Штамм "SAT-2/North Africa/2012" вируса ящура Aphtae epizooticae генотипа SAT-2/VII/Ghb-12 для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура Российский патент 2024 года по МПК C12N7/00 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, может быть использовано для разработки и изготовления средств диагностики, специфической профилактики ящура генотипа SAT-2/VII/Ghb-12.

Ящур является экономически значимым заболеванием крупного рогатого скота, овец, коз и свиней, а также парнокопытных диких животных. Возбудитель ящура приводит к производственным потерям, особенно в молочной промышленности и свиноводстве, и высокой смертности молодняка животных, а также является серьезным препятствием для международной торговли живыми животными и продуктами из них. В дополнение к нарушению торговли животными вспышки ящура имеют широкомасштабные экономические и социальные последствия как в краткосрочной, так и в долгосрочной перспективе, включая перебои с поставками кормов для животных, ветеринарной фармацевтики и связанных с туризмом отраслей [1, 2].

Страны, в которых обнаружен ящур, во многом отражают уровень их экономического развития: ящур отсутствует в Европе, Северной Америке и Австралии, спорадичен в Южной Америке и эндемичен в большинстве стран Азии и Африки. Наличие ящура дает основания для ограничения торговли продуктами животного происхождения из затронутых стран со странами, в которых нет ящура. Таким образом, лишает развивающиеся страны доступа к богатым рынкам развитого мира, снижая стимулы к повышению производительности и эффективности. Однако, хотя страны, свободные от ящура, пользуются торговыми преимуществами, которые дает этот статус, сама их зависимость от сохранения этой свободы делает их очень уязвимыми в случае распространения вируса ящура [3].

Возбудителем ящура является РНК(+)-содержащий вирус порядка Picornavirales семейства Picornaviridae рода Aphthovirus с длиной нуклеиновой кислоты около 8500 н.о., которая кодирует 4 структурных белка: VP₁, VP₂, VP₃, VP₄ и множество неструктурных протеинов [1, 4]. Выделяют 7 различных серотипов вируса ящура: O, А, Азия-1, C и SAT-1, SAT-2, SAT-3, причем в последние годы активно распространяются представители серотипа SAT-2 [2].

В пределах одного генотипа вируса ящура имеет место явление мутационной изменчивости генома и, как следствие, строения и функций белковых молекул, что приводит к возникновению новых изолятов, которые отличаются по степени вирулентности и иммуногенности от ранее выделенных штаммов вируса ящура.

Каждый из семи серотипов генетически разделен на различные топотипы. Различия между ними определяют при анализе нуклеотидной последовательности 1D-гена (белок VP₁), который характеризуется высокой геномной и антигенной вариабельностью [1, 2, 3]. Данный белок вируса ящура является наиболее изменчивым по своему аминокислотному составу, поскольку на него приходится не менее 90% мутаций всех структурных генов. Самыми вариабельными областями считаются участки 40-60, 130-160 и 190-213 а.о. [4, 5, 6]. Филогенетический анализ на основе нуклеотидной последовательности 1D-гена (белок VP₁) широко используется для вывода эволюционной динамики, эпидемиологических отношений между генетическими линиями и для отслеживания происхождения и перемещения штаммов вируса ящура [2].

Антигенные вариации возникают из-за аминокислотных мутаций, которые изменяют распознавание вирусных белков иммунной системой организма. Поверхностно открытые структуры вируса особенно подвержены иммунной атаке. Процесс появления новых антигенных форм определяется сложным взаимодействием поверхностных вирусных белков и факторов клеток-хозяев [5, 6].

Борьба с ящуром заключается в проведении своевременных профилактических мероприятий, таких как эффективный эпидемиологический контроль за болезнью; вакцинирование против ящура домашних и сельскохозяйственных животных; надзор за передвижением диких парнокопытных животных в приграничных районах, подверженных риску проникновения возбудителя из стран, неблагополучных по ящуру; мониторинговые исследования по оценке иммунного статуса сельскохозяйственного и домашнего скота, включая ретроспективную диагностику ящура [7].

Для серотипа SAT-2 выделяют 14 топотипов (I - XIV), внутри топотипа VII есть разделение на генетические линии, в частности, Lib-12, Ghb-12, Alx-12 и др. [2]. Такое высокое генетическое и антигенное разнообразие приводит к проблемам в специфической профилактике ящура при применении культуральных инактивированных противоящурных вакцин, а также затрудняет штаммоспецифическую диагностику выделенных изолятов вируса ящура. В результате возникает необходимость создания новых средств диагностики и специфической иммунопрофилактики в отношении вируса ящура серотипа SAT-2 и, в частности, генотипа SAT-2/VII/Ghb-12, представители которого активно распространяются на территории Африканского континента и теперь за ее пределами, в том числе на Ближнем Востоке. В результате возникает необходимость создания новых средств диагностики и специфической иммунопрофилактики в отношении ящура генотипа SAT-2/VII/Ghb-12.

На протяжении многих лет периодически фиксировали вспышки ящура генотипа SAT-2/VII/Ghb-12 в странах Африки, а именно в Республике Руанда в 2004 г., в Судане в 2007 г., в Республике Чад 2006 г., в Уганде в 2020 г. В настоящее время проводятся исследования, по результатам которых выявляют вирус ящура данного генотипа на территорию стран Ближнего Востока. Наличие тесных торговых отношений Российской Федерации с этими государствами является угрожающим фактором в отношении распространения возбудителя ящура на территории нашей страны и требует исследования штаммов для создания средств диагностики и специфической профилактики ящура генотипа SAT-2/VII/Ghb-12.

Известны производственные штаммы вируса ящура серотипа SАT-2, которые применяются или использовались ранее в мире для производства средств специфической профилактики ящура:

- штамм («SAT-2/ZIM/14/2002») (генотип SAT-2/I),

- штамм («SAT-2/ZIM/5/81») (генотип SAT-2/II),

- штамм («SAT-2/BOT/P3/98») (генотип SAT-2/III),

- штамм («SAT-2/ETH/1/90») (генотип SAT-2/IV),

- штамм («SAT-2/GHA/2/90») (генотип SAT-2/V),

- штамм («SAT-2/GAM/8/79») (генотип SAT-2/VI),

- штамм («SAT-2/SAU/6/2000») (генотип SAT-2/VII) (прототип),

- штамм («SAT-2/RWO/1/00») (генотип SAT-2/VIII),

- штамм («SAT-2/KEN/2/84») (генотип SAT-2/IX),

- штамм («SAT-2/UGA/19/98») (генотип SAT-2/X),

- штамм («SAT-2/ANG/4/74») (генотип SAT-2/XI),

- штамм («SAT-2/UGA/51/75») (генотип SAT-2/XII),

- штамм («SAT-2/ETH/2/2007») (генотип SAT-2/XIII),

- штамм («SAT-2/ETH/2/91») (генотип SAT-2/XIV).

Изолят вируса ящура был выделен от крупного рогатого скота на территории Египта в 2012 г. и поступил в ФГБУ «ВНИИЗЖ» для проведения научных исследований в 2023 г.

При проведении научных исследований в ФГБУ «ВНИИЗЖ» был охарактеризован и получил название - штамм «SAT-2/North Africa/2012».

По результатам сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей выделенный штамм принадлежит к генотипу SAT-2/VII/Ghb-12 вируса ящура, который значительно отличается от производственных штаммов вируса ящура серотипа SAT-2, в том числе, от штамма «SAT-2/SAU/6/2000».

Настоящее изобретение позволяет расширить арсенал производственных штаммов вируса ящура серотипа SAT-2, обладающих высокой инфекционной, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде, пригодный для контроля антигенной и иммуногенной активности вакцин, изготовления чувствительных и высокоспецифичных диагностических тест-систем и высоко иммуногенных вакцинных препаратов путем получения штамма «SAT-2/North Africa/2012» вируса ящура для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа SAT-2/VII/Ghb-12.

Штамм вируса ящура «SAT-2/North Africa/2012» депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вирусов ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ», под регистрационным номером: №499 - деп / 23-49 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Экспериментально подтверждена возможность использования штамма «SAT-2/North Africa/2012» вируса ящура для изготовления средств диагностики и профилактики ящура генотипа SAT-2/VII/Ghb-12.

Сущность изобретения отражена на графическом изображении:

Фиг. 1. - Дендрограмма, отражающая филогенетическое взаимоотношение штамма «SAT-2/North Africa/2012» вируса ящура с эпизоотическими штаммами серологического серотипа SAT-2. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей гена VР₁.

Фиг. 2. - Данные гель-электрофореза очищенного препарата антигена вируса ящура штамма «SAT-2/North Africa/2012». Примечание: 1 - маркер молекулярного веса, 2 - исследуемая проба препарата антигена вируса ящура.

Сущность изобретения пояснена следующими перечнями последовательностей:

SEQ ID NO:1 представляет последовательность нуклеотидов 1D-гена белка VР₁ штамма «SAT-2/North Africa/2012» вируса ящура генотипа SAT-2/VII/Ghb-12;

SEQ ID NO:2 представляет последовательность аминокислот 1D-гена белка VР₁ штамма «SAT-2/North Africa/2012» вируса ящура генотипа SAT-2/VII/Ghb-12.

Штамм «SAT-2/North Africa/2012» вируса ящура характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки

Штамм «SAT-2/North Africa/2012» вируса ящура имеет следующую таксономию: семейство Picornaviridae, род Aphthovirus, вид Foot-and-mouth disease virus, серотип SAT-2, генотип SAT-2/VII/Ghb-12. Штамм возбудителя обладает следующими морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона иксаэдрическая, размер 23 нм. Вирион состоит из молекулы одноцепочечной положительно заряженной молекулы РНК и 60 копий полипептида, каждый из которых представлен белками VP₄, VP₂, VP₃, VP₁.

Антигенные свойства

По антигенным свойствам штамм «SAT-2/North Africa/2012» вируса ящура относится к серотипу SAT-2. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности. У переболевших животных в сыворотке крови образуются типоспецифические антитела, выявляемые в иммуноферментном анализе и реакции микронейтрализации (РМН).

Методом нуклеотидного секвенирования была определена первичная структура 1D-гена белка VP₁ штамма «SAT-2/North Africa/2012» вируса ящура. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм «SAT-2/North Africa/2012» вируса ящура принадлежит к генотипу SAT-2/VII/Ghb-12 (Фиг. 1).

Антигенное родство (r₁) штамма «SAT-2/North Africa/2012» вируса ящура изучено в реакции микронейтрализации вируса, в перекрестном исследовании штамма со специфическими сыворотками, полученными на следующие производственные штаммы вируса ящура:

- штамм («SAT-2/ZIM/14/2002») (генотип SAT-2/I),

- штамм («SAT-2/ZIM/5/81») (генотип SAT-2/II),

- штамм («SAT-2/BOT/P3/98») (генотип SAT-2/III),

- штамм («SAT-2/ETH/1/90») (генотип SAT-2/IV),

- штамм («SAT-2/GHA/2/90») (генотип SAT-2/V),

- штамм («SAT-2/GAM/8/79») (генотип SAT-2/VI),

- штамм («SAT-2/SAU/6/2000») (генотип SAT-2/VII),

- штамм («SAT-2/RWO/1/00») (генотип SAT-2/VIII),

- штамм («SAT-2/KEN/2/84») (генотип SAT-2/IX),

- штамм («SAT-2/UGA/19/98») (генотип SAT-2/X),

- штамм («SAT-2/ANG/4/74») (генотип SAT-2/XI),

- штамм («SAT-2/UGA/51/75») (генотип SAT-2/XII),

- штамм («SAT-2/ETH/2/2007») (генотип SAT-2/XIII),

- штамм («SAT-2/ETH/2/91») (генотип SAT-2/XIV).

Титр референтных сывороток крови КРС, полученных путем иммунизации животных моновалентными вакцинами из производственных штаммов вируса ящура серотипа SAT-2, против 10² ТЦД₅₀ гомологичного и гетерологичного вируса определяли в РМН при перекрестном титровании, рассчитывая значения с использованием уравнения линейной регрессии, и выражали в lg. Значение r₁ определяли, как антилогарифм разности lg титров сыворотки против гетерологичного и гомологичного вируса [8, 9].

Значение r₁ в РМН интерпретировали следующим образом:

при ≥ 0,3 - исследуемый и производственный штаммы вируса ящура являются родственными;

при < 0,3 - исследуемый образец штамма вируса ящура значительно отличается от производственного штамма.

Максимальное родство отмечается при значении r₁ в РМН, стремящимся к 1,0.

Показатели антигенного родства при изучении штамма «SAT-2/North Africa/2012» составили r₁ от 0,01 до 0,26, что свидетельствует об отсутствии явного антигенного родства с производственными штаммами вируса ящура серотипа SAT-2 (табл. 1).

Гено- и хемотаксономическая характеристики

Штамм «SAT-2/North Africa/2012» вируса ящура является РНК(+) - содержащим вирусом с молекулярной массой 8,08×10⁶ Д. Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной молекулой молекулярной массой 2,85×10⁶ Д. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех основных белков VP₁, VP₂, VP₃ и VP₄. Липопротеидная оболочка отсутствует.

Основным антигенным белком является VP₁. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирусная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса, в том числе такой важный фермент как РНК-зависимую РНК-полимеразу (3D-ген), участвующую в репликации РНК для сборки вирионов.

Физические свойства

Масса вириона составляет 8,40×10^-18 г. Плавучая плотность 1,44 г/см³.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм «SAT-2/North Africa/2012» вируса ящура устойчив к эфиру, хлороформу, и ацетону. Наиболее стабилен при pH 7,45-7,70. Сдвиги pH в кислую и сильно щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам (выше 38,4°С).

Дополнительные признаки и свойства

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Патогенность - патогенен для парнокопытных животных.

Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.

Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 5 пассажей (срок наблюдения) на перевиваемых культурах.

Биотехнологические характеристики

Штамм «SAT-2/North Africa/2012» вируса ящура репродуцируется в перевиваемых культурах клеток: почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), почки свиньи (IB-RS-2), почки сирийского хомячка (ВНК-21).

При испытании было проведено 5 последовательных пассажей штамма «SAT-2/North Africa/2012» вируса ящура в перевиваемых культурах клеток ПСГК-30, ВНК-21, IB-RS-2. Биологические свойства характеризовали путем определения инфекционной активности вируса каждого пассажа в перевиваемой клеточной линии IB-RS-2 и на естественно восприимчивых животных - крупном рогатом скоте (КРС) и свиньях.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его исследования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Исследование биологических свойств штамма «SAT-2/North Africa/2012» вируса ящура при репродукции в монослойных перевиваемых клеточных линиях.

При выделении изолята вируса ящура с целью получения его однородной популяции, обладающей оптимальными биотехнологическими свойствами, использовали комплекс биологических, вирусологических и биохимических методов, предусмотренных методическими указаниями по выявлению и идентификации штаммов вируса ящура [8].

Биологические и вирусологические методы включали в себя метод выделения в клеточной линии и адаптацию изолята вируса ящура к ним.

Процесс выделения возбудителя ящура проводили в монослойных перевиваемых клеточных линиях ПСГК-30, IB-RS-2, ВНК-21 с последующей адаптацией в течение 5 последовательных пассажей. Культуры клеток выращивали в соответствующих питательных средах, в стационарных условиях во флаконах с площадью поверхности 75,0 см², отмывали от ростовой среды и заражали 33%-ной суспензией афтозного материала (множественность заражения составляла 1-10 ТЦД₅₀ на клетку), приготовленной в растворе Хэнкса с 0,5% гидролизата лактальбумина по стандартной рецептуре. Для удаления микрофлоры и балластных клеточных компонентов вирусную суспензию предварительно обрабатывали 10%-ным раствором хлороформа. После 30-минутного контакта вируса с клеточной культурой при температуре 37,0±0,1°C во флаконы вносили поддерживающую среду и инкубировали при температуре 37,0±0,1°C до появления цитопатического действия (ЦПД) в культуре клеток, которое представлено в виде округления клеток, повышения их оптической плотности, дегенерации и отделении клеток от поверхности субстрата. При ЦПД не менее 95% клеток, флаконы подвергали замораживанию-оттаиванию, очистке клеточной взвеси хлороформом и центрифугированию при 3000 g в течение 15 мин. Полученный вируссодержащий материал использовали для последующих пассажей. Вирус считался адаптированным к культурам клеток, если в течение не менее 24 часов проявлялось 95-100% ЦПД в монослое клеточных культур. Адаптация эпизоотического изолята к различным клеточным линиям наступала на уровне пятого пассажа. Титр инфекционной активности вируса ящура определяли с помощью разработанной ранее методики [10].

Результаты адаптации вируса к различным клеточным культурам представлены в таблице 2, данные которой свидетельствуют о высокой адаптационной способности изолята вируса ящура к использованным клеточным линиям. В монослойной культуре клеток ПСГК-30 за 15 ч получали вирусную суспензию с активностью в РСК 1:16 и титром инфекционной активности 7,15±0,10 lg ТЦД₅₀/см³. В монослойной культуре клеток IB-RS-2 за 20 ч получали вирусную суспензию с активностью в РСК 1:16 и титром инфекционной активности 7,09±0,10 lg ТЦД₅₀/см³. В монослойной культуре клеток ВНК-21 за 24 ч получали вирусную суспензию с активностью в РСК 1:16 и титром инфекционной активности 7,00±0,10 lg ТЦД₅₀/см³. Каждое исследование и культивирование проводили 8 раз. В итоге получен штамм «SAT-2/North Africa/2012» с охарактеризованными биологическими культуральными свойствами, который далее использовали для исследования его свойств.

Пример 2. Исследование биологических свойств штамма «SAT-2/North Africa/2012» вируса ящура на крупном рогатом скоте.

Заражение КРС исходным штаммом вируса ящура проводили интрадермолингвально (I пассаж). Адаптацию и наработку штамма «SAT-2/North Africa/2012» вируса ящура на КРС проводили в течение двух последовательных пассажей. С целью определения титра инфекционной активности адаптированного штамма из афт на этапе второго пассажа на КРС получали 10%-ную вирусную суспензию, из которой готовили последовательные 10-кратные разведения в 1/15 М фосфатно-солевом буферном растворе (ФСБР). Подготовленные разведения с 10^-2 по 10^-6 вводили интрадермолингвально в 4 точки по 0,1 см³ двум головам КРС. Учёт результатов титрования на животных проводили спустя 24 ч по наличию афт на месте введения разведений вируса ящура штамма «SAT-2/North Africa/2012». Титр инфекционной активности на КРС данного штамма вируса ящура на стадии первого пассажа на КРС составил 5,50 lg ИД₅₀/0,1 см³, второго пассажа - 6,00 lg ИД₅₀/0,1 см³. Таким образом, была получена 10%-ная афтозная суспензия вируса ящура штамма «SAT-2/North Africa/2012» (2 пассаж на КРС) с титром инфекционной активности 6,00 lg ИД₅₀/0,1 см³.

Пример 3. Исследование биологических свойств штамма «SAT-2/North Africa/2012» вируса ящура на свиньях.

Заражение свиней исходным штаммом «SAT-2/North Africa/2012» вируса ящура проводили внутрикожно на стадии первого пассажа в область венчика передних конечностей. Адаптацию и наработку штамма «SAT-2/North Africa/2012» вируса ящура на свиньях вели в течение двух последовательных пассажей. С целью определения титра инфекционной активности адаптированного штамма из афт второго пассажа на свиньях получали 10%-ную вирусную суспензию, из которой готовили последовательные 10-кратные разведения с использованием в качестве растворителя 1/15 М ФБР. Подготовленные разведения с 10^-2 по 10^-6 вводили внутрикожно в венчики копытец по 0,1 см³ в 4 точки на каждый палец конечности одного разведения, из расчета 1 разведение на 2 копытца 1 конечности каждому из 2 подопытных подсвинков.

Учёт результатов титрования проводили через 24 ч по наличию афт на месте введения разведений. Титр инфекционной активности на свиньях для штамма «SAT-2/North Africa/2012» вируса ящура на свиньях на стадии первого пассажа составил 5,25 lg ИД₅₀/0,1 см³, второго - 5,75 lg ИД₅₀/0,1 см³.

Пример 4. Исследование биологических свойств штамма «SAT-2/North Africa/2012» вируса ящура при репродукции в перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH.

Штамм «SAT-2/North Africa/2012» вируса ящура репродуцировали в суспензионной перевиваемой культуре клеток из почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/SUSP/ARRIAH. В качестве поддерживающей среды использовали среду Игла, с добавлением ферментативного гидролизата мышц сухого, гидролизата белков крови сухого. Клеточную линию заражали вирусом из расчета 0,005 ТЦД₅₀/клетка.

Культивирование штамма «SAT-2/North Africa/2012» вируса ящура осуществляли при температуре 37,0±0,1°С до достижения ЦПД вируса, соответствующего не менее 95%. Полученную вируссодержащую суспензию контролировали на стерильность и содержание 146S компонента и общего вирусного белка (ОВБ). Полученные суспензии были стерильными. Концентрация ОВБ в суспензии составляла 2,13±0,07 мкг/см³. Значения титра инфекционной активности вируса, а также процентное содержание 146S компонента штамма «SAT-2/North Africa/2012» вируса ящура отражены в таблице 3, из данных которой видно, что при средней концентрации клеток BHK-21/SUSP/ARRIAH, равной 4,01±0,14 млн клеток/см³, дозе заражения 0,005 ТЦД₅₀/клетку и продолжительности репродукции вируса 13,95±1,40 ч средний титр инфекционной активности возбудителя ящура был равен 9,02±0,05 lg ТЦД₅₀/см³. Концентрацию 146S компонента вируса ящура определяли с помощью ранее разработанной методики [11]. Содержание данного компонента составило 65,21±0,22 % (1,36±0,08 мкг/см³).

Пример 5. Определение типовой специфичности и активности штамма «SAT-2/North Africa/2012» вируса ящура.

Исследование типовой специфичности и активности штамма «SAT-2/North Africa/2012» вируса ящура проводили в реакции связывания комплемента (РСК). К полученному антигену штамма «SAT-2/North Africa/2012» вируса ящура, взятому в объеме 0,4 см³ в цельном виде и в разведениях 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64 добавляли по 0,1 см³ гомологичной и гетерологичных гипериммунных сывороток, полученных на вирус ящура в рабочем (удвоенном) титре и 0,1 см³ комплемента в рабочем разведении. Смесь выдерживали в водяной бане в течение 20 мин при температуре 37,0±0,1°С. Затем вносили по 0,2 см³ гемолитической системы и выдерживали 30 мин при температуре 37,0±0,1°С. Положительный результат реакции соответствовал 100%-ной задержке гемолиза эритроцитов барана («4 креста»). Параллельно проводили контрольные реакции без сыворотки, без комплемента и компонентов реакции.

В качестве реагентов в РСК использовали сыворотки ящурные типоспецифические гипериммунные морских свинок, полученные на производственные штаммы вируса ящура «А №2029/Турция/06», «SAT-2/North Africa/2012» (предлагаемое изобретение), «Азия-1/Таджикистан/2011», «SAT-1 №96/62», «SAT-2/SAU/6/2000», «О №2311/Забайкальский/2016» комплемент сухой для РСК, гемолизин (сыворотка гемолитическая), эритроциты барана 2% (взвесь на физиологическом растворе, рН = 7,05-7,15). В качестве контроля использовали антигены вируса ящура штаммов «А №2029/Турция/06», «SAT-2/North Africa/2012», «Азия-1/Таджикистан/2011», «SAT-1 №96/62», «SAT-2/SAU/6/2000», «О №2311/Забайкальский/2016».

Результаты исследования отражены в таблице 4, из которой следует, что штамм «SAT-2/North Africa/2012» вируса ящура обладает выраженной типовой специфичностью, относится к вирусу ящура серотипа SAT-2 и активен в РСК в разведении 1:32.

Пример 6. Получение, контроль качества и применение антигена штамма «SAT-2/North Africa/2012» вируса ящура как биопрепарата для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа SAT-2/VII/Ghb-12.

Для получения антигена штамма «SAT-2/North Africa/2012» вируса ящура как компонента для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа SAT-2/VII/Ghb-12 проводили суспензионное культивирование вируса в клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH с получением вирусной суспензии с титром инфекционной активности не ниже 7,00 lg ТЦД₅₀/см³. Полученную вирусную суспензию инактивировали с помощью аминоэтилэтиленимина и осветляли за счет полигексаметиленгуанидина.

Инактивированную культуральную суспензию, содержащую антиген вируса ящура, осветляли в течение 30 мин. при 6000 об/мин и 4±2°С на центрифуге типа Bekman J2-21 (Beckman Coulter, USA). Надосадочную жидкость отбирали и добавляли в нее полиэтиленгликоль с молекулярным весом 6000 Д (ПЭГ-6000) до конечной концентрации 10% и хлорид натрия (сухой) до конечной концентрации 0,85%, интенсивно перемешивали и выдерживали при температуре 4±2°С в течение 22±1 ч. Вирусную суспензию осаждали при 6000 об/мин в течение 60 мин., осадок растворяли в 1/15 М фосфатно-солевом буферном растворе, концентрируя в 20 раз (1/00 от первоначального объёма, до концентрации 27,20 мкг/мл).

К полученному преципитату добавляли 50% хлороформа, интенсивно перемешивали и фракционировали с помощью центрифуги в течение 30 мин. при 3000 об/мин. Отбирали верхнюю водную фракцию, содержащую антиген вируса ящура. Отбирали 100 мкл образца для последующего электрофоретического анализа в 12% полиакриламидном геле.

Для получения очищенного антигена штамма «SAT-2/North Africa/2012» вируса ящура готовили линейный градиент сахарозы с концентрациями 10, 20, 30, 40, 50%. Инактивированную суспензию вируса ящура наливали по 10 мл в центрифужные пробирки, затем последовательно подслаивали растворы сахарозы, начиная с 10%-го и заканчивая 50%-м раствором. Пробирки помещали в металлические центрифужные стаканы и после тщательно выполненного уравновешивания центрифугировали при скорости 40 000 об/мин и температуре 4±2°С в течение 4 часов. Фракционирование градиента сахарозы производили с помощью перистальтического насоса, отбирая фракции по 1 мл в отдельные пробирки. Опалесцирующий слой, содержащий очищенный антиген вируса ящура, располагается приблизительно в 30%-м слое сахарозы. Данную фракцию переосаждали с помощью ультрацентрифугирования в течение 4 часов при скорости 40 000 об/мин. и температуре 4±2°С и ресуспендировали осадок в 1/15 М фосфатно-солевом буферном растворе.

Результаты спектрометрического исследования полученных фракций штамма «SAT-2/North Africa/2012» вируса ящура как компонента для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа SAT-2/VII/Ghb-12 представлены в таблице 5. Анализ проводили для всех фракций, высокие значения оптической плотности наблюдали для №№ 4-11 фракции.

Проведен электрофорез полученных фракций в 12% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях для отобранной фракции. Полученные результаты отражены на фиг. 2, из которой видно, что полученный очищенный антиген вируса ящура.

С помощью реакции связывания комплемента определили концентрацию 146S компонента в полученном антигене, которая составила 27,20±0,05 мкг/см³ (n=3, p<0,005), что достаточно для использования при изготовлении диагностических наборов для выявления антигена и антител против вируса ящура, а также изготовления специфических препаратов для профилактики данного заболевания.

Таким образом, получен и проведены контроль качества антигена штамма «SAT-2/North Africa/2012» вируса ящура как биопрепарата для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа SAT-2/VII/Ghb-12.

Полученный антиген использовали в качестве биопрепарата для проведения реакции связывания комплемента для детекции антигена вируса ящура штамма «SAT-2/North Africa/2012» в исследуемых пробах при изготовлении вакцинных препаратов. Для определения диагностической чувствительности реакции анализировали 420 проб антигена, которые являлись заведомо положительными. По результатам проведения реакции связывания комплемента (РСК) доказали, что из 420 образцов сывороток крови все определены в качестве положительных. Для исследования специфичности реакции тестировали 195 отрицательных проб. В результате исследования с помощью РСК, из 195 отрицательных проб все определены в качестве отрицательных. Пользуясь статистическими методами анализа определили, что в 95%-ном доверительном интервале диагностическая чувствительность (DSe) составила 99,13-100,00%, диагностическая специфичность (DSp) - 98,13-100,00%, k-критерий - 1,000; общая точность (DAc) - 99,40-100,00%. Таким образом, полученный антиген штамма «SAT-2/North Africa/2012» вируса ящура применим для использования в качестве биопрепарата в диагностических тест-систем.

Пример 7. Получение, контроль качества и применение сывороток кролика против антигена данного штамма вируса ящура как биопрепарата для диагностики ящура генотипа SAT-2/VII/GHB-12.

Для получения сыворотки кролика против антигена штамма «SAT-2/North Africa/2012» вируса ящура как биопрепарата для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа SAT-2/VII/Ghb-12 применяли 20 клинически здоровых кроликов средней упитанности массой 2,5-3,0 кг.

Для гипериммунизации животных применяли антиген вируса ящура, полученный как описано в примере 6, из которого готовили эмульсию с использованием масляного адъюванта Montanide ISA-28 R VG («Seppic», Р. Франция) (в соотношении адъювант/антиген = 60/40 по массе). Полученную вакцину вводили в мышцу задних конечностей кролика на 0, 21 и 42 дни в объеме 0,5 см³. Через 7 дней после последней иммунизации кроликов тотально обескровливали и получали сыворотку крови, содержащую антитела против антигена штамма «SAT-2/North Africa/2012» вируса ящура, которую лиофильно высушивали и хранили при температуре 4-8°С.

Полученные 20 сывороток крови кроликов проверяли в реакции связывания комплемента и определили, что их активность составила 1:8000-1:8500. Данные показатели являются высокими и достаточными для изготовления диагностических наборов по выявлению антигена и антител против вируса ящура.

Изготовленные сыворотки объединили в общий пул, провели лиофильную сушку и, таким образом, получили биопрепарат, который использовали для проведения реакции связывания комплемента для детекции антигена вируса ящура штамма «SAT-2/North Africa/2012». Для определения диагностической чувствительности реакции анализировали 485 проб антигена, которые являлись заведомо положительными. По результатам проведения реакции связывания комплемента (РСК) доказали, что из 485 образцов сывороток крови все определены в качестве положительных. Для исследования специфичности реакции тестировали 205 отрицательных проб. В результате исследования с помощью РСК, из 205 отрицательных проб все определены в качестве отрицательных. Пользуясь статистическими методами анализа определили, что в 95%-ном доверительном интервале диагностическая чувствительность (DSe) составила 99,24-100,00%, диагностическая специфичность (DSp) - 98,22-100,00%, k-критерий - 1,000; общая точность (DAc) - 99,47-100,00%. Таким образом, полученный антиген вируса ящура штамма «SAT-2/North Africa/2012» применен для иммунизации животных как биопрепарат. Получена и проведен контроль качества сывороток кролика против антигена штамма «SAT-2/North Africa/2012» вируса ящура, а также показано применение полученной сыворотки как биопрепарата для диагностики ящура генотипа SAT-2/VII/Ghb-12.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента Российской Федерации на изобретение «Штамм «SAT-2/North Africa/2012» вируса ящура Aphtae epizooticae генотипа SAT-2/VII/Ghb-12 для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура».

1. Kitching P, Hammond J, Jeggo M, Charleston B, Paton D, Rodriguez L, Heckert R. Global FMD control--is it an option? Vaccine. 2007 Jul 26;25(30):5660-4. doi: 10.1016/j.vaccine.2006.10.052. Epub 2006 Nov 9. PMID: 17126959.

2. OIE. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. 7th еd. Paris, 2022. - Ch. 3.1.8.

3. Пономарев А.П., Узюмов В.Л. Вирус ящура: структура, биологические и физико-химические свойства. Владимир: Фолиант, 2006. - 250 с.

4. Alexandersen, S. The pathogenesis and diagnosis of foot and mouth disease / S. Alexsandersen, Z. Zhang, A.L. Donaldson // J. Compr. Pathol. - 2003. - V. 129. - P. 268-282.

5. Жильцова М.В. Биологические свойства эпизоотических изолятов вируса ящура типов А, О и Азия-1: Автореф… дис. кан. наук. - Владимир: 2008. - 23 с.

6. Бурдов А.Н., Дудников А.И., Малярец П.В. и др. Ящур. / Под ред. А.Н. Бурдова. - М., Агропромиздат, 1990, 320 с.

7. Анализ эпизоотической ситуации по ящуру в России с 2010 г. по март 2019 г. / В. П. Семакина, Т. П. Акимова, В. А. Мищенко, А. К. Караулов // Ветеринария. - 2019. - № 11. - С. 16-20.

8. Методические рекомендации по выделению и идентификации штаммов вируса ящура /А. А. Гусев, В. М. Захаров, Ж. А. Шажко и др.; ФГУ «ВНИИЗЖ». - Владимир. 2002. - 31 с.

9. Методические рекомендации по определению антигенного соответствия между эпизоотическими изолятами и производственными штаммами вируса ящура в перекрестной реакции микронейтрализации /С. Р. Кременчугская, М. В. Жильцова, Т. К. Майорова; ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Владимир, 2012. - 36 с.

10. Патент № 2674076 C1 Российская Федерация, МПК А61К 39/135 С12Q 1/68. Способ определения титра инфекционной активности вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины с применением метода обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени: № 2017145889: заявл. 25.12.2017: опубл. 04.12.2018 / Д.А. Лозовой, Д.В. Михалишин [и др.]; заявитель Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ").

11. Патент № 2712769 C1 Российская Федерация, МПК G01M 33/58, C12Q 1/68. Способ спектрометрического определения концентрации 146S частиц вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины по оценке количества молекул вирусной РНК, выделенной после иммунного захвата вирионов: № 2019116272: заявл. 27.05.2019: опубл. 31.01.2020 / Д.А. Лозовой, Д.В. Михалишин [и др.]; заявитель Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ").

Таблица 1

Антигенное родство (r₁) штамма «SAT-2/North Africa/2012» вируса ящура с производственными штаммами вируса ящура серотипа SAT-2 в реакции микронейтрализации

Исследуемые штаммы вируса ящура Значения показателя r₁ в реакции микронейтрализации с производственными штаммами вируса ящура для штамма
«SAT-2 / North Africa / 2012» «SAT-2/ZIM/14/2002» (генотип SAT-2/I) 0,03 «SAT-2/ZIM/5/81» (генотип SAT-2/II) 0,05 «SAT-2/BOT/P3/98» (генотип SAT-2/III) 0,04 «SAT-2/ETH/1/90» (генотип SAT-2/IV) 0,01 «SAT-2/GHA/2/90» (генотип SAT-2/V) 0,07 «SAT-2/GAM/8/79» (генотип SAT-2/VI) 0,06 «SAT-2/SAU/6/2000» (генотип SAT-2/VII) (прототип) 0,26 «SAT-2/RWO/1/00» (генотип SAT-2/VIII) 0,17 «SAT-2/KEN/2/84» (генотип SAT-2/IX) 0,15 «SAT-2/UGA/19/98» (генотип SAT-2/X) 0,13 «SAT-2/ANG/4/74» (генотип SAT-2/XI) 0,09 «SAT-2/UGA/51/75» (генотип SAT-2/XII) 0,10 «SAT-2/ETH/2/2007» (генотип SAT-2/XIII) 0,20 «SAT-2/ETH/2/91» (генотип SAT-2/XIV) 0,19

Таблица 2

Биологические свойства штамма «SAT-2/North Africa/2012» вируса ящура при культивировании в клеточных линиях
(предлагаемое изобретение)

(n=8)

Наименование клеточной линии Время проявления
биологической
активности, ч Количество адаптационных пассажей Характеристика адаптированного материала Активность в РСК Титр инфекционной активности вируса, lg ТЦД₅₀/см³ ПСГК-30 15 5 1:16 7,15±0,10 IB-RS-2 20 5 1:16 7,09±0,10 ВНК-21 24 5 1:16 7,00±0,10

Таблица 3

Оценка стабильности репродукции штамма «SAT-2/North Africa/2012» вируса ящура (предлагаемое изобретение) в суспензионной перевиваемой культуре клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/SUSP/ARRIAH

(n=10)

№ п/п Концентрация клеток, млн/см³ Доза заражения, ТЦД₅₀/кл. Длительность репродукции, ч Титр инфекционной активности вируса,
lg ТЦД₅₀/см³ Концент-рация ОВБ, мкг/см³ Концентрация
146S компонента, мкг/см³ Содержание 146S компонента, % 1 4,0 0,005 13,5 9,00 2,12 1,39 65,3 2 3,9 0,005 13,0 8,95 2,05 1,34 65,2 3 3,9 0,005 13,0 9,10 2,23 1,45 65,0 4 4,2 0,005 16,5 9,02 2,13 1,40 65,5 5 3,9 0,005 13,0 9,05 2,14 1,40 65,5 6 4,0 0,005 16,5 9,00 2,12 1,39 65,3 7 3,9 0,005 14,0 8,97 2,00 1,30 65,2 8 3,9 0,005 13,0 9,10 2,23 1,15 64,8 9 4,2 0,005 13,0 9,05 2,15 1,40 65,3 10 4,2 0,005 14,0 9,00 2,11 1,37 65,0 M±m 4,01±0,14
p<0,05 0,005 13,95±1,40
p<0,05 9,02±0,05
p<0,05 2,13±0,07
p<0,05 1,36±0,08
p<0,05 65,21±0,22
p<0,05

Примечание: ОВБ - общий вирусный белок,

146S - иммуногенный компонент,

ТЦД - тканевая цитопатическая доза.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="FMDV-SAT-2 VII

Ghb-12.xml" softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.1.2"

productionDate="2023-11-13">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-11-13</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>554</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-11-13</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">ФГБУ &quot;Федеральный центр охраны

здоровья животных&quot; (ФГБУ &quot;ВНИИЗЖ&quot;)</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>FGBI &quot;ARRIAH&quot;</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Доронин Максим

Игоревич</InventorName>

<InventorNameLatin>Doronin Maksim Igorevich </InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Штамм «SAT-2/North Africa/2012»

вируса ящура Aphtae epizooticae генотипа SAT-2/VII/Ghb-12 для

изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической

профилактики ящура</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>2</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>645</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..645</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q1">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>actaaatcagcgggagaaggcgcagatgtcgtcaccacggacccatcca

cacacggtgggaacgttcaagagggccggcgcaaacacaccgaagttgcgttccttcttgaccgcagtac

acatgtccacacaggaaaaacatcttttgtcgtggacctcatgaacacaaagaagaaggcgctcgtgggc

gcaatcctgcgggcttccacctactacttttgtgaccttgagattgcgtgtgtgggcgatcacacaaggg

tcttttggcaacccaacggggcaccgcgaaccacccagcccggcgataaccccatggtttttgctaaggg

cggcgtgacccgctttgccatcccgttcacagccccgcaccggctgctgtccaccgtctacaacggcgag

tgcgactacaacaagactgttactgccatccgtggggaccgggcagcactcgcggcaaagtatgctgaca

acacgcacaccctgccgtcaaccttcaacttcgggttcgtgaccgtcgacaaaccagtcgacgtttacta

ccgaatgaagagggctgagctgtactgcccacgcccgctgttgccaacctacgaccacgcaggcagagac

agattcgacgcgcccatcggcgtcgagagaaaaccc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>215</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..215</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>TKSAGEGADVVTTDPSTHGGNVQEGRRKHTEVAFLLDRSTHVHTGKTSF

VVDLMNTKKKALVGAILRASTYYFCDLEIACVGDHTRVFWQPNGAPRTTQPGDNPMVFAKGGVTRFAIPF

TAPHRLLSTVYNGECDYNKTVTAIRGDRAALAAKYADNTHTLPSTFNFGFVTVDKPVDVYYRMKRAELYC

PRPLLPTYDHAGRDRFDAPIGVERKP</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии. Представленный штамм репродуцируется в перевиваемых культурах клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), почки свиньи (IB-RS-2), почки новорожденного сирийского хомячка (ВНК-21). В перевиваемой суспензионной культуре клеток почки сирийского хомячка ВНК-21/SUSP/ARRIAH в течение 13,95±1,40 часов инкубирования концентрация 146S компонента штамма «SAT-2/North Africa/2012» генотипа SAT-2/VII/Ghb-12 вируса ящура имеет средние значения 1,36±0,08 мкг/см³ (65,21±0,22%), сохраняя исходные характеристики при пассировании в новой перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH. Представленный штамм «SAT-2/North Africa/2012» может быть использован для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа SAT-2/VII/Ghb-12 и для контроля антигенной активности противоящурных вакцин. 2 ил., 5 табл., 7 пр.

Штамм «SAT-2/North Africa/2012» вируса ящура Aphtae epizooticae генотипа SAT-2/VII/Ghb-12, депонированный во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером №499 - деп / 23-49 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ» и предназначенный для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа SAT-2/VII/Ghb-12.