А, в том числе, от штамма «А 2205/G IV».

Настоящее изобретение позволяет расширить арсенал производственных штаммов вируса ящура серотипа А, обладающих высокой инфекционной, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде, пригодный для контроля антигенной и иммуногенной активности вакцин, изготовления чувствительных и высокоспецифичных диагностических тест-систем и иммуногенных вакцинных препаратов путем получения штамма
«А/Египет/Africa G-IV/2022» вируса ящура для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа А/AFRICA/G-IV.

Штамм вируса ящура «А/Египет/Africa G-IV/2022» депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вирусов ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ», под регистрационным номером: №520 - деп / 23-70 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Экспериментально подтверждена возможность использования штамма «А/Египет/Africa G-IV/2022» вируса ящура для изготовления средств диагностики и профилактики ящура генотипа А/AFRICA/G-IV.

Сущность изобретения отражена на графическом изображении:

Фиг. 1. – Дендрограмма, отражающая филогенетическое взаимоотношение штамма «А/Египет/Africa G-IV/2022» вируса ящура с эпизоотическими штаммами серологического серотипа А. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей гена VР₁.

Фиг. 2. – Данные гель-электрофореза очищенного препарата антигена вируса ящура штамма «А/Египет/Africa G-IV/2022». Примечание: 1 – маркер молекулярного веса, 2 – исследуемая проба препарата антигена вируса ящура.

Фиг. 3 – Спектральный профиль фракций 146S компонента вируса ящура штамма «А/Египет/Africa G-IV/2022».

Сущность изобретения пояснена следующими перечнями последовательностей:

SEQ ID NO:1 представляет последовательность нуклеотидов 1D-гена белка VР₁ штамма «А/Египет/Africa G-IV/2022» вируса ящура генотипа А/AFRICA/
G-IV;

SEQ ID NO:2 представляет последовательность аминокислот 1D-гена белка VР₁ штамма «А/Египет/Africa G-IV/2022» вируса ящура генотипа А/AFRICA/
G-IV.

Штамм «А/Египет/Africa G-IV/2022» вируса ящура характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки

Штамм «А/Египет/Africa G-IV/2022» вируса ящура имеет следующую таксономию: сфера Riboviria, царство Orthornavirae, тип Pisuviricota, класс Pisoniviricetes, отряд Picornavirales, семейство Picornaviridae, род Aphthovirus, вид Foot-and-mouth disease virus, серотип А, генотип А/AFRICA/G-IV. Штамм возбудителя обладает следующими морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона иксаэдрическая, размер 26 нм. Вирион состоит из молекулы одноцепочечной положительно заряженной молекулы РНК и 60 копий полипептида, каждый из которых представлен белками VP₄, VP₂, VP₃, VP₁.

Антигенные свойства

По антигенным свойствам штамм «А/Египет/Africa G-IV/2022» вируса ящура относится к серотипу А. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности. У переболевших животных в сыворотке крови образуются типоспецифические антитела, выявляемые в иммуноферментном анализе и реакции микронейтрализации (РМН).

Методом нуклеотидного секвенирования была определена первичная структура 1D-гена белка VP₁ штамма «А/Египет/Africa G-IV/2022» вируса ящура. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм «А/Египет/Africa G-IV/2022» вируса ящура принадлежит к генотипу А/AFRICA/G-IV (Фиг. 1).

Антигенное родство (r₁) штамма «А/Египет/Africa G-IV/2022» вируса ящура изучено в реакции микронейтрализации вируса, в перекрестном исследовании штамма со специфическими сыворотками, полученными на следующие производственные штаммы вируса ящура:

- штамм «А₂₂/Ирак 24/64» (генотип A/ASIA/Iraq-64),

- штамм «А/Турция/06» (генотип A/ASIA/Iran-05),

- штамм «А №2166/Краснодарский/2013» (генотип A/ASIA/Iran-05^SIS-10),

- штамм «А №2155/Забайкальский/2013» (генотип A/ASIA/Sea-97),

- штамм «А №2269/ВНИИЗЖ/2015» (генотип A/ASIA/G-VII),

- штамм «А 2205/G IV» (генотип A/AFRICA/G-IV),

- штамм «А/Танзания/2013» (генотип A/AFRICA/G-I).

Титр референтных сывороток крови КРС, полученных путем иммунизации животных моновалентными вакцинами из производственных штаммов вируса ящура серотипа А, против 10² ТЦД₅₀ гомологичного и гетерологичного вируса определяли в РМН при перекрестном титровании, рассчитывая значения с использованием уравнения линейной регрессии, и выражали в lg. Значение r₁ определяли, как антилогарифм разности lg титров сыворотки против гетерологичного и гомологичного вируса [8, 9].

Значение r₁ в РМН интерпретировали следующим образом:

при ≥ 0,3 – исследуемый и производственный штаммы вируса ящура являются родственными;

при < 0,3 – исследуемый образец штамма вируса ящура значительно отличается от производственного штамма.

Максимальное родство отмечается при значении r₁ в РМН, стремящимся к 1,0.

Показатели антигенного родства при изучении штамма
«А/Египет/Africa G-IV/2022» составили r₁ от 0,01 до 0,27, что свидетельствует об отсутствии явного антигенного родства с производственными штаммами вируса ящура серотипа А, а именно: штамм «А₂₂/Ирак 24/64» (генотип A/ASIA/Iraq-64) – 0,12; штамм «А/Турция/06» (генотип A/ASIA/Iran-05) – 0,01;

штамм «А №2166/Краснодарский/2013» (генотип A/ASIA/Iran-05^SIS-10) – 0,04;

штамм «А №2155/Забайкальский/2013» (генотип A/ASIA/Sea-97) – 0,07;

штамм «А №2269/ВНИИЗЖ/2015» (генотип A/ASIA/G-VII) – 0,09;

штамм «А 2205/G IV» (генотип A/AFRICA/G-IV) – 0,27;

штамм «А/Танзания/2013» (генотип A/AFRICA/G-I) – 0,16.

Гено- и хемотаксономическая характеристики

Штамм «А/Египет/Africa G-IV/2022» вируса ящура является РНК(+) - содержащим вирусом с молекулярной массой 8,05×10⁶ Д. Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной молекулой молекулярной массой 2,80×10⁶ Д. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех основных белков VP₁, VP₂, VP₃ и VP₄. Липопротеидная оболочка отсутствует.

Основным антигенным белком является VP₁. В вирионе содержится приблизительно 31% РНК и 69% белка. Вирусная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса.

Физические свойства

Масса вириона составляет 8,45×10^-18 г. Плавучая плотность 1,48 г/см³.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм «А/Египет/Africa G-IV/2022» вируса ящура устойчив к эфиру, хлороформу, и ацетону. Наиболее стабилен при pH 7,45-7,70. Сдвиги pH в кислую и сильно щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам (выше 38,4⁰С).

Дополнительные признаки и свойства

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Патогенность - патогенен для парнокопытных животных.

Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.

Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 5 пассажей (срок наблюдения) на перевиваемых культурах.

Биотехнологические характеристики

Штамм «А/Египет/Africa G-IV/2022» вируса ящура репродуцируется в перевиваемых культурах клеток: почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), почки свиньи (IB-RS-2), почки сирийского хомячка (ВНК-21).

При испытании было проведено 5 последовательных пассажей штамма
«А/Египет/Africa G-IV/2022» вируса ящура в перевиваемых культурах клеток ПСГК-30, ВНК-21, IB-RS-2. Биологические свойства характеризовали путем определения инфекционной активности вируса каждого пассажа в перевиваемой клеточной линии IB-RS-2 и на естественно восприимчивых животных – крупном рогатом скоте (КРС) и свиньях.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его исследования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Исследование биологических свойств штамма
«А/Египет/Africa G-IV/2022» вируса ящура при репродукции в монослойных перевиваемых клеточных линиях.

При выделении изолята вируса ящура с целью получения его однородной популяции, обладающей оптимальными биотехнологическими свойствами, использовали комплекс биологических, вирусологических и биохимических методов, предусмотренных методическими указаниями по выявлению и идентификации штаммов вируса ящура [8].

Биологические и вирусологические методы включали в себя метод выделения в клеточной линии и адаптацию изолята вируса ящура к ним.

Процесс выделения возбудителя ящура проводили в монослойных перевиваемых клеточных линиях ПСГК-30, IB-RS-2, ВНК-21 с последующей адаптацией в течение 5 последовательных пассажей. Культуры клеток выращивали в соответствующих питательных средах, в стационарных условиях во флаконах с площадью поверхности 25,0 см², отмывали от ростовой среды и заражали 30%-ной суспензией афтозного материала (множественность заражения составляла 1-10 ТЦД₅₀ на клетку), приготовленной в среде Игла DMEM с 2% сыворотки крови телят. Для удаления микрофлоры и балластных клеточных компонентов вирусную суспензию предварительно обрабатывали 10%-ным раствором хлороформа.

После 30-минутного контакта вируса с клеточной культурой при температуре 37,0±0,1⁰C во флаконы вносили поддерживающую среду и инкубировали при температуре 37,0±0,1⁰C до появления цитопатического действия (ЦПД) в культуре клеток, которое представлено в виде округления клеток, повышения их оптической плотности, дегенерации и отделении клеток от поверхности субстрата. При ЦПД не менее 95% клеток, флаконы подвергали замораживанию-оттаиванию, очистке клеточной взвеси хлороформом и центрифугированию при 3000 g в течение 15 мин. Полученный вируссодержащий материал использовали для последующих пассажей. Вирус считался адаптированным к культурам клеток, если в течение не менее 24 часов проявлялось 95-100% ЦПД в монослое клеточных культур. Адаптация эпизоотического изолята к различным клеточным линиям наступала на уровне пятого пассажа. Титр инфекционной активности вируса ящура определяли с помощью разработанной ранее методики [10].

Результаты адаптации вируса к различным клеточным культурам представлены в таблице 1, данные которой свидетельствуют о высокой адаптационной способности изолята вируса ящура к использованным клеточным линиям. В монослойной культуре клеток ПСГК-30 за 13-14 ч получали вирусную суспензию с активностью в РСК 1:16 и титром инфекционной активности 7,35±0,10 lg ТЦД₅₀/см³. В монослойной культуре клеток IB-RS-2 за 18-19 ч получали вирусную суспензию с активностью в РСК 1:16 и титром инфекционной активности 7,10±0,10 lg ТЦД₅₀/см³. В монослойной культуре клеток ВНК-21 за 19-20 ч получали вирусную суспензию с активностью в РСК 1:16 и титром инфекционной активности 7,00±0,10 lg ТЦД₅₀/см³. Каждое исследование и культивирование проводили 8 раз. В итоге получен штамм
«А/Египет/Africa G-IV/2022» с охарактеризованными биологическими культуральными свойствами, который далее использовали для исследования его свойств.

Пример 2. Исследование биологических свойств штамма
«А/Египет/Africa G-IV/2022» вируса ящура на крупном рогатом скоте.

Заражение КРС исходным штаммом вируса ящура проводили интрадермолингвально (I пассаж). Адаптацию и наработку штамма
«А/Египет/Africa G-IV/2022» вируса ящура на КРС проводили в течение двух последовательных пассажей. С целью определения титра инфекционной активности адаптированного штамма из афт на этапе второго пассажа на КРС получали 10%-ную вирусную суспензию, из которой готовили последовательные 10-кратные разведения в 1/15 М фосфатно-солевом буферном растворе (ФСБР). Подготовленные разведения с 10^-2 по 10^-6 вводили интрадермолингвально в 4 точки по 0,1 см³ двум головам КРС. Учёт результатов титрования на животных проводили спустя 24 ч по наличию афт на месте введения разведений вируса ящура штамма «А/Египет/Africa G-IV/2022». Титр инфекционной активности на КРС данного штамма вируса ящура на стадии первого пассажа на КРС составил 5,75 lg ИД₅₀/0,1 см³, второго пассажа – 6,25 lg ИД₅₀/0,1 см³. Таким образом, была получена 10%-ная афтозная суспензия вируса ящура штамма «А/Египет/Africa G-IV/2022» (2 пассаж на КРС) с титром инфекционной активности 6,25 lg ИД₅₀/0,1 см³.

Пример 3. Исследование биологических свойств штамма «А/Египет/Africa G-IV/2022» вируса ящура на свиньях.

Заражение свиней исходным штаммом «А/Египет/Africa G-IV/2022» вируса ящура проводили внутрикожно на стадии первого пассажа в область венчика передних конечностей. Адаптацию и наработку штамма «А/Египет/Africa G-IV/2022» вируса ящура на свиньях вели в течение двух последовательных пассажей. С целью определения титра инфекционной активности адаптированного штамма из афт второго пассажа на свиньях получали 10%-ную вирусную суспензию, из которой готовили последовательные 10-кратные разведения с использованием в качестве растворителя 1/15 М ФБР. Подготовленные разведения с 10^-2 по 10^-6 вводили внутрикожно в венчики копытец по 0,1 см³ в 4 точки на каждый палец конечности одного разведения, из расчета 1 разведение на 2 копытца 1 конечности каждому из 2 подопытных подсвинков.

Учёт результатов титрования проводили через 24 ч по наличию афт на месте введения разведений. Титр инфекционной активности на свиньях для штамма «А/Египет/Africa G-IV/2022» вируса ящура на свиньях на стадии первого пассажа составил 5,50 lg ИД₅₀/0,1 см³, второго – 6,00 lg ИД₅₀/0,1 см³.

Пример 4. Исследование биологических свойств штамма «А/Египет/Africa G-IV/2022» вируса ящура при репродукции в перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH.

Штамм «А/Египет/Africa G-IV/2022» вируса ящура репродуцировали в суспензионной перевиваемой культуре клеток из почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/SUSP/ARRIAH. В качестве поддерживающей среды использовали среду Игла DMEM, с добавлением ферментативного гидролизата мышц сухого, гидролизата белков крови сухого. Клеточную линию заражали вирусом из расчета 0,005 ТЦД₅₀/клетка.

Культивирование штамма «А/Египет/Africa G-IV/2022» вируса ящура осуществляли при температуре 37,0±0,1⁰С до достижения ЦПД вируса, соответствующего не менее 95%. Полученную вируссодержащую суспензию контролировали на стерильность и содержание 146S компонента и общего вирусного белка (ОВБ). Полученные суспензии были стерильными. Концентрация ОВБ в суспензии составляла 3,62±0,15 мкг/см³. Значения титра инфекционной активности вируса, а также процентное содержание 146S компонента штамма «А/Египет/Africa G-IV/2022» вируса ящура отражены в таблице 2, из данных которой видно, что при средней концентрации клеток BHK-21/SUSP/ARRIAH, равной 3,99±0,12 млн клеток/см³, дозе заражения 0,005 ТЦД₅₀/клетку и продолжительности репродукции вируса 12,00±0,47 ч средний титр инфекционной активности возбудителя ящура был равен 9,82±0,15 lg ТЦД₅₀/см³. Концентрацию 146S компонента вируса ящура определяли с помощью ранее разработанной методики [11]. Содержание данного компонента составило 74,77±0,51 % (2,70±0,11 мкг/см³).

Пример 5. Определение типовой специфичности и активности штамма «А/Египет/Africa G-IV/2022» вируса ящура.

Исследование типовой специфичности и активности штамма «А/Египет/Africa G-IV/2022» вируса ящура проводили в реакции связывания комплемента (РСК). К полученному антигену штамма «А/Египет/Africa G-IV/2022» вируса ящура, взятому в объеме 0,4 см³ в цельном виде и в разведениях 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64 добавляли по 0,1 см³ гомологичной и гетерологичных гипериммунных сывороток, полученных на вирус ящура в рабочем (удвоенном) титре и 0,1 см³ комплемента в рабочем разведении. Смесь выдерживали в водяной бане в течение 20 мин при температуре 37,0±0,1⁰С. Затем вносили по 0,2 см³ гемолитической системы и выдерживали 30 мин при температуре 37,0±0,1⁰С. Положительный результат реакции соответствовал 100%-ной задержке гемолиза эритроцитов барана («4 креста»). Параллельно проводили контрольные реакции без сыворотки, без комплемента и компонентов реакции.

В качестве реагентов в РСК использовали сыворотки ящурные типоспецифические гипериммунные морских свинок, полученные на производственные штаммы вируса ящура «А2205/GIV», «А/Египет/Africa G-IV/2022» (предлагаемое изобретение), «Азия-1/Таджикистан/2011», «SAT-1 №96/62», «SАT-2/SAU/6/2000», «О №2383/Приморский/2019» комплемент сухой для РСК, гемолизин (сыворотка гемолитическая), эритроциты барана 2% (взвесь на физиологическом растворе, рН = 7,05-7,15). В качестве контроля использовали антигены вируса ящура штаммов «А2205/GIV», «А/Египет/Africa G-IV/2022» (предлагаемое изобретение), «Азия-1/Таджикистан/2011», «SAT-1 №96/62», «SАT-2/SAU/6/2000», «О №2383/Приморский/2019».

Результаты исследования отражены в таблице 3, из которой следует, что штамм «А/Египет/Africa G-IV/2022» вируса ящура обладает выраженной типовой специфичностью, относится к вирусу ящура серотипа А и активен в РСК в разведении 1:32.

Пример 6. Получение и применение антигена штамма «А/Египет/Africa G-IV/2022» вируса ящура как биопрепарата для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа А/AFRICA/G-IV.

Для получения антигена штамма «А/Египет/Africa G-IV/2022» вируса ящура как компонента для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа А/AFRICA/G-IV проводили суспензионное культивирование вируса в клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH с получением вирусной суспензии с титром инфекционной активности не ниже 7,00 lg ТЦД₅₀/см³. Полученную вирусную суспензию инактивировали с помощью аминоэтилэтиленимина и осветляли за счет полигексаметиленгуанидина.

Инактивированную культуральную суспензию, содержащую антиген вируса ящура, осветляли в течение 30 мин. при 6000 об/мин и 4±2⁰С на центрифуге типа Bekman J2-21 (Beckman Coulter, USA) или аналоге. Надосадочную жидкость отбирали и добавляли в нее полиэтиленгликоль с молекулярным весом 6000 Д (ПЭГ-6000) до конечной концентрации 10% и хлорид натрия (сухой) до конечной концентрации 0,90%, интенсивно перемешивали и выдерживали при температуре 4±2⁰С в течение 22±1 ч. Вирусную суспензию осаждали при 6000 об/мин в течение 60 мин., осадок растворяли в 1/15 М фосфатно-солевом буферном растворе, концентрируя в 8 раз (1/8 от первоначального объёма, до концентрации 21,60 мкг/мл).

К полученному преципитату добавляли 50% хлороформа, интенсивно перемешивали и фракционировали с помощью центрифуги в течение 30 мин. при 3000 об/мин. Отбирали верхнюю водную фракцию, содержащую антиген вируса ящура. Отбирали 100 мкл образца для последующего электрофоретического анализа в 12% полиакриламидном геле.

Для получения очищенного антигена штамма «А/Египет/Africa G-IV/2022» вируса ящура готовили линейный градиент сахарозы с концентрациями 10, 20, 30, 40, 50%. Инактивированную суспензию вируса ящура наливали по 10 мл в центрифужные пробирки, затем последовательно подслаивали растворы сахарозы, начиная с 10%-го и заканчивая 50%-м раствором. Пробирки помещали в металлические центрифужные стаканы и после тщательно выполненного уравновешивания центрифугировали при скорости 40 000 об/мин и температуре 4±2⁰С в течение 4 часов. Фракционирование градиента сахарозы производили с помощью перистальтического насоса, отбирая фракции по 1 мл в отдельные пробирки. Опалесцирующий слой, содержащий очищенный антиген вируса ящура, располагается приблизительно в 30%-м слое сахарозы. Данную фракцию переосаждали с помощью ультрацентрифугирования в течение 4 часов при скорости 40 000 об/мин. и температуре 4±2⁰С и ресуспендировали осадок в 1/15 М фосфатно-солевом буферном растворе.

Проведен электрофорез полученных фракций в 12% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях для отобранной фракции. Полученные результаты отражены на фиг. 2, из которой видно, что получен очищенный антиген вируса ящура.

Результаты спектрометрического исследования полученных фракций штамма «А/Египет/Africa G-IV/2022» вируса ящура как компонента для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа А/AFRICA/G-IV представлены в таблице 4 и на фиг. 3. Анализ проводили для всех фракций, высокие значения оптической плотности (более 1,500 О.Е.) наблюдали для №№ 2-7 фракций.

С помощью реакции связывания комплемента определили концентрацию 146S компонента в полученном антигене, которая составила 21,59±0,05 мкг/см³ (n=3, p<0,005), что достаточно для использования при изготовлении диагностических наборов для выявления антигена и антител против вируса ящура, а также изготовления специфических препаратов для профилактики данного заболевания.

Таким образом, получен антиген штамма «А/Египет/Africa G-IV/2022» вируса ящура - как биопрепарата для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа А/AFRICA/G-IV.

Полученный антиген использовали в качестве биопрепарата для проведения реакции связывания комплемента для детекции антигена вируса ящура штамма «А/Египет/Africa G-IV/2022» в исследуемых пробах при изготовлении вакцинных препаратов. Для определения диагностической чувствительности реакции анализировали 385 проб антигена, которые являлись заведомо положительными. По результатам проведения реакции связывания комплемента (РСК) доказали, что из 385 образцов сывороток крови все определены в качестве положительных. Для исследования специфичности реакции тестировали 242 отрицательных проб. В результате исследования с помощью РСК, что из 242 отрицательных проб все определены в качестве отрицательных. Пользуясь статистическими методами анализа определили, что в 95%-ном доверительном интервале диагностическая чувствительность (DSe) составила 99,05-100,00%, диагностическая специфичность (DSp) – 98,49-100,00%, k-критерий – 1,000; общая точность (DAc) – 99,41-100,00%. Таким образом, полученный антиген штамма «А/Египет/Africa G-IV/2022» вируса ящура применим для использования в качестве биопрепарата в диагностических тест-системах.

Пример 7. Получение и применение сывороток крови кролика против антигена данного штамма вируса ящура как биопрепарата для диагностики ящура генотипа А/AFRICA/G-IV.

Для получения сыворотки крови кролика против антигена штамма «А/Египет/Africa G-IV/2022» вируса ящура как биопрепарата для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа А/AFRICA/G-IV применяли 20 клинически здоровых кроликов средней упитанности массой 2,5-3,0 кг.

Для гипериммунизации животных применяли антиген вируса ящура, полученный как описано в примере 6, из которого готовили эмульсию с использованием масляного адъюванта Montanide ISA-61 R VG («Seppic», Франция) (в соотношении адъювант/антиген = 60/40 по массе). Полученную вакцину вводили в мышцу задних конечностей кролика на 0, 21 и 42 дни в объеме 0,5 см³. Через 7 дней после последней иммунизации кроликов тотально обескровливали и получали сыворотку крови, содержащую антитела против антигена штамма «А/Египет/Africa G-IV/2022» вируса ящура, которую лиофильно высушивали и хранили при температуре 4-8⁰С.

Полученные 30 сывороток крови кроликов проверяли в реакции связывания комплемента и определили, что их активность составила 1:9000-1:9400. Данные показатели являются высокими и достаточными для изготовления диагностических наборов по выявлению антигена и антител против вируса ящура.

Изготовленные сыворотки крови объединили в общий пул, провели лиофильную сушку и, таким образом, получили биопрепарат, который использовали в реакции связывания комплемента для детекции антигена вируса ящура штамма «А/Египет/Africa G-IV/2022». Для определения диагностической чувствительности реакции анализировали 312 проб антигена, которые являлись заведомо положительными. По результатам проведения реакции связывания комплемента (РСК) доказали, что из 312 образцов сывороток крови все определены в качестве положительных. Для исследования специфичности реакции тестировали 254 отрицательных проб. В результате исследования с помощью РСК, что из 254 отрицательных проб все определены в качестве отрицательных. Пользуясь статистическими методами анализа определили, что в 95%-ном доверительном интервале диагностическая чувствительность (DSe) составила 98,82-100,00%, диагностическая специфичность (DSp) – 98,56-100,00%, k-критерий – 1,000; общая точность (DAc) – 99,35-100,00%. Таким образом, полученный антиген вируса ящура штамма
«А/Египет/Africa G-IV/2022» применен для иммунизации животных как биопрепарат. Получена сыворотка крови кролика против антигена штамма «А/Египет/Africa G-IV/2022» вируса ящура, а также показано применение полученной сыворотки как биопрепарата для диагностики ящура генотипа А/AFRICA/G-IV.

Пример 8. Применение антигена вируса ящура штамма
«А/Египет/Africa G-IV/2022» для получения вакцины.

Из полученного антигена, как описано в примере 6, приготовили сорбированную вакцину для крупного рогатого скота. Провели иммунизацию 5 голов КРС вакциной в цельном виде. На 21 сутки после иммунизации отобрали кровь, получили сыворотки крови, которые исследовали на наличие антител к структурным белкам вируса ящура штамма «А/Египет/Africa G-IV/2022» в реакции микронейтрализации (РМН) и ИФА. Результаты исследования отражены в таблице 5, из которой следует, что среднее значение титра вируснейтрализующих антител в РМН составило 9,30±0,27 log₂ SN₅₀ (положительно, ≥5,5 log₂ SN₅₀). В ИФА процент ингибиции был более 50% (92,74±5,08%), что свидетельствует о том, что все сыворотки были положительными. Таким образом, по двум реакциям получили согласованные результаты о наличии защитного количества антител против заражения вируса ящура гомологичным штаммом «А/Египет/Africa G-IV/2022». Следовательно, антиген данного штамма можно применять для создания вакцины, обеспечивающей защиту от ящура указанного штамма.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента Российской Федерации на изобретение «Штамм «А/Египет/Africa G-IV/2022» вируса ящура Aphtae epizooticae генотипа
А/AFRICA/G-IV для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура».

1. Kitching P, Hammond J, Jeggo M, Charleston B, Paton D, Rodriguez L, Heckert R. Global FMD control--is it an option? Vaccine. 2007 Jul 26;25(30):5660-4. doi: 10.1016/j.vaccine.2006.10.052. Epub 2006 Nov 9. PMID: 17126959.

2. OIE. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. 7th еd. Paris, 2022. – Ch. 3.1.8.

3. Ivanov G, Klement E, Gelman B, Elnekave E, Karniely S. Foot and mouth disease viruses are recurrently introduced to Israel and spread by extensively reared sheep and cattle: Insights from a whole-genome sequence analysis. Virology. 2023 Nov 24;590:109950. doi: 10.1016/j.virol.2023.109950. Epub ahead of print. PMID: 38104361.

4. Zewdie G, Akalu M, Tolossa W, Belay H, Deresse G, Zekarias M, Tesfaye Y. A review of foot-and-mouth disease in Ethiopia: epidemiological aspects, economic implications, and control strategies. Virol J. 2023 Dec 15;20(1):299. doi: 10.1186/s12985-023-02263-0. PMID: 38102688; PMCID: PMC10724896.

5. Жильцова М.В. Биологические свойства эпизоотических изолятов вируса ящура типов А, О и Азия-1: Автореф… дис. кан. наук. – Владимир: 2008. – 23 с.

6. Бурдов А.Н., Дудников А.И., Малярец П.В. и др. Ящур. / Под ред. А.Н. Бурдова. – М., Агропромиздат, 1990, 320 с.

7. Анализ эпизоотической ситуации по ящуру в России с 2010 г. по март 2019 г. / В. П. Семакина, Т. П. Акимова, В. А. Мищенко, А. К. Караулов // Ветеринария. – 2019. - № 11. – С. 16-20.

8. Методические рекомендации по выделению и идентификации штаммов вируса ящура /А. А. Гусев, В. М. Захаров, Ж. А. Шажко и др.; ФГУ «ВНИИЗЖ». – Владимир. 2002. – 31 с.

9. Методические рекомендации по определению антигенного соответствия между эпизоотическими изолятами и производственными штаммами вируса ящура в перекрестной реакции микронейтрализации /С. Р. Кременчугская, М. В. Жильцова, Т. К. Майорова; ФГБУ «ВНИИЗЖ». – Владимир, 2012. – 36 с.

10. Патент № 2674076 C1 Российская Федерация, МПК А61К 39/135 С12Q 1/68. Способ определения титра инфекционной активности вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины с применением метода обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени: № 2017145889: заявл. 25.12.2017: опубл. 04.12.2018 / Д.А. Лозовой, Д.В. Михалишин [и др.]; заявитель Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ").

11. Патент № 2712769 C1 Российская Федерация, МПК G01M 33/58, C12Q 1/68. Способ спектрометрического определения концентрации 146S частиц вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины по оценке количества молекул вирусной РНК, выделенной после иммунного захвата вирионов: № 2019116272: заявл. 27.05.2019: опубл. 31.01.2020 / Д.А. Лозовой, Д.В. Михалишин [и др.]; заявитель Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ").

Таблица 1

Биологические свойства штамма «А/Египет/Africa G-IV/2022» вируса ящура при культивировании в клеточных линиях (предлагаемое изобретение)

(n=8)

Наименование клеточной линии Время проявления
биологической активности, ч Количество адаптационных пассажей Характеристика адаптированного материала Активность в РСК Титр инфекционной активности вируса, lg ТЦД₅₀/см³ ПСГК-30 13-14 5 1:16 7,35±0,10 IB-RS-2 18-19 5 1:16 7,10±0,10 ВНК-21 19-20 5 1:16 7,00±0,10

Таблица 2

Оценка стабильности репродукции штамма «А/Египет/Africa G-IV/2022» вируса ящура (предлагаемое изобретение) в суспензионной перевиваемой культуре клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/SUSP/ARRIAH

(n=10)

№ п/п Концентрация клеток, млн/см³ Доза заражения, ТЦД₅₀/кл. Длительность репродукции, ч Титр инфекционной активности вируса,
lg ТЦД₅₀/см³ Концентрация общего вирусного белка, мкг/см³ Концентрация
146S компонента мкг/см³ % 1 3,9 0,005 12,0 9,75 3,52 2,62 74,3 2 4,2 0,005 11,5 10,05 3,85 2,89 75,0 3 3,9 0,005 12,0 9,70 3,50 2,63 75,0 4 4,0 0,005 11,5 9,82 3,60 2,69 74,6 5 3,9 0,005 12,0 9,76 3,56 2,63 74,0 6 4,0 0,005 11,5 9,85 3,61 2,71 75,2 7 3,9 0,005 12,0 9,72 3,48 2,59 74,3 8 3,9 0,005 12,0 9,66 3,50 2,63 75,2 9 4,2 0,005 12,5 10,12 3,91 2,91 74,5 10 4,0 0,005 13,0 9,80 3,63 2,74 75,6 M±m 3,99±0,12
p˂0,05 0,005 12,00±0,47
p˂0,05 9,82±0,15
p˂0,05 3,62±0,15
p˂0,05 2,70±0,11
p˂0,05 74,77±0,51
p˂0,05

Примечание:146S – иммуногенный компонент, ТЦД – тканевая цитопатическая доза.

Таблица 4

Результаты спектрометрического исследования полученных фракций штамма «А/Египет/Africa G-IV/2022» вируса ящура (предлагаемое изобретение) как компонента для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа А/AFRICA/G-IV

№ фракции п/п Значение оптической плотности образца, О.Е.
(n = 3, p<0,005) 1 0,010±0,001 2 1,660±0,001 3 2,781±0,001 4 3,232±0,002 5 3,111±0,001 6 2,603±0,001 7 1,720±0,002 8 0,751±0,002 9 0,200±0,001

Примечание: О.Е. – оптические единицы.

Таблица 5

Результаты определения антител против структурных белков вируса ящура штамма «А/Египет/Africa G-IV/2022» после однократной иммунизации КРС на 21 сутки после вакцинации в реакции микронейтрализации (РМН) и ИФА

(n = 3, p<0,005)

№ животного Титр вируснейтрализующих антител против вируса ящура штамма «А/Египет/Africa
G-IV/2022» в РМН Результаты ИФА процент ингибиции, % интерпретация 1 9,50 96,33 положительно 2 9,50 95,63 положительно 3 9,00 88,21 положительно 4 9,00 86,32 положительно 5 9,50 97,22 положительно M±m 9,30±0,27 92,74±5,08 5/5

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="FMD Vaccine A EGY

2022.xml" softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.1.2"

productionDate="2023-12-19">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-12-19</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>561</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-12-19</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">ФГБУ &quot;Федеральный центр охраны

здоровья животных&quot; (ФГБУ &quot;ВНИИЗЖ&quot;)</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>FGBI &quot;ARRIAH&quot;</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Доронин Максим

Игоревич</InventorName>

<InventorNameLatin>Doronin Maksim Igorevich </InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Штамм «А/Египет/Africa G-IV/2022»

вируса ящура Aphtae epizooticae генотипа А/AFRICA/G-IV для

изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической

профилактики ящура</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>2</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>639</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..639</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q1">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>accactgcaacaggggagtctgcagaccctgtcaccaccaccgtggaga

actacggcggtgagacacaaccccaacgacggtaccacacggacgttggctttataatggacagatttgt

gaaagtgaacagttctacccccacacacgtcattgatctcatgcaaacccaccaacacgggctggtaggt

gcgttgttgcgttcagccacctactatttctctgatctggagatcgtggtaagacaccaggggaacctga

cctgggtgcccaacggcgccccggagggcgctctctcgaacacgggcaaccccacagcttaccacaaagc

gccgttcacgaggctggcacttccctacaccgcgccacaccgcgtgctggcgacagtgtacaacgggacg

accaagtacacggcagatacttcacccaggcgaggtgacctgggagcccttgcggcgagactcgctacac

agctcccctcctctttcaactacggggcgctgcgcgctgagaccatccacgagcttctcgtgcgcatgaa

gcgggccgagctttactgccccagaccgctgttgtcaacagaggtgagttcagcggacaggcacaaacag

aagatcattgcgcccgccaaacagctcctt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>213</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..213</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>TTATGESADPVTTTVENYGGETQPQRRYHTDVGFIMDRFVKVNSSTPTH

VIDLMQTHQHGLVGALLRSATYYFSDLEIVVRHQGNLTWVPNGAPEGALSNTGNPTAYHKAPFTRLALPY

TAPHRVLATVYNGTTKYTADTSPRRGDLGALAARLATQLPSSFNYGALRAETIHELLVRMKRAELYCPRP

LLSTEVSSADRHKQKIIAPAKQLL</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарной вирусологии. Предложен штамм «А/Египет/Africa G-IV/2022» вируса ящура Aphtae epizooticae генотипа А/AFRICA/G-IV, депонированный во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером №520 - деп / 23-70 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ», предназначенный для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа А/AFRICA/G-IV. Изобретение может быть использовано для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа А/AFRICA-G-IV и для контроля антигенной активности противоящурных вакцин. 3 ил., 5 табл., 8 пр.

Штамм «А/Египет/Africa G-IV/2022» вируса ящура Aphtae epizooticae генотипа А/AFRICA/G-IV, депонированный во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером №520 - деп / 23-70 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ», предназначенный для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа А/AFRICA/G-IV.