Способ дезинфекции поверхностей от Aspergillus niger с помощью деконтаминационного раствора Российский патент 2024 года по МПК A61L2/18 A61L101/22 A61L101/26 A61L101/32 A61L101/36 

Изобретение относится к области медицины, более конкретно к сфере медицинской микологии, и может быть широко использовано для дезинфекции и удаления генома высших плесневых грибов Aspergillus niger на различных поверхностях.

Современное состояние научной проблемы удаления ДНК и ДНК-содержащего биологического материала, а иными словами, дезинфекции и стерилизации в России и мире не решена полностью. Согласно мировой статистике, поражение человека спорами плесневых грибов является огромной проблемой: лишь за год более 6000 человек скончались от мукормикоза, а более 30% пациентов, находящихся на лечении ввиду сниженного иммунитета, скончались от грибковых заболеваний. Однако это зарегистрированные показатели, которые лишь косвенно указывают на реальные последствия инфекций, что дает основание для разработки средства обеспечения биобезопасности населения Российской Федерации.

Aspergillus niger или «Черная плесень» – один из опаснейших представителей плесневых грибов. Плесневые грибы развиваются из спор и постоянно присутствуют в воздухе. По всем современным меркам в чистой комнате находится минимум 500 спор грибов, которые непрерывно участвуют в процессе дыхания человека. Установлено, что споры способны вызывать заболевания и аллергии. Например, 37 млн. людей имеет аллергический ринит, однако причина этого заболевания сезонные плесневые грибы. Если у человека ослаблен иммунитет, то колонии начинают активно размножаться, что может привести к летальному исходу [Баязитова А.А., Глушко Н.И., Лисовская С.А. [и др.] Аллергены Aspergillus niger и Aspergillus fumigatus // Практическая медицина. – 2016. – № 3 (95). – C. 73-76].

Аспергиллы встречаются в природе повсеместно во всех странах мира, предпочитая темные и влажные места, а также хлебобулочные изделия. Внешние характеристики: темный или черный цвет, пушистая текстура, большая скорость распространения.

Впервые заболевание, вызванное этим грибом, было описано в 1856 году Р.Л.К. Вирховым и названо аспергиллез [Schuster E.,·Dunn-Coleman N.,·Frisvad J.C., van Dijck P.W.M. On the safety of Aspergillus niger – a review //Applied microbiology and biotechnology. – 2002. – Vol. 59. – P. 426-435]. При попадании спор аспергилл воздушно-капельным путем в организм человека происходит заражение. Реже споры попадают в организм через поврежденную кожу и слизистую. Наиболее распространенные симптомы – это кашель, астма, зуд кожных и слизистых покровов, насморк, головная боль, также отмечают проблемы желудочно-кишечного тракта. Однако стоит отметить, что зачастую человек не знает, что его системы органов уже серьезно поражены и болезнь может протекать незаметно несколько лет. Важно упомянуть, что если у человека уже есть хронические заболевания дыхательной системы (астма, рак легких, бронхит, ринит и т.д.), разные виды аллергии, а также иммунные отклонения, то аспергиллёз в разы осложняет их протекание.

Заболевание не передается от индивидуума к индивидууму. Зачастую поражается дыхательная система. В легких грибы формируют аспергилломы, которые представляют собой плотные сплетения аспергилл. Образования похожи на опухоль и могут быть диагносцированы как рак легкого [Schuster E.,·Dunn-Coleman N.,·Frisvad J.C., van Dijck P.W.M. On the safety of Aspergillus niger – a review //Applied microbiology and biotechnology. – 2002. – Vol. 59. – P. 426-435; Баязитова А.А., Глушко Н.И., Лисовская С.А. [и др.] Аллергены Aspergillus niger и Aspergillus fumigatus // Практическая медицина. – 2016. – № 3 (95). – C. 73-76].

На сегодняшний день дезинфекция плесневых грибов до сих пор не решенная проблема ввиду сложностей, таких как большое количество спор в воздухе, которые сложно обработать однократным местным применением средства, а также особенности клеточной стенки грибов.

Загрязнение спорами и возникновение роста плесневых грибов является актуальной и серьезной проблемой не только в быту, но в особенности в медицинских учреждениях, лабораториях. В связи с эпидемиологической ситуацией в стране и в мире, а также появлением новых штаммов возбудителей различных инфекции и новых заболеваний, необходимость в эффективной деконтаминации и дезинфекции возросла.

Наиболее распространенные компоненты, показавшие свою эффективность против плесневых грибов, это средства на основе хлора, перекиси водорода, спирта, а также антисептические грунтовки [Schuster E.,·Dunn-Coleman N.,·Frisvad J.C., van Dijck P.W.M. On the safety of Aspergillus niger – a review //Applied microbiology and biotechnology. – 2002. – Vol. 59. – P. 426-435; Abed A. R., Hussein I. M. In vitro study of antibacterial and antifungal activity of some common antiseptics and disinfectants agents // Kufa Journal for Veterinary Medical Sciences. – 2016. – Vol. 7, N 1B. – P. 148-159]. Однако общими рекомендациями является вызов специализированной службы и обработка помещения фунгицидами, что может быть невозможно в социальных помещениях: детских садах, больницах, детских лагерях, а также жилых помещениях.

Применение деконтаминационных средств направлено на удаление загрязнений биологического происхождения и предупреждение их вторичного переноса. Большинство таких агентов представлено в форме растворов, которые просты в применении и не требуют особых условий хранения. В качестве дезактивирующего агента чаще всего используются ионы металлов, в основном соли железа, и перекись водорода. По результатам различных исследований показано использование Sodium dodecyl sulfate (SDS), бензоата натрия и пероксида водорода как дезактивирующего агента [Schraufstätter I., Hyslop P.A., Jackson J.H. [et al.] Oxidant-induced DNA damage of target cells // The Journal of clinical investigation. – 1988. – Vol. 82, N 3. – P. 1040-1050; Gutteridge J.M.C. Ferrous-salt-promoted damage to deoxyribose and benzoate. The increased effectiveness of hydroxyl-radical scavengers in the presence of EDTA // Biochemical journal. – 1987. – Vol. 243, N 3. – P. 709-714]. В лабораториях, где исследуются нуклеиновые кислоты, с целью деконтаминации широко используются растворы DNARid (Биомедицинские инновации, Россия), DNA-ExitusPlus (PanReac AppliChem, США), а также коммерческий раствор «Белизна», разбавленный в 10 раз, содержащий 7 мМ гипохлорита натрия (NaOCl). Действие этих средств направлено на деградацию свободных молекул нуклеиновых кислот. Однако в окружающей среде генетический материал плесневых грибов находится в спорах – клетках, покрытых плотной оболочкой. Поэтому для разрушения генома грибов в составе деконтаминирующего раствора должны быть компоненты, способные разрушать мембраны клеток.

Известны различные способы деконтаминации объектов биологического происхождения. В частности, известен способ по патенту US8765652 (МПК C11D 3/20; C11D 3/39; C09K 3/00) на изобретение, в котором раскрыто применение перекиси водорода и ионов металлов, таких как, например, ионы меди, кобальта, железа в качестве дезактивирующего агента. Соединения, которые не были эффективными в конкретных условиях экспериментов, включают только 15% пероксида; перекись + ионы калия, натрия или железа; 5 мМ бром- или хлоргидантоин и KMnO₄. В данном патенте концентрация компонентов: SDS от 0,005 до 1%, сульфат меди (II) (CuSO₄) от 0,1 до 5 мМ, пероксида водорода (Н₂О₂) от 0,5 до 30%, при этом такая концентрация Н₂О₂ может иметь негативный эффект при деконтаминации объектов биологического происхождения. В данном патенте не раскрыто влияние состава химических композиций на клетки, а указано только воздействие на молекулы нуклеиновых кислот относительно растворов коммерческой «Белизны».

Также известен способ по патенту US9371556 (МПК C12Q 1/68; A61L 2/18; C11D 3/395), относящейся к реагентам для дезактивации нуклеиновых кислот и способам их получения и использования, обозначены следующие компоненты: соотношение CuSO₄/Н₂О₂ (2 мМ/3%), соотношение CuSO₄/Н₂О₂ (1 мМ/3%). Однако в данной работе не указано влияние композиций на РНК- и ДНК-содержащий биологический материал, а также воздействие на клетки. По результатам исследований ряда авторов раскрыт модифицированный метод экстракции нуклеиновых кислот на основе SDS для получения высококачественных препаратов. При этом концентрация SDS 20%, Tris-буфер 100 мМ. Также известно, что перекись водорода высвобождает гидроксильные свободные радикалы (•OH) при окислении Cu (I) до Cu (II) посредством реакции типа Фентона, вызывающие повреждение молекул нуклеиновых кислот, объясняя взаимное использование сульфата меди и пероксида водорода в соотношении CuSO₄/Н₂О₂ (5 мМ /не указана) [Natarajan V.P., Zhang X., Morono Y. [et al.] A modified SDS-based DNA extraction method for high quality environmental DNA from seafloor environments // Frontiers in microbiology. – 2016. – Vol. 7. – P. 986; Chattopadhyay D., Somaiah A., Raghunathan D., Thirumurugan K. Dichotomous effect of caffeine, curcumin, and naringenin on genomic DNA of normal and diabetic subjects // Scientifica. – 2014. – Vol. 2014. – 7 p].

Наиболее близким по совокупности существенных признаков аналогом (прототипом) является «Композиция для удаления ДНК и/или РНК-содержащего биологического материала (варианты)» по патенту РФ № 2789387 на изобретение (МПК A61L 2/18, A61L 101/26, A61L 101/28, A61L 101/22, A61L 101/32). Группа изобретений относится к жидким композициям, предназначенным для удаления ДНК- и РНК-содержащего биологического материала на поверхности объектов неорганического и органического происхождения. Раскрыты композиции (варианты) для удаления ДНК и/или РНК-содержащего биологического материала в виде смеси двух растворов: деконтаминационного раствора-1 (ДКР-1) и деконтаминационного раствора-2 (ДКР-2) в соотношении от 1:1 до 35:1, где ДКР-1 может содержать Додецилсульфат натрия (Sodium dodecyl sulfate, SDS), пентагидрат сульфата меди (II) (CuSO₄×5H₂O), гептагидрат сульфата железа (II) (FeSO₄×7H₂O), Трис (гидроксиметил) аминометан (Трис, (HOCH₂)₃CNH₂), глицерин, деионизованную воду, а ДКР-2 содержит пероксид водорода (H₂O₂), бензоат натрия (C₆H₅COONa) и деионизованную воду. Группа изобретений обеспечивает удаление нуклеиновых кислот и разрушение клеточных мембран на поверхности объектов неорганического и органического происхождения, включая костный материал, в лабораторных условиях. Данные жидкостные композиции обладали деконтаминационным воздействием на клеточные культуры, ампликоны, костный материал, а также нуклеиновые кислоты, включая генетический материал возбудителя новой коронавирусной инфекции SARS-CoV-2. Однако фунгицидное действие данных растворов в отношении Aspergillus niger не установлено.

Задача заявленного изобретения состояла в разработке эффективного способа деконтаминационной обработки различных поверхностей, содержащих колонии и споры высших плесневых грибов Aspergillus niger. Техническим результатом заявленного изобретения является создание способа, позволяющего избавиться от клеток и генома высших плесневых грибов Aspergillus niger при помощи деконтаминационного раствора.

Сущность изобретения заключается в том, что способ дезинфекции поверхностей от Aspergillus niger с помощью деконтаминационного раствора, включает последовательное нанесение на поверхность в равных объемах компонента 1 и компонента 2, причём компонент 1 деконтаминационный раствор-1, ДКР-1 включает: 0,5-2% Додецилсульфата натрия, 1-5 мМ пентагидрата сульфата меди (II) (CuSO₄×5H₂O), деионизованная вода – остальное, компонент 2 деконтаминационный раствор-2, ДКР-2 включает: 0,1-3% пероксида водорода (Н₂О₂) и 0,01-0,1% бензоата натрия (C₆H₅COONa), деионизованная вода – остальное, далее выдерживают по меньшей мере 15 минут и протирают обработанную поверхность. Причем ДКР-1 содержит: 100 мг Додецилсульфата натрия, 12,5 мг пентагидрата сульфата меди (II) (CuSO₄×5H₂O), до 10 мл стерильной деионизованной водой. А ДКР-2 содержит: 660 мкл 30% водного раствора пероксида водорода (Н₂О₂), 5 мг бензоата натрия (C₆H₅COONa), до 10 мл стерильной деионизованной водой.

Изобретение поясняется чертежами, где:

на фиг. 1 показан рост Aspergillus niger в контроле без обработки деконтаминационным раствором (разведение 1:10);

на фиг. 2 показан рост Aspergillus niger после обработки деконтаминационным раствором (без разведения);

на фиг. 3 представлены результаты амплификации Aspergillus niger в контроле без обработки дезинфицирующими реагентами;

на фиг. 4 показаны результаты электрофореза в 2% геле агарозы контрольных образцов Aspergillus niger без обработки дезинфицирующими реагентами: родоспецифичные праймеры A. niger BENA F337_R422 (пробы 1, 2) и A. niger BENA F237_R356 (пробы 3, 4);

на фиг. 5 представлены результаты амплификации Aspergillus niger: наличие ПЦР-продукта в пробах без обработки дезинфицирующими реагентами (А), отсутствие ПЦР-продукта в пробах после обработки «ДКР» (Б);

на фиг. 6 показаны результаты электрофореза в 2% геле агарозы образцов Aspergillus niger после обработки дезинфицирующими реагентами.

Способ удаления клеток и генома высших плесневых грибов Aspergillus niger в составе их колоний и спор, находящихся на различных поверхностях, с помощью «ДКР» заключается в последовательном нанесении в равном объеме компонента 1 и компонента 2 «ДКР» в виде спрея на поверхность колонии плесневых грибов, их инкубировании в течение 15 минут при комнатной температуре (22-25^оС) и последующем механическом удалении биологического материала путем протирания чистой салфеткой (тканевой или бумажной), смоченной водой. Причем в заявленном способе в качестве «ДКР» применена жидкая композиция, содержащая компонент 1 (деконтаминационный раствор-1, ДКР-1): 0,5-2% Додецилсульфата натрия (Sodium dodecyl sulfate, SDS), 1-5 мМ пентагидрата сульфата меди (II) (CuSO₄×5H₂O), деионизованная вода – остальное и компонент 2 (деконтаминационный раствор-2, ДКР-2): 0,1-3% пероксида водорода (Н₂О₂) и 0,01-0,1% бензоата натрия (C₆H₅COONa), деионизованная вода – остальное. Например, смесь ДКР-1: 100 мг Додецилсульфата натрия, 12,5 мг пентагидрата сульфата меди (II), доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой, и ДКР-2: 660 мкл 30% водного раствора пероксида водорода (Н₂О₂) и 5 мг бензоата натрия (C₆H₅COONa), доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой. Знак «%» в настоящем изобретении означает процентное содержание по массе указанного компонента в указанном растворе. 0,5-2% Додецилсульфат натрия (Sodium dodecyl sulfate, SDS) представляет собой наиболее мощный детергент, приводящий к разрушению клеточных структур и высвобождению нуклеиновых кислот. В состав композиции входит 1-5 мМ пентагидрата сульфата меди (II) (CuSO₄×5H₂O). Установлено, что ионы меди вызывают инактивирующий эффект и повреждения молекул нуклеиновых кислот. С другой стороны, окислительно-восстановительные свойства меди могут также вызвать повреждение клеток, что позволяет отнести медь к эффективному деконтаминирующему реагенту. Кроме того, использование меди как деактивирующего иона, вместо ионов железа, повышает стойкость и срок хранения раствора [De Benedictis P., Beato M.S., Capua I. Inactivation of avian influenza viruses by chemical agents and physical conditions: a review // Zoonoses and public health. – 2007. – Vol. 54, N 2. – P. 51-68; Steuer P., Tejeda C., Martinez O. [et al.] Effectiveness of copper ions against Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis and bacterial communities in naturally contaminated raw cow’s milk // Journal of applied microbiology. – 2021. – Vol. 131, N 1. – P. 146-154]. Пероксид водорода (Н₂О₂) 0,1-3%, входящий в состав второго компонента деконтаминационного раствора, является мощным деактивирующим агентом молекул нуклеиновых кислот, а также способствует разрушению мембран клеток [Schraufstätter I., Hyslop P.A., Jackson J. H., Cochrane C.G. Oxidant-induced DNA damage of target cells // The Journal of clinical investigation. – 1988. – V. 82, N 3. – P. 1040-1050]. Бензоат натрия (C₆H₅COONa), являющийся консервантом, позволяет увеличить срок хранения раствора пероксида водорода. Во втором компоненте деконтаминационного раствора его концентрация составляет 0,01-0,1%.

Предлагаемая методика удаления клеток и генома высших плесневых грибов Aspergillus niger в составе их колоний и спор, находящихся на различных поверхностях, с помощью двухкомпонентного «ДКР», представляет собой:

(I) равномерное нанесение при помощи пульверизатора ДКР-1 в виде спрея на всю зону роста колонии плесневых грибов Aspergillus niger с охватом прилегающей к зоне роста поверхности на ширину до 2 см.

(II) равномерное нанесение при помощи пульверизатора ДКР-2 в виде спрея на всю зону роста колонии плесневых грибов Aspergillus niger с охватом прилегающей к зоне роста поверхности на ширину до 2 см.

(III) смешивание «ДКР» и колонии плесневых грибов Aspergillus niger по настоящему изобретению в соотношении 1:1.

(IV) экспозиция обработанной поверхности с «ДКР» в течение 15 минут при комнатной температуре (22-25^оС).

(V) соотношение ДКР-1 к ДКР-2 составляет 1:1.

(VI) механическое удаление биологического материала путем протирания чистой салфеткой (тканевой или бумажной), смоченной водой.

Пример 1.

Исследовано дезинфицирующее действие деконтаминационного раствора «ДКР» [патент на изобретение RU2789387] в отношении плесневых грибов Aspergillus niger.

Грибы Aspergillus niger выращивали на сусло-агаре в течение 5 суток до достижения полной споруляции. Споры смывали с поверхности среды стерильным физиологическим раствором, плотность суспензии спор доводили до 10⁶ КОЕ/мл с применением учета в камере Горяева и разбавления.

Суспензии тест-организмов заливали в стерильные чашки Петри и выдерживали 15 минут для закрепления на поверхности стекла. После этого суспензии сливали в сброс, а донышки чашек переворачивали и оставляли в приоткрытом состоянии до полного высыхания в стерильном боксе при комнатной температуре в течение 2 часов. Тест-организмом были заражены контрольные чашки без обработки и с обработкой «ДКР» в 6 параллелях.

На высохших донышках чашек Петри, зараженных тест-организмом, с помощью миллиметровой бумаги расчерчивали квадраты площадью 25 см².

Затем с контрольных чашек с помощью стерильного тупфера, содержащего физиологический раствор, производили смыв. Для этого ватную палочку, смоченную в физиологическом растворе, извлекали из пробирки-тупфера и проводили штрих по всей площади квадрата от левого к правому краю. Затем палочку возвращали в пробирку-тупфер и интенсивно встряхивали для смыва клеток физиологическим раствором. Затем чашку поворачивали на 90 градусов и операцию повторяли. Затем чашку поворачивали на 90 градусов и выполняли последний смыв. Таким образом, достигали максимально полного смыва с фиксированной площади поверхности.

Смыв Aspergillus niger с каждой чашки разводили стерильной водой в соотношении 1:10 и 50 мкл разведения высевалось на поверхность среды Чапека с добавлением 0,3% Triton X-100 в двукратной повторности. Чашки помещали в термостат и инкубировали трое суток.

Опытные чашки последовательно обрабатывали «ДКР», нанося его в виде спрея в объеме 25 мл (по 12,5 мл ДКР-1 и ДКР-2), и выдерживали в таком состоянии в течение 15 минут. Затем избыток дезинфицирующей смеси сливали, а с квадрата производили смыв аналогично контрольным чашкам. Однако при этом посев производили из физиологического раствора в тупфере без дополнительного разведения, по 50 мкл на чашку. Инкубацию чашек производили аналогично. Результаты расчетов с указанием данных в колониеобразующих единицах (КОЕ) представлены в таблице 1.

Таблица 1.

Дезинфицирующее действие «ДКР» в отношении Aspergillus niger

Колония Aspergillus niger без обработки «ДКР» (контроль), (КОЕ) Колония Aspergillus niger с обработкой «ДКР», (КОЕ) 2,3±2,4×10³ 5,5±8,7×10¹

Согласно полученным данным обработка ДКР колоний Aspergillus niger приводит к значительному снижению их количества на 2 порядка, что также наглядно отображают фотоснимки колоний на чашках Петри (фиг. 1, 2).

Пример 2.

Проводили сравнительное исследование влияния двухкомпонентного деконтаминационного раствора «ДКР» [патент на изобретение RU2789387] на клетки и геном высших плесневых грибов Aspergillus niger и коммерческих дезинфицирующих средств: DNARid (Биомедицинские инновации, Россия), DNA-ExitusPlus (PanReac AppliChem, США), а также разбавленного в 10 раз коммерческого раствора «Белизна», содержащего 7 мМ гипохлорита натрия (NaOCl).

Испытания смывов споровых грибов Aspergillus niger после деконтаминационной обработки «ДКР» (ДКР-1 и ДКР-2) и популярными средствами со схожими техническими параметрами осуществляли в стерильном микробиологическом боксе. В чашки Петри были равномерно нанесены заранее подготовленные колонии черной плесени Aspergillus niger. После нанесения контаминирующего агента в чашку Петри были внесены средства для дезинфекции по 100 мкл каждого средства согласно инструкции пользователя:

1. ДКР-1 и ДКР-2 + Aspergillus niger

2. ДКР-1 и ДКР-2 +H₂O + Aspergillus niger

3. DNArid + Aspergillus niger

4. DNA-ExitusPlus + Aspergillus niger

5. 7мМ водный раствор коммерческого гипохлорита натрия (разбавленная в 10 раз «Белизна») + Aspergillus niger

6. H₂O + Aspergillus niger (положительный контроль)

Инкубацию проводили в соответствии с инструкциями для пользователей, при обработке «ДКР» инкубация длилась 15 минут при комнатной температуре.

Далее с помощью стерильных тупферов проводили смыв каждой полученной смеси Aspergillus niger с дезинфицирующим средством. Во втором случае после обработки опытными образцами ДКР-1 и ДКР-2 проводили повторный смыв водой (пробы обозначены «ДКР-1 и ДКР-2 +H₂O + Aspergillus niger»). При этом поверхность смыва не была физически удалена от контаминирующего агента, лишь место смыва было повторно обработано водой и полученная смесь ДКР-1 и ДКР-2 + H₂O + Aspergillus niger подвергалась дальнейшему анализу. Каждый образец исследовали в 5 повторностях.

Полученные после инкубации пробы подвергли трехдневному лизису и разрушению клеточных мембран. Лизис осуществляли путем добавления к каждой пробе 5 мл модифицированного лизирующего раствора (121 мг Трис, 2 мл 0,5 М ЭДТА, 373 мг KCl, 500 мкл Твин 20), 150 мкл Протеиназы K и 150 мкл дитиотреитола. Пробы были помещены на –70°C в течение 4 часов, затем на 46°C в течение 6 часов, –70°C ночь, 46°C в течение 7 часов, –70°C 4 часа, 46°C ночь и при помощи циклов «замораживания/оттаивания» была разрушена клеточная стенка, что позволило продолжать дальнейшее выделение ДНК из образцов. Размораживание и замораживание образцов длилось 84 часа (3,5 суток).

Выделение ДНК проводилось путем органической экстракции (фенол/хлороформ/изоамиловый спирт в соотношении 25/24/1) [Корниенко И.В, Харламов С.Г. Методы исследования ДНК человека: выделение ДНК, ее качественная и количественная оценка в аспекте судебно-медицинского исследования вещественных доказательств биологического происхождения. – Ростов н/Д.: Изд-во ЮФУ, 2012. – 216 с.; Natarajan V.P., Zhang X., Morono Y. [et al.] A modified SDS-based DNA extraction method for high quality environmental DNA from seafloor environments // Frontiers in microbiology. – 2016. – Vol. 7. – P. 986]:

1. Лизат центрифугировали при 1000 g в течение 2 минут при помощи центрифуги Harmle Labortechnik GmbH Z300K (Германия).

2. Вносили по 5 мл смеси фенол/хлороформным/изоамиловый спирт (25/24/1). Смесь интенсивно перемешивали на вортексе в течение 40 секунд, затем центрифугировали 8 минут с ускорением 3750 g.

3. Верхнюю водную фазу, не захватывая нижний слой фенол/хлороформ/изоамилол, межфазный слой и неосевшие частицы, переносили в новые 15 мл пробирки типа «Costar», в которые предварительно внесли по 5 мл смеси фенол/хлороформ/изоамиловый спирт (25/24/1). Смесь интенсивно перемешивали на вортексе в течение 40 секунд, затем центрифугировали 8 минут с ускорением 3750 g.

4. Верхнюю водную фазу, не захватывая нижний слой фенол/хлороформа, межфазный слой и неосевшие частицы, переносили в новые 15 мл пробирки типа «Costar», в которые предварительно внесли по 4,2 мл хлороформа. Смесь интенсивно перемешивали на вортексе в течение 40 секунд, затем центрифугировали 8 минут со скоростью 3750 g.

5. Верхнюю водную фазу, не захватывая нижний слой хлороформа, межфазный слой и неосевшие частицы, переносили в устройство «Amicon Ultra-4, ultracel30k» для дополнительной очистки и концентрации ДНК, куда предварительно добавили 400 мкл стерильной дионизованной воды. «Amicon Ultra-4, ultracel30k» центрифугировали при 2750 g в течение 35 минут. Полученный фильтрат удаляли.

6. Очистку деонизованной водой проводили дважды. Для этого в устройство «Amicon Ultra-4, ultracel30k» добавляли по 3950 мкл деионизованной воды, пипетировали и центрифугировали колонки при 2750 g в течение 35 минут. Полученный фильтрат удаляли.

7. Очистку TE-буфером (10 мМ Трис-HCl, 1мМ ЭДТА), проводили один раз. Для этого в устройство «Amicon Ultra-4, ultracel30k» добавляли по 3900 мкл TE-буфера и центрифугировали колонки при 2750 g в течение 35 минут.

8. Полученные препараты ДНК объемом 60-100 мкл переносили в отдельные стерильные пробирки типа «Эппендорф» для дальнейшего исследования. Недлительное хранение препаратов с выделенной ДНК осуществляется при 4-6°C. Экстракцию ДНК проводили в 20 независимых параллелях.

Для дальнейшей работы была оценена концентрация и качество (содержание иных соединений кроме нуклеиновых кислот и других ингибиторов) исходной ДНК исследуемых образцов: отношение спектров поглощения 260нм/280нм в среднем характеризует пригодную для дальнейших исследований ДНК. Измерения производились в 5 повторностях про помощи NanoDrop 1000 (ND Technologies, США). Количественная оценка выделенной ДНК проводилась в 5 повторностях при помощи прибора QuantiFluor-P (Promega Corporation, США). Полученные результаты отражены в таблице 2.

Таблица 2.

Количественная и качественная оценка выделенной ДНК Aspergillus niger после деконтаминационной обработки

Обработка
Aspergillus niger Концентрация ДНК, нг/мкл
(среднее значение) Спектры поглощения 260нм/280нм
(среднее значение) ДКР-1 и ДКР-2 0,04 0,5 ДКР-1 и ДКР-2 + H₂O 0,003 отсутствие пика DNArid 5,1 1,8 DNA-ExitusPlus 6,0 1,2 7мМ водный раствор коммерческого NaOCl (разбавленная в 10 раз «Белизна») 8,1 1,5 H₂O (положительный контроль) 8,4 1,8

Для дальнейшей работы с помощью биоинформатических методов анализа генетических последовательностей в программе Primer-BLAST, интегрированной в базу данных NCBI, были подобраны 2 пары родоспецифичных праймеров для определения деконтаминационного эффекта опытных образцов на Aspergillus niger (таблица 3).

Таблица 3.

Родоспецифичные праймеры для исследования Aspergillus niger

№ Название Последовательность Шкала 1 A. niger_BENA_F337 CGGACCTTGGCTTTTTCACG 0,04 2 A. niger_BENA_R422 GACGGCACGAGGAACATACT 0,04 3 A. niger_BENA_F237 GGCAAAGGGTTGGGTCTTCT 0,04 4 A. niger_BENA_R356 CGTGAAAAAGCCAAGGTCCG 0,04

Подобранные с помощью базы данных последовательности изначально были отработаны на положительном контроле, были выбраны оптимальные условия полимеразной цепной реакции в режиме «реального времени» (ПЦР-РВ).

В результате был определен протокол для проведения успешной амплификации генетического материала Aspergillus niger:

Цикл 1: (1×)

Шаг 1: 95,0°C в течение 03:00

Цикл 2: (40×)

Шаг 1: 95,0°C в течение 00:15. Шаг 2: 55,0°C в течение 00:20. Шаг 3: 72,0°C в течение 00:30.

Цикл 3: (71×)

Шаг 1: 60,0°C-95,0°C в течение 00:10.

Увеличение заданной температуры происходило после 2 цикла на 0,5°C.

Далее осуществляли отбор наиболее подходящей пары праймеров для анализа деконтаминационного эффекта на представителя плесневых грибов Aspergillus niger. Праймеры оценивали путем подбора оптимальной конечной концентрации.

Компоненты ПЦР-смеси были разделены на 2 пробирки типа Эппендорф, смеси отличались затравками:

A. niger BENA F337_R422 в концентрации 1 оптическая единица.

A. niger BENA F237_R356 в концентрации 1 оптическая единица.

Детекция происходила при помощи термоциклера с мультиканальным детектором для оценки ампликонов ПЦР-РВ iQ5 (Bio-Rad, США) и набора реагентов «EVA Green» (Синтол, Россия).

График амплификации плесневого гриба в положительном контроле (фиг. 3), то есть смыва H₂O + Aspergillus niger, демонстрирует успешное выделение генетического материала Aspergillus niger. Экстрагированная ДНК имеет активную матрицу, поскольку выход продуктов амплификации осуществляется в среднем на 22 цикле проведения реакции.

Полученные ампликоны были проанализированы при помощи 2% агарозного геля и однократного ТВЕ буфера для качественного определения их размера. Условия проведения гель электрофореза: 120 V – 5 минут, 100 V – 15 минут. Детекция полученных данных осуществлялась при помощи системы гель-документирования Gel Doc XR+ (Bio-Rad, США). Результаты отражены на фиг. 4.

Таким образом, модельный объект Aspergillus niger экстрагирован, а генетический материал соответствует стандарту для проведения дальнейших молекулярно-генетических испытаний опытных образцов. Исходя из полученных данных при отработке проведения ПЦР-РВ, принято решение использовать пару праймеров A. niger BENA F337_R422, поскольку размер соответствует целевому участку исследуемого гена, а также не имеет побочных продуктов, в отличие от A. niger BENA F237_R356, что показано на фиг. 4.

Далее генетический материал после обработки различными дезинфицирующими средствами (DNArid, DNA-ExitusPlus, 7мМ водным раствором коммерческого NaOCl (разбавленная в 10 раз «Белизна»), H₂O) и «ДКР» был амплифицирован с помощью отработанной методики. ПЦР проводилась в 3 независимых параллелях. Результаты отражены в таблицах 4, 5 и на фиг. 5.

Таблица 4.

Результаты амплификации Aspergillus niger после обработки «ДКР» и коммерческими аналогами по гену β-актина (флуорофор FAM)

№ Образец Параллель Пороговый цикл ПЦР (Ct) 1 ДКР-1 и ДКР-2 + A. niger 1 30,55 2 ДКР-1 и ДКР-2 + A. niger 2 30,68 3 ДКР-1 и ДКР-2 + A. niger 3 30,65 4 ДКР-1 и ДКР-2 + H₂O + A. niger 1 N/A 5 ДКР-1 и ДКР-2 + H₂O + A. niger 2 N/A 6 ДКР-1 и ДКР-2 + H₂O + A. niger 3 N/A 7 DNArid + A. niger 1 28,44 8 DNArid + A. niger 2 27,79 9 DNArid + A. niger 3 28,03 10 DNA-ExitusPlus + A. niger 1 N/A 11 DNA-ExitusPlus + A. niger 2 N/A 12 DNA-ExitusPlus + A. niger 3 N/A 13 7мМ водный раствор коммерческого NaOCl (разбавленная в 10 раз «Белизна») + A. niger 1 30,70 14 7мМ водный раствор коммерческого NaOCl (разбавленная в 10 раз «Белизна»)) + A. niger 2 N/A 15 7мМ водный раствор коммерческого NaOCl (разбавленная в 10 раз «Белизна») + A. niger 3 27,71 16 Н₂О + A. niger 1 22,88 17 Н₂О + A. niger 2 22,84 18 Н₂О + A. niger 3 22,76 19 K- (отрицательный контроль) 1 N/A

Примечания: «N/A» – отсутствие продукта амплификации (00,00); «Н₂О + A. niger» – положительный контрольный образец; «K-» – отрицательный контрольный образец.

Таблица 5.

Деградация генетического материала плесневого гриба Aspergillus niger в смывах под воздействием деконтаминирующих растворов

№ Образец ΔCt D 1 ДКР-1 и ДКР-2 + A. niger 7,7 207,9 2 ДКР-1 и ДКР-2 + H₂O + A. niger 22,8 7,3×10⁶ 3 DNArid + A. niger 2,5 5,6 4 DNA-ExitusPlus + A. niger 22,8 7,3×10⁶ 5 7мМ водный раствор коммерческого NaOCl (разбавленная в 10 раз «Белизна») + A. niger 3,4 10,5

Примечания: D – степень деградации ДНК Aspergillus niger, рассчитанная по формуле: D = 2^ΔCt; ΔCt – разница между пороговыми циклами контрольных и опытных образцов.

Значение эффективности ПЦР принимали за 1. Соответственно количественные значения деградации генетического материала Aspergillus niger под воздействием деконтаминирующих растворов рассчитывали по формуле:

D = (1+E)^ΔCt = (1+1)^ΔCt = 2^ΔCt, где

D – степень деградации ДНК Aspergillus niger (во сколько раз количество ДНК Aspergillus niger уменьшается под воздействием деконтаминационных растворов, обозначенных ДКР-1 и ДКР-2, DNArid, ExitusPlus, 7мМ водного раствора коммерческого NaOCl (разбавленная в 10 раз «Белизна»);

E – эффективность ПЦР (E = 1);

ΔCt – разница между пороговыми циклами контрольных (без воздействия деконтаминационных растворов) и опытных (после 15-минутного воздействия деконтаминационных растворов) образцов.

Электрофорез продуктов амплификации в 2% геле агарозы наглядно подтвердил полученные результаты. Детекция полученных данных осуществлялась при помощи системы гель-документирования Gel Doc XR+ (Bio-Rad, США) (фиг. 6).

Во всех параллелях проб, обозначенных ДКР-1 и ДКР-2 + H₂O + A. niger и DNA-ExitusPlus + A. niger, ПЦР-продукт не был получен, поэтому ΔCt рассчитан из имеющихся данных, что и определяет столь большое значение деградации ДНК контаминирующего агента (D = 7,3×10⁶).

В образцах Aspergillus niger после обработки «ДКР» (пробы ДКР-1 и ДКР-2 + A. niger) среднее значение концентрации ДНК плесневого гриба составило 0,04 нг/мкл, при этом отмечалась высокая степень деградации генетического материала плесневого гриба (D = 207,9), что почти в 20 раз больше наиболее часто применяемого средства для дезинфекции 7мМ водного раствора коммерческого NaOCl (D = 10,5) и отражает значительное уменьшение активной ДНК-матрицы Aspergillus niger в образцах по сравнению с контролем.

При обработке Aspergillus niger путем проведения двойного смыва «ДКР» и последующего использования воды (пробы ДКР-1 и ДКР-2 + H₂O + A. niger) среднее значение концентрации ДНК плесневого гриба составило 0,003 нг/мкл, при этом отмечалась наибольшая степень деградации ДНК (D = 7,3×10⁶) и отсутствие ПЦР-продуктов, что определяет полное удаление генома плесневых грибов Aspergillus niger.

При обработке Aspergillus niger раствором DNArid (пробы DNArid + A. niger) среднее значение концентрации ДНК плесневого гриба уменьшилось всего в 1,6 раза по сравнению с контролем и составило 5,1 нг/мкл, также отмечалась наименьшая степень деградации генетического материала гриба (D = 5,6).

В случае применения DNA-ExitusPlus (PanReac AppliChem, США) для обработки Aspergillus niger (пробы DNA-ExitusPlus + A. niger) отмечалось отсутствие продуктов амплификации, однако концентрация ДНК, определенная с помощью флуориметрии, составила в среднем не менее 6 нг/мкл. Соответственно, можно сделать вывод о том, что химические компоненты, входящие в состав деконтаминационного средства, ингибируют ПЦР и не позволяют избавиться от генома плесневых грибов Aspergillus niger.

Среднее значение концентрации ДНК Aspergillus niger после обработки 10% раствором (7мМ) гипохлорита натрия составило 8,1 нг/мкл, что практически соответствует данным положительного контроля (8,4 нг/мкл). Степень деградации ДНК плесневых грибов в образцах под воздействием 7 мМ раствора гипохлорита составила 10,5, что демонстрирует его крайне слабое дезинфицирующее действие в отношении Aspergillus niger.

Таким образом, полученные результаты доказали наличие выраженного фунгицидного действия деконтаминационного раствора «ДКР» [патент на изобретение RU2789387] и состоятельность предложенного способа дезинфекции различных поверхностей от высших плесневых грибов Aspergillus niger с помощью «ДКР». Так, после обработки Aspergillus niger «ДКР» концентрация ДНК составила 0,003 нг/мкл, отмечено отсутствие ПЦР-продуктов, что определяет полное подавление химическими компонентами опытных образцов контаминирующего агента, то есть в 100% случаев. Описанный способ применения деконтаминационного раствора «ДКР» [патент на изобретение RU2789387] позволит более продуктивно решать проблемы дезинфекции высших плесневых грибов Aspergillus niger на различных поверхностях, включая лабораторные помещения, оборудование и материалы.

Изобретение относится к области санитарии и дезинфекции и может быть использовано для дезинфекции и удаления генома высших плесневых грибов Aspergillus niger на различных поверхностях. Способ дезинфекции поверхностей от Aspergillus niger с помощью деконтаминационного раствора включает последовательное нанесение на поверхность в равных объемах компонента 1 и компонента 2, причём компонент 1 деконтаминационный раствор-1, ДКР-1, включает: 0,5-2% додецилсульфата натрия, 1-5 мМ пентагидрата сульфата меди (II) (CuSO₄×5H₂O), деионизованная вода – остальное, компонент 2 деконтаминационный раствор-2, ДКР-2, включает: 0,1-3% пероксида водорода (Н₂О₂) и 0,01-0,1% бензоата натрия (C₆H₅COONa), деионизованная вода – остальное, далее выдерживают по меньшей мере 15 минут и протирают обработанную поверхность. Способ позволяет повысить эффективность дезинфекции поверхностей от колоний и спор высших плесневых грибов Aspergillus niger. 2 з.п. ф-лы, 6 ил., 5 табл., 2 пр.

Способ дезинфекции поверхностей от Aspergillus niger с помощью деконтаминационного раствора, включающий последовательное нанесение на поверхность в равных объемах компонента 1 и компонента 2, причём компонент 1 деконтаминационный раствор-1, ДКР-1, включает: 0,5-2% додецилсульфата натрия, 1-5 мМ пентагидрата сульфата меди (II) (CuSO₄×5H₂O), деионизованная вода - остальное, компонент 2 деконтаминационный раствор-2, ДКР-2, включает: 0,1-3% пероксида водорода (Н₂О₂) и 0,01-0,1% бензоата натрия (C₆H₅COONa), деионизованная вода – остальное, далее выдерживают по меньшей мере 15 минут и протирают обработанную поверхность.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что ДКР-1 содержит:

100 мг додецилсульфата натрия,

12,5 мг пентагидрата сульфата меди (II) (CuSO₄×5H₂O),

до 10 мл стерильной деионизованной воды.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что ДКР-2 содержит:

660 мкл 30% водного раствора пероксида водорода (Н₂О₂),

5 мг бензоата натрия (C₆H₅COONa),

до 10 мл стерильной деионизованной воды.