Штамм "А/Кения/G-VII" вируса ящура Aphtae epizooticae серотипа А для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура Российский патент 2025 года по МПК C12N7/00 A61K39/135 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, может быть использовано для разработки и изготовления средств диагностики, специфической профилактики ящура серотипа А и контроля антигенной и иммуногенной активности противоящурных вакцин.

На сегодняшний день возбудитель ящура остается наиболее контагиозным патогеном для парнокопытных и мозоленогих животных, является РНК(+)-содержащим вирусом, который относится к семейству Picornaviridae, роду Aphthovirus, виду Foot-and-mouth disease virus.

РНК возбудителя ящура кодирует 4 структурных белка: VP₁, VP₂, VP₃, VP₄ и множество неструктурных протеинов [1, 2, 3]. Выделяют 7 различных серотипов вируса ящура: O, А, Азия-1, C, SAT-1, SAT-2, SAT-3, при этом серотип А является весьма разнообразным [4]. Представители серотипа А являются максимально разнообразными среди вируса ящура в антигенном отношении [2, 5].

Генетически серотипы вируса ящура разделены на топотипы, генетические линии и даже сублинии, которые в суммарной форме записи обозначают полный генотип возбудителя ящура. Различия между ними определяют при анализе нуклеотидной последовательности 1D-гена (белок VP₁), который характеризуется наиболее высоким количеством нуклеотидных и аминокислотных замен по итогам анализа с помощью программы MEGA [1, 2, 3].

Молекулярными биологами, которые детально исследуют геном вируса ящура, было сделано заключение, что самыми вариабельными областями белка VP₁ считаются участки в следующих диапазонах аминокислотных остатков: 40-60, 130-160 и 190-213 а.о. [4, 5, 6].

Антигенные вариации возникают из-за аминокислотных мутаций, которые изменяют распознавание вирусных белков иммунной системой организма. Поверхностно открытые структуры вируса в наибольшей степени подвержены реакции иммунной системы живого организма [5, 6].

Для изолятов вируса ящура серотипа А характерно наибольшее генетическое разнообразие. Серотип А включает в себя 3 охарактеризованных прототипа ASIA, AFRICA, EURO-SA и одну пока еще малоизученную группу изолятов [1, 6, 7].

Генетическое и антигенное разнообразие вируса ящура серотипа А приводит к проблемам в специфической профилактике ящура при применении культуральных инактивированных противоящурных вакцин, а также затрудняет штаммоспецифическую диагностику выделенных изолятов вируса ящура. В результате возникает необходимость создания новых средств диагностики и специфической иммунопрофилактики в отношении вируса ящура серотипа А и, в частности, генотипа А/AFRICA/G-VII, представители которого распространяются на территории Западной Африки [3].

Анализируя вспышки, которые регистрировались на территории Западной Африки, обнаружено, что в Бурунди в 2022 г. обнаружены изоляты генотипа A/AFRICA/G-I, в Эритрее в 2008 и 2018 гг. была вспышка ящура генотипа A/AFRIVA/G-IV. Высокое количество вспышек отмечали в Эфиопии и Кения в период с 2003 по настоящее время, которые вызваны генотипами A/AFRICA-G-II, A/AFRICA/G-IV и A/AFRICA/G-VII. В Танзании и Уганде в 2013 и 2016 гг. были выделены изоляты вируса ящура генотипа A/AFRICA/G-I. При этом в Кении отмечают вспышки ящура экзотического генотипа A/AFRICA/G-VII, который является редким и имеет уникальный нуклеотидный и аминокислотный состав. Распространение ящура генотипа A/AFRICA/G-VIII является опасным и требует исследования штаммов данного генотипа для создания средств диагностики и специфической профилактики ящура генотипа A/AFRICA/G-VII.

Известны производственные штаммы вируса ящура серотипа А, которые применяются для производства средств специфической профилактики ящура:

- штамм «А₂₂/Ирак/64» (генотип A/ASIA/Iraq-64),

- штамм «А/Турция/06» (генотип A/ASIA/Iran-05),

- штамм «А №2166/Краснодарский/2013» (генотип A/ASIA/Iran-05^SIS-10),

- штамм «А №2155/Забайкальский/2013» (генотип A/ASIA/Sea-97),

- штамм «А №2269/ВНИИЗЖ/2015» (генотип A/ASIA/G-VII),

- штамм «А/Танзания/2013» (генотип A/AFRICA/G-I),

- штамм «А 2205/G-IV» (генотип A/AFRICA/G-IV) (прототип).

Изолят вируса ящура был выделен из патологического материала от крупного рогатого скота на территории Кении в 2005 г. и поступил в ФГБУ «ВНИИЗЖ» для проведения научных исследований в 2018 г.

Штамм «А/Кения/G-VII» был получен в результате научно-исследовательской работы путем адаптации изолята к репродукции в первично-трипсинизированной монослойной клеточной линии почки свиньи СП, в перевиваемых культурах клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH, IB-RS-2, ПСГК-30, в организме крупного рогатого скота и свиней в условиях ФГБУ «ВНИИЗЖ».

По результатам сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей выделенный штамм вируса ящура принадлежит к генотипу A/AFRICA/G-VII, который значительно отличается от производственных штаммов вируса ящура серотипа A, в том числе, от штамма «А 2205/G-IV» (прототип) [8].

Технических результат позволяет расширить арсенал производственных штаммов вируса ящура серотипа А, обладающих высокой инфекционной, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде, пригодный для контроля антигенной и иммуногенной активности вакцин, изготовления чувствительных и высокоспецифичных диагностических тест-систем и иммуногенных вакцинных препаратов путем получения штамма «А/Кения/G-VII» вируса ящура для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура серотипа А.

Штамм вируса ящура «А/Кения/G-VII» депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вирусов ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ», под регистрационным номером: №492 - деп / 23-42 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Экспериментально подтверждена возможность использования штамма «А/Кения/G-VII» вируса ящура для изготовления средств диагностики и профилактики ящура серотипа А.

Сущность изобретения отражена на графическом изображении:

Фигура - Дендрограмма, отражающая филогенетическое взаимоотношение штамма «А/Кения/G-VII» вируса ящура с эпизоотическими штаммами серологического серотипа А. Примечание: Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей гена VР1.

Сущность изобретения пояснена следующими перечнями последовательностей:

SEQ ID NO:1 представляет последовательность нуклеотидов 1D-гена белка VР₁ штамма «А/Кения/G-VII» вируса ящура серотипа А;

SEQ ID NO:2 представляет последовательность аминокислот 1D-гена белка VР₁ штамма «А/Кения/G-VII» вируса ящура серотипа А.

Штамм «А/Кения/G-VII» вируса ящура характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки

Штамм «А/Кения/G-VII» вируса ящура имеет следующую таксономию: сфера Riboviria, царство Orthornavirae, тип Pisuviricota, класс Pisoniviricetes, отряд Picornavirales, семейство Picornaviridae, род Aphthovirus, вид Foot-and-mouth disease virus, серотип А, генотип A/AFRICA/G-VII. Штамм возбудителя обладает следующими морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона иксаэдрическая, размер 20 нм. Вирион состоит из молекулы одноцепочечной положительно заряженной молекулы РНК и 60 копий полипептида, каждый из которых представлен белками VP₄, VP₂, VP₃, VP₁.

Антигенные свойства

По антигенным свойствам штамм «А/Кения/G-VII» вируса ящура относится к серотипу А. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой, не проявляет гемагглютинирующей активности. У переболевших животных в сыворотке крови образуются специфические антитела, выявляемые в реакции микронейтрализации, иммуноферментном анализе и реакции связывания комплемента.

Методом нуклеотидного секвенирования была определена первичная структура 1D-гена белка VP₁ штамма «А/Кения/G-VII» вируса ящура. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм «А/Кения/G-VII» вируса ящура принадлежит к генотипу A/AFRICA/G-VII (Фигура).

Антигенное родство (r₁) штамма «А/Кения/G-VII» вируса ящура изучено в реакции микронейтрализации вируса в высокочувствительной перевиваемой клеточной линии почки свиньи IB-RS-2 с помощью перекрестного исследования данного штамма возбудителя ящура со специфическими сыворотками, полученными на следующие производственные штаммы вируса ящура: штамм «А₂₂/Ирак/64»; штамм «А/Турция/06»; штамм «А №2166/Краснодарский/2013»; штамм «А №2155/Забайкальский/2013»; штамм «А №2269/ВНИИЗЖ/2015»; штамм «А/Танзания/2013»; штамм «А 2205/G-IV» (прототип).

Титр референтных сывороток крови КРС, полученных путем иммунизации животных моновалентными вакцинами из производственных штаммов вируса ящура серотипа А, против 2,0 lg ТЦД₅₀ гомологичного и гетерологичного вируса определяли в реакции микронейтрализации (РМН) при перекрестном титровании, рассчитывая значения с использованием уравнения линейной регрессии, и выражали в log₂ SN₅₀. Значение r₁ определяли, как антилогарифм разности log₂ SN₅₀ титров сыворотки против гетерологичного и гомологичного вируса [7-10].

Значение r₁ в РМН интерпретировали следующим образом: при ≥ 0,3 - исследуемый и производственный штаммы вируса ящура являются родственными; при < 0,3 - исследуемый образец штамма вируса ящура значительно отличается от производственного штамма. Максимальное родство отмечается при значении r₁ в РМН, стремящимся к 1,0.

Показатели антигенного родства при изучении штамма «А/Кения/G-VII» составили r₁ от 0,03 до 0,09, что свидетельствует об отсутствии явного антигенного родства с производственными штаммами вируса ящура серотипа А (табл. 1).

Гено- и хемотаксономические характеристики

Штамм «А/Кения/G-VII» вируса ящура является РНК(+) - содержащим вирусом с молекулярной массой 8,096×10⁶ Д. Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной молекулой молекулярной массой 2,862×10⁶ Д. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех структурных белков VP₁, VP₂, VP₃ и VP₄. Липопротеидная оболочка отсутствует.

Основным антигенным белком является VP₁. В вирионе содержится приблизительно 32,2% РНК и 67,8% белка. РНК возбудителя ящура является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Данные полипептидные молекулы, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных белков вируса ящура.

Физические свойства

Масса вириона составляет 8,452×10^-18 г. Плавучая плотность 1,43 г/см³.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм «А/Кения/G-VII» вируса ящура устойчив к эфиру, хлороформу, и ацетону. Наиболее стабилен при pH 7,40-7,75. Сдвиги pH в кислую и сильно щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам (выше 38,4°С).

Дополнительные признаки и свойства

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Патогенность - патогенен для мозоленогих и парнокопытных животных.

Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.

Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 5 пассажей (срок наблюдения) на перевиваемых культурах.

Биотехнологические характеристики

Штамм «А/Кения/G-VII» вируса ящура репродуцируется в перевиваемых культурах клеток: почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), почки свиньи (IB-RS-2), почки новорожденного сирийского хомячка (ВНК-21).

При испытании было проведено 5 последовательных пассажей штамма «А/Кения/G-VII» вируса ящура в перевиваемых культурах клеток ПСГК-30, ВНК-21, IB-RS-2. Биологические свойства характеризовали путем определения инфекционной активности вируса каждого пассажа в перевиваемой клеточной линии IB-RS-2 и на естественно восприимчивых животных - крупном рогатом скоте (КРС) и свиньях.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его исследования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Исследование биологических свойств штамма «А/Кения/G-VII» вируса ящура при репродукции в монослойных перевиваемых клеточных линиях

При выделении изолята вируса ящура с целью получения его однородной популяции, обладающей оптимальными биотехнологическими свойствами, использовали комплекс биологических, вирусологических и биохимических методов, предусмотренных методическими указаниями по выявлению и идентификации штаммов вируса ящура [9].

Биологические и вирусологические методы включали в себя метод выделения в клеточной линии и адаптацию изолята вируса ящура к ним.

Процесс выделения возбудителя ящура проводили в монослойных перевиваемых клеточных линиях ПСГК-30, IB-RS-2, ВНК-21 с последующей адаптацией в течение 5 последовательных пассажей. Культуры клеток выращивали в соответствующих питательных средах, в стационарных условиях во флаконах с площадью поверхности 25,0 см², отмывали от ростовой среды и заражали 33%-ной суспензией афтозного материала (множественность заражения составляла 1-10 ТЦД₅₀ на клетку), приготовленной в среде Игла MEM с 0,5% гидролизата лактальбумина. Для удаления микрофлоры и балластных клеточных компонентов вирусную суспензию предварительно обрабатывали 0,5%-ным раствором гентамицина. После 30-минутного контакта вируса с клеточной культурой во флаконы вносили поддерживающую среду и инкубировали при температуре 37,0±0,1°C до появления цитопатического действия (ЦПД) в монослое культуры клеток, которое представлено в виде округления клеток, повышения их оптической плотности, дегенерации и отделении клеток от поверхности субстрата.

При ЦПД не менее 95% клеток, флаконы подвергали процессу «замораживание-оттаивание», очистке клеточной взвеси хлороформом и центрифугированию при 2000 g в течение 10 мин. Полученный вируссодержащий материал использовали для последующих пассажей. Вирус считался адаптированным к культурам клеток, если в течение не менее 24 часов проявлялось 95-100% ЦПД в монослое клеточных культур. Адаптация штамма к различным клеточным линиям наступала на уровне пятого пассажа. Титр инфекционной активности вируса ящура определяли с помощью разработанной ранее методики [11].

Результаты адаптации вируса к различным клеточным культурам представлены в табл. 2, данные которой свидетельствуют о высокой адаптационной способности изолята вируса ящура к использованным клеточным линиям. В монослойной культуре клеток ПСГК-30 за 17 ч получали вирусную суспензию с активностью в РСК 1:32 и титром инфекционной активности 7,25±0,10 lg ТЦД₅₀/см³. В монослойной культуре клеток IB-RS-2 за 23 ч получали вирусную суспензию с активностью в РСК 1:16 и титром инфекционной активности 6,85±0,10 lg ТЦД₅₀/см³. В монослойной культуре клеток ВНК-21 за 24 ч получали вирусную суспензию с активностью в РСК 1:16 и титром инфекционной активности 6,54±0,10 lg ТЦД₅₀/см³. Каждое исследование и культивирование проводили 9 раз. В итоге получен штамм «А/Кения/G-VII» с охарактеризованными биологическими культуральными свойствами, который далее использовали для исследования его свойств. Таким образом, наибольший титр инфекционной активности вируса ящура указанного штамма достигнут при культивировании в монослойной клеточной линии ПСГК-30 за наименьшее время репродукции вируса, что важно для производственных целей при получении вирусной массы.

Пример 2. Исследование биологических свойств штамма «А/Кения/G-VII» вируса ящура на крупном рогатом скоте

Заражение КРС исходным штаммом вируса ящура проводили интрадермолингвально (I пассаж). Адаптацию и наработку штамма «А/Кения/G-VII» вируса ящура на КРС проводили в течение двух последовательных пассажей. С целью определения титра инфекционной активности адаптированного штамма из афт на этапе второго пассажа на КРС получали 10%-ную вирусную суспензию, из которой готовили последовательные 10-кратные разведения в 1/15 М фосфатно-солевом буферном растворе (ФСБР). Подготовленные разведения с 10^-2 по 10^-6 вводили интрадермолингвально в 4 точки по 0,1 см³ двум головам КРС. Учёт результатов титрования на животных проводили спустя 24 ч по наличию афт на месте введения разведений вируса ящура штамма «А/Кения/G-VII». Титр инфекционной активности на КРС данного штамма вируса ящура на стадии первого пассажа на КРС составил 5,75 lg ИД₅₀/0,1 см³, второго пассажа - 6,00 lg ИД₅₀/0,1 см³. Таким образом, была получена 10%-ная афтозная суспензия вируса ящура штамма «А/Кения/G-VII» (2 пассаж на КРС) с титром инфекционной активности 6,00 lg ИД₅₀/0,1 см³.

Пример 3. Исследование биологических свойств штамма «А/Кения/G-VII» вируса ящура на свиньях

Заражение свиней исходным штаммом «А/Кения/G-VII» вируса ящура проводили внутрикожно на стадии первого пассажа в область венчика передних конечностей. Адаптацию и наработку указанного штамма вируса ящура на свиньях вели в течение двух последовательных пассажей. С целью определения титра инфекционной активности адаптированного штамма из афт второго пассажа на свиньях получали 10%-ную вирусную суспензию, из которой готовили последовательные 10-кратные разведения с использованием в качестве растворителя 1/15 М ФБР. Подготовленные разведения с 10^-2 по 10^-6 вводили внутрикожно в венчики копытец по 0,1 см³ в 4 точки на каждый палец конечности одного разведения, из расчета 1 разведение на 2 копытца 1 конечности каждому из 2 подопытных подсвинков.

Учёт результатов титрования проводили через 24 ч по наличию афт на месте введения разведений. Титр инфекционной активности на свиньях для штамма «А/Кения/G-VII» вируса ящура на свиньях на стадии первого пассажа составил 6,25 lg ИД₅₀/0,1 см³, второго - 6,50 lg ИД₅₀/0,1 см³. Таким образом, была получена 10%-ная афтозная суспензия вируса ящура штамма «А/Кения/G-VII» (2 пассаж на подсвинках) с титром инфекционной активности 6,50 lg ИД₅₀/0,1 см³.

Пример 4. Исследование биологических свойств штамма «А/Кения/G-VII» вируса ящура при репродукции в перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH

Штамм «А/Кения/G-VII» вируса ящура репродуцировали в суспензионной перевиваемой культуре клеток из почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/SUSP/ARRIAH. В качестве поддерживающей среды использовали среду Игла MEM, с добавлением ферментативного гидролизата мышц сухого, гидролизата белков крови сухого при рН среды 7,40-7,75. Клеточную линию заражали вирусом из расчета 0,005 ТЦД₅₀/клетка.

Культивирование штамма «А/Кения/G-VII» вируса ящура осуществляли при температуре 37,0±0,1°С до достижения ЦПД вируса, соответствующего не менее 95%. Полученную вируссодержащую суспензию контролировали на стерильность и содержание общего вирусного белка (ОВБ) и важнейшего иммуногенного компонента с коэффициентом седиментации 146S.

Полученные суспензии были стерильными. Концентрация ОВБ в суспензии составляла 3,02±0,12 мкг/см³. Значения титра инфекционной активности вируса, а также процентное содержание 146S компонента штамма «А/Кения/G-VII» вируса ящура отражены в табл. 3, из данных которой видно, что при средней концентрации клеток BHK-21/SUSP/ARRIAH, равной 4,4±0,2 млн клеток/см³, дозе заражения 0,005 ТЦД₅₀/клетку и продолжительности репродукции вируса 13,65±0,34 ч средний титр инфекционной активности возбудителя ящура был равен 8,1380,08 lg ТЦД₅₀/см³. Концентрацию 146S компонента вируса ящура определяли с помощью ранее разработанной методики [12]. Содержание данного компонента составило 64,62±0,53% (1,95±0,09 мкг/см³, n = 9).

Пример 5. Определение типовой специфичности и активности штамма «А/Кения/G-VII» вируса ящура

Исследование типовой специфичности и активности штамма «А/Кения/G-VII» вируса ящура проводили в реакции связывания комплемента (РСК). К полученному антигену штамма «А/Кения/G-VII» вируса ящура, взятому в объеме 0,4 см³ в цельном виде и в разведениях 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128 добавляли по 0,1 см³ гомологичной и гетерологичных гипериммунных сывороток, полученных на вирус ящура в рабочем (удвоенном) титре и 0,1 см³ комплемента в рабочем разведении. Смесь выдерживали в водяной бане в течение 20 мин при температуре 37,0±0,1°С. Затем вносили по 0,2 см³ гемолитической системы и выдерживали 30 мин при температуре 37,0±0,1°С. Положительный результат реакции соответствовал 100%-ной задержке гемолиза эритроцитов барана («4 креста»). Параллельно проводили контрольные реакции без сыворотки, без комплемента и компонентов реакции.

В качестве реагентов в РСК использовали сыворотки ящурные типоспецифические гипериммунные морских свинок, полученные на производственные штаммы вируса ящура «А/Кения/G-VII» (предлагаемое изобретение), «SAT-3 ZIM 4/81» «А 2205/G-IV», «Азия-1/Таджикистан/2011», «SAT-1 №96/62», «SAT-2/XIV/2023», комплемент сухой для РСК, гемолизин (сыворотка гемолитическая), эритроциты барана 2% (взвесь на физиологическом растворе, рН = 7,05-7,15). В качестве контроля использовали антигены вируса ящура штаммов «А/Кения/G-VII», «SAT-3 ZIM 4/81» «А 2205/G-IV», «Азия-1/Таджикистан/2011», «SAT-1 №96/62», «SAT-2/XIV/2023».

Результаты исследования отражены в табл. 4, из которой следует, что штамм «А/Кения/G-VII» вируса ящура обладает выраженной типовой специфичностью, относится к вирусу ящура серотипа А и активен в РСК в разведении 1:64.

Пример 6. Получение, контроль качества и применение антигена штамма «А/Кения/G-VII» вируса ящура как биопрепарата для диагностики и специфической профилактики ящура серотипа А

Для получения антигена штамма «А/Кения/G-VII» вируса ящура как компонента биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура серотипа А проводили суспензионное культивирование вируса в перевиваемой клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH с получением вирусной суспензии с титром инфекционной активности не ниже 7,00 lg ТЦД₅₀/см³. Полученную вирусную суспензию инактивировали с помощью аминоэтилэтиленимина (0,035%) и осветляли за счет полигексаметиленгуанидина (0,025%).

Инактивированную культуральную суспензию, содержащую антиген вирус ящура, осветляли в течение 45 мин при 5000 об/мин и 4±2°С на центрифуге Bekman J2-21 (Beckman Coulter, USA). Надосадочную жидкость отбирали и добавляли в нее полиэтиленгликоль с молекулярным весом 6000 Да (ПЭГ-6000) до конечной концентрации 8% и хлорид натрия (сухой) до конечной концентрации 0,85%, интенсивно перемешивали и выдерживали при температуре 4±2°С в течение 18±1 ч. Вирусную суспензию осаждали при 6000 об/мин в течение 60 мин, осадок растворяли в 1/15 М фосфатно-солевом буферном растворе, концентрируя в 8 раз (1/8 от первоначального объёма).

К полученному преципитату добавляли 50% хлороформа, интенсивно перемешивали и фракционировали с помощью центрифуги в течение 30 мин при 3000 об/мин. Отбирали верхнюю водную фракцию, содержащую антиген вируса ящура. Отбирали 100 мкл образца для последующего электрофоретического анализа в 12% полиакриламидном геле.

Для получения очищенного антигена штамма «А/Кения/G-VII» вируса ящура готовили линейный градиент сахарозы с концентрациями 10, 20, 30, 40, 50%. Инактивированную суспензию вируса ящура наливали по 10 мл в центрифужные пробирки, затем последовательно подслаивали растворы сахарозы, начиная с 10%-го и заканчивая 50%-м раствором. Пробирки помещали в металлические центрифужные стаканы и после тщательно выполненного уравновешивания центрифугировали при скорости 40 000 об/мин и температуре 4±2°С в течение 4 часов. Фракционирование градиента сахарозы производили с помощью перистальтического насоса, отбирая фракции по 1 мл в отдельные пробирки. Опалесцирующий слой, содержащий очищенный антиген вируса ящура, располагается приблизительно в 30%-м слое сахарозы. Данную фракцию переосаждали с помощью ультрацентрифугирования в течение 4 часов при скорости 40 000 об/мин и температуре 4±2°С и ресуспендировали осадок в 1/15 М фосфатно-солевом буферном растворе.

Результаты спектрометрического исследования полученных фракций штамма «А/Кения/G-VII» вируса ящура как компонента биопрепарата для диагностики и специфической профилактики ящура серотипа А представлены в табл. 5. Анализ проводили для всех фракций, высокие значения оптической плотности наблюдали для 5-10 фракции с максимальными значениями для фракции № 8 (1,765±0,001 о.е.).

Проведен электрофорез полученных фракций в 12% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях для отобранной фракции. Полученные результаты свидетельствовали, что 8-кратный антиген вируса ящура не содержал примесных белков.

С помощью реакции связывания комплемента определили концентрацию 146S компонента в полученном антигене, которая составила 15,60±0,19 мкг/см³ (n = 5 p<0,005), что достаточно для использования при изготовлении диагностических наборов для выявления антигена и антител против вируса ящура, а также для изготовления специфических препаратов для профилактики данного заболевания.

Таким образом, получен и проведен контроль качества антигена штамма «А/Кения/G-VII» вируса ящура как биопрепарата для диагностики и специфической профилактики ящура серотипа А.

Полученный антиген использовали в качестве биопрепарата для проведения реакции связывания комплемента для детекции антигена вируса ящура штамма «А/Кения/G-VII» в исследуемых пробах при изготовлении вакцинных препаратов. Для определения диагностической чувствительности реакции анализировали 322 проб антигена, которые являлись заведомо положительными. По результатам проведения реакции связывания комплемента (РСК) доказали, что из 322 образцов сывороток крови все определены в качестве положительных. Для исследования специфичности реакции тестировали 180 отрицательных проб. В результате исследования с помощью РСК, что из 180 отрицательных проб все определены в качестве отрицательных. Пользуясь статистическими методами анализа определили, что в 95%-ном доверительном интервале диагностическая чувствительность (DSe) составила 98,86-100,00%, диагностическая специфичность (DSp) - 97,97-100,00%, k-критерий - 1,000; общая точность (DAc) - 99,27-100,00%.

Таким образом, полученный антиген штамма «А/Кения/G-VII» вируса ящура применим для использования в качестве биопрепарата в диагностических тест-системах.

Пример 7. Применение антигена вируса ящура штамма «А/Кения/G-VII» для получения сывороток кролика против структурных белков вируса ящура штамма «А/Кения/G-VII»

Для получения сыворотки кролика против структурных белков вируса ящура штамма «А/Кения/G-VII» как биопрепарата для диагностики и специфической профилактики ящура серотипа А применяли 20 клинически здоровых кроликов средней упитанности массой 2,5-3,0 кг.

Для гипериммунизации животных применяли антиген вируса ящура, полученный как описано в примере 6, из которого готовили сложную эмульсию с использованием масляного адъюванта Montanide ISA-61 VG («Seppic», Р. Франция) (в соотношении адъювант/антиген = 60/40 по массе). Полученную вакцину вводили в мышцу задних конечностей кролика на 0, 21 и 42 дни в объеме 0,5 см³. Через 7 дней после последней иммунизации кроликов тотально обескровливали и получали сыворотку крови, содержащую антитела против антигена штамма «А/Кения/G-VII» вируса ящура, которую лиофильно высушивали и хранили при температуре 2-8°С.

Полученные 20 сывороток крови кроликов проверяли в реакции связывания комплемента и определили, что их активность составила 1:6000-1:6250. Данные показатели являются высокими и достаточными (не менее 1:1000) для изготовления диагностических наборов по выявлению антигена и антител против вируса ящура.

Изготовленные сыворотки объединили в общий пул, провели лиофильную сушку и, таким образом, получили биопрепарат, который использовали для проведения реакции связывания комплемента для детекции антигена вируса ящура штамма «А/Кения/G-VII». Для определения диагностической чувствительности реакции анализировали 265 проб антигена, которые являлись заведомо положительными. По результатам проведения реакции связывания комплемента (РСК) доказали, что из 265 образцов сывороток крови все определены в качестве положительных. Для исследования специфичности реакции тестировали 189 отрицательных проб. В результате исследования с помощью РСК, что из 189 отрицательных проб все определены в качестве отрицательных. Пользуясь статистическими методами анализа определили, что в 95%-ном доверительном интервале диагностическая чувствительность (DSe) составила 98,62-100,00%, диагностическая специфичность (DSp) - 98,07-100,00%, k-критерий - 1,000; общая точность (DAc) - 99,19-100,00%.

Таким образом, полученный антиген вируса ящура штамма «А/Кения/G-VII» применен для иммунизации животных как биопрепарат.

Пример 8. Применение антигена вируса ящура штамма
«А/Кения/G-VII» для получения вакцины.

Из полученного антигена, полученного по примеру 6, приготовили сорбированную вакцину для крупного рогатого скота. Провели иммунизацию вакциной в цельном виде 5 голов КРС. На 21 сутки после иммунизации отобрали кровь, получили сыворотки крови, которые исследовали на наличие антител к структурным белкам вируса ящура штамма «А/Кения/G-VII» в РМН и ИФА. Результаты исследования отражены в табл. 6, из которой следует, что среднее значение титра вируснейтрализующих антител в РМН составило 8,05±0,11 log₂ SN₅₀ (положительно, ≥5,5 log₂ SN₅₀). В ИФА процент ингибиции был более 50% (среднее значение составило 86,07±1,29%), что свидетельствует о том, что все сыворотки были положительными. Таким образом, по двум реакциям получили согласованные результаты о наличии защитного количества антител против заражения вируса ящура гомологичным штаммом «А/Кения/G-VII». Следовательно, антиген данного штамма можно применять для создания вакцины, обеспечивающей защиту от ящура указанного штамма.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента Российской Федерации на изобретение «Штамм «А/Кения/G-VII» вируса ящура Aphtae epizooticae серотипа А для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура».

1. OIE. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. 7th еd. Paris, May 2023. - Ch. 3.1.8.

2. Liu W., Yang B., Wang M., Wang H., Yang D., Ma W., Zhou G., Yu L. Identification of a conformational neutralizing epitope on the VP1 protein of type A foot-and-mouth disease virus. Res Vet Sci. 2017 Dec; 115: 374-381. doi: 10.1016/j.rvsc.2017.07.001. Epub 2017 Jul 8. PMID: 28711695.

3. Nguyen Q.T., Yang J., Byun J.W., Pyo H.M., Park M.Y., Ku B.K., Nah J., Ryoo S., Wee S.H., Choi K.S., Poo H. Development of Monoclonal Antibody Specific to Foot-and-Mouth Disease Virus Type A for Serodiagnosis. Pathogens. 2019 Dec 17; 8(4): 301. doi: 10.3390/pathogens8040301. PMID: 31861046; PMCID: PMC6963590.

4. Жильцова М.В. Биологические свойства эпизоотических изолятов вируса ящура типов А, О и Азия-1: Автореф… дис. кан. наук. - Владимир: 2008. - 23 с.

5. Kim J.Y., Lee J.H., Yang J.M., Lee S.Y., Park S.Y., Jin J.S., Kim D., Park J.W., Park J.H., Park S.H., Ko Y.J. Production of Foot-and-Mouth Disease Type O and A Vaccine Antigens on a Pilot Scale and Determination of Optimal Amount of Antigen for Monovalent Vaccines. Vaccines (Basel). 2023 Jun 26; 11(7): 1156. doi: 10.3390/vaccines11071156. PMID: 37514972; PMCID: PMC10383391.

6. Hwang Y.J., Lee K.K., Kim J.W., Chung K.H., Kim S.J., Yun W.S., Lee C.S. Effective Diagnosis of Foot-And-Mouth Disease Virus (FMDV) Serotypes O and A Based on Optical and Electrochemical Dual-Modal Detection. Biomolecules. 2021 Jun 5; 11(6): 841. doi: 10.3390/biom11060841. PMID: 34198783; PMCID: PMC8229964.

7. Tully D.C., Fares M.A. Shifts in the selection-drift balance drive the evolution and epidemiology of foot-and-mouth disease virus. J Virol. 2009; 83: 781-790. doi: 10.1128/JVI.01500-08.

8. Патент РФ на изобретение № 2 773 659. Штамм А 2205/G IV вируса ящура Aphtae epizooticae типа А для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа А. Заявка: 2021113564, 12.05.2021.

9. Методические рекомендации по определению антигенного соответствия между эпизоотическими изолятами и производственными штаммами вируса ящура в перекрестной реакции микронейтрализации / С.Р. Кременчугская, М.В. Жильцова, Т.К. Майорова; ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Владимир, 2012. - 36 с.

10. Эпизоотологические особенности ящура типа А, вызванного гетерологичными штаммами вируса / А.В. Мищенко, В.А. Мищенко, В.В. Дрыгин [и др.] // Ветеринария. - 2014. - № 11. - С. 20-24.

11. Патент № 2674076 C1 Российская Федерация, МПК А61К 39/135 С12Q 1/68. Способ определения титра инфекционной активности вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины с применением метода обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени: заявка № 2017145889: опубл. 04.12.2018.

12. Патент № 2712769 C1 Российская Федерация, МПК G01M 33/58, C12Q 1/68. Способ спектрометрического определения концентрации 146S частиц вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины по оценке количества молекул вирусной РНК, выделенной после иммунного захвата вирионов: заявка № 2019116272: опубл. 31.01.2020.

Таблица 1

Антигенное соответствие (r₁) штамма «А / Кения / G-VII» вируса ящура с производственными штаммами вируса ящура серотипа А в реакции микронейтрализации

Исследуемые штаммы вируса ящура Значения показателя r₁ в реакции микронейтрализации с производственными штаммами вируса ящура для штамма
«А/Кения/G-VII» «А₂₂/Ирак/64» (генотип A/ASIA/Iraq-64) 0,05 «А/Турция/06» (генотип A/ASIA/Iran-05) 0,03 «А №2166/Краснодарский/2013»
(генотип A/ASIA/Iran-05^SIS-10) 0,03 «А №2155/Забайкальский/2013»
(генотип A/ASIA/Sea-97) 0,04 «А/ВНИИЗЖ/2015» (генотип A/ASIA/G-VII) 0,06 «А/Танзания/2013» (генотип A/AFRICA/G-I) 0,08 «А 2205/G-IV» (генотип A/AFRICA/G-IV) (прототип) 0,09

Примечание:

при r₁ ≥ 0,3 - исследуемый и производственный штаммы вируса ящура являются родственными;

при r₁ < 0,3 - исследуемый образец штамма вируса ящура значительно отличается от производственного штамма.

Максимальное родство отмечается при значении r₁ в РМН, стремящимся к 1,0.

Таблица 2

Биологические свойства штамма «А/Кения/G-VII» вируса ящура при культивировании в клеточных линиях (предлагаемое изобретение) (n=9)

Наименование клеточной линии Время проявления
биологической
активности, ч Количество адаптационных пассажей Характеристика адаптированного материала Активность в РСК Титр инфекционной активности вируса, lg ТЦД₅₀/см³ ПСГК-30 17 5 1:32 7,25±0,10 IB-RS-2 23 5 1:16 6,85±0,10 ВНК-21 24 5 1:16 6,54±0,10

Таблица 3

Оценка стабильности репродукции штамма «А/Кения/G-VII» вируса ящура (предлагаемое изобретение) в суспензионной перевиваемой культуре клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/SUSP/ARRIAH

(n=9, p<0,05)

№ п/п Концентрация клеток, млн/см³ Доза заражения, ТЦД₅₀/кл. Длительность репродукции, ч Титр инфекционной активности вируса,
lg ТЦД₅₀/см³ Концент-рация ОВБ, мкг/см³ Концентрация
146S компонента, мкг/см³ Содержание 146S компонента, % 1 4,1 0,005 13,5 8,00 2,85 1,83 64,2 2 4,5 0,005 14,0 8,15 3,12 2,01 64,3 3 4,3 0,005 14,0 8,10 2,92 1,91 65,3 4 4,1 0,005 13,5 8,02 2,85 1,82 64,0 5 4,6 0,005 14,0 8,21 3,15 2,02 64,2 6 4,5 0,005 13,5 8,14 3,08 2,00 64,8 7 4,4 0,005 13,5 8,10 3,02 1,93 64,0 8 4,6 0,005 13,5 8,23 3,15 2,05 65,0 9 4,3 0,005 13,0 8,11 2,95 1,92 65,2 10 4,6 0,005 14,0 8,22 3,14 2,05 65,2 M±m 4,4±0,2 0,005 13,65±0,34 8,13±0,08 3,02±0,12 1,95±0,09 64,62±0,53

Примечание: ОВБ - общий вирусный белок,

146S - иммуногенный компонент,

ТЦД - тканевая цитопатическая доза.

Таблица 4

Оценка типовой специфичности и активности штамма «А/Кения/G-VII» вируса ящура (предлагаемое изобретение) в РСК

Штаммы
вируса
ящура

Сыворотки Штамм «А/Кения/G-VII» вируса ящура Контрольные штаммы вируса ящура 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 А/Кения/G-VII А 2205/G-IV Азия-1/Таджикистан/
2011 SAT-1 №96/62 SAT-2/
XIV/2023 SAT-3 ZIM 4/81 А/Кения/G-VII ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ - ++++ - - - - - А 2205/G-IV ++-- - - - - - - - ++++ - - - - Азия-1/Таджикистан/
2011 - - - - - - - - - ++++ - - - SAT-1 №96/62 - - - - - - - - - - ++++ - - SAT-2/XIV/2023 - - - - - - - - - - - ++++ - SAT-3 ZIM 4/81 - - - - - - - - - - - - ++++ б/с - - - - - - - - - - - - б/а - - - - - - - - - - - - Примечания: «++++» - четыре креста - 100%-ная задержка гемолиза;
«-» - полный гемолиз;
б/с - без сыворотки;
б/а - без антигена.

Таблица 5

Результаты спектрометрического исследования полученных фракций штамма «А/Кения/G-VII» вируса ящура (предлагаемое изобретение) как компонента биопрепарата для диагностики и специфической профилактики ящура серотипа А

(n = 3, p<0,005)

№ фракции п/п Значение оптической плотности, у.е. 1 0,024±0,001 2 0,105±0,001 3 0,402±0,001 4 0,725±0,001 5 1,201±0,001 6 1,521±0,001 7 1,843±0,002 8 1,765±0,001 9 1,523±0,001 10 1,320±0,001 11 0,765±0,001 12 0,402±0,002 13 0,142±0,001 14 0,040±0,001

Таблица 6

Результаты определения антител против структурных белков вируса ящура штамма «А/Кения/G-VII» после однократной иммунизации КРС на 21 сутки после вакцинации в реакции микронейтрализации и ИФА

(n = 3, p<0,005)

№ животного Титр вируснейтрализующих антител против вируса ящура штамма «А/Кения/G-VII» в РМН*, log₂ SN₅₀ Результаты ИФА процент ингибиции, % интерпретация 1 8,00 86,32 положительно 2 8,00 85,42 положительно 3 8,00 85,00 положительно 4 8,00 85,39 положительно 5 8,25 88,21 положительно M±m 8,05±0,11 86,07±1,29 5/5 Примечание: * - при дозе вируса, равной 2,0 lg ТЦД₅₀/мл,
РМН - реакция микронейтрализации (титр антител ≥5,5 log₂ SN₅₀ свидетельствует о серопозитивности),
ИФА - иммуноферментный анализ (процент ингибиции ≥50% свидетельствует о серопозитивности).

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="FMDV A Kenia

G-VII.xml" softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.1.2"

productionDate="2024-07-18">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2024-07-18</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>578</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2024-07-18</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">ФГБУ &quot;Федеральный центр охраны

здоровья животных&quot; (ФГБУ &quot;ВНИИЗЖ&quot;)</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin> Federal State-Financed Institution Federal

Centre for Animal Health (FGBI ARRIAH)</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Штамм «А / Кения / G-VII» вируса

ящура Aphtae epizooticae серотипа А для изготовления биопрепаратов

для диагностики и специфической профилактики ящура</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>2</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>639</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..639</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q1">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>accactgcaacgggggaatctgcagaccctgtcaccaccacggttgaga

actacggtggtgaaacacaggtccgaagacgccaacacacggacgtcagtttcatcatggacagatttgt

gaagatagacagccttggtcccatacatgtcatagacctcatgcatacccaccaacacgggcttgtgggc

gcgctactgcgcgcggccacatactacttctctgacttggagattgtagtgaagcatgaaggtaacctga

cttgggtgcccaacggtgcccctgaaagcgctctccagaacgcgagcaaccccacggcctaccacaaggc

cccgttcaccagacttgcactgccttacaccgcaccacaccgcgtgctggctacggtgtacaacgggaca

aataagtactctgtaactacctcacctagacggggtgacttggggcccctcgcggcgagagttgccgcac

aactccctgcatccttcaactacggtgcaattagagccacgaccatccacgagcttctcgtgcgcatgaa

gcgggccgagctctactgtcctagaccgctgctggcagtagcagtgtcatcaccagacagacacaagcaa

aagatcattgcacccgcaaaacagctctcg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>213</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..213</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>TTATGESADPVTTTVENYGGETQVRRRQHTDVSFIMDRFVKIDSLGPIH

VIDLMHTHQHGLVGALLRAATYYFSDLEIVVKHEGNLTWVPNGAPESALQNASNPTAYHKAPFTRLALPY

TAPHRVLATVYNGTNKYSVTTSPRRGDLGPLAARVAAQLPASFNYGAIRATTIHELLVRMKRAELYCPRP

LLAVAVSSPDRHKQKIIAPAKQLS</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Предложен штамм «А/Кения/G-VII» вируса ящура Aphtae epizooticae генотипа A/AFRICA/G-VII, семейства Picornaviridae, рода Aphthovirus. Штамм депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером №492 - деп / 23-42 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ». Представленный штамм обладает высокой инфекционной, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде, пригоден для контроля антигенной и иммуногенной активности вакцин, изготовления чувствительных и высокоспецифичных диагностических тест-систем и иммуногенных вакцинных препаратов. 1 ил., 6 табл., 8 пр.

Штамм «А/Кения/G-VII» вируса ящура Aphtae epizooticae серотипа А генотипа A/AFRICA/G-VII, депонированный во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером №492 - деп / 23-42 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ» и предназначенный для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа А.