Способ удаления РНК энтеровируса в биологическом материале с помощью деконтаминационных растворов Российский патент 2023 года по МПК C12Q1/68 A61L2/18 C11D3/395 

Изобретение относится к области медицины, более конкретно к сфере медицинской микробиологии и может быть широко использовано для удаления РНК энтеровируса (Human Enterovirus) в образцах кала больных людей в лабораторных условиях.

Загрязнение посторонним генетическим материалом является актуальной и серьезной проблемой во всех лабораториях, где проводятся молекулярно-генетические исследования образцов, включая полимеразную цепную реакцию (ПЦР) и работу с ПЦР-продуктом. Контаминация происходит за счет попадания РНК- или ДНК-содержащего материала в пробирки с образцами, на рабочую зону, оборудование и одежду сотрудников. Это способно приводить к ложным и недостоверным результатам, в особенности при поточных исследованиях, что особенно критично для клинических лабораторий медицинских организаций. В качестве источников контаминации могут выступать ампликоны, кровь, слюна, контактные следы людей, взаимодействующих с исследуемым образцом и/или рабочей поверхностью в лаборатории, а также зараженные болезнетворными возбудителями инфекций биологические образцы больных людей. Основными причинами, способствующими возникновению контаминации, являются большие объемы исследований, накопление в лаборатории образцов клинического материала, увеличение количества отходов, содержащих продукты амплификации. Перекрестная контаминация происходит вследствие технических ошибок при выполнении лабораторных манипуляций на этапах пробоподготовки и обеззараживания материала, выделения ДНК/РНК, внесения проб ДНК/РНК, положительных контрольных образцов в реакционную смесь. Загрязнение рабочих зон лаборатории ампликонами, возникающее при открытии пробирок и планшетов, содержащих продукты ПЦР - главная причина тотальной контаминации в лаборатории. Признаками перекрестной контаминации являются увеличение доли положительных проб с низкими значениями порогового цикла и выявление положительного сигнала в отрицательных контрольных образцах этапов выделения и амплификации. Получение положительного результата для всех проб в постановке, включая отрицательные контрольные образцы, свидетельствует о «тотальной контаминации» в лаборатории.

В связи с эпидемиологической ситуацией в стране и в мире, а также появлением новых штаммов возбудителей различных инфекции и новых заболеваний, необходимость в эффективной деконтаминации и дезинфекции возросла. Применение деконтаминационных средств направлено на удаление загрязнений биологического происхождения и предупреждение их вторичного переноса. Большинство таких агентов представлено в форме растворов, которые просты в применении и не требуют особых условий хранения. В качестве дезактивирующего агента чаще всего используются ионы металлов, в основном соли железа, и перекись водорода. По результатам различных исследований показано использование Sodium dodecyl sulfate (SDS), бензоата натрия и пероксида водорода как дезактивирующего агента (Schraufstätter I., Hyslop P.A., Jackson J.H., et al. Oxidant-induced DNA damage of target cells // The Journal of clinical investigation. - 1988. - V. 82. - №. 3. - P. 1040-1050; Gutteridge J. M.C. Ferrous-salt-promoted damage to deoxyribose and benzoate. The increased effectiveness of hydroxyl-radical scavengers in the presence of EDTA // Biochemical journal. - 1987. - V. 243. - №. 3. - P. 709-714). В лабораториях, где исследуются нуклеиновые кислоты, с целью деконтаминации широко используются растворы DNARid (Биомедицинские инновации, Россия), DNA-ExitusPlus (AppliChem, США), а также коммерческий раствор «Белизна» - водный раствор 70 мМ или 0,5% гипохлорита натрия (NaOCl). Действие этих средств направлено на деградацию молекул нуклеиновых кислот. Однако в окружающей среде генетический материал, как загрязнитель, не всегда существует в виде свободных молекул. Чаще всего нуклеиновые кислоты входят в состав биологического материала, такого как клетки, выделения физиологической природы, потожировое вещество рук и т.п.

Известны различные способы деконтаминации объектов биологического происхождения. В частности, известен способ по патенту US8765652 (МПК C11D 3/20; C11D 3/39; C09K 3/00) на изобретение, в котором раскрыто применение перекиси водорода и ионов металлов, таких как, например, ионы меди, кобальта, железа в качестве дезактивирующего агента. Соединения, которые не были эффективными в конкретных условиях экспериментов, включают только 15% пероксида; перекись + ионы калия, натрия или железа; 5 мМ бром- или хлоргидантоин и KMnO₄. В данном патенте концентрация компонентов: SDS от 0,005 до 1%, сульфат меди (II) (CuSO₄) от 0,1 до 5 мМ, пероксида водорода (Н₂О₂) от 0,5 до 30%, при этом такая концентрация Н₂О₂ может иметь негативный эффект при деконтаминации объектов биологического происхождения. В данном патенте не раскрыто влияние состава химических композиций на клетки, а указано только воздействие на молекулы нуклеиновых кислот относительно растворов коммерческой «Белизны».

Также известен способ по патенту US9371556 (МПК C12Q 1/68; A61L 2/18; C11D 3/395), относящейся к реагентам для дезактивации нуклеиновых кислот и способам их получения и использования, обозначены следующие компоненты: соотношение CuSO₄/Н₂О₂ (2 мМ/3%), соотношение CuSO₄/Н₂О₂ (1 мМ/3%). Однако в данной работе не указано влияние композиций на РНК- и ДНК-содержащий биологический материал, а также воздействие на клетки. По результатам исследований ряда авторов раскрыт модифицированный метод экстракции нуклеиновых кислот на основе SDS для получения высококачественных препаратов. При этом концентрация SDS 20%, Tris-буфер 100 мМ. Также известно, что перекись водорода высвобождает гидроксильные свободные радикалы (•OH) при окислении Cu (I) до Cu (II) посредством реакции типа Фентона, вызывающие повреждение молекул нуклеиновых кислот, объясняя взаимное использование сульфата меди и пероксида водорода в соотношении CuSO₄/Н₂О₂ (5 мМ /не указана) (Natarajan V.P., Zhang X., Morono Y., et al. A modified SDS-based DNA extraction method for high quality environmental DNA from seafloor environments // Frontiers in microbiology. - 2016. - V. 7. - P. 986; Chattopadhyay D., Somaiah A., Raghunathan D., et al. Dichotomous effect of caffeine, curcumin, and naringenin on genomic DNA of normal and diabetic subjects // Scientifica. - 2014. - V. 2014).

Задача заявленного изобретения состояла в разработке эффективного способа деконтаминационной обработки и утилизации образцов кала больных энтеровирусной инфекцией. Техническим результатом заявленного изобретения является создание способа, позволяющего избавиться от генома возбудителя энтеровирусной инфекции в биологическом материале при помощи деконтаминационных растворов.

Сущность изобретения заключается в способе удаления РНК энтеровируса в биологическом материале с помощью деконтаминационных растворов и состоит в том, что в качестве биологического материала используют суспензию, которую получают путем смешивания фрагментов кала либо мазка из прямой кишки больных энтеровирусной инфекцией с физиологическим раствором в одноразовой пробирке, далее пробирки встряхивают на вортексе до образования однородной суспензии, затем добавляют деконтаминационный раствор в виде двухкомпонентной жидкой композиции, содержащей компонент 1 (деконтаминационный раствор-1, ДКР-1): 0,5-2% Додецилсульфата натрия (Sodium dodecyl sulfate, SDS), 1-5 мМ пентагидрата сульфата меди (II) (CuSO₄×5H₂O), 1-15 мМ Триса (гидроксиметил) аминометана (Трис, (HOCH₂)₃CNH₂), 0,1-1 об.% глицерина, деионизованная вода - остальное и компонент 2 (деконтаминационный раствор-2, ДКР-2): 0,1-3% пероксида водорода (Н₂О₂) и 0,01-0,1% бензоата натрия (C₆H₅COONa), деионизованная вода - остальное, далее перемешивают на вортексе и инкубируют в течение 30 минут при температуре 22-25°С. Причем в способе удаления РНК энтеровируса в биологическом материале с помощью деконтаминационных растворов используют жидкую композицию, где ДКР-1 содержит:

100 мг Додецилсульфата натрия (Sodium dodecyl sulfate, SDS),

12,5 мг пентагидрата сульфата меди (II) (CuSO₄×5H₂O),

3,63 мг Триса (гидроксиметил) аминометана (Трис, (HOCH₂)₃CNH₂),

50 мкл глицерина,

до 10 мл стерильной деионизованной водой

и ДКР-2 содержит:

330 мкл 30% водного раствора пероксида водорода (Н₂О₂),

5 мг бензоата натрия (C₆H₅COONa),

до 10 мл стерильной деионизованной воды.

Также способ удаления РНК энтеровируса в биологическом материале с помощью деконтаминационных растворов заключается в том, что в качестве биологического материала используют суспензию которую получают путем смешивания фрагментов кала либо мазка из прямой кишки больных энтеровирусной инфекцией с физиологическим раствором в одноразовой пробирке, далее пробирки встряхивают на вортексе до образования однородной суспензии, затем добавляют деконтаминационный раствор в виде двухкомпонентной жидкой композиции, содержащей компонент 1 (деконтаминационный раствор-1, ДКР-1): 0,5-2% Додецилсульфата натрия (Sodium dodecyl sulfate, SDS), 1-5 мМ пентагидрата сульфата меди (II) (CuSO₄×5H₂O), деионизованная вода - остальное и компонент 2 (деконтаминационный раствор-2, ДКР-2): 0,1-3% пероксида водорода (Н₂О₂) и 0,01-0,1% бензоата натрия (C₆H₅COONa), деионизованная вода - остальное, далее перемешивают на вортексе и инкубируют в течение 30 минут при температуре 22-25°С. Причем в способе удаления РНК энтеровируса в биологическом материале с помощью деконтаминационных растворов используют жидкую композицию, где ДКР-1 содержит:

100 мг Додецилсульфата натрия (Sodium dodecyl sulfate, SDS),

12,5 мг пентагидрата сульфата меди (II) (CuSO₄×5H₂O),

до 10 мл стерильной деионизованной водой

и ДКР-2 содержит:

330 мкл 30% водного раствора пероксида водорода (Н₂О₂),

5 мг бензоата натрия (C₆H₅COONa),

до 10 мл стерильной деионизованной воды.

Вместе с тем для деконтаминации образца готовят суспензию путем смешивания фрагмента кала размером 5-10 мм³ либо мазка кала из прямой кишки с 300 мкл физиологического раствора (0,9% водный раствор хлорида натрия (NaCl)) (17-30 мкм³/мкл).

Способ удаления РНК энтеровируса в биологическом материале с помощью деконтаминационных растворов заключается в смешивании зараженных образцов кала с деконтаминационными растворами «ДКР» и их инкубировании в течение 30 минут при комнатной температуре (22-25оС). Причем в заявленном способе в качестве деконтаминационного раствора применена жидкая композиция № 1, содержащая компонент 1 (деконтаминационный раствор-1, ДКР-1): 0,5-2% Додецилсульфата натрия (Sodium dodecyl sulfate, SDS), 1-5 мМ пентагидрата сульфата меди (II) (CuSO4×5H2O), 1-15 мМ Триса (гидроксиметил) аминометана (Трис, (HOCH2)3CNH2), 0,1-1 об.% глицерина, деионизованная вода - остальное и компонент 2 (деконтаминационный раствор-2, ДКР-2): 0,1-3% пероксида водорода (Н2О2) и 0,01-0,1% бензоата натрия (C6H5COONa), деионизованная вода - остальное. Например, смесь ДКР-1: 100 мг Додецилсульфата натрия, 12,5 мг пентагидрата сульфата меди (II), 3,63 мг Триса (гидроксиметил) аминометана, 50 мкл глицерина, доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой, и ДКР-2: 330 мкл 30% водного раствора пероксида водорода (Н2О2) и 5 мг бензоата натрия (C6H5COONa), доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой. Либо жидкая композиция № 2, содержащая компонент 1 (деконтаминационный раствор-1, ДКР-1): 0,5-2% Додецилсульфата натрия (Sodium dodecyl sulfate, SDS), 1-5 мМ пентагидрата сульфата меди (II) (CuSO4×5H2O), деионизованная вода - остальное и компонент 2 (деконтаминационный раствор-2, ДКР-2): 0,1-3% пероксида водорода (Н2О2) и 0,01-0,1% бензоата натрия (C6H5COONa), деионизованная вода - остальное. Например, смесь ДКР-1: 100 мг Додецилсульфата натрия, 12,5 мг пентагидрата сульфата меди (II), доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой, и ДКР-2: 330 мкл 30% водного раствора пероксида водорода (Н2О2) и 5 мг бензоата натрия (C6H5COONa), доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой.

Знак «%» в настоящем изобретении означает процентное содержание по массе указанного компонента в указанном растворе.

0,5-2% Додецилсульфат натрия (Sodium dodecyl sulfate, SDS) является одним из постоянных составляющих жидких композиций и представляет собой наиболее мощный детергент, приводящий к разрушению клеточных структур и высвобождению нуклеиновых кислот. Также, постоянным составляющим композиций является 1-5 мМ пентагидрата сульфата меди (II) (CuSO₄×5H₂O). Установлено, что ионы меди вызывают инактивирующий эффект и повреждения молекул нуклеиновых кислот. С другой стороны, окислительно-восстановительные свойства меди могут также вызвать повреждение клеток, что позволяет отнести медь к эффективному деконтаминирующему реагенту. Кроме того, использование меди как деактивирующего иона, вместо ионов железа, повышает стойкость и срок хранения растворов (De Benedictis P., Beato M. S., Capua I. Inactivation of avian influenza viruses by chemical agents and physical conditions: a review // Zoonoses and public health. - 2007. - V. 54. - №. 2. - P. 51-68; Steuer P., Tejeda C., Martinez O., et al. Effectiveness of copper ions against Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis and bacterial communities in naturally contaminated raw cow's milk // Journal of applied microbiology. - 2021. - V. 131. - №. 1. - P. 146-154). Для создания и поддержания щелочного значения pH, а также дестабилизации нуклеиновых кислот в раствор добавляется 1-15 мМ Триса (гидроксиметил) аминометана (Трис, (HOCH₂)₃CNH₂). 0,1-1 об.% глицерина используется в растворе с целью предотвращения выпадения осадка гидроксида меди (II). Для этого добавляют 50 мкл глицерина и взбалтывают содержимое. Осадок растворяется, а раствор приобретает темно-синее окрашивание вследствие образования глицерата меди. Пероксид водорода (Н₂О₂) 0,1-3%, входящий в состав второго компонента деконтаминационного раствора, является мощным деактивирующим агентом молекул нуклеиновых кислот, а также способствует разрушению мембран клеток (Schraufstätter I., Hyslop P.A., Jackson J. H., et al. Oxidant-induced DNA damage of target cells // The Journal of clinical investigation. - 1988. - V. 82. - №. 3. - P. 1040-1050). Бензоат натрия (C₆H₅COONa), являющийся консервантом, позволяет увеличить срок хранения раствора пероксида водорода. Во втором компоненте деконтаминационного раствора его концентрация составляет 0,01-0,1%. Предлагаемая методика деконтаминации мазков и образцов кала, содержащих геном возбудителя энтеровирусной инфекции (Human Enterovirus), представляет собой:

(I) приготовление суспензии образца кала или мазка из прямой кишки в физиологическом растворе (0,9% водный раствор хлорида натрия (NaCl)) (17-30 мкм³/мкл).

(II) добавление к полученной суспензии жидких композиций № 1 и № 2 в качестве деконтаминирующего реагента в процессе очистки.

(III) смешивание «ДКР» и образца по настоящему изобретению в соотношении 1:1.

(IV) соотношение ДКР-1 к ДКР-2 составляет 9:1.

Деконтаминационная обработка проводится в процессе утилизации зараженных образцов кала больных людей. Для этого сначала получают суспензию кала путем его смешивания с физиологическим раствором (17-30 мкм³/мкл): небольшие фрагменты кала больных энтеровирусной инфекцией, размером 5-10 мм³, вносят в отдельные одноразовые пробирки, содержащие по 300 мкл физиологического раствора. Далее пробирки интенсивно встряхивают на вортексе до образования однородной суспензии. Ватные тампоны с мазками из прямой кишки больных энтеровирусной инфекцией вносят в отдельные одноразовые пробирки, содержащие по 300 мкл физиологического раствора. Далее пробирки в течение 10 сек встряхивают на вортексе. Полученные образцы кала в виде суспензии раскапывают по 100 мкл в отдельные стерильные пробирки. К ним добавляют по 90 мкл ДКР-1 и по 10 мкл ДКР-2. Смеси кратко перемешивают на вортексе. Инкубируют в течение 30 минут при комнатной температуре (22-25°С).

Проводили сравнительное исследование влияния деконтаминационных растворов на геном возбудителя энтеровирусной инфекции (Human Enterovirus) в образцах кала больных людей и коммерческих дезинфицирующих средств: «Асепт Про» («Asept Pro») (Ацея, Россия), «Фармcепт» («Pharmsept») (Уралхимфарм - Плюс, Россия), «Фориспот» (Альфа, Россия). Исследованию подверглись образцы кала и мазки кала на тампонах из прямой кишки от 33 человек, больных энтеровирусной инфекцией, возрастом до 16 лет. Небольшие фрагменты кала больных энтеровирусной инфекцией, размером 5-10 мм³, вносили в отдельные одноразовые пробирки, содержащие по 300 мкл физиологического раствора (17-30 мкм³/мкл). Далее пробирки интенсивно встряхивали на вортексе до образования однородной суспензии. Ватные тампоны с мазками из прямой кишки больных энтеровирусной инфекцией вносили в отдельные одноразовые пробирки, содержащие по 300 мкл физиологического раствора (17-30 мкм³/мкл). Далее пробирки в течение 10 сек встряхивали на вортексе. Перед оценкой воздействия деконтаминационных растворов «ДКР» на геном возбудителя энтеровирусной инфекции в каждую пробирку с клиническими образцами добавляли внутренний контрольный образец ВКО STI-87-rec (ИнтерЛабСервис).

Оценка воздействия деконтаминационных растворов на геном Human Enterovirus. Пробирки со взвесью фекалий и мазками из прямой кишки в физрастворе больных энтеровирусной инфекцией кратко встряхивали на вортексе. Стерильными наконечниками раскапывали по 100 мкл взвеси фекалий в стерильные пробирки типа «Эппендорф» объемом 1,5 мл. Добавляли по 90 мкл ДКР-1 и по 10 мкл ДКР-2. В контрольные образцы раскапывали по 100 мкл взвеси фекалий и добавляли по 100 мкл стерильной деионизованной воды. Встряхивали кратко на вортексе. Инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре (22-25°С). Сразу же после инкубации начинали процесс выделения РНК возбудителя энтеровирусной инфекции.

Оценка воздействия коммерческих дезинфицирующих средств на геном Human Enterovirus. В пробирки со 100 мкл взвеси фекалий и мазками из прямой кишки больных энтеровирусной инфекцией добавляли по 100 мкл коммерческих дезинфицирующих средств: «Асепт Про», «Pharmsept» (Фармсепт) и «Фориспот» (выбор данных коммерческих дезинфекционных средств был обусловлен результатами наших предыдущих исследований (Колпаков Д.С., Корниенко И.В., Фалеева Т.Г., Арамова О.Ю., Иванова С.Н., Полищук И.С., Наумова М.А., Твердохлебова Т.И., Рындич А.А., Алексанина Н.В., Матузкова А.Н., Суладзе А.Г., Сидоренко Ю.С. Оценка влияния двухкомпонентного набора деконтаминационных растворов «ДКР» на генетический материал возбудителя коронавирусной инфекции (SARS-CoV-2) // COVID19-PREPRINTS.MICROBE.RU. 2021. https://doi.org/10.21055/preprints-3111971)). Встряхивали кратко на вортексе. Инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре (22-25°С). Сразу же после инкубации начинали процесс выделения РНК возбудителя энтеровирусной инфекции.

Выделения РНК из биологического материала с помощью набора «РИБО-преп» (ИнтерЛабСервис). В каждую стерильную пробирку объемом по 1,5 мл вносили по 300 мкл раствора для лизиса. Далее в пробирки вносили по 100 мкл подготовленных проб после 30 минутной инкубации. Содержимое пробирок тщательно перемешивали на вортексе, центрифугировали в течение 5 секунд на микроцентрифуге для удаления капель с внутренней поверхности крышки и прогревали 5 минут при 65°С в термостате. Добавляли в пробирки по 400 мкл раствора для преципитации, перемешивали на вортексе. Центрифугировали пробирки на микроцентрифуге в течение 5 минут при 13000 об/мин. Аккуратно отбирали надосадочную жидкость, не задевая осадок. Добавляли в пробирки по 500 мкл раствора для отмывки 3, плотно закрывали крышки, осторожно промывали осадок, переворачивая пробирки 3-5 раз. Центрифугировали при 13000 об/мин в течение 1-2 минут на микроцентрифуге. Осторожно, не захватывая осадок, отбирали надосадочную жидкость. Добавляли в пробирки по 200 мкл раствора для отмывки 4, плотно закрывали крышки и осторожно промывали осадок, переворачивая пробирки 3-5 раз. Центрифугировали при 13000 об/мин в течение 1-2 минут на микроцентрифуге. Осторожно, не захватывая осадок, отбирали надосадочную жидкость. Помещали пробирки в термостат при температуре 65°С на 5 минут для подсушивания осадка (при этом крышки пробирок оставляли открытыми). Добавляли в пробирки по 50 мкл РНК-буфера. Перемешивали на вортексе. Помещали в термостат при температуре 65°С на 5 минут, периодически встряхивая на вортексе. Центрифугировали пробирки при 13000 об/мин в течение 1 минуты на микроцентрифуге. Надосадочная жидкость содержала очищенные РНК. Экстракцию РНК из каждого клинического образца проводили в присутствии внутреннего контрольного образца (ВКО STI-87-rec).

Получение кДНК на матрице РНК с помощью набора «Реверта-L» (ИнтерЛабСервис). Готовили реакционную смесь на каждые 12 реакций. Для этого в пробирку c RT-mix вносили 5 мкл RT-G-mix-1 (RT-G-mix-2), тщательно перемешивали на вортексе, осаждали капли с крышки пробирки кратковременным центрифугированием. К полученному раствору добавляли 6 мкл ревертазы (MMlv), пипетировали 5 раз, перемешивали на вортексе. Осаждали капли с крышки пробирки кратковременным центрифугированием. Вносили в микропробирки по 10 мкл готовой реакционной смеси. Затем добавляли по 10 мкл РНК-пробы в пробирки с реакционной смесью. Осторожно перемешивали пипетированием. Помещали пробирки в термоциклер с температурой термоблока 37°С на 30 минут. Полученную в реакции обратной транскрипции кДНК для последующей постановки ПЦР разводили в 2 раза ДНК-буфером.

Выявление РНК энтеровирусов человека (Human Enterovirus) в объектах окружающей среды и биологическом материале методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией «АмплиСенс® Enterovirus-FL» (ИнтерЛабСервис). Готовили реакционную смесь согласно инструкции к набору реагентов. Для приготовления готовой реакционной смеси на 1 пробу смешивали: 10 мкл ПЦР-смеси-FL, 5,0 мкл ПЦР-буфера-С, 0,25 мкл RT-Gmix-2, 0,5 мкл полимеразы (TaqF) и 0,25 мкл ТМ-ревертазы (MMlv). В пробирки вносили по 15 мкл готовой реакционной смеси. Далее в пробирки с готовой реакционной смесью добавляли по 10 мкл РНК-проб, выделенных из исследуемых проб. Устанавливали все пробирки в блок детектирующего амплификатора (ДТпрайм, ДНК-технология) и проводили ОТ-ПЦР с учетом объёма реакционной смеси, равного 25 мкл. Проводили ПЦР по следующей программе энзиматической амплификации (таблица 1):

Таблица 1.
Программа амплификации для детектирующего амплификатора Цикл Температура, °C Время Количество циклов (повторов) 1 50 30 мин 1 2 95 15 мин 1 3 95 10 с 42 60 V 10 с 72 10 с 4 72 1 мин 1 5 10 хранение Примечание: V - режим оптических измерений.

Устанавливали измерение флуоресценции по каналам FAM и HEX при 60°С (таблица 2).

Таблица 2.
Соответствие мишеней и каналов для флуорофора Канал для флуорофора ПЦР-смесь-FL Enterovirus FAM ВКО HEX/JOE кДНК Enterovirus

Анализируемый образец считали положительным на наличие генетического материала энтеровируса, если для этого образца значение порогового цикла (Ct) по каналу «HEX» было меньше или равно 40.

Ввиду отсутствия сведений об эффективности ПЦР в инструкции к набору «АмплиСенс® Enterovirus-FL» (производство ИнтерЛабСервис), значение эффективности принимали за 1. Соответственно количественные значения деградации генетического материала энтеровируса (энтеровирусной РНК) под воздействием деконтаминирующих растворов ДКР-1 и ДКР-2 рассчитывали по формуле:

D = (1+E)^ΔCt = (1+1)^ΔCt = 2^ΔCt,

где D - степень деградации РНК-энтеровируса (во сколько раз количество РНК энтеровируса уменьшается под воздействием деконтаминационных растворов);

E - эффективность ПЦР (E=1);

ΔCt - разница между пороговыми циклами контрольных (без воздействия деконтаминационных растворов) и опытных (после 30 минутной обработки деконтаминационными растворами) образцов.

Статистическую обработку полученных результатов проводили на основе общепринятых для медико-биологических исследований методов с применением компьютерных программных пакетов STADIA (версия 6.5) (Кулаичев, А. П. Методы и средства анализа данных в среде Windows. Stadia 6.0. / А. П. Кулаичев. 3-е изд., перераб. и доп. М.: Информатика и компьютеры, 1999. 340 с.) и EXCEL 2019.

Влияние двухкомпонентного набора деконтаминационных растворов ДКР-1 и ДКР-2 на генетический материал (РНК) возбудителя энтеровирусной инфекции с использованием метода обратной транскрипции и ПЦР в режиме реального времени приведены в таблице 3.

Таблица 3.
Результаты обратной транскрипции и ПЦР в режиме реального времени РНК энтеровируса в кале и мазках из прямой кишки больных энтеровирусной инфекцией после обработки образцов деконтаминационными растворами «ДКР» Обозначение биологического объекта Вид биологического материала Без обработки ДКР-1,2 С обработкой ДКР-1,2 ΔCt Образец_64 кал 27,0 35,1 8,1 Образец_72 кал 31,1 33,2 2,1 Образец_121 кал 31,0 34,2 3,2 Образец_116 кал 33,6 - 0 Образец_112 кал 31,1 - 0 Образец_94 кал 28,0 29,8 1,8 Образец_107 кал 30,6 - 0 Образец_98 кал 30,9 33,9 3 Образец_110 кал 33,8 - 0 Образец_109 кал 28,8 - 0 Образец_87 кал 31,6 32,1 0,5 Образец_86 кал 27,4 27,5 0,1 Образец_84 кал 32,5 - 0 Образец_73 кал 31,4 34,1 2,7 Образец_107 мазок из прямой кишки 32,9 - 0 Образец_97 мазок из прямой кишки 31,8 - 0 Образец_82 мазок из прямой кишки 32,5 - 0 Образец_64 мазок из прямой кишки 33,2 - 0 Образец_54 мазок из прямой кишки 32,5 - 0 Образец_53 мазок из прямой кишки 29,8 - 0 Образец_41 мазок из прямой кишки 34,7 - 0 Образец_23 мазок из прямой кишки 31,9 - 0 Образец_22 мазок из прямой кишки 32,0 - 0 Образец_19 мазок из прямой кишки 32,2 - 0 Образец_246 мазок из прямой кишки 33,7 - 0 Образец_265 мазок из прямой кишки 30,6 - 0 Образец_215 мазок из прямой кишки 31,4 - 0 Образец_221 мазок из прямой кишки 32,5 - 0 Образец_201 мазок из прямой кишки 30,6 - 0 Образец_118 мазок из прямой кишки 29,6 - 0 Образец_243 мазок из прямой кишки 28,9 40,7 11,8 Образец_239 мазок из прямой кишки 31,9 - 0 Образец_206 мазок из прямой кишки 29,6 - 0 Примечания:
1. В образцы без обработки «ДКР» вместо растворов ДКР-1 и ДКР-2 добавляли стерильную деионизованную воду;
2. «-» - ПЦР-продукт отсутствует.
3. Анализируемый образец «Образец_243» не считали положительным на наличие генетического материала энтеровируса, т.к. для этого образца значение Ct по каналу «HEX» было больше 40.

Из таблицы 3 видно, что инкубация фрагментов кала больных энтеровирусной инфекцией с растворами «ДКР» в течение 30 минут приводило к полному уничтожению РНК энтеровируса в 42,9% случаях (6 из 14 проб). Для остальных 8 образцов рассчитывали количественные значения деградации генетического материала энтеровируса (энтеровирусной РНК) под воздействием деконтаминирующих растворов, исходя из значений ΔCt - разницы между пороговыми циклами контрольных (без обработки «ДКР») и опытных (после обработки «ДКР») образцов. Результаты расчетов эффективности воздействием деконтаминационных растворов в отношении кала, содержащего генетический материал возбудителя энтеровирусной инфекции, приведены в таблице 4.

Таблица 4.
Деградация генетического материала возбудителя энтеровирусной инфекции в кале больных под воздействием растворов «ДКР» Обозначение биологического объекта Вид биологического материала ΔCt Степень деградации РНК энтеровируса в кале (D) Образец_64 кал 8,1 274,37 Образец_72 кал 2,1 4,29 Образец_121 кал 3,2 9,19 Образец_94 кал 1,8 3,48 Образец_98 кал 3 8,00 Образец_87 кал 0,5 1,41 Образец_86 кал 0,1 1,07 Образец_73 кал 2,7 6,50 Примечание: деградация (D) РНК энтеровируса в кале под воздействием «ДКР» рассчитана по формуле: D = 2^ΔCt

Для последующей оценки полученных результатов, приведенных в таблице 4, оценивали нормальность распределения значений D (степени деградации РНК энтеровируса в кале). Согласно тестам Колмогорова, Омега-квадрат и Хи-квадрат распределение значений степени деградации РНК энтеровируса в кале отличалось от нормального (таблица 5). В связи с этим дальнейшие расчеты по этим пробам проводили с использованием непараметрических статистических методов.

Таблица 5.
Результаты тестов на нормальность распределения значений степени деградации РНК энтеровируса в кале Тест Значение Значимость Число степеней свободы Колмогоров 0.4959 9.308×10^-5 8 Омега-квадрат 0.4416 1.131×10^-6 8 Хи-квадрат 15.95 6.71×10^-5 1

Анализ полученных результатов остальных 57,1% образцов (6 из 14 проб) кала (таблица 5) показал, что 30 минутное совместное воздействие деконтаминационных растворов «ДКР» на суспензию кала больных энтеровирусной инфекцией примерно в 5,4 раза снижает концентрацию активной РНК-матрицы (таблица 6).

Таблица 6.
Результаты исследования стабильности РНК энтеровируса в кале после его обработки деконтаминационными растворами «ДКР» (исходя из значений ΔCt) Медиана P25 (Q1) P75 (Q3) 5.395 1.927 8.893

Такие результаты исследования кала, когда в 57,1% образцах не удалось полностью разрушить генетический материал энтеровирусов при 30 минутной инкубации с «ДКР», можно объяснить нейтрализующим воздействием частиц кала на деконтаминационные растворы.

При уменьшении концентрации частиц кала в реакционной среде, когда биологические образцы были представлены только мазками из прямой кишки больных энтеровирусной инфекцией на тампонах, наблюдалась нейтрализация этого ингибирующего воздействия и в течение 30 минут происходило полное разрушение генетического материала энтеровируса (таблица 3).

Далее были проведены сравнительные результаты испытаний эффективности воздействия деконтаминационных растворов «ДКР» в сравнении с коммерческими дезинфицирующими средствами (1. «Асепт Про», 2. «Pharmsept» (Фармсепт), 3. «Фориспот») на генетический материал (РНК) возбудителя энтеровирусной инфекции. Результаты ПЦР в режиме реального времени приведены в таблице 7.

Таблица 7.
Результаты обратной транскрипции и ПЦР в режиме реального времени РНК энтеровируса в кале и мазках из прямой кишки больных энтеровирусной инфекцией после обработки образцов коммерческими дезинфицирующими средствами Обозначение биологического объекта Вид биологического материала Деконтаминационная обработка, Ct «Асепт Про» «Pharmsept» (Фармсепт) «Фориспот» Образец_64 кал 26,0 26,5 28,2 Образец_72 кал 28,2 28,2 28,8 Образец_121 кал 29,3 - - Образец_116 кал 33,2 33,0 32,4 Образец_112 кал 32,7 31,3 32,2 Образец_94 кал 29,3 29,3 29,1 Образец_107 кал 31,2 31,3 29,0 Образец_98 кал 30,0 31,5 28,0 Образец_110 кал 33,9 33,7 33,2 Образец_109 кал 29,2 27,0 27,6 Образец_87 кал 28,2 30,9 29,5 Образец_86 кал 26,2 25,5 30,1 Образец_84 кал 38,4 39,6 - Образец_73 кал 29,7 30,4 31,3 Образец_107 мазок из прямой кишки 33,5 35,0 30,9 Образец_97 мазок из прямой кишки 34,0 35,2 33,6 Образец_82 мазок из прямой кишки 31,6 - 34,3 Образец_64 мазок из прямой кишки 32,3 35,6 33,1 Образец_54 мазок из прямой кишки - 33,3 34,2 Образец_53 мазок из прямой кишки 28,5 33,2 29,3 Образец_41 мазок из прямой кишки - - - Образец_23 мазок из прямой кишки 34,9 33,0 - Образец_22 мазок из прямой кишки 35,4 36,5 - Образец_19 мазок из прямой кишки - - - Образец_246 мазок из прямой кишки - - - Образец_265 мазок из прямой кишки - - 34,1 Образец_215 мазок из прямой кишки - 33,6 34,5 Образец_221 мазок из прямой кишки - - - Образец_201 мазок из прямой кишки 34,4 - 34,7 Образец_118 мазок из прямой кишки - - - Образец_243 мазок из прямой кишки 34,4 34,0 - Образец_239 мазок из прямой кишки 29,5 - 31,6 Образец_206 мазок из прямой кишки 33,2 34,8 32,6 Примечание: «-» - ПЦР-продукт отсутствует.

В остальных 57,9% случаев степень деградации генома энтеровируса после 30 минутной инкубации с вышеуказанными растворами составила от 3,5 до 7,9 (таблица 8). Стоит отметить, что для статистических расчетов в данном случае использовали непараметрические статистические методы, так как согласно тестам Омега-квадрат и Хи-квадрат распределение значений степени деградации РНК энтеровируса после воздействия на мазки коммерческих растворов «Асепт Про», «Pharmsept» (Фармсепт) (но не «Фориспот») отличалось от нормального.

Таблица 8.
Степень деградации РНК энтеровируса после обработки мазков из прямой кишки больных энтеровирусной инфекцией коммерческими дезинфицирующими средствами «Асепт Про», «Pharmsept» и «Фориспот» Коммерческий раствор Среднее значение Ошибка Стандартное отклонение Меди-ана P25 (Q1) P75 (Q3) «Асепт Про» 8,877 3,956 13,12 4,595 0,5359 12,13 «Pharmsept» 13,28 4,18 13,22 7,917 3,751 25,54 «Фориспот» 5,268 1,627 5,396 3,482 0,8123 8,574 Примечание: D = 2^ΔCt - степень деградации РНК энтеровируса.

При этом различия между результатами воздействия коммерческих растворов («Асепт Про», «Pharmsept» и «Фориспот») на РНК энтеровируса отсутствовали (таблица 9).

Таблица 9.
Результаты теста Колмогорова-Смирнова по данным исследования сохранности РНК энтеровируса в пробах после обработки мазков из прямой кишки коммерческими дезинфицирующими средствами «Асепт Про», «Pharmsept» и «Фориспот» Переменные Значение Значимость Число степеней свободы Гипотеза 0 «Асепт Про»/ «Pharmsept» 0,4545 0,2296 11,10 Нет интегральных различий между выборками «Асепт Про»/ «Фориспот» 0,2727 0,8825 11,11 Нет интегральных различий между выборками «Pharmsept»/ «Фориспот» 0,4364 0,2721 10,11 Нет интегральных различий между выборками

30 минутное воздействие на фрагменты кала больных энтеровирусной инфекцией коммерческих дезинфектантов показало следующее: воздействие «Асепт Про» не приводило к полному уничтожению РНК энтеровируса ни в одной из 14 проб; воздействие «Pharmsept» (Фармсепт) и «Фориспот» приводило к полному уничтожению РНК энтеровируса только в 7,1% и 14,3% случаев (1 и 2 пробы из 14) соответственно.

Исследование влияния коммерческих дезинфицирующих средств на РНК энтеровируса в мазках из прямой кишки больных людей показало, что все три препарата («Асепт Про», «Pharmsept» (Фармсепт), «Фориспот») продемонстрировали схожую эффективность: 30 минутная обработка мазков с их использованием привело к полному уничтожению генома энтеровируса в 42,1% случаев (таблица 7).

Результаты проведенных испытаний показали, что деконтаминационные растворы «ДКР» проявили наибольшую эффективность в отношении генома возбудителя энтеровирусной инфекции по сравнению с коммерческими аналогами. Так, инкубация мазков из прямой кишки больных энтеровирусной инфекцией с деконтаминационными растворами «ДКР» в течение 30 минут обеспечила полное уничтожение генома энтеровируса во всех 19 пробах, т.е. в 100% случаев. Тогда как обработка мазков коммерческими аналогами приводила к деградации РНК Human Enterovirus только в 42,1% случаев.

Для исследования влияния растворов «ДКР» на свободные (внеклеточные) молекулы ДНК проводили количественную оценку изменения концентрации внутреннего контрольного образца ВКО STI-87-rec (ИнтерЛабСервис), который предварительно добавляли в каждую пробирку с клиническими образцами перед их обработкой растворами «ДКР». Полученные результаты представлены в таблице 10.

Таблица 10.
Результаты ПЦР внутреннего контрольного образца ДНК - ВКО STI-87-rec (ИнтерЛабСервис) Обозначение биологического объекта Вид биологического материала Канал FAM (ВКО)
без обработки «ДКР» Канал FAM (ВКО)
с обработкой «ДКР» ΔСt Образец_107 мазок из прямой кишки 28,3 30,5 2,20 Образец_97 мазок из прямой кишки 27,7 30,2 2,50 Образец_82 мазок из прямой кишки 27,5 33,8 6,30 Образец_64 мазок из прямой кишки 28,6 30,1 1,50 Образец_54 мазок из прямой кишки 28,1 30,1 2,00 Образец_53 мазок из прямой кишки 26,2 30,2 4,00 Образец_41 мазок из прямой кишки 28,3 30,3 2,00 Образец_23 мазок из прямой кишки 27,5 30,5 3,00 Образец_22 мазок из прямой кишки 27,4 38,3 10,90 Образец_19 мазок из прямой кишки 27,7 30,4 2,70 Образец_246 мазок из прямой кишки 31,0 31,3 0,30 Образец_265 мазок из прямой кишки 28,8 31,5 2,70 Образец_215 мазок из прямой кишки 29,4 33,1 3,70 Образец_221 мазок из прямой кишки 30,5 33,7 3,20 Образец_201 мазок из прямой кишки 29,2 33,6 4,40 Образец_118 мазок из прямой кишки 28,0 36,8 8,80 Образец_243 мазок из прямой кишки 27,5 33,5 6,00 Образец_239 мазок из прямой кишки 32,1 34,3 2,20 Образец_206 мазок из прямой кишки 29,8 33,5 3,70

Согласно тесту Колмогорова (значение = 0,1643, значимость = 0,2788, число степеней свободы = 9) распределение значений степени деградации ВКО STI-87-rec не отличалось от нормального. В связи с этим дальнейшие расчеты по этим пробам проводили с использованием параметрических статистических методов. Результаты анализа воздействия растворов «ДКР» на нуклеиновые кислоты, представленные в виде ВКО STI-87-rec (ИнтерЛабСервис), приведены в таблице 11.

Таблица 11.
Результаты исследования сохранности контрольного образца ДНК (ВКО STI-87-rec, ИнтерЛабСервис) в пробах после обработки образцов кала растворами «ДКР» Параметр Среднее значение Ошибка Дисперсия Стандартное отклонение Канал FAM (ВКО) без обработки «ДКР» 26,2 0,3304 2,074 1,44 Канал FAM (ВКО) с обработкой «ДКР» 30,1 0,5506 5,761 2,40

Достоверность различий между выборочными средними и дисперсиями в пробах после 30 минутного воздействия на кал в присутствии контрольного образца ДНК (ВКО STI-87-rec, ИнтерЛабСервис) «ДКР» подтверждена тестами Стьюдента и Фишера (таблица 12).

Таблица 12.
Результаты тестов Стьюдента и Фишера по данным исследования сохранности контрольного образца ДНК (ВКО STI-87-rec, ИнтерЛабСервис) в пробах после обработки образцов кала растворами «ДКР» Параметр Значение Значимость Число степеней свободы Гипотеза 1 Статистика Фишера 0,3601 0,01817 18,18 Есть различия между выборочными дисперсиями Статистика Стьюдента 5,909 1,677×10^-5 36 Есть различия между выборочными средними Стьюдент для парных данных 6,375 3,690×10^-5 18 Есть различия между выборочными средними

Из таблиц 10 и 11 видно, что 30 минутное воздействие «ДКР» на свободные (внеклеточные) молекулы ДНК (представленные в виде ВКО STI-87-rec, ИнтерЛабСервис), содержащиеся в кале, уменьшает концентрацию активной-ДНК матрицы в 15 раз (2^ΔСt = 2^3,9).

Таким образом, инкубация мазков из прямой кишки больных энтеровирусной инфекцией с «ДКР» приводит к деградации РНК вируса в 100% случаев. Аналогичная обработка фрагментов кала способствовала полной деградации РНК энтеровируса в 42,9% случаев, в остальных образцах кала в 5,4 раза снизилась концентрация активной РНК-матрицы возбудителя, что связано с нейтрализующим воздействием частиц кала на «ДКР». Описанный способ применения деконтаминационных растворов «ДКР» позволит более продуктивно решать проблемы молекулярно-генетических лабораторий, связанные с деконтаминацией не только ДНК-, но и РНК-содержащего биологического материала патогенов, в частности, энтеровирусов. Результаты настоящей работы найдут широкое применение в ситуациях, связанных с массовой обработкой патогенного биологического материала.

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ удаления РНК энтеровируса в биологическом материале с помощью деконтаминационных растворов. Способ включает стадии получения суспензии биологического материала, путем смешивания фрагментов кала либо мазка из прямой кишки больных энтеровирусной инфекцией с физиологическим раствором в одноразовой пробирке, добавление деконтаминационного раствора при перемешивании на вортексе и инкубирование в течение 30 минут при температуре 22-25°С. Изобретение расширяет арсенал способов удаления РНК энтеровируса в биологическом материале. 3 з.п. ф-лы, 12 табл.

1. Способ удаления РНК энтеровируса в биологическом материале с помощью деконтаминационных растворов, отличающийся тем, что в качестве биологического материала используют суспензию, которую получают путем смешивания фрагментов кала либо мазка из прямой кишки больных энтеровирусной инфекцией с физиологическим раствором в одноразовой пробирке, далее пробирки встряхивают на вортексе до образования однородной суспензии, затем добавляют деконтаминационный раствор в виде двухкомпонентной жидкой композиции, содержащей компонент 1 – деконтаминационный раствор-1, ДКР-1: 0,5-2% Додецилсульфата натрия, 1-5 мМ пентагидрата сульфата меди (II) (CuSO₄×5H₂O), 1-15 мМ Триса гидроксиметил аминометана, 0,1-1 об.% глицерина, деионизованная вода – остальное и компонент 2 – деконтаминационный раствор-2, ДКР-2: 0,1-3% пероксида водорода (Н₂О₂) и 0,01-0,1% бензоата натрия (C₆H₅COONa), деионизованная вода – остальное, далее перемешивают на вортексе и инкубируют в течение 30 минут при температуре 22-25°С.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что используют жидкую композицию, где ДКР-1 содержит:

100 мг Додецилсульфата натрия,

12,5 мг пентагидрата сульфата меди (II) (CuSO₄×5H₂O),

3,63 мг Триса гидроксиметил аминометана,

50 мкл глицерина,

до 10 мл стерильной деионизованной воды

и ДКР-2 содержит:

330 мкл 30% водного раствора пероксида водорода (Н₂О₂),

5 мг бензоата натрия (C₆H₅COONa),

до 10 мл стерильной деионизованной воды.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что используют жидкую композицию, где ДКР-1 содержит:

100 мг Додецилсульфата натрия,

12,5 мг пентагидрата сульфата меди (II) (CuSO₄×5H₂O),

до 10 мл стерильной деионизованной воды

и ДКР-2 содержит:

330 мкл 30% водного раствора пероксида водорода (Н₂О₂),

5 мг бензоата натрия (C₆H₅COONa),

до 10 мл стерильной деионизованной воды.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для деконтаминации образца готовят суспензию путем смешивания фрагмента кала размером 5-10 мм³ либо мазка кала из прямой кишки с 300 мкл физиологического раствора, что соответствует диапазону от 17 до 33 мкм³/мкл.