Средство для функционального энтерального диетического питания, содержащее муропептидный постбиотик, являющийся абсолютно специфическим агонистом к NOD2-рецепторам Российский патент 2024 года по МПК A23L33/00 

Средство для функционального энтерального диетического питания, содержащее муропептидный постбиотик, являюийся абсолютно специфическим агонистом к NOD2-рецепторам, причем в качестве такого средства используют муропептидный постбиотик у которого соотношение относительной экспрессии провоспалительного цитокина IL-1β и противовоспалительных цитокинов не превышает величины, равной 1,5 и это средство предназначено для комплексной коррекции синдрома вторичной иммунной недостаточности (ВИН) и сопряженного с ней дисбиоза у онко- и коморбидных пациентов с хроническими неинфекционными заболеваниями, причем данный постбиотик входит в состав пищевых композиций, содержащих кроме такого постбиотика инертные к нему традиционные наполнители, разбавители и эксципиенты.

Изобретение относится к области функционального диетического питания включающего добавки биотиков с целью коррекции или профилактики тех или иных патологических состояний пациентов.

Было обнаружено, что средства функционального диетического питания, на основе некоторых муропептидных постбиотиков из числа абсолютно специфических агонистов к NOD2-рецепторам особенно эффективны для применения в соответствии с настоящим изобретением у онкологических и коморбидных пациентов с хроническими неинфекционными заболеваниями нуждающихся в коррекции вторичной иммунной недостаточности и сопряженного с ней дисбиоза.

Заявленное в изобретении фармакологическое позиционирование таких постбиотиков основано на их статусе абсолютно специфичных агонистов к внутриклеточному NOD2 -рецептору, который в активированном состоянии обеспечивает комплексный коррекционный эффект в отношении вторичной иммунной недостаточности пациентов и сопряженного с ней дисбиоза, влияя на 3 компонента кишечника: иммунную систему слизистой оболочки, эпителиальный барьер и микробиоту.

Конкретной целью настоящего изобретения являлась комплексная коррекция вторичной иммунной недостаточности (ВИН) и сопряженного с ней дисбиоза желудочно-кишечного тракта у онкологических и коморбидных пациентов с хроническими неинфекционными заболеваниями посредством применения муропептидного постбиотика являющегося абсолютно специфическим агонистом к NOD2-рецепторам как средства функционального диетического питания.

Уровень техники

В медицинской практике врачам часто приходится лечить так называемых коморбидных больных, у которых имеется сразу несколько хронических заболеваний. Такие ситуации обусловлены широкой распространенностью основных хронических неинфекционных заболеваний ( онко- уро-, лор-, гастро-, сердечно-сосудистых и т.д.) и их тесными патогенетическими взаимосвязями. Было выяснено, что в патогенез любых хронических заболеваний вовлечена иммунная дисфункция и потому весь широкий спектр хронических заболеваний, сопровождается синдромом вторичной иммунной недостаточности, при которой дисфункции в системе иммунитета являются обратимыми. Также было выяснено, что любая хроническая патология сопровождается поражением нормофлоры микробиоты толстого кишечника пациентов. При этом дисбактериоз всегда усугубляет течение хронических болезней[1]. Таким образом, при выборе стратегии ведения пациентов и, особенно, онко- и коморбидных пациентов, хроническая патология создает клиническую ситуацию, требующую учета синдрома ВИН и поражения нормофлоры микробиоты. Достигнутая современной наукой расшифровка механизмов взаимоотношения факторов «микробиота- иммунитет» привела к логическому выводу необходимости модифицировать этиотропную терапию хронических заболеваний включением в протокол лечения, кроме базовой терапии, патогенетически обоснованных средств, корректирующих одновременно нормофлору слизистых оболочек и иммунный гомеостаз. До недавнего времени для этих целей использовали функциональное биотическое питание, содержащее добавки пробиотиков (одни или в комбинациях с пребиотиками) или синбиотики, поскольку применение бактериальных препаратов является наиболее физиологическим. Все используемые для этих целей пробиотики представляют собой живые микроорганизмы, выбранные из пейзажа нормальной микробиоты слизистых оболочек. Однако, как оказалось, их применение в качестве лекарственных средств или биологических добавок к питанию, не всегда может обеспечить ожидаемые эффекты из-за многих причин. Во-первых, состав кишечной микробиоты варьируется между популяциями и даже отдельными людьми. Состав микробиоты кишечника связан с ее метаболическим и функциональным фенотипом. Следовательно, степень микробного метаболизма компонентов может различаться у разных людей. Это может привести к различиям в воздействии этих «биотиков» на здоровье между людьми. Во-вторых, введение в организм живых бактерий не безопасно для людей с синдромом ВИН. В-третьих, они могут препятствовать заселению слизистых оболочек микроорганизмами резидентными для макроорганизма. Кроме того, ни один из пробитиков и синбиотиков не может полностью воспроизвести состав нормофлоры, а значит, не способен восстановить нормальный баланс кишечной микробиоты Поэтому, согласно современным представлениям, в качестве альтернативы пробиотикам позиционируются постбиотики. Международная научная ассоциация пробиотиков и пребиотиков (ISAPP) определила постбиотики как «препараты неживых микроорганизмов и/или их компонентов, которые приносят пользу для здоровья. Такие препараты должны содержать инактивированные микробные клетки или компоненты клеток». Постбиотики могут включать множество различных компонентов, в том числе метаболиты, короткоцепочечные жирные кислоты (КЦЖК), структуры типа пилей, фракции микробных клеток, функциональные белки, внеклеточные полисахариды (ЭПС), клеточные лизаты, тейхоевую кислоту и муропептиды, полученные из пептидогликанов клеточных стенок бактерий[2]. Клинически установлено, что постбиотики обладают ключевыми пробиотическими эффектами и при этом имеют ряд преимуществ по сравнению с живыми пробиотиками, главным образом, профилем безопасности и своим многоцелевым поливалентным действием. Например, мурамилпептиды из пептидогликанов клеточных стенок бактерий способны оказывать благотворное действие на макроорганизм, в основном иммуномодулирующее, и одновременно поддерживать целостность кишечного барьера, защищать макроорганизм от энтеропатогенов, восстанавливать нормальный пейзаж микробиоты макроорганизма после его поражения из-за болезни или ятрогенных причин[3]. Установлена тесная взаимосвязь между состоянием клеток макроорганизма («хозяина») и состоянием микробиоты[4]. Также установлено, что иммунная система уравновешивает микробиоту толстой кишки, в том числе регулируя гомеостаз эпителиальной поверхности. Это подводит к новым терапевтическим стратегиям для восстановления баланса микробиоты толстой кишки в широком спектре заболеваний человека, поскольку дисбактериоз является процессом, протекающим непосредственно на эпителиальных поверхностях слизистых оболочек кишечника.

Изучение механизмов развития дисбактериоза показало, что при экспериментальном дисбактериозе, происходит снижение активности кислородзависимых бактерицидных систем профессиональных (перитонеальные макрофаги) и непрофессиональных (энтероциты и колоноциты) фагоцитов. Это снижение активности наиболее значительное в колоноцитах и энтероцитах по сравнению с перитонеальными макрофагами, что указывает на преимущественное снижение местной неспецифичесюй резистентности. При экспериментальном (мыши) дисбактериозе, обусловленном использованием антибиотиков широкого спектра действия, выявлена четко выраженная зависимость характера изменений микрофлоры кишечника от состояния активности кислородзависимых бактерицидных систем колоноцитов и энтероцитов: наибольшему снижению активности кислородзависимых бактерицидных систем соответствует максимальное количество E.coli со сниженной ферментативной активностью, гемолитических E.coli и условно-патогенных микроорганизмов в составе микрофлоры. Установление факта развития гипоксического состояния эпителиальных клеток кишечника параллельно с изменениями в состоянии прооксидантной и антиоксидантной системы макроорганизма указывают на то, что использование для коррекции дисбактериоза только пробиотических препаратов недостаточно. Наблюдаемый сдвиг в составе микробиоты толстой кишки от облигатных к факультативным анаэробным бактериям, связанный со многими хроническими заболеваниями человека, может иметь общую основу для дисфункции колоноцитов[5]. Установлено, что различные метаболические состояния, принятые колоноцитами во время гомеостаза кишечника или дисбактериоза, очень напоминают метаболическое програмирование макрофагов М2 или М1. Вышеизложенное объясняет почему в настоящее время существует потребность в новых средствах, обладающих способностью более комплексного воздействия на организм пациентов с ВИН, сопряженным с дисбиозом, чем пробиотики/синбиотики.

Из уровня техники можно было предположить, что наиболее продуктивно коррекцию вторичной иммунной недостаточности и сопряженного с ней дисбиоза будут выполнять такие муропептиды из пептидогликанов клеточных стенок бактерий, которые проявляют абсолютно специфический агонизм к внутриклеточному NOD2 -рецептору[6], который обладает комплексным действием, обеспечивающим коррекционный и протективный эффекты в отношении дисбиоза и вторичной иммунной недостаточности пациентов. NOD2 может влиять на 3 компонента кишечника: иммунную систему слизистой оболочки, эпителиальный барьер и микробиоту просвета. Сообщалось, что NOD2 регулирует развитие кишечно-ассоциированной лимфоидной ткани (GALT) и функциональность иммунных клеток, включая макрофаги, дендритные клетки, и Т-клетки. NOD2 также может модулировать секрецию антимикробных пептидов, проницаемость слизистой оболочки кишечника, рост и выживание клеток эпителия толстой кишки. Генотип NOD2 в итоге влияет на микробный состав кишечника у человека и мыши. Специалистами в области иммунологии раскрыт механизм действия муропептидов на эпителиальные клетки, в том числе находящиеся в ЖКТ. Так в отношении глюкозаминилмурамилдипептидов, относящихся к группе таких муропептидов которые являются абсолютно специфическими агонистами NOD2 рецептора, было установлено, что они через взаимодействие с NOD2-рецепторами активируют нескольких сигнальных клеточных путей, включая NF-κB (nuclear factor κB), MAPK (mitogen-activated protein kinase) и интерфероновый (IFN) пути, что приводит к увеличению синтеза провоспалительных цитокинов, индукции, пролиферации и дифференцировки иммунокомпетентных клеток[7]. Также установлено, что абсолютно специфические агонисты NOD2 - рецептора мурамилдипипетид МДП и его гомологи глюкозаминилмурамилдипептиды ГМДП и ГМДП-А вызывают синтез провоспалительного цитокина ИЛ-6, хемокина CXCL-8 и антимикробного пептида β-дефензина, играющих важную роль в защите слизистых. В пограничных клетках, в частности эндотелия, эти мурамилдипептиды усиливают экспрессию NOD2-рецептора, приводя к фосфорилированию интерферон-регуляторного фактора IRF3 и синтезу ИФН-1. Кроме того, усиливается экспрессия генов провоспалительных цитокинов, включая ИЛ-1β, ИЛ-8 и MCP-1. Все эти изменения существенно усиливают защиту слизистой кишечника. Другим важным свойством является способность абсолютно специфических агонистов NOD2 - рецептора МДП и его гомологов повышать в эпителиальных клетках продукцию активных форм кислорода (АФК), обладающих бактерицидными функциями. В настоящее время установлено, что способностью к продукции АФК обладают не только фагоциты, нейтрофилы и макрофаги, но и практически все клетки макроорганизма. Ответственной за продукцию АФК в различных органах и тканях является семейство трансмембранных ферментов - суперсемья NOX/DUOX, состоящая из адаптерных и регуляторных белков. В барьерных органах макроорганизма, в том числе кишечнике, экспрессируются оксидазы DUOX1 и DUOX2 (dual oxidase). При взаимодействии эпителиальных клеток с мурамилдипептидами происходит транслокация цитозольного NOD2-рецептора к цитоплазматической мембране и его взаимодействие с DUOX2. Образуется сложный мультибелковый комплекс, активирующий повышенное образование АФК.

Таким образом, известный уровень техники позволяет объяснить почему применение муропептидных постбиотиков являющихся специфическими агонистами к внутриклеточному NOD2-рецептору имеет потенциал к корректированию тех или иных патологий в составе лекарственных или пищевых продуктов.

Введение муропептидных постбиотиков в функциональное диетическое питание для решения тех или иных задач уже получило свое развитие.

Имеется техническое решение предлагающее использовать в качестве диетических модуляторов композиции глюкопротеина, которые демонстрируют ингибирование активности гамма глютамилтранспептидазы (GGTP) и могут быть полезны для лечения окислительного стресса после ишемического реперфузионного повреждения, атеросклероза, сердечного приступа, инфаркта головного мозга и хронической сердечной недостаточности [US20010034325A1 «Dietary modulators of gamma glutamyl transpeptidase», приоритет от 18.01.2001]. Решаемая в патенте задача: диетическое ингибирование GGTP пищевыми продуктами и напитками, содержащими в качестве эффективного компонента постбиотики - глюкопротеины муропептидного ряда, полученные из грамположительных бактерий. Предложенное решение - создание нового медицинского продукта питания, состоящего из пробиотических муропептидных глюкопротеиновых комплексов которые демонстрируют ингибирование активности GGTP и полезны для лечения окислительного стресса, причем данные пробиотические глюкопротеиновые комплексы получают из таких грамм-положительных бактерий, как Lactobacillus или Bifidum, выделяя эти комплексы из продуктов разложения пептидогликанов клеточной стенки названных бактерий в виде фракции глюкопротеинов с молекулярной массой не выше 30 000 D и не менее 800 D, причем тщательно удаляют из них низкомолекулярные иммуногенные примеси, такие как глюкозаминилмурамилдипептиды. Эту целевую фракцию муропептидов дополнительно активируют через создание композиции указанных пробиотических глюкопротеинов с изолятами соевых белков и N- ацетилглюкозамином. Авторы этого изобретения работают с постбиотиками, получаемыми из пептидогликанов клеточных стенок бактерий, как и в настоящей заявке, но при этом они решают другую поставленную задачу и применяют другие продукты деградации пептидогликанов. Примененные авторами этого изобретения постбиотики в принципе не могут решать задачу коррекции ВИН и дисбиоза, так как, во-первых, из примененной композиции исключены низкомолекулярные иммуногенные постбиотики муропептидного ряда- специфические агонисты к внутриклеточному NOD2-рецептору, которые как раз являются предметом данной заявки. Во-вторых, для функционального питания применены не индивидуальные вещества с известным механизмом действия, а неидентифицированные композиции веществ с невыявленным механизмом действия. Такой продукт в силу исключения из него иммуногенных постбиотиков, априори не может выполнить ту патогенетически обоснованную функцию, которую обеспечивает заявленный постбиотик для коррекции ВИН, сопряженного с дисбиозом у онкологических и коморбидных пациентов с хроническими неинфекционными заболеваниями.

Другим постбиотическим продуктом муропептидного ряда для функционального питания заявлена диетическая композиция для управления и лечения окислительного стресса [US20050059579А1 «Dietary and pharmaceutical compositions for management and treatment of oxidative stress», приоритет от 06.06.2003 и US2007167355A1 «Dietary and pharmaceutical compositions for management and treatment of oxidative stress» приоритет от 06.06.2003]. В данной группе изобретений поставлена задача создания лечебного питания для функционального диетического лечения всех состояний окислительного стресса с повышенной активностью гамма-глутамилтрансферазы и сопутствующими изменениями экспрессии NF-kB, что может быть особенно полезно для модуляции апоптоза у людей с хронической вирусной инфекцией и метастазированием рака. В этом техническом решении, как и в настоящей заявке на изобретение, активным продуктом в функциональном диетическом питании использованы постбиотики из группы муропептидов, получаемых из разложения гликопептидов клеточных стенок бактерий. В изобретении решается отличительная от нашего изобретения задача и отличительными средствами. Во-первых, эти постбиотики, высвобождающиеся после расщепления специфической эндопептидазой и лизоцимом пептидогликанов клеточных стенок бактерий - представителей родов Lactobacillus и Bifidum, представлены не индивидуальным веществом, а композицией постбиотических гликопептидов, содержащих совокупность N -глюкозаминил- N-ацетилмурамилдипептидов, -трипептидов, -тетрапептидов, -пентапептидов, -гексапептидов, -октапептидов с нераскрытым количественным составом этой композиции. В таком составе только часть веществ является специфическими агонистами к внутриклеточному NOD2-рецептору (ди- и трипептиды). Во-вторых, такой продукт для выполнения заявленной функции дополнительно активируется добавлением к нему биофлаваноидов из соевого белка или красного вина. Раскрытое в этом изобретении ингибирование прооксидантного действия TNF- альфа в отличие от заявляемого нами технического решения не является многофакторным. Даже максимально эффективная модуляция окислительного стресса, без способности воздействовать на другие факторы, провоцирующие ВИН и дисбиоз, не может корректировать эти состояния так же эффективно, как заявляемый постбиотик глюкозаминилмурамилдипептид-кислота (ГМДП-А).

Наиболее близким к заявляемому изобретению является техническое решение предлагающее использовать глюкозаминилмурамилдипептид ГМДП в продуктах питания и напитках [JP2007238512A «New action of gmdp, pharmaceutical agent and food and drink», приоритет от 09.03.2006]. Решаемая в патенте задача: представить новый противовоспалительный агент в форме функционального пищевого материала, подавляющего экспрессию γ-GTP (γ-глутамилтранспептидаза; GGTP). Для этого предлагается фармацевтический агент ГМДП, который ранее был известен авторам японского патента как иммунный адъювант, применить его в качестве противовоспалительного средства, а также применить продукты питания и напитки, содержащие ГМДП (N-ацетил-D-глюкозаминил-β(1,4)-N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутамин). Поскольку было обнаружено, что ГМДП может оказывать действие на подавление экспрессии GGTP, подавление запаха изо рта и т.п., то данным изобретением было предложено применять ГМДП в продуктах питания и напитках при различных воспалениях - таких как хроническом ревматоидном артрите, остеопорозе, периодонтите, для подавления запаха изо рта и т.п. В этом изобретении N- ацетилглюкозаминилмурамилдипептид (класс гликопептидов, группа муропептидов) применен как средство функционального питания. Это вещество является специфическим агонистом NOD2-рецептора. Назначение применения ГМДП в японском патенте - в качестве противовоспалительного лекарственного и пищевого средства. Применение аргументировано способностью ГМДП подавлять экспрессию γ-глутамилтранспептидазы, причем данная способность подтверждена в патенте опытами in vitro и только при сверхвысоких дозах ГМДП, то есть при дозах не менее 1000 мкг/мл. Однако известно, что ГМДП, как и многие другие муропептиды, имеет ограниченную широту терапевтического действия, обусловленную пирогенностью данных веществ. Сообщалось[8], что при определении пирогенности на кроликах ГМДП был апирогенен только в дозах ниже 0,01 мг/кг. По причине пирогенности ранее применение ГМДП было известно только в качестве лекарственного средства в узком, строго контролируемом, интервале доз, но не в качестве функционального питания.

Издержки со временной цивилизации привели к большой численности онкологических и коморбидных пациентов с хроническими неинфекционными заболеваниями, остро нуждающихся в коррекции синдрома вторичной иммунной недостаточности и сопряженного с ней дисбиоза. Для уменьшения большой медикаментозной нагрузки таких пациентов, связанной с проведением этиотропного лечения, для коррекции у них синдрома ВИН и дисбиоза наиболее востребовано дополнительное функциональное диетическое питание, а не новые лекарственные средства. Поэтому развитие арсенала средств для функционального энтерального диетического питания онкологических и коморбидных пациентов с хроническими неинфекционными заболеваниями, нуждающихся в коррекции синдрома вторичной иммунной недостаточности и сопряженного с ней дисбиоза является востребованным и актуальным.

Краткое описание изобретения

Муропептидные постбиотики, из числа абсолютно специфических агонистов NOD2-рецепторов имеют потенциал для комплексной коррекции синдрома ВИН и сопряженного с ней дисбиоза, в том числе благодаря механизму потенциирования экспрессии провоспалительных цитокинов. Однако, некоторые провоспалительные цитокины, например такие как IL-1β, являются сильными пирогенами и поэтому только способность муропептидного постбиотика балансировть выработку про- и противовоспалительных цитокинов будет определять широту его терапевтического действия и, соответственно, доступность для применения в пищевых функциональных диетических продуктах. Поэтому задача настоящего изобретения заключалась в идентификации муропептидного постбиотического продукта из числа абсолютно специфических агонистов к NOD2-рецепторам, который может комплексно корректировать синдром вторичной иммунной недостаточности и сопряженного с ней дисбиоза и при этом обладать достаточной для применения в качестве функционального диетического питания широтой терапевтического действия.

Соответственно, первым аспектом настоящего изобретения было установление критерия применимости муропептидного постбиотика в качестве средства для функционального энтерального диетического питания. Таким критерием явилось установление того факта, что муропептидный постбиотик являющийся абсолютно специфическим агонистом к NOD2-рецепторам, для применения в качестве средства для функционального энтерального диетического питания должен иметь соотношение относительной экспрессии провоспалительного цитокина IL-1β и противовоспалительных цитокинов не превышающеее величины, равной 1,5.

В Примере 1 было проведено сравнительное изучение способности муропептидных постбиотиков, относящихся к абсолютно специфичным агонистам NOD2-рецептора, к эффективному участию в активации NF-kB сигнального пути, необходимому для корректировки ВИН, и способности балансировать экспрессию провоспалительных и противовоспалительных цитокинов. Исследование было проведено методом ПЦР в реальном времени, комбинированным с обратной транскрипцией на клеточной линии J774 мышиных макрофагов в ряду трех гомологов: ГМДП, ГМДП-А и ГМДП-Lys. Для подтверждения способности данных муропептидов участвовать в активации NF-kB сигнального пути оценивалась их экспрессия в отношении молекул NOD2-рецептора, а для оценки широты терапевтического действия было проведено сравнение их влияния на уровень экспрессии мРНК провоспалительных цитокинов ( IL-1β и TNF-α,) и противовоспалительных цитокинов (IL-10 и TGF-β). Учитывая, что именно провоспалительный цитокин IL-1β определяет пирогенные свойства вещества, и что пирогенность является основным токсическим воздействием, ограничивающим применение муропептидов, широту терапевтического действия муропептидных постбиотиков оценивали по отношению показателя относительной экспрессии гена IL-1β к сумме показателей относительной экспрессии противовоспалительных генов IL-10 и TGF-β.

Было подтверждено, что все изученные близкие структурные гомологи муропептидных постбиотиков ( ГМДП, ГМДП-А и ГМДП-Lys) являются специфическими агонистами NOD2- рецепторов, и, следовательно, участвуют в активации NF-kB сигнального пути и реализации стандартного механизма потенциирования экспрессии провоспалительных цитокинов, приводящего к коррекции ВИН ( Таблица 1). Однако, нами было открыто, что даже в близком ряду гомологов муропептидных постбиотиков являющихся абсолютно специфическими агонистами NOD2- рецепторов, одни из них отличаются от других, способностью индуцировать значимую экспрессию противовоспалительных цитокинов, например, таких как TGF-β и IL-10 (Таблица 1) и что постбиотики надежно контролируют чрезмерные провоспалительные реакции от активации TOLL и NOD1 -рецепторов нерезидентными патогенными бактериями, присутствующими в кишечнике при дисбиозе, только в том случае, если соотношение относительной экспрессии провоспалительных и противовоспалительных цитокинов не превышает величины, равной 1,5 (Таблицы 1 и 2). Такие муропептидные постбиотики отличаются малой пирогенностью, но обладают достаточной активностью для комплексной коррекции синдрома ВИН, в широком интервале доз (Таблица 2), то есть обладают широтой терапевтического действия.

Существенность этого признака вытекает из того, что одна только принадлежность муропептидного постбиотика к абсолютно специфическими агонистами NOD2- рецепторов и вытекающая из этого факта способность корректировать ВИН, не является достаточным основанием для применения его в качестве средства для функционального диетического питания, поскольку вторым, необходимым для этого качеством, будет являться способность муропептидного постбиотика балансировать выработку про- и противовоспалительных цитокинов в установленных эмпирически пределах - соотношение относительной экспрессии провоспалительных и противовоспалительных цитокинов не должно превышать величины, равной 1,5.

Такая способность к балансу про- и противовоспалительных цитокинов в сочетании с широтой терапевтического действия обеспечивает безопасность применения муропептидных постбиотиков, являющихся абсолютно специфическими агонистами NOD2-рецепторов, в пищевой продукции.

Следующим аспектом настоящего изобретения было установление безусловной способности муропептидного постбиотика, являющегося абсолютно специфическим агонистом NOD2-рецептора, и у которого соотношение относительной экспрессии провоспалительного цитокина IL-1β и противовоспалительных цитокинов не превышает величины, равной 1,5 и подтверждена широта терапевтического действия в большом интервале доз, комплексно корректировать синдром вторичной иммунной недостаточности и сопряженного с ней дисбиоза.

В качестве объекта исследования был выбран муропептидный постбиотик ГМДП-А как полностью соответствующий критериям выбора в качестве средства для функционального энтерального питания. ГМДП-А является классическим постбиотиком - компонентом клеток инактивированных грамм-положительных или грамм-отрицательных бактерий, составляющих пейзаж микробиоты человека, приносящим пользу «хозяину». По отношению к пептидогликанам клеточных стенок бактерий ГМДП-А является одним из их мономерных фрагментов и минимальных фармакологически активных структурных фрагментов пептидогликанов клеточных стенок всех грамм-положительных и грамм-отрицательных бактерий. В организме человека ГМДП-А является вторичным метаболитом, образующимся в тонком кишечнике вследствие ферментной деградации микроорганизмов его микрофлоры, и служит одним из медиаторов её системного действия. Антитела к ГМДП-А обнаруживаются в системном кровотоке что свидетельствует об образовании этого постбиотика в слизистом слое и его способности проникать через эпителий. Он является абсолютно специфичным агонистом NOD2-рецептора и благодаря его взаимодействию с данным рецептором имеет потенциал обеспечить требуемый технический результат - комплексную многофакторную корректировку вторичной иммунной недостаточности и сопряженного с ней дисбиоза.

Для ГМДП-А хорошо изучен профиль безопасности и механизм фармакологического действия, включая сигнальные пути, которые этот постбиотик инициирует в организме, а также фармакокинетика. Разовый внутрижелудочный прием ГМДП-А крысами не вызывает гибели животных при дозе 9000 мг/ кг. ГМДП-А не обладает кумулятивным действием, не токсичен в отношении основных органов и систем.

ГМДП-А обладает иммуноадъювантной, иммуномодулирующей, противоопухолевой и другими видами биологической активности. Изучено и защищено множественными патентами его применение для лечения септического шока, воспалительных дерматологических, предраковых и некоторых раковых заболеваний в монотерапии или в сочетанной терапии с цитостатиками (RU97101904A; US4395399A; RU96109376A; WO 9809989; ЕР 0722332 В1; US 2007167355 A; RU 2209078; RU 2139086 C1; WO 2005007676; US 5534492; WO 9601645; WO 9609063; WO 2008070564; WO 9313791; RU2571551). Однако, применение ГМДП-А как постбиотического средства для функционального энтерального диетического питания онкологических и коморбидных пациентов с хроническими неинфекционными заболеваниями, нуждающихся в коррекции вторичной иммунной недостаточности и сопряженного с ней дисбиоза, ранее не было известно.

В следующей серии экспериментов в клинических условиях была изучена возможность постбиотика ГМДП-А, изготовленного в форме функционального диетического питания, комплексно корректировать иммунный гомеостаз и дисбиоз. Исследование было проведено у пациентов старше 60 лет имеющих несколько хронических неинфекционных заболеваний и получающих свое базовое этиотропное лечение. Рандомизированные исследования проводили на ограниченной группе пациентов в возрасте от 60 до 75 лет с установленным не менее 10 лет назад диагнозом «Ишимическая болезнь сердца ассоциированная с возрастным атеросклерозом». В группу контроля традиционной антиангинальной терапии «ТАТ» вошло 2 пациента (1 мужчина и 1 женщина). Опытная группа 1 «ГМДП-А» состояла из 3 больных ИБС (1 мужчина и 2 женщины), опытная группа 2 «ГМДП-А» состояла из 3 больных ИБС (2 мужчин и 1 женщина), опытная группа 3 «ГМДП-А» состояла из 2 больных ИБС (1 мужчина и 1 женщина). Течение ИБС сопровождалось артериальной гипертонией (АД до 180/100 мм рт. ст.) у всех пациентов. Кроме того, у всех больных имелось несколько заболеваний из перечня: варикозная болезнь, хронический бронхит, сахарный диабет, остеоартроз суставов нижних конечностей, язвенная болезнь, желчнокаменная болезнь, хронический пиелонефрит.

Опытная группа 1 «ГМДП-А» с момента рандомизации ежедневно, трехкратно, в течение 10 дней за 30 минут до еды получала на фоне традиционной терапии свежеприготовленный крахмальный кисель с добавкой в него постбиотика ГМДП-А в дозе 1 мг. Опытная группа 2 «ГМДП-А» с момента рандомизации три дня подряд утром натощак получала на фоне традиционной терапии свежеприготовленный крахмальный кисель с добавкой в него постбиотика ГМДП- в дозе 15 мг. Следующие три дня эта группа получала только базовую терапию. Затем этот цикл приема постбиотика в той же дозе повторялся еще 2 раза. Опытная группа 3-2 человека получала утром натощак на фоне традиционной терапии свежеприготовленный крахмальный кисель с добавкой в него постбиотика ГМДП-А (изготовитель АО «Пептек») в дозе 25 мг.

Исследование кала пациентов на дисбиоз проводилось по отраслевому стандарту "Протокол ведения больных - Дисбактериоз кишечника"». Собранный в стерильную посуду кал серийно разводился и сеялся на питательные среды с последующим подсчетом колоний и идентификацией выросших культур до вида. Степень микробиологических нарушений оценивалась по классификации дисбактериоза для лиц старше 60 лет, рекомендованной отраслевым стандартом.

Результаты исследований кала на дисбиоз под влиянием терапии оценивали по изменению степени дисбиоза толстого кишечника до и после лечения. У всех пациентов, включенных в исследование, была степень дисбиоза П. После лечения данный показатель снизился до степени дисбиоза I в группах 1 и 2 «ГМДП-А» (Таблица 3 ). Опытная группа 3 «ГМДП-А» отказалась от приема киселя с постбиотиком после его однократного приема из-за жалоб на боли в суставах, которые связывали с приемом постбиотика.

Исследования показали, что применение функционального питания с постбиотиком ГМДП-А в комплексной терапии ИБС привело к переходу у всех больных степени дисбиоза со II степени на I степень (р<0,01). В группе ТАТ снижения степени дисбиоза не произошло.

Изменения иммунологических показателей под влиянием проведенной терапии оценивали по динамике степени завершенности фагоцитоза в группах сравнения.

Иммунологическое исследование включало в себя определение степени завершенности фагоцитоза (норма - 95%), характеризующегося процентом поглощения и убивания бактерий через 2 часа инкубирования фагоцитов периферической крови с живыми бактериями. Тесты проводили in vitro при анализе лейкоцитарной взвеси.

Результаты оценки иммунологических показателей под влиянием проведенной терапии представлены в Таблице 4. Результаты показывают, что степень завершенности фагоцитоза под влиянием дополнительного приема функционального диетического питания с постбиотиком ГМДП-А стремится к норме в обоих опытных группах «ГМДП-А». Тогда как в контрольной группе ТАТ с базовым лечением без ГМДП-А степень завершенности фагоцитоза не претерпела изменения.

С целью установления возможностей ГМДП-А корректировать сидром ВИН, являющейся одной из причин дисбиоза, у онкологических и коморбидных пациентов с хроническими неинфекционными заболеваниями были проведены исследования иммунокоррегирующей активности ГМДП-А в условиях экспериментальной иммуносупрессии вызванной у экспериментальных животных одним из следующих воздействий: введением гидрокортизона или циклоосфана, а также тотальным гамма- облучением. Функции иммунной системы в эксперименте вторичного иммунодефицита оценивали по способности отвечать выработкой антителообразующих клеток (АОК) на эритроциты барана (ЭБ) по сравнению с животными контрольной группы, не подвергшихся указанным воздействиям. Все эксперименты проведены на мышах гибридах F1 CBAxC-57BL6. ГМДП-А с чистотой 99% вводили внутрибрюшинно в широком диапазоне доз - от 0,05 мкг до 5 мкг/кг, одновременно с ЭБ (2х107). Контролем служили животные, получавшие физиологический раствор.

Результаты исследования подтвердили способность ГМДП-А стимулировать иммунный ответ в условиях экспериментальной иммуносупрессии. На фоне введения ГМДП-А наблюдалась стимуляция иммунного ответа в случае нарушения иммунного гомеостаза под действием онкоцитостатика циклофосфана при оптимальной дозе ГМДП-А - 1 мкг/мышь, в случае гидрокортизона при оптимальной дозе ГМДП-А 0,01 мкг/мышь (0,5 мкг/кг), в случае гамма-облучения, имитирующего лучевую терапию онкозаболеваний, наибольшая стимуляция иммунного ответа была достигнута при введении ГМДП-А в дозе 0,01 мкг/мышь (0,5 мкг/кг).

Результаты данной серии экспериментов показали, что ГМДП-А выполняет иммунокоррегирующее действие при нарушениях иммунного гомеостаза, сопутствующего этиотропной терапии онкологических и воспалительных неинфекционных заболеваний и, следовательно, применение средства функционального диетического энтерального питания целесообразно у онко- и коморбидных пациентов с хроническими неинфекционными заболеваниями».

Тесты, выполненные в Примерах 2 и 3 доказывают комплексный характер коррекции синдрома ВИН и сопряженного с ней дисбиоза как следствия применения постбиотика ГМДП-А, а также правильность выбора целевой группы пациентов и, следовательно, существенность признака «это средство предназначено для комплексной коррекции синдрома ВИН и сопряженного с ней дисбиоза у онко- и коморбидных пациентов с хроническими неинфекционными заболеваниями.

Кроме того, Пример 2 обосновывает диапазон разовых доз и курсовое применение постбиотика ГМДП-А в составе функционального диетического питания.

Пример 1. Сравнительное изучение способности муропептидных постбиотиков, относящихся к абсолютно специфичным агонистам NOD2-рецептора к участию в активации NF-kB сигнального пути и способности балансировать экспрессию провоспалительных и противовоспалительных цитокинов

Проведена сравнительная оценка влияния постбиотиков, являющихся абсолютно специфическими агонистами NOD2-рецептора, на уровень экспрессии мРНК провоспалительных ( IL-1β и TNF-α) и противовоспалительных (IL-1β и TGF-β) цитокинов, принимающих участие в активации NF-kB сигнального пути.

Для исследования использовали постбиотики ГМДП (N-acetyl-d-glucosaminyl-(1→4)-N-acetylmuramyl-lalanyl-d-isoglutamine), ГМДП-А ( N-acetyl-d-glucosaminyl- (1→4)-N-acetylmuramyl-l-alanyl-d-glutamic acid), ГМДП -Lys ( N-acetyl-d-glucosaminyl-(1→4)-N-acetylmuramyl-l-alanyl-d-isoglutamine-l-lysine). Наработку ГМДП, ГМДП-А и ГМДП -Lys осуществляли известными методами биохимии[9]. В качестве ключевого дисахаридного реагента в синтезе ГМДП, ГМДП-А и ГМДП -Lys использовали N-ацетил-D-глюкозаминил-N-ацетилмурамовую кислоту, полученную известными методами (Авт. Свид. СССР № 113516) из штамма пробиотической бактерии Micrococcus Lysodeikticus ( Collection SCPM; Strein number in SCPM -211001; Strein name - Luteus (Lysodeikticus); Strein details - №4698ATCC=№2665NCTC).

Выбранные муропептидные постбиотики относятся к абсолютно специфическим агонистам NOD2- рецепторов. Для этих муропептидных постбиотиков, как специфических агонистов NOD2-рецептора, ранее была подтверждена способность активации сигнальных клеточных путей NF-kB, отвечающих за выработку провоспалительных цитокинов [10]. Для оценки широты терапевтического действия выбранных муропептидных постбиотиков, было проведено сравнение их влияния на уровень экспрессии мРНК провоспалительных цитокинов (IL-1β и TNF-α,) и противовоспалительных цитокинов (IL-10 и TGF-β) методом ПЦР в реальном времени, комбинированным с обратной транскрипцией.

Материалы и методы

Муропептидные постбиотики. Работа выполнена на образцах муропептидных постбиотиков ГМДП, ГМДП-А и ГМДП -Lys с чистотой не менее 98%.

Клетки. Работа была выполнена на клеточной линии J774 мышиных макрофагов, полученной из коллекции Института цитологии, Санкт-Петербург.

Клетки вносили в лунки 6-ти луночного планшета из расчёта 3х106 клеток/лунку в 3 мл среды DMEM, содержащей 10% телячьей эмбриональной сыворотки, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, и инкубировали их в течение ночи при 37°С в атмосфере 5%-ного СО2. На следующий день в лунки к клеткам добавляли один из муропептидов ГМДП, ГМДП-А и ГМДП-Lys. Выделение тотальной РНК из клеток проводили реагентом TRIzol® (Invitrogen, США) по протоколу фирмы-производителя.

Для синтеза кДНК проводили реакцию обратной транскрипции с использованием фермента Mint ("Евроген", Россия) по стандартному протоколу фирмы-производителя с использованием поли(Т) праймера.

ПЦР. Полимеразную цепную реакцию проводили в термоциклере CX96 (BioRad, США). Реакционная смесь объёмом 12,5 мкл содержала: 1 мкг кДНК, 2,5 мкл готовой 5-кратной реакционной смеси qPCRmix-HS SYBR ("Евроген", Россия), в которую входят Taq ДНК-полимеразы со специфическими моноклональными антителами, краситель SYBR Green I, смесь нуклеотидтрифосфатов, MgCl2, ПЦР буфер, и по 10 пМ каждого из двух специфичных олигонуклеотидов.

Протокол амплификации включал: 1 цикл продолжительностью 4 мин денатурации при 94°С, 40 циклов: по 20 сек при 94°С для денатурации цепей ДНК, 20 сек при 50-72°С для отжига праймеров с матрицей и 40 сек при 72оС для синтеза комплиментарных цепей ДНК, и 1 цикл завершающего синтеза в течение 3 мин при 72°С.

Расчёт относительного уровня мРНК целевых генов был выполнен с использованием deltaCT-метода. Относительная концентрация субстрата была нормализована по усреднённым данным амплификации эндогенного гена сравнения HPRT1: deltaCT=CT(target gene)-CT(reference gene), где СТ - количество циклов, требуемых для достижения порогового значения флуоресценции. Относительный уровень мРНК вычисляли как х*delta CT, где х - эффективность праймеров. Все реакции проводили в двух повторах и включали негативный контроль без обратной транскриптазы.

Учитывая, что именно провоспалительный цитокин IL-1β определяет пирогенные свойства вещества, и что пирогенность является основным токсическим воздействием, ограничивающим применение муропептидов, широту терапевтического действия муропептидных постбиотиков оценивали по отношению показателя относительной экспрессии гена IL-1β к сумме показателей относительной экспрессии противовоспалительных генов IL-10 и TGF-β.

Полученные результаты приведены в Таблице 1.

Ген Относительная экспрессия ГМДП ГМДП-А ГМДП-Lys NOD2 2,2 4,0 2,0 IL-1β 27,5 4,0 200,0 TNF-α 1,0 3,0 15,0 IL-10 0,0 0,5 20,0 TGF-β 2,0 3,1 2,5 Соотношение показателей относительной экспрессии IL-1β и противовоспалительных генов 13,7 1,1 22,5

Таблица 1. Оценка влияния муропептидных постбиотиков, являющихся абсолютно специфическими агонистами NOD2-рецептора, на уровень экспрессии мРНК провоспалительных цитокинов ( IL-1β и TNF-α,) и противовоспалительных цитокинов (IL-10 и TGF-β) методом ПЦР на клеточной линии J774 мышиных макрофагов. Концентрация муропептидов 100 мкг/мл ( соответствует максимальному уровню стимуляции экспрессии мРНК для генов цитокинов ИЛ-1бета ). Время инкубации с муропептидами равно 4 ч ( время наиболее сильного ответа для изученных генов)

Полученные результаты демонстрируют, что, хотя все протестированные муропептиды проявляют способность к развитию иммунного ответа и принимают участие в активации NF-kB сигнального пути, из них только ГМДП-А показывает способность балансировать экспрессию провоспалительных и противовоспалительных цитокинов. Для него величина соотношения показателей относительной экспрессии IL-1β и противовоспалительных генов незначительно превышала 1,0.

Для проверки диапазона доз, в которых соблюдается этот вывод, была изучена зависимость величины относительной экспрессиии цитокинов и молекул NOD2 от концентрации ГМДП-А, для чего к клеткам J774 добавляли препарат в широком диапазоне концентраций. Время инкубации в данном эксперименте составило 4 ч. Результаты представлены в Таблице 2.

Ген Концентрация ГМДП-А, мкг/мл 100 50 10 1 0,1 IL-1β 3,73 2,14 0,63 0,58 0,40 TGF-β 2,87 1,42 0,57 0,52 0,38 NOD2 2,25 1,12 1,67 1,22 2,03 Соотношение показателей относительной экспрессии IL-1β и противовоспалительных генов 1,3 1,5 1,1 1,1 1,0

Таблица 2. Оценка диапазона доз в которых ГМДП-А имеет способность надежно контролировать экспрессию провоспалительных и противовоспалительных цитокинов. Метод ПЦР на клеточной линии J774 мышиных макрофагов.

Изучением дозовой зависимости подтверждена способность ГМДП-А к развитию требуемого иммунного ответа в широком диапазоне доз: показатель относительной экспрессии молекул NOD2 остается на высоком уровне во всем диапазоне концентраций. В отношении контроля баланса экспрессии провоспалительных и противовоспалительных цитокинов подтвердилась надежность такого контроля: величина соотношения показателей относительной экспрессии IL-1β и противовоспалительных генов не превысила 1,5 во всем изученном диапазоне доз. При концентрациях 1 и 10 мкг ГМДП-А вообще не оказывал влияния на синтез ИЛ-1β, представляющего собой сильный пироген. Это согласуется с ранее выявленной на кроликах апирогенностью ГМДП-А в широком диапазоне доз [8].

Таким образом, из всех исследованных муропептидных постбиотиков, только ГМДП-А проявил широту терапевтического действия в большом диапазоне доз и подтвердил способность к контролю баланса выработки про- и противовоспалительных цитокинов на фоне иницации основного механизма активации NF-kB сигнального пути взаимодействием с NOD2-рецептором.

Учитывая, что соединения на основе мурапептидов, являющихся постбиотиками, привлекают все большее внимание исследователей для применения их как средства функционального диетического питания, поскольку выявлена их физиологическая роль для коррекции большого числа иммунных и сопряженных с ними нарушений, возникает потребность выработки критериев оценки приемлемости применения различных постбиотиков, являющихся абсолютными агонистами NOD2-рецептора, в качестве средства функционального диетического питания. Рассматривая показатели активации NF-kB сигнального пути при применении ГМДП-А в широком диапазоне доз как эталонные в отношении выработки оптимального баланса про- и противовоспалительных цитокинов, можно принять величину соотношения относительной экспрессии провоспалительного пирогена IL-1β и противовоспалительных цитокинов, равную ≤ 1,5 за критерий оценки необходимой широты терапевтического действия муропептидных постбиотиков для применения их в качестве средства для функционального диетического питания.

Выполненное исследование показывает, что несмотря на принадлежность к абсолютно специфичным агонистам NOD2-рецепторов и способность участвовать в активации NF-kB сигнального пути, обеспечивающую механизм комплексной коррекции ВИН и сопряженного с ней дисбиоза всех трех исследованных муропептидных постбиотиков, только ГМДП-А может быть выбран для применения в качестве средства для функционального диетического питания онкологических и коморбидных пациентов с хроническими неинфекционными заболеваниями нуждающихся в коррекции синдрома вторичной иммунной недостаточности и сопряженного с ним дисбиоза.

Пример 2. Исследование влияние ГМДП-А на коррекцию дисбиоза у возрастных пациентов с ИБС

Учитывая, что лица пожилого возраста, страдающие ИБС, характеризуются иммунной недостаточностью и нарушениями микробиоценоза толстого кишечника, были выполнены исследования по коррекции ВИН и сопряженному с ним дисбиозу назначением функционального диетического питания с постбиотиком ГМДП-А. Рандомизированные исследования проводили на ограниченной группе пациентов в возрасте от 60 до 75 лет с установленным диагнозом «Ишимическая болезнь сердца ассоциированная с возрастным атеросклерозом», причем в исследование были включены только пациенты с коэффициентом атерогенности КА ≤ 3,5 ( на основании предварительных исследований). В группу традиционной антиангинальной терапии «ТАТ» вошло 2 пациента (1 мужчина и 1 женщина). Опытная группа 1 «ГМДП-А» состояла из 3 больных ИБС (1 мужчина и 2 женщины), опытная группа 2 «ГМДП-А» состояла из 3 больных ИБС (2 мужчин и 1 женщина), опытная группа 3 «ГМДП-А» состояла из 2 больных ИБС (1 мужчина и 1 женщина). В обследуемых группах анамнез заболевания составил от 10,56±7,64 до 13,67±7,55 лет, преобладающее количество больных имели III ФК ССН (от 60,47% до 69,57%). Течение ИБС сопровождалось артериальной гипертонией (АД до 180/100 мм рт.ст.) у всех пациентов. Кроме того, у всех больных имелось несколько заболеваний из перечня: варикозная болезнь, хронический бронхит, сахарный диабет, остеоартроз суставов нижних конечностей, язвенная болезнь, желчно-каменная болезнь, хронический пиелонефрит. У всех больных были зарегистрированы различные виды нарушений ритма- сердца в анамнезе. Все больные групп «ТАТ» и «ГМДП-А» получали стандартную терапию ССН, которая включала в себя β-АБ, ацетилсалициловую кислоту, амлодипин и нитраты в адекватно подобранных дозах. При необходимости назначалась терапия сопутствующей артериальной гипертонии (АГ) и ХСН (диуретики, ингибиторы АПФ). Опытные группы «ГМДП-А» дополнительно к базовой терапии получали постбиотик ГМДП-А (изготовитель АО «Пептек»), который экстемпорально вводили в крахмальный кисель перед употреблением. Опытная группа 1 «ГМДП-А» с момента рандомизации ежедневно, трехкратно, в течение 10 дней за 30 минут до еды получала на фоне традиционной терапии свежеприготовленный крахмальный кисель с добавкой в него постбиотика ГМДП-А в дозе 1 мг. Опытная группа 2 «ГМДП-А» с момента рандомизации три дня подряд утром натощак получала на фоне традиционной терапии свежеприготовленный крахмальный кисель с добавкой в него постбиотика ГМДП- в дозе 15 мг. Следующие три дня эта группа получала только базовую терапию. Затем этот цикл приема постбиотика в той же дозе повторялся еще 2 раза. Опытная группа 3-2 человека получала утром натощак на фоне традиционной терапии свежеприготовленный крахмальный кисель с добавкой в него постбиотика ГМДП-А (изготовитель АО «Пептек») в дозе 25 мг.

Исследование кала на дисбиоз проводилось на основе приказа № 231 от 9 июня 2003 года «Об утверждении отраслевого стандарта "Протокол ведения больных - Дисбактериоз кишечника"» по методу Казанского государственного института усовершенствования врачей «Бактериологическая диагностика дисбактериоза». Собранный в стерильную посуду кал серийно разводился и сеялся на питательные среды с последующим подсчетом колоний и идентификацией выросших культур до вида. Степень микробиологических нарушений оценивалась по классификации дисбактериоза для лиц старше 60 лет, рекомендованной отраслевым стандартом:

Классификация степени дисбиоза для возраста старше 60 лет

Степень дисбиоза Бифидобактерии Лактобактерии Кишечная палочка Условнопатогенные микроорганизмы I Снижение до 10⁸ - 10⁷ КОЕ/г Снижение до 10⁵ - 10⁴ КОЕ/г Снижение типичных эшерихий до 10^б -10⁵ КОЕ/г или повышение до 10⁹ - 10¹⁰ КОЕ/г В пределах нормы II Снижение до 10^б и ниже КОЕ/г Снижение до 10⁴ и ниже КОЕ/г Повышение гемолотических и др. измененных эшерихий до 10⁵ -10⁷ КОЕ/г Повышение до 10⁵ -10⁷ КОЕ/г III Снижение до 10^б КОЕ/г и ниже Снижение до 10⁴ и ниже КОЕ/г Могут быть атипичные эшерихий в ассоциациях Ассоциации условнопатог. м/о в концентрации 10^б -10⁷ КОЕ/г

Результаты

Опытная группа 3 отказалась от приема киселя с постбиотиком после его однократного приема из-за жалоб на боли в суставах, которые связывали с приемом постбиотика.

В двух других опытных группах результаты исследований кала на дисбиоз под влиянием терапии оценивали по изменению степени дисбиоза толстого кишечника до и после лечения. У всех пациентов, включенных в исследование, была степень дисбиоза П. После лечения данный показатель снизился в группе ГМДП-А ( Таблица 3 ). Таким образом, применение функционального питания с постбиотиком ГМДП-А в комплексной терапии ИБС привело к переходу всех больных со II степенью дисбиоза в I степень (р<0,01). В группе ТАТ снижения степени дисбиоза не произошло.

Оценка результата Группа
ТАТ
n=2 Опытная группа 1
ГМДП-А
п=3 Опытная группа 2
ГМДП-А
п=3 Абсолют.
кол-во пациентов Степень дисбиоза Абсолют.
кол-во пациентов Степень дисбиоза Абсолют.
кол-во пациентов Степень дисбиоза До лечения 2 II 3 II 3 II После лечения 2 II 2 I 3 I

Таблица 3. Динамика степени дисбиоза у пациентов с ИБС в группах сравнения. Оценка степени дисбиоза по классификации дисбактериоза для лиц старше 60 лет, рекомендованной отраслевым стандартом

Сравнение содержания в кале основных представителей кишечной микрофлоры в исследуемых группах выявило наиболее выраженные положительные изменения в ходе лечения с применением ГМДП-А, которые в обоих опытных группа «ГМДП-А» заключались в восстановлении до нормы содержания ключевых резидентных представителей микробиоты толстого кишечника: бифидобактерий и лактобактерий. В группе ТАТ достоверных изменений содержания толстокишечной микрофлоры под влиянием терапии не выявлено.

Влияние дополнения базового этиотропного лечения приемом функционального диетического питания на основе постбиотика ГМДП-А на иммунологические показатели оценивали по динамике степени завершенности фагоцитоза в группах сравнения.

Иммунологическое исследование включало в себя определение степени завершенности фагоцитоза (норма - 95%), характеризующегося процентом поглощения и убивания бактерий через 2 часа инкубирования фагоцитов периферической крови с живыми бактериями. Тесты проводили in vitro при анализе лейкоцитарной взвеси.

Результаты оценки иммунологических показателей под влиянием проведенной терапии представлены в Таблице 4.

Показатель Время оценки фагоцитоза Группа
ТАТ Опытная группа 1
ГМДП-А Опытная группа 2
ГМДП-А Степень завершенности фагоцитоза,
%% До лечения 46,60±25,19 47,49±22,53 45,68±28,15 После лечения 49,12±22,55 80,57±28,69 88,77±27,78

Таблица 4. Динамика степени завершенности фагоцитоза в группах сравнения. Оценка процента поглощения и убивания бактерий через 2 часа инкубирования фагоцитов периферической крови с живыми бактериями. Тесты проводили in vitro при анализе лейкоцитарной взвеси. Достоверность различия до и после лечения Р>0,05

Результаты показывают, что степень завершенности фагоцитоза под влиянием дополнительного приема функционального диетического питания с постбиотиком ГМДП-А стремится к норме в обоих опытных группах «ГМДП-А». Тогда как в контрольной группе ТАТ с базовым лечением степень завершенности фагоцитоза не претерпела изменения.

Данный тест доказывает комплексный характер коррекции синдрома ВИН и сопряженного с ней дисбиоза у коморбидных пациентов с хроническими неинфекционными заболеваниями.

Пример 3. Исследование иммунокоррегирующей активности постбиотка ГМДП-А в условиях экспериментальной иммуносупрессии

Было проведено исследование иммунокоррегирующей активности препарата в условиях экспериментальной иммуносупрессии, вызванной у экспериментальных животных одним из следующих воздействий: введением гидрокортизона или циклоосфана, а также тотальным гамма- облучением. Функции иммунной системы в эксперименте вторичного иммунодефицита оценивали по способности отвечать выработкой антителообразующих клеток (АОК) на эритроциты барана (ЭБ) по сравнению с животными контрольной группы, не подвергшихся указанным воздействиям.

Все эксперименты проведены на мышах гибридах F1 CBAxC-57BL6.

ГМДП-А вводили внутрибрюшинно в широком диапазоне доз - от 0,05 мкг до 5 мкг/кг, одновременно с ЭБ (2х107). Контролем служили животные, получавшие физиологический раствор.

1. Влияние ГМДП-А на иммунный ответ мышей при введении циклофосфана

Циклофосфан вводили внутрибрюшинно в дозе 150 мг/кг за 3 суток до иммунизации. На фоне введения ГМДП-А наблюдалась стимуляция иммунного ответа при оптимальной дозе ГМДП-А - 1 мкг/мышь.

2. Влияние ГМДП-А на иммунный ответ мышей при введении гидрокортизона

Гидрокортизона ацетат вводили подкожно в дозе 50 мг/кг за 6 суток до иммунизации. Полученные результаты показали, что в условиях проведенного эксперимента дозы 0,1 и 1 мкг на мышь не оказывали эффекта. Значимая стимуляция иммунного ответа была достигнута при введении дозы ГМДП-А 0,01 мкг/мышь (0,5 мкг/кг).

3. Влияние ГМДП-А на иммунный ответ мышей в условиях ионизирующего излучения

Иммуносупрессию вызывали воздействием ионизирующего излучения от гамма-источника 137 Cs за 14 суток до иммунизации. Доза облучения составила 2 Гр. Как и при введении гидрокортизона, наибольшая стимуляция иммунного ответа была достигнута при введении 0,01 мкг/мышь (0,5 мкг/кг).

Результаты серии экспериментов показали, что ГМДП-А выполняет иммунокоррегирующее действие в условиях экспериментальной иммунодепрессии. При этом наилучший эффект по восстановлению показателей регистрировался при введении препарата в малых дозах (оптимум в области 0,0005 мг/кг). Следует также отметить, что в более «мягких» условиях иммунодепрессии (50% ингибиция АОК), вызванной циклофосфаном, наблюдается полное восстановление антителообразования при введении ГМДП-А в широком интервале доз.

Приведенные примеры доказали возможности применения постбиотика ГМДП-А как средства для функционального энтерального диетического питания пациентов с хроническими неинфекционными заболеваниями, нуждающихся в коррекции дисбиоза и вторичной иммунной недостаточности. Обнаруженная функция постбиотика ГМДП-А является новой, поскольку ранее ГМДП-А позиционировался как лекарственный препарат для модификации цитостатиков в специфической сочетанной терапии злокачественных опухолей. По данному применению получено разрешение на проведение клинических исследований. Его новая функция, предложенная в данном изобретении не была очевидной пока не было неожиданно установлено, что ГМДП-А, в отличие от близких структурных аналогов ГМДП и ГМДП-Lys, значимо активирует противовоспалительный цитокин TGF-β обеспечивая соотношение относительной экспрессии провоспалительного цитокина IL-1β и противовоспалительных цитокинов в широком интервале доз до величины, равной 1,5, что открывает ему перспективу стать средством для функционального энтерального диетического питания онкологических и коморбидных пациентов с хроническими неинфекционными заболеваниями нуждающихся в коррекции синдрома вторичной иммунной недостаточности и сопряженного с ней дисбиоза.

Литературные источники:

1. Метаболизм колоноцитов формирует микробиоту кишечника» Yael Litvak et al. Colonocyte metabolism shapes the gut microbiota/ Scince 30 Nov 2018 Vol.362 Issue 6418;

2. Постбиотики и их потенциальное применение в питании в раннем возрасте и за его пределами Carrie A.M. Wegh et al.// // Postbiotics and Their Potential Applications in Early Life Nutrition and Beyond/IJMS, Volume 20, Issue 19// 10.3390/ijms20194673);

3. Козлов И.Г. Микробиота, мукозальный иммунитет и антибиотики: тонкости взаимодействия. РМЖ. 2018;8(I):19-27;

4. Микробиота в адаптивном иммунном гомеостазе и болезнях// Honda, K.; Littman, D.R. The microbiota in adaptive immune homeostasis and disease// Nature2016, 535, 75;

5. Дисбиотическая экспансия протеобактерий: микробиологический признак эпителиальной дисфункции.// Litvak Y, Byndloss MX, Tsolis RM, Baumler AJ, Dysbiotic Proteobacteria expansion: a microbial signature of epithelial dysfunction// Curr Opin Microbiol 39, 1-6 (2017);

6. NOD1 и NOD2: молекулярные мишени в профилактике и лечении инфекционных заболеваний М. В. Пашенков, Ю. А. Дагил, Б. В. Пинегин/ Международная иммунофармакология, 54, (2018), С. 385-400.// Z. Alnabhani, J.P. Hugot, N. Montcuquet, K. Le Roux, M. Dussaillant, M. Roy, et al., Respective roles of hematopoietic and nonhematopoietic Nod2 on the gut microbiota and mucosal homeostasis, Inflamm. Bowel Dis. 22 (2016) Р. 763-773;

7. Kitaura H., Ishida M., Kimura K., Sugisawa H., Kishikawa A., Shima K., Ogawa S., Qi J., Shen W.R. Role of muramyl dipeptide in lipopolysaccharide-mediated biological activity and osteoclast activity. Anal Cell Pathol (Amst). 2018;2018:8047610. DOI: 10.1155/2018/8047610;

8. Биоорганическая химия, том 17, №9, 1991, С.1157 -1165;

9. Ростовцева Л., Андронова Т. М., др., Синтез и противовопухолевое действие гликопептидов, содержащих N-ацетилглюкозаминил-(β1→4)-N-ацетилмурамил-дисахаридное звено. Биоорган. химия 1981,7(12), 1843-1858);

10. E. Meshcheryakova, T. Andronova, et al., Evidence for correlation between the intensities of adjuvant effects and NOD2 activation by monomeric, dimeric and lipophylic derivatives of N-acetylglucosaminylN-acetylmuramyl peptides Vaccine, 25,2007, p.4515-4520;

Средство для функционального энтерального диетического питания, содержащее муропептидный постбиотик, являющийся абсолютно специфическим агонистом к NOD2-рецепторам, причем в качестве такого средства используют муропептидный постбиотик, у которого соотношение относительной экспрессии провоспалительного цитокина IL-1β и противовоспалительных цитокинов не превышает величины, равной 1,5, и это средство предназначено для комплексной коррекции синдрома ВИН и сопряженного с ней дисбиоза у онко- и коморбидных пациентов с хроническими неинфекционными заболеваниями, причем данный постбиотик входит в состав пищевых композиций, содержащих, кроме такого постбиотика, инертные к нему традиционные наполнители, разбавители и эксципиенты. 4 табл., 3 пр.

Композиция для комплексной коррекции синдрома вторичной иммунной недостаточности и сопряженного с ней дисбиоза у онко- и коморбидных пациентов с хроническими неинфекционными заболеваниями, содержащая муропептидный постбиотик, являющийся абсолютно специфическим агонистом к NOD2-рецепторам, у которого соотношение относительной экспрессии провоспалительного цитокина IL-1β и противовоспалительных цитокинов не превышает величины, равной 1,5, в количестве от 0,001% до 12% от общей массы композиции и инертные к нему фармацевтически приемлимые наполнители, разбавители и эксципиенты.