САМООПЫЛЯЮЩЕЕСЯ РАСТЕНИЕ BRASSICA OLERACEA И СПОСОБ ЕГО ВЫРАЩИВАНИЯ Российский патент 2024 года по МПК A01H6/20 A01H5/10 A01H1/02 C12Q1/6895 

[Перекрестная(ые) ссылка(и) на родственные заявки]

[0001] В настоящей заявке испрашивается приоритет заявки на патент Японии No. 2018-030872 (дата подачи: 23 февраля 2018 г.), которая включена в настоящее описание в полном объеме посредством ссылки.

[Область техники]

[0002] Настоящее изобретение относится к растению Brassica oleracea, которому была сообщена способность к самоопылению (SC). Более конкретно, настоящее изобретение относится к технологии, позволяющей решить проблемы, связанные с получением семян путем введения локуса гена потери функции вместо гена неспособности к самоопылению (SI), присущей Brassica oleracea.

[Предпосылки создания изобретения]

[0003] Растения семейства Brassicaceae произрастают на Ближнем Востоке и в странах Средиземорского бассейна и включают чрезвычайно ценные сельскохозяйственные культуры рода Brassica. В частности, Brassica oleracea является чрезвычайно ценным видом растений, включая B. oleracea сорта capitata (капусту кочанную), B. oleracea сорта italica (брокколи), B. oleracea сорта botrytis (цветную капусту), B. oleracea сорта gemmifera (брюссельскую капусту), B. oleracea сорта gongyloides (кольраби), B. oleracea сорта acephara (декоративную капусту, кормовую капусту), B. oleracea сорта albograbra (китайскую капусту) и другие.

[0004] Многие растения семейства Brassicaceae, включая Brassica oleracea, обладают «неспособностью к самоопылению», то есть, если растение подвергается опылению другим растением, имеющим такой же гаплотип S, как и само растение, то прорастание пыльцы на рыльце и рост пыльцевой трубочки подавляется, и растение не будет оплодотворено. Для сельскохозяйственных культур семейства Brassicacaea, крупномасштабное производство семян, обеспечивающих сорта первого дочернего поколения (F1), было налажено с 1960-х годов, и выведение сортов F1 активно проводилось различными компаниями по выведению сортов. Поскольку сорта F1, которые наследуют превосходные свойства своих родителей, имеют высокую однородность среди сортов по сравнению с природными сортами и сортами открытого опыления, а также демонстрируют высокую способность адаптироваться к различным условиям окружающей среды, то эти сорта имеют высокую коммерческую ценность и используются во многих странах.

[0005] Что касается конкретного способа получения семян F1, то родительскую линию, имеющую определенный гаплотип S, и родительскую линию, имеющую другой гаплотип S, выращивают на одном и том же поле фермы, в результате чего осуществляется перекрестное опыление насекомыми, а именно, медоносными пчелами и т.п. В этом процессе, растение также опыляются собственной пыльцой и пыльцой одной родительской линии, однако, поскольку прорастание и рост пыльцевых трубочек из такой пыльцы подавляются из-за свойств SI, то самораспространяющиеся семена (самосев) теоретически не образуются. С другой стороны, если растение опыляется пыльцой линии, имеющей другой гаплотип S, то происходит обычное оплодотворение, приводящее к образованию семян F1.

Таким образом, SI, присущая растениям, имеет высокую ценность для системы производства семян F1. Однако в этом случае, также существует проблема.

[0006] Что касается SI, которая является биологическим явлением, то экспрессия функции не является идеальной, и интенсивность SI варьируется в зависимости от генетического фона, гаплотипа S и факторов окружающей среды. Следовательно, существует проблема, заключающаяся в том, что саморазмножающиеся семена, полученные путем самооплодотворения, составляют часть урожая из-за недостаточного подавления роста пыльцевых трубочек собственной пыльцы.

[0007] Ранее, чтобы решить эту проблему, селекционеры выбирали линии, в которых в значительной степени экспрессируется функция SI среди множества гаплотипов S, существующих у Brassica oleracea. Несмотря на это, в случае, когда производство семян осуществлялось на крупномасштабном коммерческом уровне, то невозможно было полностью избежать включения саморазмножающихся семян.

[0008] В случае, когда такие саморазмножающиеся семена включаются в коммерческий продукт, поставляемый как семена F1, то также возникает проблема, заключающаяся в том, что снижается не только ценность семенного урожая, но и в том, что родительские линии, которые важны для компаний по выведению сортов, становятся доступными конкурентам.

[0009] В начале 1990-х годов, средства для решения описанных выше проблем при производстве семян F1 стали реализовываться за счет использования цитоплазматической мужской стерильности (CMS). CMS представляет собой наследуемый по материнской линии признак в цитоплазматическом геноме, имеющем ген, вызывающий мужскую стерильность (нефункциональная пыльца). В зависимости от культуры, существуют виды с нестабильным проявлением этого признака стерильности; однако, поскольку CMS Brassica oleracea является очень стабильной и не подвержена влиянию окружающей среды, то производство семян F1 высокой чистоты стало возможным.

[0010] К сожалению, SI, которая изначально присуща культурам семейства Brassicaceae, является стойкой, и этот признак остается проблемным свойством при размножении родительских линий (размножении элитными семенами), используемых для получения семян F1.

[0011] Это происходит потому, что свойство SI стало совершенно ненужным в системе производства семян F1 с использованием CMS; однако, поскольку все родительские линии имеют SI, даже при обычном скрещивании, то самооплодотворение происходит редко, и размножение элитными семенами не может быть выполнено эффективно. Кроме того, в случае, если во время производства семян F1, родительские линии имеют один и тот же гаплотип S, то возникает проблема, заключающаяся в том, что семена F1 не могут быть получены из этой комбинации.

[0012] Были проведены различные исследования методик устранения неспособности к самоопылению. Так, например, размножение элитных семян было предпринято с помощью: (i) техники опыления бутонов путем скрещивания вручную, (ii) техники воздействия CO₂ на цветущие побеги или (iii) техники выполнения такой операции, как опрыскивание цветков водным раствором NaCl (T. Guohua et al., Cruciferae Newsletter (1986) р. 75 (Непатентный документ 1)).

Однако, остается проблема, заключающаяся в том, что, поскольку опыление бутонов путем скрещивания вручную требует много времени и труда, то трудно реализовать крупномасштабное производство, а при обработке CO₂ или NaCl, эффект ингибирования SI не всегда бывает стабильным и зависит от генетического фона и гаплотипа S. различных линий. Таким образом, ситуация, с которой борются все компании, занимающиеся выведением сортов, то есть, размножением элитных семян, все еще сохраняется (Niikura et al., Theor Appl Genet (2000) vol.101 p1189 (Непатентный документ 2)).

[0013] Что касается соответствующих технологий предшествующего уровня техники, то, например, в JP 4346933 B2 (в Патентном документе 1) описан способ идентификации генотипа S для растений семейства Brassicaceae. Кроме того, в WO 2014/115680 A (в Патентном документе 2) описан способ выращивания растения семейства Brassicaceae, обладающего способностью к самоопылению. Однако объектом, на который направлен метод, описанный в этом документе, является Brassica rapa, то есть, растение из рода Brassica, но оно полностью отличается от растения Brassica oleracea. Специалистам в данной области хорошо известно, что даже если растения принадлежат к одному и тому же «роду», а их «виды» отличаются, то любая информация, относящаяся к одному «виду», не может быть непосредственно применима к другому «виду».

[0014] Таким образом, что касается системы производства семян F1 для Brassica oleracea с использованием CMS, то способ эффективного и стабильного размножения элитных семян пока еще не был описан.

[Список предшествующих документов]

Патентные документы

[0015] Патентный документ 1: публикация японского патента No. 4346933 B2 (JP 4346933 B2).

Патентный документ 2: WO 2014/115680 A

Непатентные документы

[0016] Непатентный документ 1: Cruciferae Newsletter (1986) p75 T. Guohua et al., «Use of CO2 and salt solution to overcome self-incompatibility of Chinese cabbage (B. campestris spp. Pekinensis)».

Непатентный документ 2: Theor Appl Genet (2000) vol. 101 p1189 S. Niikura et al., «Genetic analysis of the reaction level of self-incompatibility to a 4% CO2 gas treatment in the radish (Raphanus sativus L.)».

Непатентный документ 3: Breeding Science (2003) vol.53 p199 M. Watanabe et al., «Recent progress on self-incompatibility research in Brassica species».

Непатентный документ 4: Theor Appl Genet (1996) vol.92 p388, T. Nishio et al., «Registration of S alleles in Brassica campestris L by the restriction fragment sizes of SLGs».

Непатентный документ 5: Breeding Science (2004) vol.54 p291 A. Horisaki et al., «Effectiveness of insect-pollination to evaluate the level of self-incompatibility and genetic variation in Brassica rapa L».

Непатентный документ 6: Proc Natl Acad Sci (1997) vol.94 p7673 M. Kusaba et al., «Striking sequence similarity in inter- and intra-specific comparisons of class I SLG alleles from Brassica oleracea and Brassica campestris: Implications for the evolution and recognition mechanism».

Непатентный документ 7: Plant Cell (2007) vol.19 p3961 M. Kitaura et al., «Two distinct forms of M-locus protein kinase localize to the plasma membrane and interact directly with S-locus receptor kinase to transduce self-incompatibility signaling in Brassica rapa».

Непатентный документ 8: Plant Cell (2012) vol.24 p4607 E.Indriolo et al., «The ARC1 E3 ligase gene is frequently deleted in self-compatible Brassicaceae species and has a conserved role in Arabidopsis lyrata self-pollen rejection».

[Сущность изобретения]

[Проблемы, которые должны быть решены с помощью настоящего изобретения]

[0017] Целью настоящего изобретения является разработка технических средств, обеспечивающих стабильное и эффективное производство элитных семян растений Brassica oleracea. Кроме того, другой целью настоящего изобретения является разработка технологии, позволяющей получать семена F1 растений Brassica oleracea с использованием любых родительских линий без учета гаплотипов S родительских линий.

[Средства для решения этих проблем]

[0018] До настоящего времени, авторы настоящего изобретения неоднократно проводили тщательные исследования в целях разработки технологии, обеспечивающей стабильное и эффективное производство семян растений Brassica oleracea. На основе многочисленных исследований, авторы настоящего изобретения изучили неспособность к самоопылению, присущую растениям Brassica oleracea.

[0019] Авторами настоящего изобретения было выскзано предположение, что если может быть обнаружен ген самоопыляемости, дефицитный по функции неспособности к самоопылению, то может быть осуществлено аутоскрещивание или скрещивание с тем же гаплотипом S, и, таким образом, может быть достигнуто не только эффективное размножение элитными семенами без какой-либо специальной обработки, но также и производство семян F1 между родительскими линиями, имеющими один и тот же гаплотип S.

[0020] Что касается конкретного способа использования самоопыляющейся линии, то, например, если бумажный пакет для скрещивания надеть на соцветие с распустившимися цветками и применить физические воздействия, такие как постукивание по пакету рукой, то пыльца самого растения будет прикрепляться к рыльцу и будет происходить оплодотворение. Даже в случае крупномасштабного производства семян, самоопыляющиеся семена могут быть получены эффективно и в больших количествах путем опыления насекомыми, такими как медоносные пчелы и т.п.

Несмотря на эти высокие коммерческие преимущества, такой метод не применялся для ценных растений Brassica oleracea, таких как брокколи и капуста кочанная, поскольку генетических ресурсов для самоопыления этих культур не существуют.

[0021] Авторами настоящего изобретения были проведены широкие исследования генетических ресурсов видов Brassica oleracea и родственных им видов, а также были неоднократно проведены тщательные исследования с помощью анализа ДНК гаплотипов S и тесты на скрещивание. В результате различных исследований и изучений, сопровождавшихся огромными усилиями, авторы изобретения обнаружили, что среди генетических ресурсов, которыми обладает SAKATA SEED CORPORATION, линия китайской капусты «K-3», линия Brassica oleracea дикого вида «T-16» и линия «CF-33» цветной капусты обладают способностью к самоопылению.

[0022] Китайская капуста, дикие виды Brassica oleracea и цветная капуста являются родственными видами брокколи и капусты кочанной. Однако, поскольку они имеют большое количество признаков, которые считаются нежелательными для целевых культур, то трудно использовать вышеупомянутые виды в качестве селекционного материала. В частности, поскольку существует большое количество факторов, влияющих на фенотип в области локуса S, то у этих видов часто невозможно эффективно получить родительские линии путем простого возвратного скрещивания (BC).

Таким образом, авторами настоящего изобретения был проведен генетический анализ области S-аллелей и была проведена успешная селекция высококачественной брокколи и капусты кочанной, которым была сообщена способность к самоопылению посредством возвратного скрещивания в крупномасштабной популяции.

[0023] Таким образом, авторами настоящего изобретения была обнаружена линия Brassica oleracea, обладающая способностью к самоопылению, и было продемонстрировано, что можно разработать линию селекции, имеющую высокую промышленную ценность. Кроме того, разработка новой самоопыляющейся линии возможна за счет использования самоопыляющегося растения Brassica oleracea согласно настоящему изобретению или способа выведения самоопыляющейся линии, и если это станет возможным, то можно будет осуществлять стабильное производство элитных семян. Кроме того, с использованием выведенной таким образом родительской линии, можно создавать новые комбинации сортов F1 без учета гаплотипа S родителя-партнера.

[0024] Настоящее изобретение основано на этих открытиях.

[0025] То есть, в соответствии с этим, настоящее изобретение включает:

<1> Самоопыляющееся растение Brassica oleracea или его потомство, где указанное растение не является цветной капустой и китайской капустой.

[0027] <2> Самоопыляющееся растение Brassica oleracea в соответствии с вышеуказанным пунктом <1> или его потомство, где указанное растение не является цветной капустой и китайской капустой, и где указанное растение включает:

ген, расположенный в локусе S самоопыляющегося растения Brassica oleracea, и замененный геном, находящимся в локусе гена неспособности к самоопылению (в локусе S) несамоопыляющегося растения Brassica oleracea, за исключением цветной капусты и китайской капусты.

[0028] <3> Самоопыляющееся растение Brassica oleracea в соответствии с вышеуказанным пунктом <1> или <2>, или его потомство, которое может быть получено путем скрещивания самоопыляющегося растения Brassica oleracea с несамоопыляющимся растением Brassica oleracea, за исключением цветной капусты и китайской капусты, и отбора отдельного растения, обладающего способностью к самоопылению, из потомства после скрещивания.

[0029] <4> Самоопыляющееся растение Brassica oleracea в соответствии с любым из вышеуказанных пунктов <1>-<3>, имеющее любую одну или более ДНК, выбранных из группы, состоящей из следующих (а)-(с) в локусе S:

(а) ДНК, включающей нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2;

(b) ДНК, включающей нуклеотидную последовательность, имеющую последовательность, которая на 95% или более идентична нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, где ДНК участвует в экспрессии самоопыляемости растения; или

(c) ДНК, включающей нуклеотидную последовательность, полученную путем делеции, замены, инсерции и/или добавления одного или множества оснований в нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, где ДНК участвует в экспрессии самоопыляемости растения.

[0030] <5> Растение Brassica oleracea в соответствии с вышеуказанным пунктом <4> или его потомство, где растение является самоопыляющимся и содержит аллель S, включаящий ДНК по любому из вышеописанных пунктов (а)-(c), введенную в локус гена неспособности к самоопылению.

[0031] <6> Самоопыляющееся растение Brassica oleracea в соответствии с любым из вышеуказанных пунктов с <1> - <5> или его потомство, где растение представляет собой брокколи или капусту кочанную.

[0032] <7> Растение Brassica oleracea, за исключением китайской капусты, или его потомство, где растение имеет локус гена самоопыляемости «BoS-SC1» в S-локусе, а локус гена «BoS-SC1» присутствует в сорте китайской капусты, идентифицированной под номером доступа FERM BP-22347.

[0033] <8> Растение Brassica oleracea, за исключением китайской капусты, или ее потомство, где растение имеет локус гена самоопыляемости «BoS-SC1» в S-локусе, а локус гена «BoS-SC1» присутствует в сорте брокколи, идентифицированной под номером доступа FERM BP-22347.

[0034] <9> Растение Brassica oleracea, за исключением китайской капусты, в соответствии с вышеуказанным пунктом <7> или <8>, или его потомство, где локус гена «BoS-SC1» включает нуклеотидную последовательность (i) - (iii):

(i) нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1;

(ii) нуклеотидную последовательность, которая на 95% или более идентична нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1; или

(iii) нуклеотидную последовательность, полученную путем делеции, замены, инсерции и/или добавления одного или множества оснований в нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1.

<10> Растение Brassica oleracea в соответствии с любым из вышеуказанных пунктов <7> - <9> или его потомство, где растение представляет собой брокколи или капусту кочанную.

[0036] <11> Растение Brassica oleracea, за исключением цветной капусты и диких видов Brassica oleracea, или его потомство, где растение имеет локус гена самоопыляемости «BoS-SC2» в S-локусе, а локус гена «BoS-SC2» присутствует в сорте цветной капусты, идентифицированной под номером доступа FERM BP-22350.

[0037] <12> Растение Brassica oleracea, за исключением цветной капусты и диких видов Brassica oleracea, или его потомство, где растение имеет локус гена самоопыляемости «BoS-SC2» в S-локусе, а локус гена «BoS-SC2» присутствует в сорте брокколи, идентифицированной под номером доступа FERM BP-22348.

[0038] <13> Растение Brassica oleracea, за исключением цветной капусты и диких видов Brassica oleracea, в соответствии с вышеуказанным пунктом <11> или <12>, или его потомство, где локус гена «BoS-SC2» включает нуклеотидную последовательность (I)-(III):

(I) нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2;

(II) нуклеотидную последовательность, которая на 95% или более идентична нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2; или

(III) нуклеотидную последовательность, полученную путем делеции, замены, инсерции и/или добавления одного или множества оснований в нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2.

[0039] <14> Растение Brassica oleracea в соответствии с любым из вышеуказанных пунктов <11> - <13> или его потомство, где растение представляет собой брокколи или капусту кочанную.

[0040] <15> Брокколи, идентифицированную под номером доступа FERM BP-22349, или ее потомство.

<16> Брокколи, идентифицированную под номером доступа FERM BP-22348, или ее потомство.

[0041] <17> Часть растения в соответствии с любым из вышеуказанных пунктов <1> - <16> или ее потомство.

<18> Семена растения в соответствии с любым из вышеуказанных пунктов <1> - <16> или их потомство.

[0042] <19> Способ выращивания самоопыляющегося растения Brassica oleracea, за исключением цветной капусты и китайской капусты,

где указанный способ включает скрещивание самоопыляющегося растения Brassica oleracea с несамоопыляющимся растением Brassica oleracea, за исключением цветной капусты и китайской капусты, и отбор отдельного растения, обладающего способностью к самоопылению, из потомства после скрещивания.

[0043] <20> Способ выращивания самоопыляющегося растения Brassica oleracea в соответствии с вышеуказанным пунктом <19>, где самоопыляемость самоопыляющегося растения Brassica oleracea ассоциируется с геном, находящимся в локусе гена неспособности к самоопылению (в локусе S).

[0044] <21> Способ выращивания самоопыляющегося растения Brassica oleracea в соответствии с вышеуказанным пунктом <19> или <20>, где самоопыляющееся растение Brassica oleracea имеет любую одну или более ДНК, выбранных из группы, состоящей из (a)-(c), в локусе S:

(а) ДНК, включающей нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2;

(b) ДНК, включающей нуклеотидную последовательность, имеющую последовательность, которая на 95% или более идентична нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, где ДНК участвует в экспрессии самоопыляемости растения; или

(c) ДНК, включающей нуклеотидную последовательность, полученную путем делеции, замены, инсерции и/или добавления одного или множества оснований в нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, где ДНК участвует в экспрессии самоопыляемости растения.

[0045] <22> Способ выращивания самоопыляющегося растения Brassica oleracea в соответствии с вышеуказанными пунктами <19> - <21>, где выбор самоопыляющегося отдельного растения из потомства после скрещивания включает отбор самоопыляющегося растения исходя из наличия в этом растении ДНК по любому из (а) - (с) в соответствии с вышеуказанным пунктом <21>, используемой в качестве индикатора.

[0046] <23> Способ выращивания самоопыляющегося растения Brassica oleracea в соответствии с вышеуказанными пунктами <19> - <22>, где способ дополнительно включает определение генотипа с использованием ДНК-маркера, расположенного в области в непосредственной близости к локусу S (от 0 до 4 сМ от локуса S), включая ген, ассоциированный с самоопыляемостью, и выбор растения, обладающего способностью к самоопылению.

[0047] <24> Способ выращивания самоопыляющегося растения Brassica oleracea в соответствии с вышеуказанными пунктами <19> - <23>, где способ включает осуществление непрерывного возвратного скрещивания с использованием несамоопыляющегося растения Brassica oleracea, за исключением цветной капусты и китайской капусты, в качестве родительской линии для возвратного скрещивания.

[0048] <25> Способ выращивания самоопыляющегося растения Brassica oleracea в соответствии с вышеуказанными пунктами <19> - <24>, где самоопыляющееся растение Brassica oleracea, используемое при скрещивании, представляет собой сорт китайской капусты, идентифицированный под номером доступа FERM BP-22347, сорт брокколи, идентифицированный под номером доступа FERM BP-22349, сорт брокколи, идентифицированный под номером доступа FERM BP-22348, или сорт цветной капусты, идентифицированный под номером доступа FERM BP-22350.

[0049] <26> Способ выращивания самоопыляющегося растения Brassica oleracea в соответствии с вышеуказанными пунктами <19>- <25>, где самоопыляющееся растение Brassica oleracea представляет собой брокколи или капусту кочанную.

[0050] <27> Маркер для детектирования самоопыляемости растения Brassica oleracea, включающий нуклеотидную последовательность, выбранную из любой из следующих (A) - (C):

(А) нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2;

(B) нуклеотидной последовательности, которая на 95% или более идентична нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2; или

(C) нуклеотидной последовательности, полученной путем делеции, замены, инсерции и/или добавления одного или множества оснований нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2.

[0051] <28> Способ получения семян растения Brassica oleracea, где указанный способ включает самораспространение самоопыляющегося растения Brassica oleracea, полученного способом выращивания в соответствии с любым из вышеуказанных пунктов <19> - <26>, или его потомства, и тем самым, получение его семян.

[0052] <29> Способ сохранения или размножения родительской линии подходящей первой дочерней линии поколения с применением способа выращивания в соответствии с любым из вышеуказанных пунктов <19> - <26>.

[0053] <30> Маркер для проведения анализа генотипа области в непосредственной близости от локуса S растения Brassica oleracea, где указанная область имеет любую одну или более нуклеотидных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 10 - SEQ ID No: 15.

[0054] <31> Способ получения семян первого дочернего поколения Brassica oleracea посредством цитоплазматической мужской стерильности (CMS), где указанный способ включает:

стадию размножения родительской линии первой дочерней линии поколения с использованием растения Brassica oleracea, способного к самоопылению.

[0055] <32> Способ выращивания семян в соответствии с вышеуказанным пунктом <31>, где самоопыляющееся растение Brassica oleracea имеет любую одну или более ДНК, выбранных из группы, состоящей из (a) - (c), в локусе S:

(а) ДНК, включающей нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2;

(b) ДНК, включающей нуклеотидную последовательность, имеющую последовательность, которая на 95% или более идентична нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, где ДНК участвует в экспрессии самоопыляемости растения; или

(c) ДНК, включающей нуклеотидную последовательность, полученную путем делеции, замены, инсерции и/или добавления одного или множества оснований в нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, где ДНК участвует в экспрессии самоопыляемости растения.

[0056] <33> Способ выращивания семян в соответствии с вышеуказанными пунктами <31> или <32>, где самоопыляющееся растение Brassica oleracea представляет собой любое из следующих растений 1) - 6):

1) растение Brassica oleracea, за исключением китайской капусты, где растение имеет локус гена самоопыляемости «BoS-SC1» в локусе S, а локус гена «BoS-SC1» присутствует в сорте китайской капусты, идентифицированной под номером доступа FERM BP-22347;

2) растение Brassica oleracea, за исключением китайской капусты, где растение имеет локус гена самоопыляемости «BoS-SC1» в локусе S, а локус гена «BoS-SC1» присутствует в сорте брокколи, идентифицированной под номером доступа FERM BP-22349;

3) растение Brassica oleracea, за исключением цветной капусты и диких видов Brassica oleracea, где растение имеет локус гена самоопыляемости «BoS-SC2» в локусе S, а локус гена «BoS-SC2» присутствует в сорте цветной капусты, идентифицированной под номером доступа FERM BP-22350;

4) растение Brassica oleracea, за исключением цветной капусты и диких видов Brassica oleracea, где растение имеет локус гена самоопыляемости «BoS-SC2» в локусе S, а локус гена «BoS-SC2» присутствует в сорте брокколи, идентифицированной под номером доступа FERM BP-22348;

5) брокколи, идентифицированную под номером доступа FERM BP-22349, или ее потомство; и

6) брокколи, идентифицированную под номером доступа FERM BP-22348, или ее потомство.

[Эффекты изобретения]

[0057] При использовании растения Brassica oleracea, обладающего самоопыляемостью согласно настоящему изобретению, может быть выведена новая родительская линия Brassica oleracea, имеющая превосходные свойства семян. С использованием самоопыляющейся линии, созданной таким образом, можно эффективно осуществлять размножение родительской линии элитными семенами для получения семян F1. По этой причине, предпринятые в настоещее время усилия, необходимые для обычного саморазмножения, могут быть в значительной степени снижены, а площадь культивирования посевных угодий фермы по производству семян может быть уменьшена. Кроме того, ожидается, что такая самоопыляющаяся линии, созданная таким образом, внесет большой вклад даже с точки зрения стабильной поставки элитных семян, что часто было проблемой при использовании обычных линий SI.

[0058] Кроме того, при использовании выведенной таким образом линии, могут быть созданы новые комбинации сортов F1 без учета гаплотипа S родительских семян для получения семян F1. Это позволяет расширить ассортимент сортов F1, что открывает широкие возможности для селекции.

[Краткое описание чертежей]

[0059] На Фиг. 1 показаны формы растений брокколи (выращенные в горшках) различных поколений как описано в Примере 2. Среди диаграмм на Фиг. 1(а) показана форма растения «BR-9», которая представляет собой элитную линию системы SI, используемую для возвратного скрещивания, на фиг. 1(b) показана форма растения на промежуточной стадии возвратного скрещивания, а на фиг. 1(c) показана форма растения «SC-BR-9», которая является линией SC, где BC проводят до тех пор, пока растение не приобретет форму, подобную BR-9.

На фиг. 2 показана брокколи (выращенная в полевых условиях фермы), выращенная, как описано в Примере 2. Среди диаграмм на Фиг. 2(а) показано растение «BR-9», которое представляет собой элитную линию системы SI, используемую для возвратного скрещивания; на фиг. 2(b) показано растение «SC-BR-9», которое является линией SC, где BC проводят до тех пор, пока растение не приобретет форму, подобную «BR-9», а на фиг. 2(c) показана форма растения «CMS-SC-BR-9», которая представляет собой линию, где «SC-BR-9» заменен цитоплазмой CMS.

На фиг. 3 показаны результаты испытания по производству семян в изоляционной камере, как описано в Примере 3 («SC-BR-9» и «CMS-SC-BR-9»).

На фиг. 4 показаны результаты испытания по производству семян в изоляционной камере, как описано в Примере 4 («SC-BR-6» и «CMS-SC-BR-6»).

На фиг. 5(A) показано состояние завязывания семян «CB-3», которое представляет собой элитную линию системы SI капусты Примера 6, и линии «SC-CB-3», в которую был введен фактор SC. На диаграмме показана форма соцветия, где распускание цветков происходило последовательно из бутонов на более низких участках.

На фиг. 5(B) показано состояние стручков через один месяц или более после скрещивания, как описано в Примере 6.

На Фиг. 5(C) показаны результаты подсчета количества семян, образовавшихся в различных стручках, как описано в Примере 6.

[Варианты изобретения]

[0060] Настоящее изобретение будет подробно описано ниже.

[0061] Самоопыляющееся растение Brassica oleracea и способ его выращивания

Настоящее изобретение относится, как описано выше, к растению Brassica oleracea (за исключением цветной капусты и китайской капусты), обладающему способностью к самоопылению, или к его потомству.

[0062] В данном случае, самоопыляющееся растение Brassica oleracea получают путем замены гена, находящегося в локусе гена неспособности к самоопылению (в локусе S) несамоопыляющегося растения Brassica oleracea (за исключением цветной капусты и китайской капусты), геном в локусе S самоопыляющегося растения Brassica oleracea. То есть, самоопыляющееся растение Brassica oleracea согласно изобретению означает растение Brassica oleracea (за исключением цветной капусты и китайской капусты), которое было превращено из несамоопыляющегося в самоопыляющееся растение путем замены гена, находящегося в локусе S несамоопыляющегося растения Brassica oleracea (за исключением цветной капусты и китайской капусты), геном, находящимся в локусе S другого растения Brassica oleracea, обладающего способностью к самоопылению.

В данном случае, термин «заменен на ...» означает, что ген, экспрессирующий признак несамоопыляемости, заменяют геном, экспрессирующим признак самоопыляемости, и способы такой замены не имеют конкретных ограничений.

[0063] Растение Brassica oleracea, способное к самоопылению (самоопыляющееся растение Brassica oleracea) согласно изобретению лишено функции несамоопыляемости, которая изначально присуща гену S, а поэтому стало возможным получить новое растение Brassica oleracea, обладающее самоопыляемостью, с использованием вышеупомянутого растения в качестве генетического ресурса. Другими словами, самоопыляющееся растение Brassica oleracea согласно изобретению стало самоопыляющимся благодаря введению аллеля S, включающего фактор самоопыляемости, обнаруженный в самоопыляющемся растении Brassica oleracea, в локус гена неспособности к самоопылению, и этот термин включает его потомство.

[0064] В данном случае, метод определения того факта, обладает ли «самоопыляющееся растение Brassica oleracea» «самоопыляемостью», не имеет конкретных ограничений и может быть проведен с применением любых известных средств, однако, например, это может быть определено с применением методик отбора самоопыляющегося растения, описанного в настоящей заявке, например, теста на скрещивание путем самоопыления; теста на скрещивание в случае введения гаплотипа S, как будет описано ниже; сравнения процентного соотношения семян при опылении распустившихся цветков и опыления бутонов, как будет описано ниже; использования ДНК-маркера, относящегося к известному локусу S, и т.п. В частности, например, является ли растение самоопыляющимся или нет, можно определить с применением методики, описанной ниже в Примере 1.

[0065] В соответствии с настоящим изобретением, «растение Brassica oleracea» представляет собой растение семейства Brassicaceae и означает растение вида Brassica oleracea среди растений рода Brassica, и его примеры включают: B. oleracea сорт capitata (капусту кочанную), B. oleracea сорт italica (брокколи), B. oleracea сорт botrytis (цветную капусту), B. oleracea сорт gemmifera (брюссельскую капусту), B. oleracea сорт gongyloides (кольраби), B. oleracea сорт acephara (декоративную капусту, капусту коромвую) и B. oleracea сорт albograbra (китайскую капусту).

[0066] Кроме того, «самоопыляемость» (SC) означает свойство, при котором функция неспособности к самоопылению (SI), присущая растению Brassica oleracea, является дефицитной, в результате чего происходит оплодотворение самого растения или с помощью растения, имеющего гаплотип S такого же типа, как и у самого растения.

[0067] Самоопыляющееся растение Brassica oleracea согласно изобретению обычно имеет нижеследующие признаки.

(1) Поскольку функция неспособности к самоопылению является дефицитной, то возможно эффективное скрещивание с самим растением или с растением, имеющим такой же гаплотип S, как и у самого растения, и может быть осуществлено эффективное размножение элитными семенами, которое обычно было затруднено.

(2) В частности, растение представляет собой растение, имеющее последовательность ДНК, представленную в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2 в локусе S, и это растение обладает способностью к самоопылению, поскольку оно имеет этот аллель.

(3) С использованием линии, имеющей описанную выше последовательность в качестве материала для скрещивания, стало возможным получение новой родительской линии, обладающей способностью к самоопылению.

[0068] Способ получения

В соответствии с настоящим изобретением, если несамоопыляющееся растение Brassica oleracea скрещивают с растением Brassica oleracea, которое, как было обнаружено, обладает самоопыляемостью, то растение, обладающее самоопыляемостью, выбирают из потомства после скрещивания, и такое растение может быть получено путем сообщения несамоопыляющемуся растению Brassica oleracea способности к самоопылению.

[0069] То есть, способ выращивания растения Brassica oleracea, обладающего самоопыляемостью согласно изобретению, включает, как описано выше, скрещивание самоопыляющегося растения Brassica oleracea с несамоопыляющимся растением Brassica oleracea (за исключением цветной капусты и китайской капусты) и отбор растения, обладающего самоопыляемостью, от потомства после скрещивания.

[0070] Используемый здесь термин «самоопыляющееся растение Brassica oleracea» как генетический ресурс означает растение Brassica oleracea, имеющее фактор самоопыляемости, и в тесте на скрещивание путем самоопыления, растенияе Brassica oleracea, имеющее фактор самоопыляемости, может быть отобрано с помощью теста на скрещивание путем введения гаплотипа S, как будет описано ниже, сравнения процентного соотношения семян при опылении распустившихся цветков и опылении бутонов, как будет описано ниже, использования ДНК-маркера, относящегося к известному локусу S, и т.п. В частности, например, можно провести отбор растения Brassica oleracea, имеющего фактор самоопыляемости, с применением методики, описанной ниже в Примере 1.

[0071] Кроме того, «самоопыляемость» самоопыляющегося растения Brassica oleracea представляет собой свойство, ассоциированное с геном, находящимся в локусе гена неспособности к самоопылению (в локусе S). То есть, в соответствии с настоящим изобретением, «самоопыляемость» означает самоопыляемость, экспрессируемую благодаря функции гена, находящегося в локусе S, или дефициту этой функции (или, предположительно, такому дефициту), или благодаря влиянию гена, находящегося в локусе S, но при этом, например, исключается приобретение самоопыляемости за счет другого эффекта, отличающегося от эффекта локуса S. Между прочим, что касается растений Brassica oleracea, как будет описано ниже в примере 1, то согласно общепринятому мнению, считается, что в большинстве случаев, даже растения, обладающие свойством SI, могут иметь SC из-за эффекта, отличающегося от эффекта локуса S (Horisaki et al., 2004 (непатентный документ 5)).

[0072] В соответствии с настоящим изобретением, «самоопыляющееся растение Brassica oleracea», используемое в качестве материала, имеет ДНК по любому из нижеследующих пунктов (а) - (с) в локусе S:

(а) ДНК, включающую нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2,

(b) ДНК, включающую нуклеотидную последовательность, которая на 95% или более идентична нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, где ДНК участвует в экспрессии самоопыляемости растения; или (c) ДНК, включающую нуклеотидную последовательность, полученную путем делеции, замены, инсерции и/или добавления одного или множества оснований в нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, где ДНК участвует в экспрессии самоопыляемости растения.

[0073] Используемый здесь термин «имеющий», например, «имеющий ДНК», может быть заменен на «включающий», однако этот термин может быть заменен предпочтительно на «состоящий, по существу, из», а более предпочтительно, на «состоящий из».

[0074] Кроме того, что касается вышеописанного пункта (b), то в случае, когда сказано, что «последовательность на 95% или более идентична нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2», если идентичность последовательностей вычисляют с использованием нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, и известного алгоритма поиска гомологии (например, с использованием параметров по умолчанию, то есть, исходных параметров), такого как BLAST или FASTA, то это означает, что идентичность последовательностей ДНК составляет по меньшей мере 95%, предпочтительно по меньшей мере 96%, более предпочтительно по меньшей мере 97%, еще более предпочтительно по меньшей мере 98%, а особенно предпочтительно по меньшей мере 99%.

[0075] В данном случае, что касается термина «идентичность последовательностей», например, если две последовательности оснований (нуклеотидов) подвергаются выравниванию (при условии, что могут быть введены, а могут быть и не введены пробелы), то этот термин означает процент (%) числа идентичных оснований по отношению к общему количеству оснований, включая пробелы.

[0076] Кроме того, в настоящей заявке, когда говорится, что ДНК (b) «участвует в экспрессии самоопыляемости в растении», то подразумевается, что ДНК (b) растения, имеющего эту ДНК в локусе S, в значительной степени экспрессирует самоопыляемость.

[0077] Кроме того, что касается вышеописанного (c), то термин «множество», используемый во фразе «нуклеотидная последовательность, полученная путем делеции, замены, инсерции и/или добавления одного или множества оснований в нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2» означает, например, приблизительно 10 оснований, предпочтительно, приблизительно 7 оснований, более предпочтительно, 5 оснований, а еще более предпочтительно, 3 основания.

[0078] В соответствии с одним предпочтительным вариантом осуществления изобретения, в способе согласно изобретению, «самоопыляющееся растение Brassica oleracea», используемое в качестве материала, представляет собой сорт китайской капусты, идентифицированный под номером доступа FERM BP-22347, сорт брокколи, идентифицированный под номером доступа FERM BP-22349, сорт брокколи, идентифицированный под номером доступа FERM BP-22348, или сорт цветной капусты, идентифицированный под номером доступа FERM BP-22350.

[0079] Кроме того, «несамоопыляющееся растение Brassica oleracea», используемое в настоящей заявке в качестве материала, не имеет конкретных ограничений, при условии, что это растение может быть скрещено с «самоопыляющимся растением Brassica oleracea», используемым в качестве вышеописанного материала, и обладает неспособностью к самоопылению, присущей растению семейства Brassicaceae. Однако, что касается цветной и китайской капусты, то поскольку эти растения, как уже известно, обладают самоопыляемостью, то цветная капуста и китайская капуста были исключены из определения «несамоопыляющегося растения Brassica oleracea», используемого в качестве материала. «Несамоопыляющееся растение Brassica oleracea» предпочтительно представляет собой брокколи, капусту кочанную, брюссельскую капусту, кольраби, декоративную капусту или капусту кормовую, а более предпочтительно брокколи или капусту кочанную.

[0080] В способе культивирования согласно изобретению, сначала самоопыляющееся растение Brassica oleracea скрещивают с несамоопыляющимся растением Brassica oleracea (за исключением цветной капусты и китайской капусты). Затем, из потомства, полученного путем скрещивания, отбирают растение, обладающее способностью к самоопылению.

То есть, гаплотип S локуса S «самоопыляющегося растения Brassica oleracea», используемого в качестве материала, вводят в несамоопыляющееся растение Brassica oleracea (за исключением цветной капусты и китайской капусты), и из потомства, полученного путем скрещивания, отбирают растение, обладающее способностью к самоопылению, в результате введения в него гаплотипа S.

[0081] В данном случае, скрещивание не имеет конкретных ограничений при условии, что потомство получают путем скрещивания «самоопыляющегося растения Brassica oleracea» и «несамоопыляющегося растения Brassica oleracea» в качестве материалов, и скрещивание может представлять собой любое природное скрещивание, такое как энтомофилия, скрещивание вручную и т.п. Кроме того, используемый здесь термин «скрещивание» также включает возвратное скрещивание.

[0082] В случае введения гаплотипа S можно проверить, является ли растение самоопыляющимся или несамоопыляющимся, с помощью теста на скрещивание.

В частности, был проведен тест на скрещивание посредством самоопыления и тест на скрещивание посредством перекрестного опыления с использованием пыльцы линии, имеющей другой гаплотип S, в качестве объекта для сравнения. Результаты самоопыления и перекрестного опыления сравнивали, и если семена были успешно получены в том и другом случае, то растения считались самоопыляемыми, а если процент самоопыляемости с образованием семян был низким, то растения считались несамоопыляемыми.

[0083] Кроме того, обычно, поскольку SI проявляется в распустившихся цветках, то можно определить, какое свойство из SI и SC будет проявляться у растения, путем сравнения набора семян после опыления распустившихся цветков (OFP) и опыления бутонов (BP). На стадии появления бутонов, поскольку экспрессия гена SI является низкой, когда чашечки и лепестки обнажены, а затем принудительно достигается опыление (опыление бутонов), то можно избежать SI и получить семена, пока клетки семяпочки находятся в состоянии способности к оплодотворению. В случае, если процент образования семян при скрещивании OFP ниже, чем процент образования семян при скрещивании BP, то такое растение можно рассматривать как принадлежащее к линии SI, в соответствии с принципом, описанным выше.

[0084] В соответствии с настоящим изобретением, для анализа гаплотипа S, гаплотип S можно классифицировать по полиморфизму группы генов, находящихся в локусе S, как описано в документе Watanabe et al. (2003) (Непатентный документ 3) (киназа S-рецептора; SRK, гликопротеин локуса S; SLG, белок локуса S 11; SP11 (= богатый цистеином белок локуса S; SCR)), где такой полиморфизм служит в качестве индикатора. Средством классификации гаплотипа S может быть любой произвольный метод, и, например, могут быть использованы общеизвестные ПЦР-праймеры, такие как праймеры, описанные в документе Nishio et al. (1996) (Непатентный документ 4) или т.п. Кроме того, может быть проведен анализ, в котором продуцируется ДНК-маркер на основе SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, или анализ нуклеотидной последовательности гена S.

[0085] Следовательно, в соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения, относящимся к отбору самоопыляющегося растения из потомства после скрещивания, самоопыляющееся растение может быть выбрано исходя из того, имеет ли оно ДНК по любому из описанных выше пунктов (a) - (c) в качестве индикатора. То есть, если растение имеет ДНК по любому из описанных выше пунктов (а) - (с), то такое растение обладает способностью к самоопылению.

[0086] Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением, при определении самоопыляемости, присутствие или отсутствие локуса гена самоопыляемости можно определить, даже когда локус S находится в гетерозиготном состоянии, путем проведения анализа на локус S с использованием ДНК-маркера, и при этом может быть проведено более эффективное возвратное скрещивание, чем тест на скрещивание.

[0087] Следовательно, в соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения, способ селекции согласно изобретению включает проведение повторного возвратного скрещивания с использованием вышеописанного несамоопыляющегося растения Brassica oleracea (за исключением цветной капусты и китайской капусты) в качестве родительской линии для возвратного скрещивания.

[0088] В способе осуществления возвратного скрещивания, если только не проводится специальный отбор, средние значения коэффициента замены генома в популяции различных поколений составляют 75% для первого поколения (BC1F1), 87,5% для второго поколения (BC2F1), 93,75% для третьего поколения (BC3F1) и 96,875% для четвертого поколения (BC4F1). Таким образом, по мере смены поколений, популяция приобретает генотип, более близкий к родительской линии для возвратного скрещивания (рекуррентный родитель). Следовательно, для создания практически полезных почти изогенных линий, в которых заменен только локус S, имеющийся в родительской линии, для возвратного скрещивания, обычно требуется проведение возвратного скрещивания 6 или 7 раз.

[0089] Для более эффективного продолжения возвратного скрещивания, которое требует длительного периода времени, также возможно приблизить области, отличающиеся от локуса S, к родительской линии для более раннего возвратного скрещивания с использованием полногеномных ДНК-маркеров.

[0090] Так, например, как описано выше, в первом поколении возвратного скрещивания (BC1F1) в среднем 75% генома имеют такой же генотип, как и рекуррентный родитель. Поскольку поколение BC1F1 является сегрегационным поколением, то коэффициенты замены генома, которыми обладают растения, отличаются друг от друга. Когда масштаб популяции расширяется в зависимости от вида растения, также возможно получить растение, у которого 90% или более областей генома имеют такой же генотип, как и у рекурентного родителя. Путем отбора такого растения, области, отличающиеся от локуса S, могут быть присоединены так, чтобы они имели такой же генотип, как и у рекурентного родителя, на ранней стадии с использованием меньшего числа поколений.

[0091] Что касается конкретных средств, которые могут быть использованы в качестве ДНК-маркера для всего генома, то в случае наличия информации о геномной последовательности рекуррентного родителя, может быть создан ДНК-маркер на основе этой информации, а затем может быть проведено генотипирование различных локусов генов.

[0092] Кроме того, даже в случае, когда информация о геномной последовательности рекуррентного родителя отсутствует, можно выбрать растение, имеющее генотип, близкий к генотипу рекуррентного родителя, из сегрегирующего поколения с примененеим метода случайной ПЦР, такой как метод случайной амплифицированной полиморфной ДНК (RAPD), метод амплифицированного полиморфизма последовательности (SRAP) или метод полиморфизма длин амплифицированного фрагмента (AFLP). В дополнение к этому, если существует чип для генотипирования полиморфизма по одному нуклеотиду (SNP), предназначенного для полного анализа большого количества SNP, разбросанных по всему геному (продукт, произведенный Affymetrix, Inc., или продукт, произведенный Illumina, Inc.), то такой анализ может быть проведен с использованием указанных средств.

[0093] В качестве еще одного фактора, который следует отметить во время возвратного скрещивания, можно упомянуть перемещение сцепления нецелевого признака, связанного с локусом S.

[0094] При обычном возвратном скрещивании, замена области, отличающейся от хромосомы 6, где находится ген S, на генотип рекуррентного родителя, может быть осуществлена относительно легко при повторении поколений, хотя это занимает много времени, как описано выше. С другой стороны, что касается области, расположенной поблизости от локуса S, то необходима программа селекции, которая намеренно исключает эту область.

В качестве конкретного примера может быть сконструирован маркер, находящийся поблизости от локуса S, и можно проанализировать генотип растений вместе с маркером для идентификации локуса S в сегрегирующем поколении. В большинстве случаев, два маркера являются совместно сегрегированными (сцепленными), однако, хотя и крайне редко, связь между двумя маркерами нарушается, и появляется растение, в котором ген S имеет локус гена линии самоопыляемости, в то время как область генома, находящаяся поблизости, имеет генотип родительской линии для возвратного скрещивания. При выборе такого растения, можно выбрать растение, у которого был удален нецелевой признак, сцепленный с локусом S.

[0095] Информация о последовательности ДНК в области локуса S может быть получена путем использования общей информации о Brassica oleracea, зарегистрированной в NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_000695525.1/). Если полиморфизм может быть получен в случае использования маркеров, находящихся в непосредственной близости от локуса S, таких как маркеры, представленные в SEQ ID NO: 10 - SEQ ID NO: 15, между линиями, подлежащими скрещиванию, то эти маркеры также могут быть использованы. Путем подавления перемещения сцепления, насколько это возможно, в небольшую область с помощью таких средств, можно сообщить тесно сцепленный признак рекуррентного родителя.

[0096] Следовательно, в соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения, генотип идентифицируют с использованием ДНК-маркера, расположенного в области в непосредственной близости от локуса S (от 0 до 10 сМ, а предпочтительно от 0 до 4 сМ от локуса S), включая ген, ассоциированный с самоопыляемостью, и может быть выбрано растение, которое обладает способностью к самоопылению, и в котором геномная область, находящаяся в непосредственной близости от локуса S, имеет генотип рекуррентного родителя, то есть, растения, у которого проявляется фенотип, очень близкий к фенотипу рекуррентного родителя.

[0097] Что касается такого ДНК-маркера, то ДНК-маркер, имеющий одну или более нуклеотидных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 10 - SEQ ID NO: 15, может быть упомянут как предпочтительный.

В данном случае, когда говорят, что ДНК-маркер «имеет» нуклеотидную последовательность, то подразумевается, что маркер имеет эту нуклеотидную последовательность. В соответствии с настоящим изобретением подразумевается, что ДНК-маркер может иметь любое одно или несколько (например, 1, 2 или 3; предпочтительно 1 или 2; а более предпочтительно 1) оснований в соответствующей нуклеотидной последовательности, которые были заменены, делетированы, добавлены или удалены, или даже последовательность, включающую соответствующую нуклеотидную последовательность как часть с сохранением предварительно определенных свойств. В таком случае, термин «иметь» может быть заменен термином «включать». Кроме того, в случае, когда допускается замена, делеция, добавление или удаление одного основания, то термин «иметь» может быть заменен термином «по существу, состоит из».

[0098] Таким образом, такой ДНК-маркер может быть использован для анализа на генотип в области, расположенной поблизости от локуса S растения Brassica oleracea.

[0099] Создание двойного гаплоида в культуре пыльников и пыльцы может быть осуществлено как описано Palmer C et al. (1996) «In vitro Haploid Production in Higher Plants», Vol. 3 (Kluwer Academic Publishers, editors: S Jain, S Sopory и RVeilleux), стр. 143-172.

[0100] Новая выведенная самоопыляющаяся линия может быть использована в качестве мужской родительской линии в системе производства семян F1. С другой стороны, если самораспространяющиеся семена, полученные посредством самоопыления, производятся в больших количествах, то эти семена нельзя использовать непосредственно в качестве материнского родителя. Чтобы семена можно было использовать в качестве материнского родителя, необходимо получить А-линию, имеющую цитоплазму CMS, для того, чтобы не осуществлялся самосев.

[0101] В случае, когда линия CMS рекуррентного родителя была уже получена, то если возвратное скрещивание осуществляется по меньшей мере два раза с использованием этой вновь созданной самоопыляющейся линии в качестве B-линии, то можно вывести A-линию, в которой были заменены только локус S и его область.

[0102] При использовании обычных несамоопыляющихся линий необходимо приложить огромные усилия для размножения элитных семян. Однако, в случае родительской линии, в которую был введен признак самоопыляемости, размножение родительской линии элитными семенами можно легко осуществить посредством опыления насекомыми. Также может быть осуществлено крупномасштабное производство семян F1 с использованием семян размноженной родительской А-линии.

[0103] В данном случае, A-линия и B-линия представляют собой линию цитоплазматической мужской стерильности и линию сохранения, соответственно, в системе производства гибридных семян, использующей цитоплазматическую мужскую стерильность. Поскольку конфигурации ядерных геномов двух линий почти идентичны, то фенотипы растений являются сходными, однако, А-линия не дает пыльцу из-за влияния цитоплазмы. Элитные семена, полученные путем скрещивания A-линии с пыльцой B-линии, используются в качестве родительских семян для производства семян F1.

[0104] «Родительская линия» согласно изобретению означает линию, выведенную для получения семян сортов F1, и обычно, сорт F1 получают с использованием двух родительских линий, имеющих различные агрономические признаки, в качестве материалов, и путем скрещивания этих линий.

[0105] В соответствии с настоящим изобретением, «размножение элитными семенами» представляет собой размножение семенами родительской линии, необходимыми для получения семян сорта F1.

[0106] Самоопыляющееся растение Brassica oleracea

Самоопыляющееся растение Brassica oleracea согласно изобретению представляет собой растение, полученное способом культивирования согласно изобретению, который будет описан ниже, и его потомство, как описано выше.

[0107] Кроме того, самоопыляющееся растение Brassica oleracea согласно изобретению представляет собой растение Brassica oleracea (за исключением китайской капусты и цветной капусты), обладающее самоопыляемостью, где указанное растение или его потомство имеет ДНК по любому из нижеследующих пунктов (а) - (с) в локусе S:

(а) ДНК, включающую нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2;

(b) ДНК, включающую нуклеотидную последовательность, имеющую последовательность, которая на 95% или более идентична нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, где ДНК участвует в экспрессии самоопыляемости растения; или

(c) ДНК, включающую нуклеотидную последовательность, полученную путем делеции, замены, инсерции и/или добавления одного или множества оснований в нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, где ДНК участвует в экспрессии самоопыляемости растения.

[0108] В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения, растение Brassica oleracea согласно изобретению представляет собой растение, которое стало самоопыляющимся благодаря введению аллеля S, включающего ДНК по любому из описанных выше пунктов (а) - (c) в локус гена неспособности к самоопылению, или его потомство.

[0109] Кроме того, «потомство» самоопыляющегося растения Brassica oleracea согласно изобретению включает не только собственное потомство, полученное посредством самооплодотворения, но также потомство, происходящее от культуры пыльников и культуры пыльцы, и гибриды, получаемые путем скрещивания самоопыляющегося растения Brassica oleracea согласно изобретению с растением Brassica oleracea, которое может быть скрещено с вышеупомянутым растением. Следовательно, «потомство» также включает, например, растение, которое можно получить путем скрещивания с использованием самоопыляющегося растения Brassica oleracea согласно изобретению в качестве родительской пыльцы (мужского родительского растения) и растения Brassica oleracea, которое может быть скрещено с вышеупомянутым растением, используемым в качестве семенного родителя (женского родительского растения). Кроме того, в случае, если линия CMS родительской линии для возвратного скрещивания уже существует, и если возвратное скрещивание осуществляют два раза с использованием вновь созданной самоопыляющейся линии в качестве B-линии, то можно вывести A-линию, в которой заменены только локус S и его окружение. Самоопыляющееся растение Brassica oleracea, имеющее цитоплазматическую мужскую стерильность, которую можно получить таким образом, также может быть включено в потомство. Кроме того, термин «потомство», например, растение, полученное путем слияния клеток самоопыляющегося растения Brassica oleracea согласно изобретению, и растение, которое может быть скрещено с вышеупомянутым растением Brassica oleracea, также включает межродовое гибридное растение и межвидовое гибридное растение.

[0110] В соответствии с другим своим аспектом, настоящее изобретение также относится к части самоопыляющегося растения Brassica oleracea согласно изобретению или к его потомству, или к семенам растения и их потомству.

В данном случае, «часть растения» включает органы, такие как цветки, листья, стебли и корни, или их части или ткани, или клетки, полученные из этих органов или тканей, агрегаты клеток и т.п.

[0111] В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения, самоопыляющееся растение Brassica oleracea согласно изобретению обычно представляет собой растение, за исключением цветной капусты и китайской капусты, предпочтительные примеры которого включают брокколи, капусту кочанную, брюссельскую капусту, кольраби, декоративную капусту и капусту кормовую, а более предпочтительные примеры включают брокколи и капусту кочанную.

[0112] В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения, самоопыляющееся растение Brassica oleracea согласно изобретению или его потомство может представлять собой любое из следующих растений:

1) растение Brassica oleracea, за исключением китайской капусты, где растение имеет локус гена самоопыляемости «BoS-SC1» в локусе S, а локус гена «BoS-SC1» присутствует в сорте китайской капусты, идентифицированной под номером доступа FERM BP-22347, или его потомство;

2) растение Brassica oleracea, за исключением китайской капусты, где растение имеет локус гена самоопыляемости «BoS-SC1» в локусе S, а локус гена «BoS-SC1» присутствует в сорте брокколи, идентифицированной под номером доступа FERM BP-22349, или его потомство;

3) растение Brassica oleracea, за исключением цветной капусты и диких видов Brassica oleracea, где растение имеет локус гена самоопыляемости «BoS-SC2» в локусе S, а локус гена «BoS-SC2» присутствует в сорте цветной капусты, идентифицированной под номером доступа FERM BP-22350, или его потомство;

4) растение Brassica oleracea, за исключением цветной капусты и диких видов Brassica oleracea, где растение имеет локус гена самоопыляемости «BoS-SC2» в локусе S, а локус гена «BoS-SC2» присутствует в сорте брокколи, идентифицированной под номером доступа FERM BP-22348, или его потомство;

5) брокколи, идентифицированную под номером доступа FERM BP-22349, или ее потомство; и

6) брокколи, идентифицированную под номером доступа FERM BP-22348, или ее потомство.

[0113] Предпочтительно, чтобы вышеупомянутый локус гена «BoS-SC1» имел нижеследующие нуклеотидные последовательности (i)-(iii):

(i) нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1;

(ii) нуклеотидную последовательность, которая на 95% или более идентична нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1; и

(iii) нуклеотидную последовательность, полученную путем делеции, замены, инсерции и/или добавления одного или множества оснований в нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1.

[0114] Кроме того, предпочтительно, чтобы вышеупомянутый локус гена «BoS-SC2» имел нижеследующие нуклеотидные последовательности (I)-(III):

(I) нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2;

(II) нуклеотидную последовательность, которая на 95% или более идентична нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2; или

(III) нуклеотидную последовательность, полученную путем делеции, замены, инсерции и/или добавления одного или множества оснований в нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2.

[0115] Что касается фразы «имеет последовательность, которая на 95% или более идентична нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1», по вышеуказанному пункту (ii), и «имеет последовательность, которая на 95% или более идентична нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2», по вышеуказанному пункту (II), которые аналогичны вышеописанному пункту (b), если идентичность последовательностей вычисляют с использованием нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, и известного алгоритма поиска гомологии (например, с использованием параметров по умолчанию, то есть, исходных параметров), такого как BLAST или FASTA, то это означает, что идентичность последовательностей ДНК составляет по меньшей мере 95%, предпочтительно по меньшей мере 96%, более предпочтительно по меньшей мере 97%, еще более предпочтительно по меньшей мере 98%, а особенно предпочтительно по меньшей мере 99%.

[0116] Кроме того, термин «множество», используемый во фразах «нуклеотидная последовательность, полученная путем делеции, замены, инсерции и/или добавления одного или множества оснований в нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1» по указанному выше пункту (iii) и «нуклеотидная последовательность, полученная путем делеции, замены, инсерции и/или добавления одного или множества оснований в нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2» по указанному выше пункту (III) означает, по аналогии с вышеописанным пунктом (с), например, приблизительно 10 оснований, предпочтительно 7 оснований, более предпочтительно 5 оснований, а еще более предпочтительно 3 основания.

[0117] В соответствии со своим другим вариантом, настоящее изобретение относится к маркеру для детектирования самоопыляемости растения Brassica oleracea, включающему нуклеотидную последовательность, выбранную из любой из следующих последовательностей (A)-(C):

(А) нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2;

(B) нуклеотидной последовательности, которая на 95% или более идентична нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2; или

(C) нуклеотидной последовательности, полученной путем делеции, замены, инсерции и/или добавления одного или множества оснований нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2.

Кроме того, упомянутые здесь нуклеотидные последовательности по пунктам (B) и (C) определены так же, как нуклеотидные последовательности по вышеописанным пунктам (b) и (c).

[0118] В соответствии с еще одним своим аспектом, настоящее изобретение относится к способу получения семян растения Brassica oleracea, где указанный способ включает самораспространение самоопыляющегося растения Brassica oleracea, полученного способом согласно изобретению, или его потомства, и семян этого растения.

[0119] В данном случае, если самоопыляющаяся линия, полученная способом согласно изобретению, является самораспространяющейся, то пыльца самого растения или той же самой линии может быть скрещена с рыльцем. В конкретном способе, пыльник распустившегося цветка выщипывают пинцетом, и пыльцу опыляют посредством контактирования пыльника с рыльцем. В дополнение к этому, если бумажный пакет для скрещивания надеть на соцветие с распустившимися цветками и применить физические воздействия, такие как постукивание по пакету рукой, то пыльца самого растения будет прикрепляться к рыльцу и будет происходить оплодотворение.

[0120] Кроме того, в случае производства семян в крупных масштабах, самооплодотворенные семена могут быть эффективно получены в больших количествах путем посадки большого количества растений одной и той же линии в изоляционную камеру, в которую доступ насекомых из окружающей среды заблокирован, и опыления насекомыми, а именно медоносными пчелами и т.п.

[0121] В случае, когда в дальнейшем осуществляется крупномасштабное производство семян, самооплодотворенные семена могут быть эффективно получены в больших количествах путем посадки большого количества растений одной линии на открытом воздухе на фермерском угодье, где обеспечивается изоляция на уровне, достаточном для предотвращения неожиданного скрещивания, а также опыление насекомыми, такими как медоносные пчелы и т.п.

[0122] В соответствии с еще одним своим аспектом, настоящее изобретение относится к способу сохранения или размножения родительской линии нужного сорта первого дочернего поколения с применением способа культивирования согласно изобретению.

[0123] Кроме того, в соответствии с еще одним своим аспектом, настоящее изобретение также относится к способу получения семян Brassica oleracea первого дочернего поколения, в котором используется цитоплазматическая мужская стерильность (CMS), при этом, родительская линия первого дочернего поколения размножается с использованием самоопыляющегося растения Brassica oleracea.

[0124] С применением таких способов согласно изобретению можно не проводить (1) стадии, необходимые для устранения SI (опыления бутонов, обработки CO₂, обработки NaCl и т.п.); и (2) стадий разрабртки стратегии размножения (растений для крупномасштабного производства семян и т.п.) с учетом степени SI, что необходимо в традиционных условиях.

[0125] Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением может быть разработан способ селекции в целях получения комбинации родителей для выращивания F1 без необходимости учитывать гаплотипы S между элитными линиями.

[ПРИМЕРЫ]

[0126] Настоящее изобретение будет конкретно описано на нижеследующих примерах, однако, настоящее изобретение не ограничивается этими примерами.

[0127] Пример 1. Поиск фактора самоопыляемости

Для поиска фактора самоопыляемости, в качестве материалов использовали брокколи, капусту кочанную, цветную капусту, китайскую капусту, декоративную капусту и другие дикие виды Brassica oleracea, а также проводили тест на скрещивание и анализ локуса S с помощью маркера, распознающего гаплотип S.

[0128] Исходя из результатов теста на скрещивание путем самоопыления была отобрана самоопыляющаяся линия с чрезвычайно слабой SI или полностью самоопыляющаяся линия.

В качестве маркера, определяющего гаплотип S, анализ на гаплотип S различных линий проводили с использованием известных праймеров, представленных в SEQ ID NO: 3 - SEQ ID NO: 9.

В результате, в большинстве случаев, согласно общепринятому мнению, даже для линий, имеющих один и тот же гаплотип S, факторы, отличающиеся от локуса S, по-видимому, влияют на характер SI или SC (Horisaki et al., 2004 (Непатентный документ 5)).

[0129] С другой стороны, что касается линии «К-3» китайской капусты, линии «Т-16» диких видов Brassica oleracea и линии цветной капусты «CF-33», то было исследовано сегрегированное потомство популяций, полученных путем скрещивания этих линий, и в результате было обнаружено, что любое растение, имеющее такой же гаплотип S, как и эти материалы, имеет стабильный фенотип SC.

Исходя из этого, было высказано предположение, что самоопыляемость этих материалов вызвана потерей функции гена, находящегося в локусе S.

[0130] Для анализа нуклеотидных последовательностей амплифицированных фрагментов ДНК, в качестве праймеров были использованы праймеры для амплификации SLG (гликопротеин локуса S), которые представляют собой один из генов, находящихся в локусе S, а именно, PS5 (SEQ ID NO: 3) и PS15 (SEQ ID NO: 4).

В результате, линия K-3 имела нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 (этот генотип обозначается как «BoS-SC1»), а линии T-16 и CF-33 имели нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2 (этот генотип обозначается как «BoS-SC2»).

[0131] В результате поиска с использованием BLAST на NCBI, нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 1 была зарегистрирована как XM_013734339 (SLG, подобная BoS-13), а нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 2 была зарегистрирована как D85202 (SLG BoS-16).

[0132] Что касается нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 2, то в документе Kusaba et al., (1997) (Непатентный документ 6), эта нуклеотидная последовательность рассматривается как одна из множества аллелей множества генов неспособности к самоопылению, присутствующих у видов Brassica oleracea, однако, в этом документе не указано, что этот аллель обладает признаком самоопыляемости.

[0133] Что касается нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1, то в том же документе, эта нуклеотидная последовательность рассматривается как родственная гену, который, предположительно, представляет собой ген SLG в геноме линии под общим названием: TO1000, и было указано, что эта линия TO1000 является самоопыляющейся, однако, в этом документе не указано, что такая линия обладает самоопыляемостью, вызванной локусом S. Фактически, много раз упоминались случаи, когда даже если линия казалась самоопыляющейся, как описано выше, эта линия имела очень слабую самоопыляемость, а тажке случаи, когда линия приобретала самоопыляемость за счет делеции фактора передачи сигнала, отличающегося от локуса S (M. Kitaura et al., 2007 (Непатентный документ 7) и E. Indriolo, 2012 (Непатентный документ 8)).

Таким образом, исходя их документа Kusaba et al., описанного выше и т.п., было трудно определить, участвует ли локус гена, включающий SEQ ID NO: 1, в сообщении самоопыляемости.

[0134] Таким образом, авторами настоящего изобретения было впервые обнаружено, что, как описано ниже в Примерах 2-6, локусы генов, включающих SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, сами по себе представляют собой локусы генов, сообщающих самоопыляемость, как показали эксперименты по выведению крупномасштабной популяции для возвратного скрещивания и многих поколений.

[0135] Пример 2: Введение гена SC в линию селекции брокколи «BR-9».

Тест на скрещивание проводили с использованием линии «K-3» (гаплотип S представляет собой BoS-SC1, номер доступа FERM BP-22347), которая представляет собой линию китайской капусты, в качестве материала линии с делетированной функцией SI, и с использованием «BR-9» (гаплотип S представляет собой BoS-18), которая представляет собой родительскую линию брокколи, принадлежащую SAKATA SEED CORPORATION, в качестве родительской линии для возвратного скрещивания.

В случае эффективного проведения возвратного скрещивания был проведен анализ ДНК, в основном, с использованием маркера гаплотипа S, после чего были отобраны растения, в которых локус S был гетерозиготным по BoS-SC1/BoS-18, а «BR-9» была подвергнута повторному возвратному скрещиванию с оценкой фенотипа.

[0136] Семена вышеописанной линии китайской капусты «К-3» были помещены на Международный депозит (первоначальное депонирование) 29 сентября 2017 г. Национальным Институтом технологии и оценки, Международным депозитарием патентных организмов (#120, 2-5-8, Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba Prefecture) (указание для идентификации, присвоенное депонентом: K-3, номер доступа No.: FERM BP-22347).

[0137] Сначала скрещивали китайскую капусту «К-3», имеющую BoS-SC1, и брокколи «BR-9», в результате чего получали семена F1, после чего, в течение нескольких лет проводили возвратное скрещивание «BR-9». Для эффективного продолжения возвратного скрещивания был проведен отбор с использованием двадцати видов праймеров RAPD, и были отобраны растения, имеющие генотип, близкий к «BR-9», который был рекуррентным родителем.

В результате были отобраны растения, у которых эти маркеры RAPD точно совпадали с маркерами «BR-9» в поколении BC2F1.

[0138] Семена поколения BC3F1 высевали, отбирали ДНК по локусу S с использованием проростков, после чего проростки высаживали на поле фермы и проводили исследование фенотипа. Значительное число этих отобранных растений созревали раньше, чем BR-9, их соцветия были рыхлыми, а товарная ценность как брокколи была низкой (фиг. 1b).

[0139] Исходя их этих результатов было высказано предположение, что факторы, сообщающие свойства раннего созревания и компактности соцветий, могут находиться в непосредственной близости от гена BoS-SC1, расположенного на хромосоме 6.

[0140] В следующем году были посеяны семена BC4F1 и проведен анализ ДНК на основе маркера гаплотипа S для 1581 проросших растений, а после отбора, проростки были высажены на поле фермы.

Во время появления соцветий были оценены такие фенотипы, как время созревания, компактность соцветий и гладкость, и было отобрано тридцать растений, форма которых была относительно близка к форме «BR-9».

В то же время был проведен анализ генотипирования с использованием ДНК-маркеров, расположенных по обе стороны от области локуса S, BoC6MK1 (проводилась ПЦР на основе SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 11. Этот локус находился на расстоянии 1,1 сМ от локуса S) и BoC6MK2 (была проведена ПЦР на основе SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 13. Этот локус находился на расстоянии 0,3 сМ от локуса S), и четыре растения, у которых маркеры с обеих сторон были заменены маркерами типа «BR-9», можно было выбрать из тридцати растений, для которых проводился фенотипический отбор. Затем от этих растений были получены саморазмножающиеся семена и потомство, культивированное из пыльников или пыльцы.

[0141] Семена потомства выбранного штамма высевали, отбирали растения, у которых локус S стал гомозиготным по BoS-SC1, и полученную таким образом самоопыляющуюся линию «SC-BR-9» культивировали на поле фермы. Как описано выше, исследование фенотипа было проведено в январе, когда распускались бутоны, и у этих растений форма и время созревания были настолько похожи на форму и время созревания родительского растения «BR-9» BC, что эти линии были неразличимы (фиг. 1c и фиг. 2).

[0142] С использованием этой линии, было проведено возвратное скрещивание с получением A-линии CMS «BR-9», а также была получена линия «CMS-SC-BR-9», (номер доступа FERM BP-22349), которая является самоопыляющейся линией цитоплазматической мужской стерильности «SC-BR-9» (фиг. 2).

[0143] Семена вышеописанной линии брокколи «CMS-SC-BR-9» были помещены на Международный депозит (первоначальное депонирование) 29 сентября 2017 г. Национальным Институтом технологии и оценки, Международным депозитарием патентных организмов (#120, 2-5-8, Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba Prefecture) (указание для идентификации, присвоенное депонентом: CMS-SC-BR-9, номер доступа No.: FERM BP-22349).

[0144] Исходя из приведенных выше результатов, даже если локус S был гомозиготным по BoS-SC1, происходящему от китайской капусты, создание самоопыляющейся линии, имеющей высокую товарную ценность как брокколи, было впервые успешным благодаря выбору растения, у которого область генома, находящаяся в непосредственной близости, была рекомбинирована в генотип «BR-9», который был рекуррентным родителем.

[0145] Пример 3: Тест на производство семян с использованием энтомофили самоопыляющейся линии

Тест на производство семян в изоляционной камере был проведен путем опыления насекомыми с использованием «SC-BR-9» (B-линии), которая представляет собой нормальную цитоплазматическую линию, где ген S (BoS-18), изначально принадлежащий «BR-9», был заменен на BoS-SC1, и с использованием «CMS-SC-BR-9» (A-линии), которая представляет собой линию CMS, происходящую от вышеупомянутой линии (фиг. 3).

[0146] Для проведения повторных тестов использовали две изоляционные камеры, после чего культивировали по 24 растения А-линии и В-линии, проводили энтомофильное скрещивание медоносными пчелами и оценивали массу полученных таким образом семян.

Средняя урожайность в первой секции составляла 30,4 г/растение для A-линии и 36,2 г/растение для B-линии, а средняя урожайность во второй секции составляла 35,8 г/растение для A-линии и 29,7 г/растение для B-линии. Таким образом, были получены очень высокие урожаи (Таблица 1).

[0147] При сравнении этих результатов с результатами теста на производство семян для линии «CMS-BR-9», которая представляет собой исходную линию CMS SI, и «BR-9» (гомозиготную по BoS-18), для которой урожайность семян составляла всего 0,02 г/растение для A-линии и 0,61 г/растение для B-линии в среднем для семи растений, разница была очевидной.

На этом примере было подтверждено, что линии, полученные в соответствии с настоящим изобретением, представляли собой линии, имеющие превосходные семенные свойства.

[0148] [Таблица 1]

Изоляционная
камера Линия Число растений Общий выход (г) г/штамм Пояснение Отделение-1 CMS-SC-BR-9 24 729,67 30,4 Линия SC (А-линия) Отделение-1 SC-BR-9 22 795,68 36,17 Линия SC (B-линия) Отделение-2 CMS-SC-BR-9 21 752,72 35,84 Линия SC (А-линия) Отделение-2 SC-BR-9 24 713,26 29,72 Линия SC (B-линия) Отделение-3 CMS-BR-9 7 0,17 0,02 Линия SI (А-линия) Отделение-3 BR-9 7 4,29 0,61 Линия SI (B-линия)

[0149] Пример 4: Введение SC в линию селекции брокколи «BR-6» и выращивание линии CMS из этой линии.

Для другой родительской линии брокколи, «BR-6», была предпринята попытка сообщения самоопыляемости с использованием «Т-16» диких видов Brassica oleracea в качестве донора для фактора самоопыляемости.

[0150] Как описано в Примере 2, возвратное скрещивание «BR-6» было осуществлено с использованием маркера идентификации гаплотипа S и был выбран фенотип, а затем был проведен отбор на основе анализа генотипирования с использованием маркеров в области локуса S, BoC6MK1 (проводилась ПЦР на основе SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 11. Этот локус находился на расстоянии 1,1 сМ от локуса S) и BoC6MK2 (была проведена ПЦР на основе SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 15. Этот локус находился на расстоянии 2,2 сМ от локуса S), и, таким образом, был исследован фенотип полученного поколения BC4F1S1.

В результате стало ясно, что, если локус S был гомозиготным по BoS-SC2, происходящим от «Т-16», и если было отобрано растение, у которого геномная область, находящаяся в непосредственной близости, была рекомбинирована в генотип родительской линии для возвратного скрещивания, «BR-6», то растение продемонстрировало зрелость и имело форму, которые по внешнему виду очень напоминали зрелость и форму BR-6, рекуррентного родителя.

[0151] Тест на производство семян в изоляционной камере проводили (фиг. 4) таким же образом, как и в Примере 3, с использованием «SC-BR-6» (нормальная цитоплазма, B-линия), полученной таким образом, и из A-линии CMS, то есть, «CMS-SC-BR-6» (цитоплазма с мужской стерильностью, A-линия) (номер доступа FERM BP-22348).

[0152] Семена вышеописанной линии брокколи «CMS-SC-BR-6» были помещены на Международный депозит (первоначальное депонирование) 29 сентября 2017 г. Национальным Институтом Технологии и Оценки, Международным депозитарием патентных организмов (#120, 2-5-8, Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba Prefecture) (указание для идентификации, присвоенное депонентом: CMS-SC-BR-6, номер доступа No.: FERM BP-22348). Аналогичным образом, семена линии, для которой указанием для идентификации, присвоенной депонентом, является Milkyway, были помещены на Международный депозит (первоначальное депонирование) 29 сентября 2017 г. Национальным Институтом Технологии и Оценки, Международным депозитарием патентных организмов (#120, 2-5-8, Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba Prefecture) (номер доступа No.: FERM BP-22350).

[0153] Было выращено по четырнадцать растений для каждой A-линии и B-линии, а затем проводили опыление насекомыми, и в среднем, урожай семян соответствующих линий составил 39,5 г/растение для A-линии и 39,8 г/растение для B-линии. Таким образом, было установлено, что эти линии имеют такое свойство, как высокая урожайность семян (Таблица 2).

[0154] Из приведенных выше результатов стало ясно, что даже если локус S является гомозиготным по BoS-SC2, то была получена самоопыляющаяся линия брокколи с высокой товарной стоимостью.

[0155] [Таблица 2]

Изоляционная
камера Линия Число растений Общий выход (г) г/штамм Пояснение Отделение-4 CMS-SC-BR-6 14 553,68 39,55 Линия SC (А-линия) Отделение-4 SC-BR-6 14 557,58 39,83 Линия SC (B-линия) Отделение-5 CMS-BR-6 186 104 0,56 Линия SI (А-линия) Отделение-5 BR-6 190 Данные отсутствуют Данные отсутствуют Линия SI (B-линия)

[0156] Пример 5: Выращивание самоопыляющейся капусты SC (4 линии)

Линия «K-3» (гаплотип S представляет собой BoS-SC1, номер доступа FERM BP-22347), которая является линией китайской капусты, была использована в качестве линии с делетированной функцией SI, и был проведен тест на скрещивание с использованием каждой из линий «CB-20» (капусты Юшена, гаплотип S - BoS-5), «CB-35» (капусты Кангиоку, гаплотип S - BoS-51), «CB-23» (капусты весенней, гаплотип S - BoS-8) и «CB-97» (круглокочанной капусты, гаплотип S - BoS-15), которые представляют собой родительские линии капусты, принадлежащие SAKATA SEED CORPORATION и используются в качестве рекуррентного родителя.

[0157] Для эффективного проведения возвратного скрещивания был проведен анализ ДНК с использованием маркера гаплотипа S, то есть, были выбраны растения, у которых локус S был гетерозиготным по BoS-SC1/BoS-5, BoS-SC1/BoS-51, BoS-SC1/ BoS-8 и BoS-SC1/BoS-15, соответственно, и после оценки фенотипа, «CB-20», «CB-35», «CB-23» и «CB-97» были подвергнуты повторному возвратному скрещиванию.

[0158] Сначала, китайскую капусту «K-3», имеющую BoS-SC1, и каждую из линий капусты «CB-20», «CB-35», «CB-23» и «CB-97» скрещивали для получения семян F1, а затем проводили возвратное скрещивание «CB-20», «CB-35», «CB-23» и «CB-97» с использованием каждой из линий в течение нескольких лет.

[0159] Для эффективного продолжения возвратного скрещивания был проведен отбор с использованием двадцати видов праймеров RAPD, и для каждой из линий возвратного скрещивания были отобраны растения, имеющие генотипы, близкие к «CB-20», «CB-35», «CB-23» и «CB-97», которые представляют собой родительские линии для возвратного скрещивания, соответственно.

[0160] В результате, что касается «CB-20», «CB-35» и «CB-23», то были отобраны растения поколения BC4F1, у которых эти маркеры RAPD точно совпадали с маркерами соответствующих родительских линий для возвратного скрещивания.

Кроме того, что касается CB-97, то были отобраны растения поколения BC4F1, у которых эти маркеры RAPD почти совпадали с маркерами рекуррентного родителя.

[0161] Далее поколения передавались, экспериментальное производство осуществлялось на полях ферм, и было подтверждено, что фенотипы были идентичны фенотипам исходного рекуррентного родителя.

[0162] Для каждой из линий, гомозиготу BoS-SC1 получали в результате самораспространения или из культуры пыльников и культуры пыльцы, и, таким образом, культивирование самоопыляющейся линии капусты впервые было успешным.

[0163] Кроме того, было проведено возвратное скрещивание в соответствующие A-линии (с цитоплазматической мужской стерильностью) «CB-20», «CB-35», «CB-23» и «CB-97», и были также культивированы линии самоопыляющихся растений «SC-CB-20», «SC-CB-35», «SC-CB-23» и «SC-CB-97» и линии с цитоплазматической мужской стерильностью «CMS-SC-CB-20», «CMS-SC-CB-35», «CMS-SC-CB-23» и «CMS-SC-CB-97».

[0164] Пример 6: Селекция отдельных линий капусты SC и проведение теста на скрещивание вручную

Другие селекционные линии капусты были дополнительно скрещены с использованием самоопыляющихся линий капусты, полученных как описано в Примере 5, в качестве SC-доноров, и, таким образом, была выращена капуста, обладающая способностью к самоопылению.

[0165] В качестве примера, скрещивание было достигнуто с использованием «CB-3» (круглокочанной капусты, гаплотип S - BoS-2b) в качестве исходного семенного материала, и с использованием поколения BC5F1 «CB-97» (круглокочанной капусты, гаплотип S - BoS-SC1/BoS-15), обладающего способностью к самоопылению на промежуточной стадии культивирования, описанного в Примере 5, в качестве родительской пыльцы, и были получены семена F1.

[0166] Для эффективного проведения возвратного скрещивания был проведен анализ ДНК с использованием маркера гаплотипа S, а затем были отобраны растения, у которых локус S был гетерозиготным по BoS-SC1/BoS-2b, и «CB-3» подвергали повторному возвратному скрещиванию с оценкой фенотипа.

«CB-3» дополнительно подвергали возвратному скрещиванию с поколением BC4F1 линии «CB-3», имеющей аллель самоопыляемости, и, таким образом, была получена линия капусты «SC-CB-3», обладающиая способностью к самоопылению.

[0167] Вместе с «CB-3», который был рекуррентным родителем из системы SI, в качестве материала использовали только что выведенную самоопыляющуюся «SC-CB-3», и был проведен тест на скрещивание вручную.

Были получены следующиие результаты.

[0168] Соцветия растений семейства Brassicaceae имеют форму, показанную на фиг. 5(A), а раскрытие цветков происходит по порядку от бутонов в нижних положениях.

Что касается такого соцветия, то опыление распустившихся цветков (OFP) и опыление бутонов (BP) проводили в один и тот же день, и, таким образом, проводили анализ на неспособность к самоопылению и на самоопыляемость. Во время опыления бутонов, чашечки и лепестки срезали ножницами, обнажали пестик и тем самым проводили опыление. Скрещенным бутонам и цветкам были присвоены номера в соответствии с правилами, представленными на фиг. 5(A), и по прошествию одного месяца или более после скрещивания и созревания семян, количество развившихся семян в различных положениях на стебле подсчитывали.

[0169] На Фиг. 5(B) представлено состояние семенных стручков через один месяц или более после скрещивания.

У рекуррентного родителя из системы SI в положениях ниже, чем волокно, которое указывало границу OFP/BP во время скрещивания, семена почти не образовывались. С другой стороны, в зоне BP, поскольку ген SI не экспрессировался в рыльце во время скрещивания, можно было подтвердить, что семена были сформированы. И наоборот, в линии, в которую был введен SC, было обнаружено, что большое количество семян образовывалось в зоне BP, а также в зоне OFP.

[0170] На Фиг. 5(C) представлены результаты подсчета количества семян, образовавшихся в каждом из этих стручков.

Как показали результаты, в линии «CB-3», которая является рекуррентным родителем из системы SI, семена почти не образовывались в стручках в зоне OFP, тогда как в зоне BP, семена образовывались на уровне более или менее 10 семян на стручок. С другой стороны, в линии, в которую был введен признак SC, в зоне OFP образовалось от 10 до 20 семян, и было подтверждено, что растению был сообщен признак самоопыляемости.

[0171] Из результатов, описанных выше, был сделан вывод, что для брокколи и капусты коченной, для которых существование самоопыляющихся линий до сих пор не было известно, самоопыляемость может быть сообщена в соответствии с настоящим изобретением, и могут быть выведены линии, обладающие способностью к самоопылению и дающие качественный сельскохозяйственный продукт.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Sakata Seed Corporation

<120> САМООПЫЛЯЮЩЕЕСЯ РАСТЕНИЕ BRASSICA OLERACEA И СПОСОБ ЕГО

ВЫРАЩИВАНИЯ

<130> 800522JP01

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1173

<212> ДНК

<213> Brassica oleracea

<400> 1

tctttctcgt cttgattcta tttcgtcctg tcttttcgat caacattttg tcgtccacag 60

aatctcttac aatctcaggc aacggaacgc ttgtatctcc cggtgatgtc ttcgagctcg 120

gtttcttcag aaccacctca agttctcgtt ggtatctcgg gatatggtac aagaaagtct 180

acttcagaac ctacgtatgg gttgccaaca gagataaccc tctctcccgt tccattggaa 240

ccctcacaat ctccaacatg aacctggtcc tccttgatca ctctaataaa tctgtttggt 300

cgacaaatct tactagagaa aatgagagat ctccggtggt ggcagagctt ctcgctaacg 360

gaaatttcgt gatgcgagac tccaataaca acgacgcaag tggattctta tggcaaagtt 420

tcgatttccc tacagatacc ttgcttccag agatgaagct aggttacaac ctcaaaacag 480

ggctgaacag attccttaca gcatggagaa attcagatga tccctcaagc ggggattact 540

cgtacaagct tgaaaaccga gagcttcctg agttctatct actgaaaagt ggcttccaag 600

tccaccggag cggtccatgg aatggagtcc gatttagtgg cataccagag aaccaaaagt 660

tgagttacat ggtgtacaat ttcacagaga acagtgagga ggtcgcttat acatttcgaa 720

tgaccaacaa cagcttctac tcgagattga aagtaagttc cgacgggtac ttgcagcgac 780

tgacgttgat cccgatatca attgtttgga acttgttctg gtcttcacca gtggatatcc 840

ggtgtgatat gttcagggtt tgtggtcctt acgcttactg tgacgggaac acatcaccgt 900

tgtgtaactg tatccaaggg tttgatccct ggaatttgca gcagtgggat atcggggagc 960

cggcaggtgg gtgtgtaagg aggacgctgc tgagctgcag tggtgatggt tttaccaaga 1020

tgaagaaaat gaagttgcct gacactaggt tggcgattgt tgaccggagt attggtctga 1080

aagaatgtga gaagaggtgc cttagcgact gtaactgtac cgcatttgca aatgcggata 1140

tccggaatgg tggtacgggt tgtgtgattt gga 1173

<210> 2

<211> 1158

<212> ДНК

<213> Brassica oleracea

<400> 2

tctttttggt cttgattcca tttcgtcctg ccttttcgat caacattttg tcgtctacag 60

aatctcttac aatttcaaac aacagaacac ttgtatctcc cggtgatgtc ttcgagctcg 120

gtttcttcag aaccaattca agttctcctt ggtatctcgg gatatggtac aagcaattat 180

ccgacagaac ctatgtatgg gttgccaaca gagatagccc tctctccaac gccattggaa 240

tcctcaaaat ctctggcaat aatcttgtca tccttgatca ttccaataaa tctgtttggt 300

caacgaatat aactagagga aatgatagat ctccggtggt ggcagagctt ctcgctaatg 360

gaaacttcgt gatgcgacac gcaagtggat tcttgtggaa aagtttcgat taccctacag 420

atacattgct tccagagatg aagctgggtt acgacctcaa aacaaggttg aacaggttcc 480

ttatatcatg gagaagttta gatgatccgt caagcgggga ttacttgtac aagctcgaaa 540

accgaaggtt tcctgaattt tatctatcaa gtgggggctt tcaattgtat cggagtggtc 600

catggaatgg agtccgattt agtggcatac cagatgacca aaagttgagt tacatggtgt 660

acaatttcac agagaatagt gaagaagtcg cttatacatt ccgaatgacc aacaacagca 720

tgtactcgag attgacagta aatttcttag gggattttga acgacagacg tggaatccgt 780

cattagggat gtggaacagg ttttgggctt ttccattgga ctcacagtgc gatgcgtacg 840

gagcgtgtgg acctaacgct tactgtgacg tgaacacatc accgatttgt aactgtatcc 900

aagggttcaa tccctcgaat gtgcagcagt gggatcagag agtctggtca ggtgggtgta 960

taaggaggac gaggcttagc tgcagaggag atggttttac caggatgaaa aatatgaagt 1020

tgccagaaac tacgatggct actgtcgacc gcagtattgg tgtgaaagaa tgtgagaaga 1080

ggtgtcttag cgactgtaat tgtaccgcgt ttgcaaatgc ggatatccgg aatggtggga 1140

cgggttgtgt gatttgga 1158

<210> 3

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 3

atgaaaggcg taagaaaaac cta 23

<210> 4

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 4

ccgtgtttta ttttaagaga aagagct 27

<210> 5

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 5

atcgatggga tgaaaaagtc atcg 24

<210> 6

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 6

ctgctgatca tgttctgcct ctgg 24

<210> 7

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 7

caatcccaaa atccgagatc t 21

<210> 8

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 8

atgaaagggg tacagaacat 20

<210> 9

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 9

ctcaagtccc actgctgcgg 20

<210> 10

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 10

agccgttcag agacctttag a 21

<210> 11

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 11

cgttcaggag caaatgcaac 20

<210> 12

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 12

gccaaagaga ggtgacaaat gg 22

<210> 13

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 13

gcatcaatga atactcaaag agca 24

<210> 14

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 14

atcaggccac taggaaacct t 21

<210> 15

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 15

actcatgttc cccgtgtagt t 21

<---

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способному к самоопылению растению Brassica oleracea. Также раскрыты часть указанного растения; семя указанного растения; маркер для детектирования способности к самоопылению растения Brassica oleracea; маркер для проведения анализа генотипа области локуса S растения Brassica oleracea. Раскрыты способ получения указанного растения; способ получения семян указанного растения. Изобретение позволяет эффективно получать способное к самоопылению растение Brassica oleracea. 9 н. и 23 з.п. ф-лы, 7 ил., 2 табл., 6 пр.

1. Способное к самоопылению растение Brassica oleracea, где указанное растение не является цветной капустой и китайской капустой и включает:

ген, расположенный в локусе S способного к самоопылению растения Brassica oleracea, который заменяет ген, находящийся в локусе гена неспособности к самоопылению (локус S) неспособного к самоопылению растения Brassica oleracea, за исключением цветной капусты и китайской капусты.

2. Способное к самоопылению растение Brassica oleracea по п. 1,

которое может быть получено путем скрещивания способного к самоопылению растения Brassica oleracea с неспособным к самоопылению растением Brassica oleracea, за исключением цветной капусты и китайской капусты, и отбора отдельного растения, обладающего способностью к самоопылению, из потомства после скрещивания.

3. Растение Brassica oleracea по п. 1, имеющее любую одну или более ДНК, выбранных из группы, состоящей из следующих (а)-(b) в локусе S:

(а) ДНК, включающей нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2; или

(b) ДНК, включающей нуклеотидную последовательность, имеющую последовательность, которая на 95% или более идентична нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2,

где ДНК участвует в экспрессии способности к самоопылению растения.

4. Растение Brassica oleracea по п. 3, где растение является способным к самоопылению и содержит аллель S, включающий ДНК по пункту (а) или (b), введенную в локус гена неспособности к самоопылению.

5. Растение Brassica oleracea по п. 1, где растение представляет собой брокколи или капусту кочанную.

6. Растение Brassica oleracea по п. 1, где растение имеет локус гена способности к самоопылению «BoS-SC1» в S-локусе, а локус гена «BoS-SC1» включает нуклеотидную последовательность (i) или (ii):

(i) нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1;

(ii) нуклеотидную последовательность, которая на 95% или более идентична нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1.

7. Растение Brassica oleracea по п. 1, где растение имеет локус гена способности к самоопылению «BoS-SC1» в S-локусе, а локус гена «BoS-SC1» присутствует в сорте брокколи, идентифицированной под номером доступа FERM BP-22349.

8. Растение Brassica oleracea по п. 6, где локус гена «BoS-SC1» присутствует в сорте китайской капусты, идентифицированной под номером доступа FERM BP-22347.

9. Растение Brassica oleracea по п. 6, где растение представляет собой брокколи или капусту кочанную.

10. Растение Brassica oleracea по п. 1, где растение не является диким видом Brassica oleracea и растение имеет локус гена способности к самоопылению «BoS-SC2» в локусе S, а локус гена «BoS-SC2» включает нуклеотидную последовательность (I) или (II):

(I) нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2;

(II) нуклеотидную последовательность, которая на 95% или более идентична нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2.

11. Растение Brassica oleracea по п. 10, где растение не является диким видом Brassica oleracea и растение имеет локус гена способности к самоопылению «BoS-SC2» в локусе S, а локус гена «BoS-SC2» присутствует в сорте брокколи, идентифицированной под номером доступа FERM BP-22348.

12. Растение Brassica oleracea по п. 10, где локус гена «BoS-SC2» присутствует в сорте цветной капусты, идентифицированной под номером доступа FERM BP-22350.

13. Растение Brassica oleracea по п. 10, где растение представляет собой брокколи или капусту кочанную.

14. Растение Brassica oleracea по п. 1, где растение представляет собой брокколи, идентифицированную под номером доступа FERM BP-22349.

15. Растение Brassica oleracea по п. 1, где растение представляет собой брокколи, идентифицированную под номером доступа FERM BP-22348.

16. Часть растения по п. 1 для получения растения Brassica oleracea по п. 1, где указанная часть содержит ген, расположенный в локусе S способного к самоопылению растения Brassica oleracea, который заменяет ген, находящийся в локусе гена неспособности к самоопылению (локус S) неспособного к самоопылению растения Brassica oleracea, за исключением цветной капусты и китайской капусты.

17. Семя растения по п. 1 для получения растения Brassica oleracea по п. 1, где указанное семя содержит ген, расположенный в локусе S способного к самоопылению растения Brassica oleracea, который заменяет ген, находящийся в локусе гена неспособности к самоопылению (локус S) неспособного к самоопылению растения Brassica oleracea, за исключением цветной капусты и китайской капусты.

18. Способ получения растения Brassica oleracea по п. 1, где растение не является цветной капустой и китайской капустой,

где указанный способ включает скрещивание способного к самоопылению растения Brassica oleracea с неспособным к самоопылению растением Brassica oleracea, за исключением цветной капусты и китайской капусты, и идентификацию гаплотипа S, и отбор отдельного растения, обладающего способностью к самоопылению, из потомства после скрещивания на основе анализа на генотип с использованием по меньшей мере одного маркера, расположенного по обе стороны от области локуса S.

19. Способ получения способного к самоопылению растения Brassica oleracea по п. 18, где способность к самоопылению способного к самоопылению растения Brassica oleracea ассоциируется с геном, находящимся в локусе гена неспособности к самоопылению (в локусе S).

20. Способ получения способного к самоопылению растения Brassica oleracea по п. 18 или 19, где способное к самоопылению растение Brassica oleracea имеет любую одну или более ДНК, выбранных из группы, состоящей из (a) или (b), в локусе S:

(а) ДНК, включающей нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2;

(b) ДНК, включающей нуклеотидную последовательность, имеющую последовательность, которая на 95% или более идентична нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2,

где ДНК участвует в экспрессии способности к самоопылению растения.

21. Способ получения способного к самоопылению растения Brassica oleracea по любому из пп. 18-20, где выбор способного к самоопылению отдельного растения из потомства после скрещивания включает отбор способного к самоопылению растения исходя из наличия в этом растении ДНК по (а) или (b) по п. 20 в качестве индикатора.

22. Способ получения способного к самоопылению растения Brassica oleracea по любому из пп. 18-21, где способ дополнительно включает определение генотипа с использованием ДНК-маркера, расположенного в области в непосредственной близости к локусу S (от 0 до 4 сМ от локуса S), включая ген, ассоциированный со способностью к самоопылению, и выбор растения, обладающего способностью к самоопылению.

23. Способ получения способного к самоопылению растения Brassica oleracea по любому из пп. 18-22, где способ включает осуществление непрерывного возвратного скрещивания с использованием неспособного к самоопылению растения Brassica oleracea, за исключением цветной капусты и китайской капусты, в качестве родительской линии для возвратного скрещивания.

24. Способ получения способного к самоопылению растения Brassica oleracea по любому из пп. 18-23, где способное к самоопылению растение Brassica oleracea, используемое при скрещивании, представляет собой сорт китайской капусты, идентифицированный под номером доступа FERM BP-22347, сорт брокколи, идентифицированный под номером доступа FERM BP-22349, сорт брокколи, идентифицированный под номером доступа FERM BP-22348, или сорт цветной капусты, идентифицированный под номером доступа FERM BP-22350.

25. Способ получения способного к самоопылению растения Brassica oleracea по любому из пп. 18-24, где способное к самоопылению растение Brassica oleracea представляет собой брокколи или капусту кочанную.

26. Маркер для детектирования способности к самоопылению растения Brassica oleracea по п. 1, включающий нуклеотидную последовательность, выбранную из любой из следующих (A) или (B):

(А) нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2;

(B) нуклеотидной последовательности, которая на 95% или более идентична нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2.

27. Способ получения семян растения Brassica oleracea, где указанный способ включает саморазмножение способного к самоопылению растения Brassica oleracea, полученного способом выращивания по любому из пп. 18-25, и тем самым получение его семян.

28. Способ сохранения или размножения родительской линии подходящей первой дочерней линии поколения с применением способа выращивания по любому из пп. 18-25.

29. Маркер для проведения анализа генотипа области в непосредственной близости от локуса S растения Brassica oleracea, где указанная область имеет любую одну или более нуклеотидных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 10 - SEQ ID No: 15.

30. Способ получения семян первого дочернего поколения Brassica oleracea с использованием цитоплазматической мужской стерильности (CMS), где указанный способ включает:

стадию размножения родительской линии первой дочерней линии поколения с использованием растения Brassica oleracea, способного к самоопылению, согласно любому из пп. 1-15.

31. Способ получения семян по п. 30, где способное к самоопылению растение Brassica oleracea имеет любую одну или более ДНК, выбранных из группы, состоящей из (a) и (b), в локусе S:

(а) ДНК, включающей нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2; или

(b) ДНК, включающей нуклеотидную последовательность, имеющую последовательность, которая на 95% или более идентична нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2,

где ДНК участвует в экспрессии способности к самоопылению растения.

32. Способ получения семян по п. 30 или 31, где ген способности к самоопылению Brassica oleracea присутствует в любых из следующих растений 1) - 6):

1) растение Brassica oleracea, за исключением китайской капусты, где растение имеет локус гена способности к самоопылению «BoS-SC1» в локусе S, а локус гена «BoS-SC1» присутствует в сорте китайской капусты, идентифицированной под номером доступа FERM BP-22347;

2) растение Brassica oleracea, за исключением китайской капусты, где растение имеет локус гена способности к самоопылению «BoS-SC1» в локусе S, а локус гена «BoS-SC1» присутствует в сорте брокколи, идентифицированной под номером доступа FERM BP-22349;

3) растение Brassica oleracea, за исключением цветной капусты и диких видов Brassica oleracea, где растение имеет локус гена способности к самоопылению «BoS-SC2» в локусе S, а локус гена «BoS-SC2» присутствует в сорте цветной капусты, идентифицированной под номером доступа FERM BP-22350;

4) растение Brassica oleracea, за исключением цветной капусты и диких видов Brassica oleracea, где растение имеет локус гена способности к самоопылению «BoS-SC2» в локусе S, а локус гена «BoS-SC2» присутствует в сорте брокколи, идентифицированной под номером доступа FERM BP-22348;

5) брокколи, идентифицированную под номером доступа FERM BP-22349; и

6) брокколи, идентифицированную под номером доступа FERM BP-22348.